蛹虫草多糖（通用9篇）
蛹虫草多糖 篇1
自从日本学者千原在1969年从香菇子实体中分离出一种具有抗肿瘤活性的活性多糖以来,世界掀起了从真菌中寻找抗肿瘤成分的高潮。虫草多糖作为虫草中的一种主要活性成分,当然也就成为人们的研究开发热点。据报道虫草所含的虫草多糖是免疫促进物质,而且是目前世界上发现的最佳免疫促进剂之一。因此,蛹虫草多糖备受人们青睐,对其研究也已成为近年来分子生物学、医药、食品科学等领域研究和开发应用的热点。本文就蛹虫草多糖的提取、结构和药用保健功能的研究进展作一综述。
1 蛹虫草多糖的提取
1.1 一般提取工艺
多糖的提取通常采用水煮醇沉的常规方法。蛹虫草多糖提取一般先用乙醚脱脂,再经热水提取、乙醇沉淀得粗多糖。不同研究者用的提取方法不同,所得粗多糖得率也不同。
季晖等取人工虫草菌丝干粉200g,经10g乙醇、7g乙醇索氏提取后,残渣用热水反复提取(10h×5次),提取液对自来水透析2天,再对无离子水透析2天,合并未透析部分稍加浓缩后,加入2倍体积的乙醇,离心收集乙醇沉淀,沉淀物用水洗涤浓缩后真空干燥,即得粗多糖(CHWc),产率6.67%。
马成坚等取蛹虫草胶囊粉末100g,置于索氏提取器中,加无水乙醚100ml于圆底烧瓶中,连续回流提取至无色。药渣风干后用8倍量沸水回流提取2次,每次30min,趁热过滤,合并滤液,并将滤液浓缩至15ml,加乙醇至含醇量80%,于冰箱中静置过夜,离心过滤,并加0.2%活性炭脱色。沉淀分别用无水乙醇、丙醇依次洗涤3次,每次5ml,置60℃烘干,得灰白色粗多糖,得率4.9%。
姚桂卿等取无杂菌的蛹虫草发酵物压滤,将菌丝体与发酵液分开,菌丝体加5倍体积的水,90～95℃浸煮10h,浸煮4～5次,浸煮液抽滤,滤液合并,减压浓缩至一定体积,离心弃去滤渣,向上清液中加3倍体积95%乙醇沉淀过夜,离心,收集沉淀,加丙酮、乙醚反复洗涤,然后置真空干燥器中抽真空干燥,得粗多糖黄色粉末,得率2.8%。
1.2 提取工艺优化
余晓斌等以常用的乙醇沉析法从乙醇添加量、pH值及时间3个因素对虫草多糖的提取工艺进行了优化,利用SAS分析软件得出回归方程,并进行了响应面分析从而得出虫草多糖的最佳提取工艺。即乙醇/发酵液(V/V)为3.8/1,醇析时间为11.7h,pH为7.65,结果虫草多糖醇析量为11.35g/L发酵液。他们在该实验中发现乙醇添加量对多糖沉析的影响最大,其次是pH值,且当pH值为7.65时沉淀量最大,这可能是与虫草多糖分子带电荷有关,所以可以通过调整乙醇添加量、沉析时间及pH使虫草多糖的沉析达到最佳化。
2 蛹虫草多糖的结构分析
虫草多糖(CMPS)是蛹虫草中的重要的活性物质,国内外科研人员对蛹虫草多糖的结构研究较多。不同研究者测得虫草多糖的结构略有差异。
宫崎等提取的水溶性虫草多糖,是一种高度分支的半乳糖甘露聚糖,主链为由α(1→2)糖苷键连接的D-呋喃甘露聚糖,支链含(1→3)、(1→5)和(1→6)糖苷键连接的D-呋喃半乳糖基以及(1→4)键连接的D-吡喃半乳糖基,非还原性末端均为D-呋喃半乳糖和D-吡喃甘露糖。
苏普等在藏药研究中报道从冬虫夏草中分离出两种多糖:一种分子量约为23kD组成的D-甘露糖和D-半乳糖,其分子比为3:5。另一种分子量约为43kD,单糖组成为甘露糖、半乳糖、葡萄糖等,比例为10.3:3.6:1。
Yua等(2004)从子实体水提液中分离得到3种蛹虫草多糖,其组成分别为:CPS21为鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖(1:6143:2516:1610:1318);CPS22为鼠李糖、葡萄糖、半乳糖(1:4146:2143);CPS23为只含葡萄糖的均一多糖。3种多糖的分子量分别为213×104D、1129×104D和510×103D;CPS21主要含有p糖苷键,CPS22和CPS23主要含有a糖苷键。Yu等(2004)又分离到一种分子量为213×104的多糖,并证明有生物活性。
3 蛹虫草多糖的药用保健功能
3.1 调节免疫系统作用
蛹虫草的免疫作用主要与虫草多糖有关,研究表明虫草多糖的不同组分均能增加小鼠的胸腺和脾脏的重量,提高机体的体液与细胞免疫。蛹虫草的胞内、胞外多糖均能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数,其吞噬功能的增强代表着机体非特异性免疫的增强。此外,虫草多糖还能显著增强小鼠血清溶菌酶活力,提高小鼠肝红细胞SOD酶活力,促进红细胞C3b降。虫草多糖对人外周血淋巴细胞具有双向免疫调节作用。
3.2 抗氧化、抗衰老作用
研究证实,虫草多糖能促进SOD酶活力,具有明显抗衰老作用,对老年性痴呆的有效率为37.14%,明显优于维生素E;同时能提高老龄大鼠SOD、GSH-Px (谷胱甘肽过氧化物酶)活性和明显降低体内脂质过氧化物含量,从而提示虫草多糖的抗衰老作用是通过抗氧化作用实现的。
3.3 抗肿瘤作用
多糖类物质是蛹虫草的重要活性物质之一,近来研究发现虫草多糖对网状皮系统及巨噬细胞有明显激活作用,能促进淋巴细胞的转化,是一种非特异性免疫增强及调节剂,可激活机体的免疫活性细胞,特别是淋巴细胞及淋巴因子、单核巨噬细胞系统和NK细胞等,从而攻击靶细胞,发挥抗肿瘤作用。主要是虫草多糖能促进免疫细胞的增殖、分泌,增强免疫细胞的功能,通过宿主介导而发挥抗肿瘤的作用。蛹虫草抑制肿瘤的机理已取得初步的研究结果。Yoo等(2004)发现,蛹虫草发酵菌丝提取物通过影响相关基因的表达来抑制血管的形成,从而抑制黑色素瘤的生长。Park等(2005)研究表明,蛹虫草水提液能通过诱导细胞凋亡使白血病细胞U937的生长受到抑制,最终抑制肿瘤细胞的生长。
3.4 抗炎作用
炎症是机体活组织对损伤因子所发生的防御反应,早期即表现为毛细血管通透性增高而引起的炎症渗出和肿胀等反应,虫草多糖(CMPS)对巴豆油所致耳肿胀和醋酸所致毛细血管通透性的增高均有显著抑制作用,证明其具有良好的抗炎作用。主要是虫草多糖(尤其是菌类多糖)能够调节免疫细胞间信息的传递与感受,细胞的转化、分裂及再生等活动,具有抗炎作用。
4 虫草多糖的主要应用
4.1 医药制剂
依据虫草多糖的药理作用,人们正在进一步研究及挖掘它在医药、保健食品等各个方面的价值。由于虫草多糖具有抗肿瘤作用、抗放作用、增强机体免疫力、抗免疫损害性大鼠肝纤维化作用、治疗肝的病毒性感染和降血糖等多方面药理作用,虫草多糖被提取制成各种医疗药剂。
4.2 保健食品
在保健食品方面,虫草多糖也有所应用。张雁等以功能性甜味剂和营养性食品凝胶剂为载体,引入虫草的提取液,通过合理的制作工艺,制成了低热量、具有保健功能的虫草高级果冻和新型虫草保健软糖。
5 结论
蛹虫草作为我国传统名贵的强壮滋补品,在历史上很早就引起重视和应用,近年来由于国家的重视和商业经济的需求,对蛹虫草的研究、生产和应用取得了迅速的发展。蛹虫草多糖作为虫草中含量最高的生理活性物质,也是其主要活性成分之一。所以随着对蛹虫草多糖研究的不断深入,利用蛹虫草多糖开发的功能性食品添加剂、保健品或药品的市场前景为人们所看好。为研究出有利于人民身体健康的、经济效益高的蛹虫草多糖的深加工产品,就需要我们广大的生物学家、食品科学家和医学家的共同努力,来带动整个多糖研究的快速发展。
参考文献
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蛹虫草多糖 篇2
关键词：蛹虫草；配方培养基；虫草素；腺苷；多糖；虫草酸
中图分类号：S567.3+50.1文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0351-02
