多糖测定

多糖测定（精选10篇）

多糖测定 篇1

氨基多糖用途十分广泛, 食品工业及医药界将其称为“第六要素”。其广泛应用于医疗、生物技术、化妆品、水处理、造纸、食品工程等领域。氨基多糖含量的测定也成为重要的课题, 现今其测定方法有很多种, 如乙酰丙酮法、USP法、HPLC衍生化法、紫外分光光度法 (UV法) 、硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法等。但都有其各自的特点, 找出一种最佳测定氨基多糖的方法具有重要意义。

实验部分

1. 实验试剂与药品

实验所需主要试剂如表1所示

2. 实验仪器

UV—754型紫外分光光度计。

3. 硫酸苯酚法

(1) 实验原理

苯酚法测定可溶性糖的原理是:糖在浓硫酸作用下, 脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物, 在10 mg~100 mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比, 且在490 nm波长下有最大吸收峰, 故可用比色法在此波长下测定。

(2) 标准曲线的制备

准确称取对照品100 mg, 制成2.00 mg/mL溶液于50 mL容量瓶中备用。然后分别准确称量, 取上述溶液2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL于50 mL容量瓶中, 加水至刻度 (相当于制备0.08 mg/mL、0.12 mg/mL、0.16 mg/mL、0.20 mg/mL、0.24 mg/mL的浓度) , 分别吸取上述溶液各2.0 mL, 再加苯酚试剂1.0 mL, 摇匀, 缓慢滴加浓硫酸5 mL, 摇匀后放置5 min, 置于沸水浴中加热15 min, 然后冷却至室温, 用分光光度计在490 nm处, 水作参比测定各溶液的吸光值。以吸光值为纵坐标、浓度为横坐标、绘制标准曲线, 求回归方程。

(3) 测定

取样品1 g (试样) , 称准至0.0001 g。用水溶解后移入25 mL的容量瓶中, 加水稀释至刻度。以下操作按本法“标准曲线的制备”中分别吸取上述溶液2.0 mL……规定执行。

(4) 回收率的计算

吸取试品溶液0.5mL, 分别加入标准葡萄糖溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL, 且分别置于25 mL试管中, 补水至2 mL, 以下操作按“标准曲线的制备”中加入6%苯酚1.0 mL……规定执行。

4. 硫酸蒽酮法

(1) 实验原理

糖在浓硫酸作用下, 可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛, 生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物, 在一定范围内, 颜色的深浅与糖的含量成正比, 故可用于糖的定量。

(2) 标准曲线的制备

精密量取对照品溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL, 分别置于25 mL量瓶中, 用蒸馏水定容、摇匀, 分别精密量取0.5 mL, 加4 mL浓硫酸, 摇匀, 5 min后加1 mL显色剂, 摇匀。置于100℃水浴加热10 min, 取出, 速冷至室温后, 以0 mL对照品溶液制备为空白试剂, 以600 nm为测定波长测定各浓度的吸光值。以吸光值为纵坐标、浓度为横坐标, 绘制标准曲线, 求回归方程。

(3) 测定

取样品1 g (试样) , 称准至0.0001 g。用水溶解后移入25 mL的容量瓶中, 加水稀释至刻度。以下操作按本法“标准曲线的制备”中分别吸取上述溶液0.5 mL……规定执行。

(4) 回收率的计算

吸取试品溶液0.5 mL, 分别各加入标准葡萄糖溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL, 分别置于25 mL试管中, 补水至2 mL, 以下操作按本法“标准曲线的制备”中分别吸取上述溶液0.5 mL……规定执行。

5. 乙酰丙酮法

(1) 实验原理

氨基葡萄糖在碱性条件下加热, 乙酰丙酮将氨基葡萄糖分子2号碳位上的氨基乙酰化, 生成带有吡咯环的N-乙酰衍生物。该衍生物与对二甲氨基苯甲醛反应, 反应物呈红色, 于525 nm处测定吸光度。其适用范围是氨基糖。