蛹虫草别称北冬虫夏草、北虫草等，是冬虫夏草的近缘种，也是虫草属真菌的模式种[1]，其活性成分和医疗保健功效与冬虫夏草相近。冬虫夏草由于生境特殊、寄主单一、产量较低，加之人工培育技术难以突破，市场价格高昂。蛹虫草可以进行人工培育，其主要活性成分有虫草素、腺苷、多糖、虫草酸，特别是虫草素含量远高于冬虫夏草[2]，在药理或临床试验中可作为冬虫夏草的替代品。蛹虫草人工培养方式有固体培养、液体发酵、有蚕培养、蛹培养，还有用大米、小麦代料栽培或添加微量元素等，并在一些地区形成规模，但培育的蛹虫草活性成分含量不高。目前，以提高蛹虫草活性物质含量为指标，对蛹虫草发酵条件的优化研究从未间断，也取得了很大进展[3-5]。本研究采用固体培养，以蚕蛹作为基础培养基，适量添加黄豆、玉米糁、蛋白胨，比较不同配方对蛹虫草中虫草素、腺苷、多糖、虫草酸含量的影响，以期为蛹虫草活性物质含量研究奠定基础。
1材料与方法
1.1材料与试剂
菌种：蛹虫草H-3麦粒菌种，江苏食品药品职业技术学院食品与营养工程学院食用菌课题组自行培育。
材料：蚕蛹（江苏省淮安市丝织厂），蛋白胨（生化试剂，国药集团化学试剂有限公司），黄豆、玉米糁购自江苏省淮安市农贸市场。
药品与试剂：磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸钙、葡萄糖、D-甘露醇、高碘酸钠、乙酸铵、冰醋酸、无水乙醇、苯酚、98%浓硫酸、磷酸氢二钾、四氢呋喃等均为分析纯，培养用水为自来水，分析用水为双蒸水。虫草素对照品、腺苷对照品由上海化学试剂公司进口分装。
1.2仪器设备
培养设备：高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，恒温培养箱；样品处理设备：电热恒温鼓风干燥箱，粉碎机，台式离心机，电子天平，微波炉等；检测设备：美国Waters高效液相色谱仪系统（600Epump，600controller，2487紫外检测器，In-lineDegasserAF在线脱气机，Empower色谱数据管理系统）。
1.3方法
1.3.1培养基配制配方1：蚕蛹200g（蚕蛹干质量100g，按50%折算，下同），加1.5%硫酸钙，0.1%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，2%红糖，5mL水。配方2：蚕蛹140g，黄豆30g（蚕蛹与黄豆质量比为7∶3），加1.5%硫酸钙，0.1%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，2%红糖，45mL水。配方3：蚕蛹120g、黄豆40g（蚕蛹与黄豆质量比为6∶4），加1.5%硫酸钙，0.1%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，2%红糖，60mL水。配方4：蚕蛹100g、黄豆50g（蚕蛹与黄豆质量比为5∶5），加1.5%硫酸钙，0.1%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，2%红糖，75mL水。配方5：蚕蛹140g、玉米糁30g（蚕蛹与玉米糁质量比为7∶3），加1.5%硫酸钙，0.1%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，2%红糖，30mL水。配方6：蚕蛹120g、玉米糁40g（蚕蛹与玉米糁质量比为6∶4），加1.5%硫酸钙，0.1%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，2%红糖，40mL水。配方7：蚕蛹190g、蛋白胨5g（蚕蛹与蛋白胨质量比为95∶5），加1.5%硫酸钙，0.1%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，2%红糖，10mL水。配方8：蚕蛹180g、蛋白胨10g（蚕蛹与蛋白胨质量比为9∶1），加1.5%硫酸钙，0.1%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，2%红糖，20mL水。
1.3.2接种培养将配制好的培养基于115℃灭菌90min，冷却。在超净工作台上按无菌操作要求接入蛹虫草H-3菌种，每瓶接6粒麦粒菌种，置培养箱中于25℃下培养，培养结束后将培养物于60℃烘干，粉碎待测。
1.3.3样品处理采用微波法提取样品[6]。称取一定量样品粉末，用水作提取介质，料液比1∶100，经微波法辅助提取，并将提取液离心得上清液，備用。
1.3.4虫草素与腺苷测定采用HPLC法测定蛹虫草虫草素与腺苷[6]，上清液经0.2μm微孔滤膜压滤，色谱条件为：WatersNova-pakC18（3.9mm×300.0mm，4μm）；流动相为KH2PO4-K2HPO4+1%（体积分数）四氢呋喃缓冲液，pH值为6.86，流速为1.0mL/min，检测波长260nm。虫草素标准曲线回归方程为y=3.10×106x-1.34×104，r=0.9999；腺苷标准曲线回归方程为y=3.55×106x-5.72×103，r=0.9999；式中y为色谱峰面积，x为虫草素或腺苷的进样量。
1.3.5蛹虫草多糖测定蛹虫草多糖测定采用苯酚-硫酸法[7-8]。多糖在酸性条件下水解成葡萄糖等单糖，用葡萄糖配制系列标准溶液，于490nm处测定吸光度，得到葡萄糖含量（C葡萄糖）与吸光度（D）的回归方程：D=7.3542C葡萄糖+0.0532，r=0.9996。
1.3.6虫草酸测定采用高碘酸钠比色法测定虫草酸[9]。虫草酸的化学成分为D-甘露醇，用甘露醇配制系列标准溶液，于420nm处测定吸光度，得到甘露糖含量（C甘露糖）与吸光度（D）的回归方程：C甘露糖=104.5500D+0.3012，r=0.9999。
2结果与分析
2.1不同配方培养基对蛹虫草虫草素含量的影响
nlc202309032136
蚕蛹营养丰富，蛋白质含量高，而且蛋白质中氨基酸种类齐全，可直接作为蛹虫草生长的培养基。由表1可知，试验所用8种培养基均适合蛹虫草生长，虫草素含量也较高，其中配方5下蛹虫草虫草素含量最高，达4.75mg/g。配方5和配方6虫草素含量差异显著，配方5、6与配方1、2、3、4、7、8虫草素含量差异极显著。从表1还可见，配方5、6、7、8虫草素含量大于配方1，说明在纯蛹培养基中添加适量玉米糁、蛋白胨有利于虫草素积累；配方2、3、4虫草素含量小于配方1，说明在纯蛹培养基中添加黄豆未能提高蛹虫草虫草素含量。
2.2不同配方培养基对蛹虫草腺苷含量的影响
由表2可知，配方1下蛹虫草腺苷含量最高，达0.55mg/g，其次为配方5，配方8下蛹虫草腺苷含量最低。配方1、5與配方2、3、4、6、7、8腺苷含量差异极显著。试验表明，在纯蛹培养基中添加黄豆、玉米糁、蛋白胨均未能显著提高蛹虫草腺苷含量。
2.3不同配方培养基对蛹虫草多糖含量的影响
表3显示，配方4下蛹虫草多糖含量最高，达75.67mg/g，配方8下蛹虫草多糖含量最低。配方2、3、4和配方1、5、6、7、8多糖含量差异极显著，配方5、6和配方1、7、8多糖含量差异极显著，说明在纯蛹培养基中添加适量黄豆、玉米糁有利于蛹虫草多糖的产生和积累。
2.4不同配方培养基对蛹虫草虫草酸含量的影响
由表4可知，配方4下蛹虫草虫草酸含量最高，达76.73mg/g，配方3下蛹虫草虫草酸含量最低。配方4和其他配方下的虫草酸含量差异极显著。
3结论与讨论
本研究对不同配方培养基处理下的蛹虫草中虫草素、腺苷、多糖、虫草酸含量进行了比较。结果表明，配方5（蚕蛹与玉米糁质量比为7∶3）下蛹虫草虫草素含量最高，说明在纯蛹培养基中添加适量玉米糁可显著提高虫草素含量；在纯蛹培养基中添加适量黄豆、玉米糁有利于蛹虫草多糖的产生和积累；配方4（蚕蛹与黄豆质量比为5∶5）下蛹虫草虫草酸含量最高。综上，以纯蛹为基础培养基，添加适量黄豆、玉米糁、蛋白胨有利于蛹虫草虫草素、多糖、虫草酸含量的提高。但在该试验条件下，腺苷含量没有显著提高。如要提高腺苷含量，还须进一步研究。
蚕蛹营养价值高，可直接作为蛹虫草的培养基，添加适量黄豆、玉米糁后培养基碳氮比更加合理，有利于蛹虫草活性物质产生和积累。如果再配合其他育种技术，会使活性成分总量得到进一步提高。在纯蛹培养基中添加其他成分能否进一步提高蛹虫草中虫草素、腺苷、多糖、虫草酸含量，还须深入研究。
参考文献：
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蛹虫草子实体多糖的分离纯化 篇3
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
蛹虫草(Cordyceps militaris L.Link)C19子实体由深圳澎源生物科技有限公司提供。
1.1.2 试剂:
木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白为Sigma试剂;Sephadex G-100 为Pharmacia进口分装试剂;其它试剂均为国产分析纯。
1.1.3 仪器:
5810R高速冷冻离心机,MP502B电子天平,2×60cm层析柱。
1.1.4 培养基:
大米培养基。
1.2 方法
1.2.1 多糖测定:
苯酚-硫酸法。多糖总量的测定根据文献[6,7]进行。多糖得率(%)=0.9×(总糖百分含量-还原糖百分含量)×100 %,其中0.9为葡萄糖换算为多糖的系数。
1.2.2 多糖除色素实验:
扫描粗多糖溶液的紫外-可见吸收光谱,结果表明溶液没有最大吸收波长,在445 nm有较高吸收值,且溶液脱色前后均为橙黄色,故从互补色考虑选取445 nm作为检测波长。
1.2.3 多糖醇析实验:
多糖浓缩后用乙醇沉淀。选定影响多糖得率的3个主要因素进行正交实验(表1)。于4℃醇析,以10 000r/mim离心10min,挥发干乙醇,溶解沉淀,测定多糖得率,确定最佳醇析条件。
1.2.4 多糖除蛋白实验:
粗多糖溶液经95 %乙醇沉淀、无水乙醇洗涤后,用丙酮搅拌洗涤30min,以3 500r/min 离心10min,沉淀再用乙醚搅拌洗涤30min,除去乙醚,沉淀溶于适量的纯水配成多糖溶液后,进行除蛋白处理。采用考马斯亮蓝G250法测蛋白质,以牛血清白蛋白为标准蛋白。
1.2.4.1 Sevag法:
将氯仿:正丁醇配按4:1(V/V)混合,即为Sevag试剂。法Ⅰ:将粗多糖溶液与Sevag试剂按3:1(V/V)混合,充分振荡抽提30min,10 000r/min离心10min,上层为脱蛋白的多糖溶液。重复3～7次,分别取上清液测蛋白质和多糖含量。法Ⅱ:充分振荡抽提1h,11 000r/min离心20min,其它操作同前。
1.2.4.2 蛋白酶法
(1)单因素实验
将木瓜蛋白酶与粗多糖溶液按体积比1:15混合,于60℃分别酶解1h、2h、3h、4h,沸水浴5min灭活,用95%乙醇于4℃醇析24h,测定蛋白质和多糖含量。
将酶与激活剂等体积混合,室温激活25min,测蛋白质含量;将酶与多糖溶液按1:10混合,于60℃分别酶解0.25h 、0.5h、1h 、2h、3h、4h、6h,其它操作同前。
(2)正交实验
选定影响蛋白去除率的三个因素进行正交实验(表2)。
1.2.4.3 蛋白酶法结合Sevag法
粗多糖经激活15min的木瓜蛋白酶于55℃、1:15、处理2h后,再经Sevag法处理2次,分析脱蛋白率与多糖损失率。
1.2.5 乙醇分级沉淀
透析后的样品加无水乙醇至终浓度为50%,于4℃醇析3.5h,10 000r/min离心10min,收集沉淀,为50%醇析样品;离心后收集的上清液加无水乙醇至终浓度为80%,于4℃醇析27h,10 000r/inm离心20min,收集沉淀,为80%醇析样品。
1.2.6 Sephadex G100 柱层析法
50%醇析样品复溶,上样,流速为4ml/10min/管;80%醇析样品复溶,上样,流速为4ml/10min/管;样品全部进入柱后开始洗脱并收集。
2 结果与分析
2.1 多糖除色素实验结果
多糖溶液经201×7树脂脱色后颜色变淡,吸光值降低。同一温度下保温时间越长脱色率越高,60℃脱色9h脱色率最高(表3)。
2.2 多糖醇析实验结果
多糖醇析正交实验结果见表4。影响多糖得率的因子顺序为:乙醇浓度A>乙醇与样品比例C>醇析时间B。最优条件为A2B2C2(无水乙醇、24h、4倍乙醇)。考虑后者到成本问题,追加了95 %乙醇的实验。结果表明,两者多糖得率接近且更高,故醇析可选定95%乙醇、24h、4倍乙醇进行。
2.3 多糖除蛋白实验结果
2.3.1 Sevag法除蛋白结果
Sevag试剂振荡抽提30min结果表明(图1),操作6次除蛋白率可达84.09%,但多糖损失率在第3次已达44.77%。Sevag试剂振荡抽提1h 结果表明(图2),操作3次除蛋白率即可达到81.14%,之后除蛋白效果不明显,操作6次除蛋白率达到84.47%;抽提3次多糖损失率为27.03%,抽提6次多糖损失率达到43.16%。Sevag法除蛋白较彻底,但多糖损失率也高,操作3次后除蛋白效果不明显,可能溶液中Pr量太微,沉淀离心后极易再次进入溶液;振荡30min与60min差别不大。比较表明,用Sevag试剂振荡抽提1h,除蛋白3次即可。
2.3.2 蛋白酶法
单因素实验中,木瓜蛋白酶不激活(图3)或采用激活剂激活(图4)除蛋白率都不高,但后者多糖提取率远高于前者。
正交实验结果表明(表5),最优条件A3B3C2(70 ℃、1:10、2h);影响因素顺序为:反应温度>酶与样品比例>处理时间。
2.3.3 蛋白酶法结合Sevag法
样品经木瓜蛋白酶处理后再用Sevag法处理,除蛋白率比单独采用酶法高但比单独采用Sevag法低(图5)。
2.4 多糖柱层析结果
50%醇析样品经Sephadex G100柱层析后得到两个多糖吸收峰,其中第一个吸收峰多糖含量高,且与蛋白质吸收峰重叠,说明多糖与蛋白可能没有完全分开,需进一步纯化;亦可能为含蛋白多糖;第二吸收峰多糖含量低,且在280nm没有吸收峰,不含蛋白质,可收集进行后续实验。80%醇析样品经Sephadex G100柱层析后得到一个多糖吸收峰,与蛋白质峰有部分重叠,说明多糖与蛋白可能没有完全分开,需进一步纯化,亦可能为含蛋白多糖。
3 讨论
蛹虫草粗多糖含色素、蛋白质、脂质等杂质,要对多糖特性、药理等进行研究首先要除掉上述杂质,并进行精制纯化。文献报道以DEAE纤维素纯化[4,9,10]或将DEAE纤维素与Sephacryl S-100 HR、 Sephacryl S-400柱层析法结合纯化[3,8],均得到较好纯化效果。Rongmin Yu,et al[2]将蛹虫草多糖经50%乙醇沉淀、Sephadex G100柱层析分离得到4种成分。本研究先经50%、80%乙醇分级沉淀得2种粗多糖成分,再分别采用Sephadex G100柱层析,可将粗多糖纯化为较纯的3种成分,方法简便易行,纯化效果较好,纯化周期缩短、成本相对降低。而分离出的3个峰具体成分及性质有待进一步研究。
参考文献
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蛹虫草多糖 篇4
关键词：北冬虫夏草；亚硒酸钠；硒含量测定；生长曲线
中图分类号 TS213.2 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）19-0037-02
Abstract：The selenium- enriched Cordyceps was screened， and the mutant Cordyceps 1 was obtianded. Fermentation conditions were investigated，the concentration of sodium selenite resistant 12μg/ml.Under the optimized conditions， the selenium content of the cells was up to 12.01g/L，Se amount was up to4.635μg/ml， selenium-riched rate was up to 385.92μg/g. The growth curve of cordyceps shows when the incubation time was about 72h， the biomass is the largest and the effect of selenium- enriched is the best.