(2) 标准曲线的制备

分别精密量取100 mg/mL标准品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL置于20 mL比色管中, 另取试品溶液5 mL置于25 mL比色管中。各加水至5 mL, 再另取25 mL比色管一支, 加水5 mL作为空白。各加乙酰丙酮试剂1.0 mL, 摇匀, 置沸水浴中准确加热25 min, 取出, 用冰水浴迅速冷却后, 加无醛乙醇3.0 mL, 在60℃水浴中保温10 min后, 再加对二甲氨基苯甲醛试液1.0 mL, 强力振摇, 并继续在60℃水浴中保温1 h, 立即用冷水冷却至室温, 用分光光度计在525 nm处, 水作参比测定各溶液的吸光值。计算即得供测试样浓度。以吸光值为纵坐标、浓度为横坐标, 绘制标准曲线, 求回归方程。

(3) 测定

取样品1 g (试样) , 称准至0.0001 g。用水溶解后移入25 mL的容量瓶中, 加水稀释至刻度。以下操作按本法“标准曲线的制备”中各加乙酰丙酮试剂1.0 mL, 摇匀……规定执行。

(4) 回收率的计算

吸取试品溶液0.5 mL, 分别各加入标准葡萄糖溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL, 分别置于25 mL试管中, 补水至2 mL, 以下操作按本法“标准曲线的制备”中各加乙酰丙酮试剂1.0 mL……规定执行。

结果分析与讨论

1.硫酸苯酚法标准曲线

硫酸苯酚法标准曲线如图1所示:

其回归方程为y=2.4297x+0.0098, 多次测得被测试样的吸光值平均值为0.416, 对照曲线得其平均浓度为0.167 mg/mL, 其回收率为97.7%。

2.硫酸蒽酮法标准曲线

硫酸蒽酮法标准曲线如图2所示:

其回归线方程为y=4.1037x-0.0093, 多次测得被测试样的平均吸光值为0.765, 对照曲线得其平均浓度为0.186 mg/mL, 其回收率为96.5%。

3.乙酰丙酮法标准曲线

乙酰丙酮法标准曲线如图3所示:

其回归线方程为y=1.0771x-0.0011, 经多次测得被测试样的平均吸光值为0.176, 对照曲线得其平均浓度为0.170 mg/mL, 其回收率为95.8%。

4.讨论

(1) 对所得数据的讨论

硫酸苯酚法所测得的羟氨基葡聚多糖 (钠型) 含量最小, 乙酰丙酮法所测得的含量居中, 而硫酸蒽酮法所测得的含量最大。苯酚硫酸法方法简单、灵敏度高, 实验时基本不受蛋白质存在的影响, 并且产生的颜色稳定160 min以上。蒽酮-硫酸法几乎可以测定所有的碳水化合物, 所以用该法测出的碳水化合物含量, 实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。因此, 蒽酮硫酸法测定结果偏高于苯酚硫酸法。而乙酰丙酮法所测得的结果稳定性较好, 显色在10 min~30 min内, 稳定性较好。

(2) 试剂的比较

硫酸苯酚法和硫酸蒽酮法所用的硫酸均为分析纯, 如果不用分析纯则空白大。乙酰丙酮法中, 要用到无醛乙醇, 主要是由于乙酰丙酮是测定甲醛含量的主要试剂, 如果乙醇中含有醛基则影响测定结果, 但是无醛乙醇的制备需要很长的时间, 影响实验的效率。而硫酸苯酚法以及硫酸蒽酮法所用到的试剂都容易制备。蒽酮试剂易氧化、遇水后测定数值波动较大, 且几乎可以测定所有的碳水化合物, 所以用该法测出的碳水化合物含量, 实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。硫酸苯酚法的回收率:结果显示平均回收率是97.7%。在3种实验方法中最高。

(3) 试验方法的比较

结论

本实验所用的3种方法中, 硫酸蒽酮法所测结果数值偏大, 稳定性最差, 不是测定氨基多糖含量的最佳方法。而乙酰丙酮法测量数值较为准确, 稳定性也比较好, 但实验所需的无醛乙醇的制备较为复杂, 使得该方法操作繁琐。硫酸苯酚法方法简单、灵敏度高, 实验时基本不受蛋白质存在的影响, 并且产生的颜色稳定160 min以上, 是最佳的测定氨基多糖含量的方法。

多糖测定 篇2

茶多糖是一类从茶叶提取出来的与蛋白质结合在一起的酸性多糖或一种酸性糖蛋白，具有降血脂、降血糖、增强免疫力、抗辐射、降血压、抗血凝、抗血等功效，是一种极具应用和开发前景的天然产物，可广泛应用于食品、医药、保健等领域。