Key words：Cordyceps；Selenite；Determination of selenium content；Growth curve
北冬虫夏草（蛹虫草）生活史的有性阶段包括菌丝体生长和子实体生长[1]。鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫幼虫把蛹草拟青霉的孢子食入体内，还可以自由活动，即为“冬虫”，当条件适宜时，孢子便萌发形成菌丝体，菌丝体吸取虫蛹的营养作为其生长发育的物质和能源[2]。
硒是人体必需的微量元素之一，研究发现，硒尤其是有机硒具有预防心脑血管疾病、抗肿瘤、提高免疫力、促进人体生长发育等作用，人体缺硒会导致多种疾病。据硒盐的毒理分析表明，无机硒均为剧毒，且不易被人体吸收，而有机硒化合物毒性远低于无机硒化合物，且生物利用率高[3]。通过人工方法将无机硒转化成有机硒，具有普遍的食用和保健价值。无机硒在虫草体内通过菌丝细胞内物质的代谢，结合到大分子活性物质（如多糖和蛋白质）上，转化为有机硒多糖和硒蛋白，从而发挥了硒和虫草固有的以及协同的生理作用，使其具有无毒、安全、高效的生理活性，进而为开发天然的富硒蛹虫草提供科学的理论依据[4]。
1 材料与方法
1.1 菌种与试剂
1.1.1 菌种 供试蛹虫草（Cordyceps militaris）为本实验室保藏菌种，各菌株编号：蛹虫草1，蛹虫草2，蛹虫草3。
1.1.2 试剂 土豆，黄豆，玉米粉（均购自同达森客超市）；葡萄糖，果糖，麦芽糖，蔗糖，磷酸二氢钾，硫酸镁，硝酸铵，氯化铵，硫酸铵（均为分析纯），蛋白胨，酵母粉，实验室已具有。酵子：玉米面活性干酵母。
1.2 仪器与设备 KDM型控温电热套（山东鄄城华鲁仪器公司），生化培养箱（上海跃进医疗器有限公司，型号 SPX-250），手提式蒸汽灭菌器（江阴滨江设备有限公司），超净工作台（上海智诚分析仪器制造有限公司，型号 ZHJH-C1112B），恒温震荡培养器（上海智诚分析仪器制造有限公司，型号ZWY-100D）。
1.3 蛹虫草富硒菌株的选育 取0.2～0.3cm的三种菌种的组织块分别接种到亚硒酸钠发酵培养基，装液量150mL/250mL，置于19℃、130r/min的恒温培养振荡器中震荡培养72h，测定其发酵液中残留无机硒（残硒）的含量及其生物量[5]。
1.4 富硒蛹虫草发酵液的制备 将三角锥瓶中培养的液体移入离心管中，称重后等量对称放置在台式离心机中，以4 000r/min的转速常温离心30min，离心后的上清液即为发酵液[6]。
1.5 蛹虫草生物量测定 采用干重法，将三角锥瓶中培养的液体移入离心管中，称重后等量对称放置在台式离心机中，以4 000r/min的转速常温离心30min，倾去上清液，将固体放到称量纸上，置于精密电热恒温鼓风干燥箱中，100℃烘干至恒重，称量[7]。
1.6 硒标准曲线的绘制 参加文献[8]。
1.7 发酵液中残留无机硒（残硒）含量测定 参加文献[9]。
1.8 蛹虫草耐硒实验 参加文献[10-11]。
2 结果与分析
2.1 蛹虫草富硒菌株的选育
2.1.1 硒标准曲线的绘制 以亚硒酸钠浓度为横坐标，以420nm处的吸光值为纵坐标做图，得硒标准曲线（图1），其回归线性方程为y=0.0070x-0.0050。
2.1.2 富硒菌株的选育 从表1可以看出，在指标生物量的考察中蛹虫草1占优势，在指标富硒量的考察中蛹虫草1占优势，在指标富硒率的考察中蛹虫草1同样占优势。该实验表明，在同等实验条件下蛹虫草1富硒效果最好。
2.2 蛹虫草耐硒实验 表2显示了亚硒酸钠浓度对蛹虫草菌丝体的生长情况和富硒效果的影响。由表2可以看出，培养基中亚硒酸钠浓度的高低会影响蛹虫草的生长，随着亚硒酸钠浓度的增加，生物量呈下降趋势。亚硒酸钠有一定的毒性，当亚硒酸钠浓度低于12μg/mL时，它的加入虽然会影响蛹虫草的生长，但并不显著。当亚硒酸钠浓度超过14μg/mL时，蛹虫草的生物量急剧下降，表明蛹虫草在液体发酵培养基中耐硒浓度为12μg/mL。由表2还可以看出，随着培养基浓度的增加，蛹虫草菌丝体的富硒量越高，其富硒效果越好，然而当亚硒酸钠浓度达到14μg/mL时，发酵液由淡黄色变为粉红褐色，这可能是由于蛹虫草将亚硒酸钠转化为单质硒而不是转化为有机硒的缘故。当亚硒酸钠的浓度较高时（超过14μg/mL后），尽管富硒率继续增加，但富硒量与生物量已显著下降，因此，蛹虫草1摇瓶培养时的耐亚硒酸钠最大浓度为12μg/mL，此时蛹虫草1的生物量可以达到12.01g/L，富硒量达到4.635μg/mL，富硒率达到385.92μg/g。
2.3 蛹虫草生长曲线实验 图2、3显示了蛹虫草生物量与富硒量随培养时间变化的关系。由图2、3可以看出，当蛹虫草培养72h时，生物量与富硒量均达到最高值，培养时间从12h到72h，蛹虫草的菌丝体生物量与富硒量逐渐增加，而72h之后菌丝体的生物量和富硒量急剧下降，此时菌丝体出现了明显的萎缩、老化现象，而富硒量下降的原因还有待进一步研究。
3 结论
本文研究了蛹虫草的耐硒特征，结果表明，在摇瓶培养过程中，蛹虫草耐亚硒酸钠浓度为12μg/mL时，生物量达到12.01g/L，富硒量达到4.635μg/mL，富硒率达到385.92μg/g。
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蛹虫草多糖 篇5
真菌多糖的提取方法有传统热水浸提法、稀碱法、稀酸法、稀盐法、微波法和超声波法等, 其中超声波提取法, 相对于其他方法而言, 具有快速、溶剂用量少, 提取率高、节约能耗、成本低和质量高等优点, 而超声波技术应用于蛹虫草多糖的提取少见报道, 因此本文探讨了超声波功率、提取时间和水浸提温度对蛹虫草菌丝体多糖提取率的影响, 在此基础上使用正交设计的试验方法, 优化了多糖提取工艺。
1 试验材料和方法
1.1 材料和试剂
蛹虫草菌丝体自行发酵获得。葡萄糖 (AR) , 蒽酮, 硫脲, 硫酸均为国产分析纯。
1.2 主要仪器
YJ92-2D型超声波细胞破碎仪, 宁波新芝生物科技股份有限公司;UV-2800型紫外可见分光光度计, 尤尼柯 (上海) 仪器有限公司;BCM-1000型生物净化工作台, 苏州净化设备有限公司;YXQ-SG41-280型电热手提压力蒸汽消毒器, 上海医用核子仪器厂;LXJ-II型高速离心机, 上海医用分析仪器厂;FA1004型电子天平、CHA-S型数显气浴恒温振荡箱, 上海上天精密仪器有限公司;101-2型干燥箱, 上海市试剂厂;SPX-250型生化培养箱, 北京市永光明医疗器械厂;电热恒温水浴锅, 上海医疗器械五厂
1.3 培养基
种子斜面培养基:马铃薯20%, 葡萄糖2%, 蛋白胨1%, KH2PO40.05%, pH值自然。
自然液体种子培养基:马铃薯20%, 葡萄糖2%, 蛋白胨1%, KH2PO40.15%, MgSO40.05%, pH值自然。
发酵培养基:葡萄糖2%, 蛋白胨1.5%, KH2PO40.15%, MgSO40.05%, VB15mg/L。
1.4 菌丝体获得
用接种铲从活化后的菌种斜面上挑取大约1mm2大小的菌块置于盛有液体种子培养基的三角瓶中, 24℃培养, 摇床转数180r/min, 培养3d。将种子培养基中形成的菌丝球过滤掉, 按10%接种量置于发酵培养基中, 24℃培养, 摇床转数180r/min, 培养5d。将获得的菌丝液3 000r/min离心取沉淀, 于60℃干燥并研磨至粉末状。
1.5 多糖含量测定
本试验采用蒽酮硫酸法, 以葡萄糖为标准样品。
1.5.1 标准曲线的制备
准确称取0.01g葡萄糖, 用蒸馏水定容至100mL, 从中吸取1、2、4、6、8和10mL分别移入100mL容量瓶中, 用蒸馏水定容, 即得1、2、4、6、8和10mg/L的葡萄糖系列标准溶液。分别吸取各标准葡萄糖溶液1mL, 并以蒸馏水作为空白, 各加入5mL蒽酮试剂, 摇匀, 沸水浴10min, 迅速冷却, 暗处放置10min, 之后在620nm处分光光度计测吸光度。以葡萄糖浓度为自变量 (x) , 620nm处吸光度为变量 (y) , 绘制标准曲线得回归方程为y=0.0654x-0.0449, R2=0.9910。
1.5.2 多糖含量测定
以蒸馏水为空白对照, 将超声波处理之后的各菌丝体多糖液定容至100mL, 从中吸取1mL, 加入5mL蒽酮试剂, 摇匀, 沸水浴处理10min, 迅速冷却, 在暗处放置10min, 之后用分光光度计在620nm处测定吸光度。从葡萄糖标准曲线上找出相对应的数值, 根据下面的公式计算出各多糖含量。
式中:w为样品多糖含量, mg/g;c为从标准曲线中查出的多糖含量, mg/L;v为样品定容后的体积, L;m为样品的质量, g。