在茶叶的种植和加工生产过程中，大量粗老枝叶和茶叶灰末等副产品常被丢弃，另外由于人们在茶叶消费时追求茶叶的.档次，使得中低档茶叶滞销而挤压，造成了自然资源的巨大浪费。如果能从其中提取茶多糖作为保健食品的功能因子，则可变废为宝，为粗茶和中低档茶的综合利用开辟一条新的途径。

本试验通过对粗老茶叶中的茶多糖的提取与测定，为粗茶的深度开发和利用提供一定的依据。

1实验部分

1.1仪器和试剂

仪器:722型可见分光光度计(上海光学仪器)，KQ-500VDB双频数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司);超纯水机(南京易普易达科学发展有限公司);电子天平(赛多利斯利科仪器(北京)有限公司)等。

试剂:无水乙醇，蒽酮，浓硫酸，葡萄糖，丙酮，无水乙醚等，所用的化学试剂均为分析纯。

1.2茶多糖的提取

1.2.1工艺流程

粗老茶叶-烘干-研磨-温水浸提-过滤-浓缩-乙醇沉淀-静置-离心-无水乙醇、丙酮、无水乙醚交替洗涤-烘干-茶多糖粗成品。

1.2.2具体步骤

称取10 g粗茶，60 度干燥2 h,磨碎过40-50目筛，温水浸提(80 度 ，80 min， 3次)，过滤，减压浓缩，沉淀剂，95%乙醇沉淀，离心(4000 r/min，10 min)得沉淀物，用无水乙醇、丙酮、无水乙醚交替搅拌洗涤2次干燥(60 度, 4 h),得粗茶多糖，称量。

1.3蒽酮-硫酸试液的配制

称取0.30 g蒽酮，加100 mL浓硫酸，置于棕色试剂瓶中，摇匀后置于冰箱中。

1.4标准曲线的绘制

称取无水葡萄糖标准品适量，加蒸馏水配成1.008 mg/mL的标准溶液。精密移取标准溶液1.0. 2.0. 4.0. 6.0. 8.0. 10.0 mL分别置于100 mL容量瓶中，各加水至刻度，摇匀。分别精密移

取上述标准溶液各2.0 ml置具塞试管中，以2 mL蒸馏水作空自，每管再加8 mL蒽酮-硫酸试液，立即摇匀，冰水浴冷却。沸水浴中加热7 min，流动水冷却至室温，10 min后在560 nm处测定吸光度，以吸光度(A)对葡萄糖浓度(C)作回归处理，得回归方程:C=105.0383 A-7.2499， r=0.9995 。

1.5换算因子的测定

精确称取干燥至恒重的茶多糖0.0102 g,溶解后定量转移至25 mL容量瓶中，然后加纯化水定容至刻度，80度水浴加热，再超声1 min增溶，摇匀，制得茶多糖贮备液。用蒽酮-硫酸法测定其吸光度，由回归方程求出贮备液中葡萄糖的浓度，测得其葡萄糖含量，按下式计算换算因子。因茶多糖干燥后在水中溶解性降低，故按1.2.2项下的方法制得多糖提取液取等量两份，经乙醇沉淀洗涤后，一份直接加纯化水溶解(复水性好)，定容，测定吸光度和茶多糖含量;另一份干燥至恒重，称得茶多糖的干重，由二者计算平均换算因子。

1.6茶多糖的测定

精确称取粗茶叶1g，按照1.2.2项下方法制得茶多糖，然后将制得的茶多糖溶解后定量转移于100 mL容量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，80 度水浴加热，超声1 min增溶，摇匀，制得茶多糖样品液，蒽酮-硫酸分光光度法测定其吸光度，由回归方程计算试液中葡萄糖浓度(C)，按下式计算样品中茶多糖含量。