2 试验结果与分析
2.1 超声波功率对虫草多糖得率的影响
准确称取0.1g菌丝体粉, 加入5mL水, 设超声波功率为50、150、250、350和400W, 超声波辅助提取全程时间10min, 工作时间2s, 间歇时间3s, 保护温度25℃, 提取液3 000r/min离心10min, 弃去滤渣, 定容至100mL, 蒽酮比色法测定多糖含量。由图1可知:超声波功率设定在50~150W时随着功率的增大, 超声波对细胞壁的破碎作用增强, 胞内多糖溶出速率增大, 溶液中的多糖含量也逐渐提高;在250~350W之间时, 随着超声波功率的增大, 多糖含量逐渐下降, 原因可能是由于功率过高, 多糖链断裂, 使多糖得率有所下降;在150W-250W之间时, 多糖含量变化不大, 从经济, 节能等方面考虑, 功率为150W为宜。
2.2 超声波提取时间对虫草多糖得率的影响
准确称取0.1g菌丝体粉, 加入5mL水, 超声波功率为150W, 全程时间设为5、10、15、20和25min, 工作时间2s, 间歇时间3s, 保护温度25℃, 提取液3000r/min离心10min, 弃去滤渣, 定容至100mL, 蒽酮比色法测定多糖含量。由图2可知:超声时间在前10min内, 多糖含量随着超声时间的延长而增加, 10min时达到最大值;当超声时间在10~25min时, 多糖含量已基本趋于平衡, 不再增加。因此, 超声波辅助提取的适宜时间为10min。
2.3 水浸提温度对虫草多糖得率的影响
准确称取0.1g菌丝体粉, 加入5mL水, 超声波功率为150W, 提取全程时间为10min, 工作时间2s, 间歇时间3s, 保护温度为25℃, 将超声波处理后的样品置于水浴锅中热水浸提, 水浸提温度分别设定为50、60、70、80和90℃, 提取液3 000r/min离心10min, 弃去滤渣, 定容至100mL, 蒽酮比色法测定多糖含量。由图3可知:在50~80℃温度的范围内提取时, 随着温度的升高, 多糖含量逐渐增加, 并达到最大值。之后温度上升, 多糖得率反而下降, 这可能是由于温度过高, 多糖链断裂, 使多糖得率有所下降。因此, 超声波辅助水浸提温度为10min。
2.4 正交试验确定超声波提取虫草多糖最佳工艺
在单因素试验的基础上, 采用了L9 (34) 正交试验对虫草多糖的超声提取工艺进行优化, 正交试验结果见表1。
由表1可知:A、B、C因素对提取虫草多糖的影响顺序为提取时间>提取功率>水浸提温度, 同时确定出超声波功率、提取时间、水浸提温度的较优组合为A3B3C2, 即超声功率200W、提取时间15min和水浸提温度80℃。
3 结论
(1) 超声波提取蛹虫草多糖的L9 (34) 正交试验结果表明:影响蛹虫草多糖超声波提取的主要因素为提取时间, 其次为超声波功率, 再次为水浸提温度。最佳工艺组合为超声波功率为200W、提取时间为15min和水浸提温度80℃, 在此工艺条件下, 测得提取液中多糖含量为10.61mg/g。
(2) 此工艺提取多糖的结构及对其生物活性的影响还需进一步研究。
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蛹虫草多糖 篇6
1 实验部分
1.1 材料、仪器与试剂
1.1.1 材料
蛹虫草废弃培养基, 陕西泾阳食用菌种植基地;澄清剂ZTC 1+1, 天津正天成澄清技术有限公司;标准牛血清白蛋白, 国药集团化学试剂有限公司。
1.1.2 仪器
R-201旋转蒸发仪, 上海申胜生物技术有限公司;7530分光光度计, 上海分析仪器总厂。
1.1.3 试剂
乙醇、氯仿、正丁醇、葡萄糖等, 分析纯, 国药集团化学试剂有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 蛹虫草废弃培养基多糖的提取
称取蛹虫草培养基粉末100g, 按照文献[4]上的最佳工艺条件提取, 提取液减压浓缩至小体积, 加入3倍体积95%乙醇沉淀, 静置, 抽滤, 收集沉淀物, 依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤三次, 真空干燥, 得蛹虫草废弃培养基多糖EPSⅠ。
1.2.2 蛹虫草废弃培养基多糖脱蛋白
1.2.2.1 Sevag法脱蛋白[5]
准确称取EPSⅠ2.140g于锥形瓶中, 加水10mL, 80℃加热溶解并过滤, 去除不溶物, 上清液放凉后定容至10mL, 用Sevag法除蛋白, 脱除4次, 离心, 收集上清液, 透析48h后, 再加入30mL 95%乙醇沉淀, 离心, 收集沉淀物, 依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤三次, 真空干燥, 得蛹虫草废弃培养基多糖EPSⅡ。
1.2.2.2 改良的Sevag法脱蛋白[6]
准确称取EPSⅠ2.100g于锥形瓶中, 加水10mL, 80℃加热溶解并过滤, 去除不溶物, 上清液放凉后定容至10mL, 用改良的Sevage法脱蛋白, 脱除4次, 离心, 收集上清液, 透析48h后, 再加入30mL 95%乙醇沉淀, 离心, 收集沉淀物, 依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤三次, 真空干燥, 得蛹虫草废弃培养基多糖EPSⅢ。
1.2.2.3 澄清剂法脱蛋白
准确称取EPSⅠ2.180g于锥形瓶中, 加水10mL, 80℃加热溶解并过滤, 去除不溶物, 上清液放凉后定容至10mL, 按待处理溶液的10%量加入浓度为1%的ZTC 1+1澄清剂。先加入A组分1mL, 60℃下加热 15min, 再加入B组分1mL, 80℃下加热 15min, 放凉, 离心, 收集上清液, 透析48h后, 再加入30mL 95%乙醇沉淀, 离心, 收集沉淀物, 依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤三次, 真空干燥, 得蛹虫草废弃培养基多糖EPSⅣ。
1.2.3 纯度鉴定[7]
分别称取EPSⅠ、EPSⅡ、EPSⅢ、EPSⅣ产品0.5g, 用蒸馏水溶解, 定容至50mL, 使用7530分光光度计对溶液于波长190～400nm处扫描, 以蒸馏水为对照, 检测样品中是否含有蛋白质。
1.2.4 蛹虫草废弃培养基多糖含量测定
1.2.4.1 标准曲线的绘制
精密称取105℃干燥0.5h后恒重的葡萄糖标准品100mg, 置于100mL容量瓶中, 加蒸馏水至刻度, 摇匀, 即得1mg/mL的标准溶液, 备用。
精密吸取标准溶液1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0mL, 分别置于100mL容量瓶中加蒸馏水至刻度, 摇匀。精密吸取上边各种溶液2.0mL, 分别加入6%苯酚溶液1.0mL摇匀, 加入5.0mL浓硫酸, 摇匀, 静至10min, 40℃水浴30min, 在490nm波长处测定各管的吸光度值。以葡萄糖浓度为横坐标, 吸光度值为纵坐标, 绘制标准曲线。进行回归处理, 得直线回归方程为:Y=-0.0611+10.97×X, R=0.9990。 式中:X代表浓度 (mg/mL) , Y代表吸光度值。
1.2.4.2 样品中多糖的含量测定
精确称取样品EPSⅠ、EPSⅡ、EPSⅢ、EPSⅣ各0.005g, 用水溶解, 定容至100mL容量瓶中, 精密吸取以上样品溶液2.0mL, 采用上述的苯酚-硫酸法在490nm波长处测定其吸光度值, 代入回归方程, 计算其多糖含量。
1.2.5 蛋白质含量测定
1.2.5.1 标准曲线的绘制
准确称取牛血清白蛋白0.102g, 加蒸馏水溶解后移至100mL容量瓶中定容, 制成蛋白储备液。分别吸取蛋白质标液1.0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0mL置于100mL容量瓶中, 用蒸馏水定容制成标准蛋白液。
称取考马斯亮兰G250 100mg溶于50mL95%乙醇中, 再加入100mL85%磷酸后移至1000mL容量瓶中, 用蒸馏水定容, 即为考马斯亮兰溶液。
分别吸取1mL标准蛋白液置于25mL比色管中, 加入5ml考马斯亮兰溶液, 混匀, 放置10min, 然后以蒸馏水为空白, 在595nm处测吸光度值。以蛋白浓度为横坐标, 吸光度值为纵坐标, 绘制标准曲线。进行回归处理, 得直线回归方程为:Y=9.18X-0.0502, R=0.9931。式中:X代表浓度 (mg/mL) , Y代表吸光度值。
1.2.5.2 样品中蛋白质的含量测定