2 结果与讨论

2.1茶多糖提取最佳条件选择

选择浸提时间、浸提温度、料液比三个因素、三个水平，进行茶多糖提取最佳条件的选择。

2.2重复性

精确称取粗老茶叶1g，按照1.6项下方法处理后重复测定6次分别计算茶叶多糖含量，RSD=0.54，表明精密度良好。

2.3稳定性

精确吸取1.6项下制取茶多糖样品液1 mL于具塞试管中，每间隔1h测定溶液的吸光度，RSD=0.23 %(n=5)，在5h内显色稳定。

2.4加样回收率

精确称取3份粗老茶叶各1g，加入精制茶叶多糖约20 mg，按1.6项下方法测定茶叶多糖含量，计算回收率，回收率范围为98.86%-102.32%。

3结论

多糖测定 篇3

关键词：多糖-苯酚-硫酸显色反应;导数光谱;蚕蛹多糖;正交试验

中图分类号： S131+.2;R284.2 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）04-0309-03

收稿日期：2014-06-03

基金项目：江苏省教育厅“青蓝工程”资助项目（编号：201423）;江苏省南通市农村科技创新及产业化项目（编号：HL2012025）。

作者简介：吴海燕（1978—），女，江苏南通人，副教授，主要从事食品综合利用、食品安全检测的研究。E-mail：why022@126.com。

蚕蛹为蚕蛹科昆虫家蚕的蛹，具有生津止咳、消食理气等作用，为药膳同源传统中药材，具有很高的营养和药用价值。蚕蛹多糖是蚕蛹中的主要活性成分之一[1-2]。近年来研究表明，蚕蛹多糖具有明显增强机体免疫功能的作用[3-6]。

目前蚕蛹多糖的测定方法广泛采用苯酚-硫酸法，此法虽简单、快速、无需多糖纯品和高级仪器，但要求被测溶液本身无颜色或颜色较淡[7]，而且由于蚕蛹本身有一定的颜色，会对测定产生较大干扰。因此蚕蛹在测定前一般要经过脱色或其他处理，费时费力，容易产生较大误差;另外，蚕蛹多糖结构比较复杂，仅仅用葡萄糖作为标准品不能精确反映多糖含量。

导数光谱又称微分光谱，是将吸收光谱进行数学变换，得到关于波长的微分系数（dA/dλ）对波长（λ）的导数光谱图，属于紫外吸收光谱派生的1个分支[8]。对于复杂的多组分物质，导数光谱可不经分离而直接检测，方法简便、快速、准确、灵敏;导数光谱法对重叠谱带及平坦谱带的分辨率高、噪声低，能从重叠的吸收光谱中分离出各自的吸收峰，并能分别进行定量，可排除杂质和颜色的干扰[9-10]。因此导数光谱法近年来在食品、药品鉴别分析测定领域得到迅速发展和广泛应用[11-14]。本试验采用一阶导数光谱法测定蚕蛹多糖含量，以期为蚕蛹多糖的开发利用和工业化生产提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

蚕蛹粉由南通福尔生物制品有限公司提供;葡萄糖、苯酚、浓硫酸、无水乙醇等试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器与设备

TU-1901紫外-可见分光光度计，北京通用普析仪器有限责任公司;DZF-6020真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司;SHA-C数显水浴恒温振荡器，金坛市精达仪器制造厂;RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 多糖的提取 称取5 g脱脂蚕蛹粉末，加入100 mL蒸馏水，在功率为500 W的超聲波中提取30 min，过滤，滤液为粗多糖提取液。

1.3.2 多糖的测定

1.3.2.1 线性关系分析 精确量取0、0.10、0.20、0.30、040、0.50、0.60、0.70、0.80 mL 0.1mg/mL葡萄糖溶液，分别置于10 mL干燥比色管中，加蒸馏水至体积为1.00 mL，加入 0.50 mL 一定浓度的精制苯酚溶液，混匀后迅速加入浓H2SO4，放置于水浴锅中加热一定时间，取出冷却至室温。用TU-1901紫外-可见分光光度计在420～550 nm波长范围内扫描，记录葡萄糖的零阶和一阶导数吸收光谱，以一阶导数光谱中波峰与波谷间距对葡萄糖含量进行直线回归。

1.3.2.2 样品的测定 将蚕蛹多糖提取液定容至250 mL，取10 mL提取液定容至100 mL待测，精确吸取待测液 100 mL 置于10 mL干燥比色管中，按“1.3.2.1”节方法绘制零阶和一阶导数吸收光谱。将一阶导数光谱中波峰与波谷间距值代入直线回归曲线，求得样品的多糖含量。

1.3.3 苯酚-硫酸法的显色条件优化 以苯酚浓度（A）、浓硫酸用量（B）、水浴温度（C）、水浴时间（D）为考察因素，每个因素各取3个水平，按L9（34）正交表设计试验确定苯酚-硫酸法显色的最优试验条件，详见表1。