精密吸取1.2.4.2制备的样品溶液1mL, 采用上述的考马斯亮兰法在595nm波长处测定其吸光度值, 代入回归方程, 计算其蛋白质含量。
2 结果与讨论
2.1 不同方法制得的多糖和蛋白质含量比较
不同方法制得的多糖和蛋白质含量如图1所示。
由图1可以看出, 与未处理的多糖相比, 各种处理方法都可以使多糖的含量有所提高, 提高的幅度分别是澄清剂法﹥改良的sevag法﹥sevag法。但是在多糖含量提高的同时也引起了多糖的大量损失, sevag法、改良的sevag法, 澄清剂法的多糖损失率分别是14.3%、18.1%、14.2%。改良的sevag法多糖的损失率最大, 可能是因为加入了一定的甲醇和无机盐, 使得大分子量的多糖沉淀出来;sevag法和澄清剂法的多糖损失率相当。从蛋白的去除情况看, sevag法、改良的sevag法, 澄清剂法的蛋白脱除率分别是80%、83.2%、91.3%。澄清剂法的蛋白脱除率最高。
以上的分析表明, 使用澄清剂法来处理蛹虫草废弃培养基多糖, 可以达到很好的脱蛋白目的, 脱除率达到91.3%, 多糖损失率最低。
2.2 纯度鉴定
多糖在波长190～400nm区间紫外-可见光谱扫描, 见图2。图谱显示未脱蛋白的样品在280nm处有明显的蛋白特征吸收峰, 经脱蛋白样品在190nm处有多糖特征吸收峰, 在280nm处没有明显的蛋白特征吸收峰。
3 结 论
Sevag法、改良的Sevag法和澄清剂法对蛹虫草废弃培养基多糖都能达到一定的脱蛋白效果, 脱除率分别为:80%、83.2%、91.3%;但多糖也有大量的损失, 损失率分别为:14.3%、18.1%、14.2%从以上数据比较这三种去除杂蛋白方法, 澄清剂法脱蛋白效果最好, 多糖损失率最低, 同时还避免了使用氯仿、正丁醇等大量的有机溶剂。
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蛹虫草中虫草素抗癌活性研究进展 篇7
虫草素是从真菌中分离出来的第一个脱氧核苷类抗生素。1951年, Cuninghum等发现蛹虫草寄生的虫体不容易腐烂, 于是对培养液进行研究, 从中分离出一种核苷抗菌素, 命名为虫草素。之后, Kaczka等从无冠构巢曲霉中也分离出该种物质。
虫草素, 亦称虫草菌素, 它是一种核苷酸, 由腺苷和脱氧戊糖组成, 因此也称为3’-脱氧腺苷, 属于嘌呤类生物碱, 它是针状或片状的结晶, 溶于水、热乙醇和甲醇, 不溶于苯、乙醚和氯仿, 熔点为230~231℃, 紫外光的最大吸收波长为260nm, 分子式为C10H13N5O3, 分子量为251Da, 其结构式如图1所示。
虫草素在体内大部分遵循嘌呤核苷代谢途径, 由于腺苷脱氨酶的作用, 虫草素脱氨基成为3’-脱氧次黄嘌呤核苷;另外, 有一小部分被磷酸化, 成为三磷酸虫草素。在小鼠纤维原细胞BALB/c-3T3的代谢试验中, 发现虫草素可能有两种磷酸化的方式:第一种是依赖于腺苷激酶, 第二种是伴随腺嘌呤核糖核苷酸的分解代谢发生的。
在上世纪60年代就已经发现, 虫草素具有抗疟原虫、抑制肿瘤以及抑制m RNA翻译的作用。在治疗急性前B、前T淋巴细胞白血病方面, FDA批准虫草素进入临床研究。虫草素的抗肿瘤作用引起了国内外研究者的广泛关注。
1 虫草素抗癌活性研究
虫草素作为蛹虫草主要活性组分之一, 其抗肿瘤效果在20世纪60年代就有报道证实。研究发现, 虫草素对多种癌细胞有明显的抑制作用, 如肝癌、肺癌、口腔鳞癌、宫颈癌、乳腺癌、黑色素瘤细胞等。
1.1 体外细胞实验
丁向萍等的研究已经表明, 虫草素对人肝癌Hep G-2细胞有明显抑制作用, 它改变了肝癌细胞的细胞周期, 使处于S期的细胞数增加, 并下调NF-κB p65的表达。此外, 虫草素也导致了肝癌细胞端粒酶的活性下降, 抑制了抗凋亡基因的激活, 使肿瘤细胞分裂或萎缩, 最终导致了细胞的凋亡。另外有研究者对不同浓度的虫草素抑制小鼠肝癌H22细胞增殖的研究, 发现虫草素对H22细胞具有明显的抑制作用, 且具有明显的剂量依赖性, 随着虫草素浓度的增大和作用时间的延长, 抑制作用增强。
虫草素除了抑制肝癌细胞, 在其他癌细胞株的试验中, 也表现出显著的抑制作用。张超等通过研究不同浓度虫草素对人肺癌细胞株A549的作用, 发现虫草素对A549表现出一定的增殖抑制作用。余伯成等研究发现, 虫草素对胰腺癌细胞具有一定的生长抑制作用。
雷坤通过研究虫草素对宫颈癌细胞He La, 乳腺癌细胞MCF-7, 小鼠肝癌细胞H22, 黑色素瘤细胞B16等的体外生长抑制作用发现, 虫草素对它们的增殖都有比较明显的抑制作用, 且存在剂量依赖关系。此外还现, 虫草素对不同细胞的抑制效果是不同的, 对耐阿霉素乳腺癌细胞MCF-7/Dox的抑制效果最明显。
1976年, Yamkaguchi等的研究就发现, 虫草素对癌细胞的抑制率达到55%, 而对正常细胞的生长抑制率仅为15%。当虫草素与环磷酰胺联用时, 虫草素辅助增强了环磷酰胺的抗肿瘤作用。Cho等的研究也证实了虫草素在抗肿瘤方面高效低毒的特性。
1.2 小鼠体内实验
在1960年, 有研究者就发现虫草素可以使欧立希腹水瘤小鼠存活时间延长。剂量研究的结果表明虫草素的剂量在15-200mg/kg (老鼠体重) 范围时, 小鼠存活时间可以增加。此外接种肿瘤细胞5天后, 以150mg/kg (老鼠体重) 的剂量给小鼠注射虫草素, 可以显著延长小鼠的存活时间。
1961年Jagger通过试验证实了虫草素可延长S180荷瘤小鼠的存活时间, 说明虫草素对肿瘤的生长具有一定的抑制作用。孙科峰等也以S180荷瘤小鼠为研究对象, 研究发现当研究者以600 mg/d的剂量连续灌胃S180荷瘤小鼠后, 肿块的生长被显著抑制, 存活时间也显著延长。杨企震、郭用庄研究表明, 多种癌症共49例经蛹虫草治疗后, 总有效率高达73.5%。
Yoshikawa等研究发现, 以15g/L浓度的虫草素灌胃黑色素瘤小鼠, 能显著抑制接种了黑色素瘤B16-BL6细胞小鼠的瘤块的生长, 抑制率达36%, 且未引起体质量下降和全身毒性, 表明虫草素在防治肿瘤方面非常安全.
此外, 吴洪臻等比较了虫草素和抗癌药物的抑瘤率, 并对它们的协同作用进行了研究, 用低剂量[30 mg/ (kg·d) ]和中剂量[60 mg/ (kg·d) ]的虫草素以及抗癌药物阳性对比环磷酰胺[20 mg/ (kg·d) ]作用S180荷瘤小鼠9天, 抑瘤率分别为45.72%、49.11%和55.91%。而将虫草素与环磷酰胺联合使用作用于S180荷瘤小鼠, 抑瘤率可提高到88.55%。结果表明, 虫草素对肿瘤细胞具有一定的抑制率, 且可以增强环磷酰胺的抗癌活性。
2 虫草素作用机制
虫草素有明显的抗癌作用, 但其机制还不确定, 目前认为, 虫草素的抗癌作用机制主要有诱导癌细胞凋亡、抑制细胞的增殖和转移、影响细胞信号传导途径等等。从虫草素是否直接作用于靶细胞来分, 主要分为直接抗癌机制和间接抗癌机制两大类。
2.1 直接抗癌机制
直接作用指虫草素通过抑制靶细胞的DNA、RNA和蛋白质的合成来直接作用于癌细胞。
Jagger认为虫草素抗癌的机理是虫草素含有一个游离的醇羟基, 该醇羟基可掺入到癌细胞作用于它的DNA, 从而抑制了癌细胞的核酸合成。彭俊峰等研究表明, 虫草素对DNA的作用方式可能存在两种方式, 即插入方式和与DNA的磷酸基团结合。
Chen等实验表明虫草素可致MET (一种存活基因) 的转录水平下降, 并可以使XIAP, bcl-2和survivin基因的表达下降。也有研究表明, 虫草素能够使m RNA的poly A的长度变短, 导致了m RNA在虫草素存在的情况下更容易被降解, 同时, 虫草素可以抑制纤维细胞NIH3T3的增殖;而高剂量的虫草素对m RNA的形成过程有抑制作用, 并影响癌细胞的附着能力。还有研究发现, 虫草素不仅可以抑制m RNA, 还对r RNA和t RNA有抑制作用。此外, 低浓度虫草素可以显著抑制He La细胞中r RNA合成, 且t RNA含量和细胞质中核不均一RNA含量均有降低。
2.2 间接抗癌机制
间接抗癌作用是指并不直接作用于靶细胞, 而是主要通过提高免疫, 增加药物敏感性, 或影响信号通路等, 使癌细胞得到控制。
Kim等证明了虫草素通过下调i NOS和COX-2基因的表达而抑制了NF-κB的活性以及Akt和P38的磷酸化作用, 刺激了巨噬细胞RAW264.7的活性, 从而控制癌细胞。Zhou等试验证实了虫草素能明显上调细胞产生IL-10和IL-10m RNA的表达, 不仅强烈抑制Thl型淋巴细胞和单核细胞的功能, 而且减少炎性介质和前炎症细胞因子的产生, 对自身免疫性疾病、炎性疾病发挥潜在的治疗作用。
虫草素的另一个作用机制是增加耐药细胞对药物的敏感性。Lsllas等用药物耐受的经典模型K562细胞观察聚腺苷酸化对凋亡的影响时发现, 虫草素与INF-α或5-Fu联用能够使耐受化疗药物的K562细胞对凋亡敏感.其主要是抑制Poly (A) 多聚酶 (PAP) 的活性。
此外也有研究证明, 虫草素的抗癌活性与细胞内的信号通路有关, 目前研究得比较多的信号通路有Akt/p38、NF-KB、AMPK。
虫草素的抗肿瘤作用与其自身结构也相关, 由于它与腺苷结构相似, 能够与腺苷形成竞争关系, 在一定程度上可以抑制肿瘤细胞DNA或RNA的合成, 从而起到抗肿瘤作用。
通过刺激免疫细胞, 增强细胞对抗癌药物的敏感性, 改变细胞内的信号通路, 以及利用竞争关系, 抑制肿瘤细胞的增殖等等, 提高机体对癌细胞的治疗作用。虫草素作为一种天然来源的抗肿瘤有效成分, 安全性高, 作用显著。
3 结语
虫草素具有多种生物学活性, 如抗肿瘤、抗白血病、免疫调节, 还具有抗菌、消炎、抗病毒、降血糖、降血脂、抗衰老等。目前其应用价值越来越被重视, 已引起全球科技发达国家的高度重视。对虫草素的提取、纯化以及测定的技术研究已经较为成熟, 但另一方面, 我们从蛹虫草中提取到的虫草素, 产量有限。培养高产虫草素的蛹虫草菌种或者通过人工合成虫草素还有待进一步研究。
在抗癌活性的研究方面, 很多体外和体内研究都已证明了虫草素具有抗癌活性, 虽然蛹虫草是传统的中医药材。但对比国内外研究现状, 国内的研究偏重于虫草素的提取、检测和蛹虫草的人工培养技术改进等方面, 对虫草素的突破性研究较少。此外, 虫草素对癌细胞作用的研究多集中在肝癌、肺癌、口腔鳞癌等, 对于其他癌细胞的作用还有待研究。
现代人们压力增大, 生活节奏过快, 人们的免疫系统的功能逐渐在减弱, 虫草素的多种生物活性对人的机体均具有显著作用, 因此, 无论是在医疗康复, 还是保健养生, 虫草素都将会拥有更大的应用市场。
摘要：虫草素是一种脱氧核苷类抗生素, 具有多种生物学活性。本文综述了国内外虫草素抗癌活性的研究现状, 主要概括了虫草素对癌细胞作用和虫草素抗癌机制的研究进展。虫草素的抗癌活性, 它有望成为临床可用的抗肿瘤药物, 但来源有限。
蛹虫草中虫草素的研究与开发进展 篇8
1 虫草素的药理作用
Cunningham等[2,3]于1951年发现昆虫组织如被蛹虫草寄生则不易腐烂,经研究从中分离出虫草素。之后,众多学者对虫草素进行了研究,证实虫草素具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、免疫调节、改善新陈代谢、清除自由基等作用[4,5]。Kodama等[6]研发的以虫草素为主要成分的新药已在临床上试用于白血病的治疗,具有良好的临床应用前景。目前虫草素的研究正成为药物化学、抗衰老、美容、保健品等领域中极其热门的一部分。
2 虫草素的开发
2.1 虫草素的生产
2.1.1 虫草素的固体发酵法。
虫草素虽然可以经生物合成获得,但由于反应时间长、产量低、排放大量对人体有害的有机溶剂而不常用,通过虫草菌丝体人工培养一直是国内外的研究热点。万涛等[7]通过正交旋转组合试验,确定蛹虫草固体发酵虫草素的最佳培养基配方为水料比1.1 m L/g,营养水中酵母膏的用量为22.6 g/L、蛋白胨的用量为6.0 g/L、葡萄糖的用量为25.4 g/L,KH2PO4的用量为2 g/L,Mg SO4的用量为0.5 g/L,营养水p H值6.6。通过正交试验,确定蛹虫草固体发酵虫草素的最佳环境条件为:光照强度4 400 lx,每日光照时间18 h,温度18~22℃。按照上述优化的培养基配方和环境条件进行固体发酵生产虫草素,经过大约13 d的培养,培养基中虫草素的含量可达到0.60%以上。与传统液体发酵方法相比,利用蛹虫草固体发酵虫草素的最高产量比普通液体发酵的最高产量高近2倍,并且生产周期缩短2 d。
2.1.2 虫草素的液体发酵法。
国内外虫草素的制备主要通过液体发酵法获取。MAO XB等主要从培养基质方面对利用液体发酵获取不同含量虫草素进行研究,发现以葡萄糖为碳源时虫草素产量最高,当葡萄糖的浓度为40 g/L时虫草素的产量可达到262.7 mg/L,当葡萄糖的浓度超过55 g/L时对虫草素的合成反而不利;以酵母提取物和蛋白胨的混合物为氮源,其比例为3∶1时虫草素产量可以达到最大;在培养基中添加铵离子的浓度为40 mmol/L时虫草素含量最大,当浓度超过160 mmol/L后虫草素的含量明显下降。万涛等[7]主要从培养条件方面对蛹虫草液体培养生产虫草素进行相关研究,发现p H值为4,培养方式为振荡培养8 d和静置培养16 d相结合,摇床转速为150 r/min,温度为25℃时虫草素的产量最高。DAS等[8]主要从菌种方面对虫草素的液体发酵进行相关研究,发现虫草素的分泌与菌株特性有很大关系,G81-3高产突变菌株在合适的培养基中虫草素的产量比传统野生型产量提高72%,达到8.6 g/L。
2.2 虫草素的分离及纯化
虫草素的分离纯化方法主要有离子交换树脂法、超临界萃取技术和活性炭吸附法。毛宁等[9]对利用离子交换树脂分离纯化虫草素的工艺条件进行了研究,发现选择合适的离子交换树脂对虫草素的分离纯化过程非常重要,选择吸附能力较强及吸附量较多的树脂可以有效提高蛹虫草中虫草素分离纯化的效率和产率。超临界萃取法是以CO2作为超临界流体对虫草素进行分离纯化,超临界技术具有操作温度低、分离效率高、无毒、无溶剂残留、无二次污染、不损害活性天然成分的结构等优点,但是这种方法所得虫草素的含量较低,成本较高[10]。Cuuningham等[2,3]采用活性炭对经过过滤的蛹虫草培养液进行吸附,再将培养液进行洗脱和浓缩,得到虫草素晶体。此种方法适用于分离水溶性物质,操作简单,成本低,但吸附选择性差,产率较低。
2.3 虫草素的分析检验
目前,主要采用薄层色谱法(TLCS)、高效液相色谱法(HPLC)、TLCS-HPLC联用法以及高效毛细管电泳技术(HPCE)对蛹虫草质量指标(甘露醇、虫草多糖和虫草核苷)进行测定。1994年刘静明等[11]采用薄层色谱扫描法(TLCS)分离和测定蛹虫草和冬虫夏草中的虫草素含量,发现冬虫夏草中尿苷、腺苷、腺嘌呤、虫草素、尿嘧啶含量分别为0.045%、0.031%、0.008%、0.007%、0.006%;蛹虫草菌丝中平均含量分别为0.048%、0.027%、0.009%、0.025%、0.009%,经过对比发现蛹虫草菌丝中虫草素含量和冬虫夏草中虫草素的含量相近。1994年解军等[12]采用高效液相色谱法(HPLC)定性定量测定天然冬虫夏草中虫草素含量,发现HPLC具有灵敏度高、重复性好,对流量和温度变化不敏感等优点,但其成本高。与之相比,TLCS灵敏度虽不及HPLC,却具有展开时间短,显色方便,价格较便宜等特点。因此,许多学者开始采用TLCS-HPLC联用法来获取虫草素,如贡成良等[13]采用薄层扫描分析和HPLC定量分析来测得蛹虫草子实体中虫草素含量,根据HPLC定量分析得知:冬虫夏草中虫草素的含量为1.036%±0.042%,人工蚕蛹虫草中虫草素的含量为3.059%±0.046%,蚕蛹虫草中虫草素的含量明显高于天然冬虫夏草[14,15,16]。
2.4 虫草素及其衍生物研发现状与前景
目前,美国已将虫草素作为抗癌、抗病毒新药尽心临床试用,我国也将其用于白血病的临床治疗中。当前以虫草素及其衍生物为原料的产品开发均是以蛹虫草子实体或菌丝体为原料的开发,主要在茶、酒、膨化食品、中药、口香糖、调味品等市场,以纯虫草素为原料的产品开发较少。因此虫草素及其衍生物有巨大的开发价值和广阔的市场前景[17,18,19]。
摘要：虫草素是冬虫夏草和蛹虫草中主要活性成分之一,具有抗菌消炎、抗肿瘤、降血脂、清除体内自由基等方面的药理作用。该文介绍虫草素的药理作用,并总结其开发研究进展。
蛹虫草多糖 篇9
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
蛹虫草子实体由大连生物技术研究所生产,自然干燥后60℃恒温干燥4h,用粉碎机粉成60目备用。大孔树脂(ML-7)购于上海摩速科学器材有限公司。
1.1.2 试剂
虫草素、腺苷标准品购于Sigma公司。无水乙醇、甲醇、盐酸、氢氧化钠等均为国产分析纯,购于沈阳市联邦试剂厂。
1.1.3 仪器
紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司UV1102);高效液相色谱仪(Agilent1100型);红外光谱仪(美国PE spectrum-400型);离心机(上海安亭科学仪器厂);超声波破碎仪(宁波新芝生物科技有限公司JY92-2D);微波炉(格兰仕MI-2270M型);多功能提取罐(上海顺仪科技EX-TE103型);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂RE-52AA型);真空冷冻干燥机(日本大川原制作所SF-02型)。