表1 苯酚-硫酸法显色条件正交试验设计

水平

因素

A：苯酚浓度

（%） B：浓硫酸

的量（mL） C：水浴温度

（℃） D：水浴时间

（min）

1 4 3 30 10

2 5 4 65 15

3 6 5 100 20

1.3.4 精密度试验 取6份同一批次的脱脂蚕蛹样品，按照“1.3.1”节的方法进行多糖的提取，提取后的每份试样按照“1.3.2.2”节的方法求得的一阶导数光谱中波峰与波谷间距值，测定蚕蛹多糖含量来确定方法的精密度。

1.3.5 回收率试验 精确称取5 g蚕蛹样品，加入葡萄糖标准品，分别制备添加量为4、8、16 mg/g的样品，每个添加量均测定6个平行样，按“1.3.1”节的方法提取后，按“1.3.2”节的方法测定多糖含量，计算多糖的回收率。

1.3.6 稳定性试验 精确称取适量多糖样品，按照“1.3.1”节的方法进行多糖的提取，按“1.3.2”节的方法显色后每隔30 min测定其一阶光谱导数值的波峰与波谷间的间距值变化。

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2 结果与分析

2.1 导数光谱试验

取葡萄糖对照品、空白溶液、蚕蛹多糖提取液，分别在420～550 nm波长范围内扫描，记录葡萄糖的吸收光谱（图1）;利用UVWin5.0软件对葡萄糖零阶吸收光谱求导，得到葡萄糖一阶导数光谱（图2）。一阶导数光谱在425～525 nm间波峰-波谷间距值（dA/dλ）与葡萄糖含量进行直线回归（图3），可见一阶导数光谱在425～525 nm间的dA/dλ与葡萄糖含量成正比，因此选择一阶导数光谱在425～525 nm间的波峰-波谷间距值作为定量的依据。

2.2 显色条件的选择

苯酚-硫酸法显色原理为：多糖类物质在硫酸作用下先水解成单糖分子，并迅速脱水成糖醛衍生物，糖醛衍生物再与酚性物质（如苯酚）络合成有色物质。试验发现，此有色物质的一阶导数光谱在425～525 nm间的波峰-波谷间距值定量效果最好。正交试验数据和极差分析结果见表2。

正交试验中极差的大小反映各个因素对测定指标影响程度，根据表2的极差分析可知，各因素对波峰-波谷间距值影

表2 苯酚-硫酸法显色条件正交试验结果的极差分析

编号 A：苯酚

浓度 B：浓硫酸

的量 C：水浴

温度 D：水浴

时间 dA/dλ

1 1 1 1 1 0.016

2 1 2 2 2 0.032

3 1 3 3 3 0.023

4 2 1 1 3 0.023

5 2 2 3 1 0.021

6 2 3 1 2 0.028

7 3 1 3 2 0.036

8 3 2 1 3 0.032

9 3 3 2 1 0.032

k1 0.024 0.025 0.025 0.023

k2 0.024 0.028 0.029 0.032

k3 0.033 0.028 0.027 0.026

R 0.009 0.003 0.004 0.009

注：dA/dλ為一阶导数光谱在425～525 nm间的波峰与波谷间距值。

响程度为：A= D>C>B，苯酚-硫酸法的最佳显色条件为 A3B2C2D2组合，即苯酚的浓度为6%，浓硫酸的用量为4 mL，水浴温度65 ℃，水浴时间为15 min。

2.3 标准曲线

以葡萄糖一阶导数吸收光谱在425～525 nm 间的波峰-波谷间距（dA/dλ）为纵坐标、葡萄糖含量（m）为横坐标求得标准曲线（图3），回归方程为：dA/dλ=0.582 1m+0.001 4，r2=0.998 2。结果表明，葡萄糖浓度在1.81～14.55 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验