1.2 方法
1.2.1 色谱条件
色谱柱C184.6×250mm;Agilent 1100紫外可变波长检测器;波长259nm;流动相:水:乙腈=95:5;流速:1.2ml/min;柱温:30℃。
1.2.2 不同温度不同乙醇浓度提取虫草素和腺甘含量比较
分别取蛹虫草子实体粉末3g,按1:20的料液比加入到水、20%、40%、60%、80%、90%浓度的乙醇溶液中,分别在30℃、45℃、60℃、75℃四个不同温度下水浴搅拌提取2h,过滤,重复提取2次,合并滤液,65℃减压浓缩至10ml左右,离心,取上清液用HPLC测定虫草素和腺甘含量。
1.2.3 不同提取方法虫草素含量比较
1.2.3. 1 恒温水浴提取法:
分别取蛹虫草子实体粉末3g,按1:20的料液比加入到水、20%、40%、60%、80%、90%浓度的乙醇溶液中,在45℃恒温条件下水浴搅拌提取2h,过滤,重复提取2次,合并滤液,65℃减压浓缩至10ml左右,离心,取上清液用HPLC测定虫草素含量。
1.2.3. 2 超声波提取法:
分别取蛹虫草子实体粉末3g,,按1:20的料液比加入到水、20%、40%、60%、80%、90%浓度的乙醇溶液中,用超声波(超声功率200W)提取30min,过滤,重复提取2次,合并滤液,以下同上。
1.2.3. 3 微波提取法:
分别取蛹虫草子实体粉末3g,,按1:20的料液比加入到水、20%、40%、60%、80%浓度的乙醇溶液中,用微波(低档)提取1min,过滤,重复提取2次,合并滤液,以下同上。
1.2.4 大孔树脂处理方法
参照刘红锦等方法[5]进行处理。
1.2.5 虫草素纯化方法
1.2.5. 1 虫草素提取:
将蛹虫草子实体粉200g(过60目筛),放入5L的多功能提取罐中加入4 000ml 80%的乙醇溶液,在45℃的恒温条件下搅拌加热2h,过滤、沉淀部分重复提取2次,分批次浓缩提取液至无乙醇,离心除杂,水定溶至200ml溶液。
1.2.5. 2 加样、洗脱
在25℃条件下,将树脂柱底部的阀门打开流速调至1滴/s,树脂柱上层水滴至1㎝高度时,用滴管顺管臂慢慢地加入温度20~25℃的样品,做到不冲床,上样量视柱体吸附情况,当样品流到树脂柱底部2㎝左右时,用纯净水洗柱除去杂质,然后利用甲醇梯度(浓度在5%~20%之间,每5%为一个基点)洗脱溶液逐级洗脱,洗脱液2~3倍,收集甲醇洗脱液。
1.2.5. 3 收集、结晶
洗脱液用20ml试管收集,每管12~15ml,检测、收集有虫草素的部分,减压浓缩,4℃静止析出晶体,经无水乙醇重结晶及低温冷冻干燥,得虫草素晶体。
1.2.6 纯化虫草素样品和虫草素标准品的比较
1.2.6. 1 紫外光谱比较法:
分别称取5mg纯化虫草素晶体和虫草素标准品,用50%乙醇溶解,利用紫外分光光度计扫描二者的紫外吸收光谱,扫描范围为200~400nm,扫描精度为1nm,比较二者的紫外吸收光谱。
1.2.6. 2 红外光谱比较法:
分别取1mg纯化虫草素晶体和虫草素标准品,与100mg干燥溴化钾混匀、研细、压片,然后在波数为4 000~400cm-1下扫描,比较二者的红外光谱。
2 结果与分析
2.1 不同温度不同乙醇浓度提取虫草素含量比较
分别取北冬虫夏草粉3g,按1:20的料液比在不同温度、不同乙醇浓度条件下水浴提取,采用HPLC法测定其虫草素含量,结果见图1。
从图1结果可以看出,采取同一温度、不同乙醇浓度提取,对虫草素的含量影响较大,在0(水)到80%乙醇范围内,随着乙醇浓度的提高,虫草素的含量逐渐增大,乙醇浓度在80%时虫草素的含量最高,当乙醇浓度达到90%时虫草素的含量反而降低;而在乙醇浓度一定时,采取不同温度提取对虫草素的含量也有一定影响,但各试验组均以45℃提取的虫草素含量为最高。
2.2 不同温度不同乙醇浓度提取腺苷含量比较
不同温度不同乙醇浓度条件下水浴法提取腺苷含量比较,结果见图2。
从图2结果可以看到,采取同一温度、不同乙醇浓度提取,对腺苷的含量影响较大。其中,以水提取腺苷的含量为最高,随着乙醇浓度的提高(0~60%),腺苷的含量显著降低,45℃水提取的腺苷含量约为80%乙醇的36倍,而在60%至90%乙醇浓度提取的腺苷含量差别很小,由此可以看出腺苷易溶于水不易溶于高浓度乙醇。同时,从试验结果还可以看出,同一乙醇浓度(0~60%)不同提取温度(30℃、45℃、60℃、75℃)对腺苷的提取也有一定的影响,其中,在30~60℃时差别较小,而在75℃时则显著下降,说明高温(75℃)不利于腺苷的提取。
通过2.1和2.2的试验结果发现,在45℃、80%乙醇条件下提取,虫草素含量最高而腺苷含量很低,这样可以最大限度地除去与虫草素结构相近的核苷类成分如腺苷等的干扰有利于后期虫草素的纯化。所以,通过本试验确定了以45℃80%乙醇为虫草素最佳提取条件。
2.3 不同提取方法虫草素含量比较
分别采用恒温水浴(45℃)、超声波及微波提取法比较了不同浓度乙醇提取虫草素的含量差别,结果见图3。
图3结果表明,在相同乙醇浓度条件下,采取三种提取方法,以超声波法提取的虫草素含量最高,水浴提取法次之,微波提取法最差;而在不同乙醇浓度条件下,三种提取方法均以80%乙醇提取的虫草素含量为最高。虽然从本实验的结果看超声波法提取法的效果最好,但基于水浴和超声波提取法的虫草素含量差别很小,而且,从提取工艺的难易程度考虑,笔者认为还是以水浴提取法比较适合虫草素的规模化生产。
2.4 虫草素的纯化工艺研究
将45℃、80%乙醇提取的虫草素样品上样中极性ML-7大孔树脂,当样品流到树脂柱底部2㎝左右时,用纯净水洗柱除去杂质,然后再用5%~20%(每5%为一个基点)甲醇溶液进行梯度洗脱,流速控制在1滴/s,收集10%和15%洗脱液进行浓缩,置4℃静止析出晶体,晶体在适温条件下用无水乙醇溶解、低温重结晶,最后冷冻干燥成干粉。通过本工艺纯化出的虫草素样品与虫草素标准品比较,纯度达92%以上(见图4)。
2.5 纯化虫草素样品和虫草素标准品谱图比较
2.5.1 紫外扫描谱图比较:
将纯化样品和虫草素标准品分别用50%乙醇溶解,利用紫外分光光度计扫描二者在200~400nm的紫外吸收光谱,结果见图5。从扫描结果看,纯化样品和虫草素标准品的紫外扫描谱图一致,且均在259nm处出现最大吸收峰,这于文献报道的相同[6],说明纯化样品确为虫草素。
2.5.2 红外扫描谱图比较:
将纯化样品和虫草素标准品用溴化钾处理压片后,分别在4 000~400cm-1红外光谱区扫描,结果见图6。从扫描结果看,纯化样品和虫草素标准品的红外谱图的谱线特征一致,特征光谱规律相同,说明二者结构相同,为同一物质。
Note:Data of microwave extraction with 90%ethanol were invalid.
3 讨论
3.1 本研究通过对虫草素不同提取方法的比较,以超声波提取法的提取效果最好,这与张嘉等[7]的报道相似。但从工作难易程度考虑,笔者认为虫草素规模化提取工艺还是以恒温水浴法较为合适。
3.2 大孔树脂是一种兼具吸附性及分子筛作用的分离材料,根据其化学结构分为非极性、中极性和极性三大类。在大孔树脂的选择上,即要求对目的成分有较高的吸附性,还要保证吸附之后目的成分容易被洗脱下来。所以,大孔树脂和目的成分极性不能过于相似[8]。由于虫草素属于强极性的有机弱碱,而本实验选择的ML-7大孔树脂属于中极性,纯化的虫草素纯度达92%以上,这与上述报道有些相符。据陈淘报道,采用非极性H103大孔树脂纯化的虫草素纯度达44.5%以上[9]。所以,大孔树脂的极性以及树脂类型与虫草素的纯化效果究竟有怎样的关系,尚有待于进一步研究分析。
3.3 在利用大孔树脂纯化虫草素过程中,笔者发现有些树脂不吸附虫草素,因此,可以考虑将几种树脂联用,从而尽可能去除杂质,来提高虫草素纯度。
摘要：目的:优化从蛹虫草中提取、纯化虫草素的方法并鉴定其纯度。方法和结果:通过3种提取方法的比较,确定了以恒温水浴法作为虫草素规模化提取方法,最佳提取条件为45℃、80%乙醇;同时,确定了ML-7大孔树脂纯化虫草素的工艺,采用该工艺虫草素纯度可达到92%以上,并对纯化虫草素和标准品进行了比较鉴定。结论:该方法提取、纯化的虫草素纯度高,适于虫草素的规模化生产。
关键词：蛹虫草,虫草素,提取,大孔树脂,纯化
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