蚕蛹多糖含量的精密度试验相对标准偏差为3.08%，表明采取一阶导数光谱法测定蚕蛹中多糖含量的方法重现性较好。精密度试验结果见表3。

表3 精密度试验结果

蚕蛹样品 蚕蛹多糖含量（mg/g）

平行样1 20.271

平行样2 21.130

平行样3 21.130

平行样4 20.271

平行样5 21.989

平行样6 21.130

平均值 20.987

精密度RSD 3.08%

2.5 回收率试验

回收率试验结果表明，添加量为4 mg/g的样品，平均回收率为99.46%，RSD值为2.82%;添加量为8 mg/g的样品，平均回收率为101.54%，RSD值为2.38%;添加量为16 mg/g的样品，平均回收率为101.25%，RSD值为2.05%，表明采用一阶导数光谱法测定蚕蛹中多糖含量的方法准确可靠，符合定量分析的准确度要求。多糖的回收率结果见表4。

表4 回收率试验结果

样品

序号 样品中含

量（mg/g） 加标量

（mg/g） 测定值

（mg/g） 回收率

（%） RSD值

（%）

1 20.987 4 24.566 98.31

2 20.987 4 25.425 101.75

3 20.987 4 24.566 98.31

4 20.987 4 23.707 94.87

5 20.987 4 25.425 101.75

6 20.987 4 25.425 101.75

1～6平均 99.46 2.82

7 20.987 8 29.720 102.53

8 20.987 8 28.861 99.57

9 20.987 8 28.861 99.57

10 20.987 8 28.861 99.57

11 20.987 8 29.720 102.53

12 20.987 8 30.579 105.49

7～12平均 101.54 2.38

13 20.987 16 36.592 98.93

14 20.987 16 38.310 103.57

15 20.987 16 38.310 103.57

16 20.987 16 37.451 101.25

17 20.987 16 37.451 101.25

nlc202309051143

18 20.987 16 36.592 98.93

13～18平均 101.25 2.05

2.6 稳定性试验

表5稳定性试验结果表明，蚕蛹多糖一阶导数光谱的波峰与波谷间距值在显色后30 min达到最大，在120 min内基本稳定，RSD值为2.72%。

表5 稳定性试验结果

时间（min） dA/dλ

0 0.026

30 0.027

60 0.026

90 0.026

120 0.025

150 0.021

3 结论

导数光谱法测定多糖能消除背景颜色的干扰，可以使蚕蛹多糖不经脱色处理直接测定，提高了测定准确度，避免了由于脱色导致多糖的损失。

本试验利用一阶导数光谱法测定蚕蛹多糖含量。通过试验优化最佳显色条件为：苯酚的浓度为6%，浓硫酸的用量为4 mL，水浴温度为65 ℃，水浴时间为15 min。显色反应体系的一阶导数光谱值与多糖含量成正比，回归方程为：dA/dλ=0.582 1m+0.001 4，r2=0.998 2。测定方法的相对标准偏差为3.08%，平均回收率在99.46%～101.54%之间，显色体系在120 min中稳定性好，测定的准确度和精密度高，可以用于蚕蛹中多糖含量的测定。

参考文献：

[1]藏其中，万淑莹，何光星，等. 蚕蛹多糖的分离和分析[J]. 中成药，1992，14（3）：35-36.

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芦荟多糖的提取与含量测定 篇4

1 材料

1.1 仪器

7530紫外分光光度计 (上海第三分析仪器厂) , 1000r/min高速自控组织捣碎机 (江苏盐城市龙冈医疗器械厂制造) , JB-1型搅拌器 (上海雷磁新泾仪器有限公司) , LG10-2.4A型高速离心机 (北京医用离心机厂制造) 。

1.2 试药

无水乙醇 (齐齐哈尔轻工学院试剂厂, AR) ;硫酸 (上海化学试剂有限公司, AR) ;苯酚 (上海试剂一厂, AR;重蒸后使用) ;丙酮 (齐齐哈尔轻工学院试剂厂, AR) , 乙醚 (沈阳市试剂五厂, AR) ;D-甘露糖 (上海试剂二厂, AR) 。

2 方法与结果

2.1 标准曲线绘制

精密称取105℃干燥至恒重的甘露糖0.100 g置于100 ml容量瓶中, 加蒸馏水定容。从中精密量取5 ml置于50 ml容量瓶中, 加蒸馏水定容。分别精密吸取0 ml、1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml置于50 ml容量瓶中, 加蒸馏水定容。分别精密吸取2 ml于试管中, 加苯酚1 ml摇匀, 加浓硫酸5 ml, 迅速摇匀后, 静置5 min, 沸水水浴加热15 min, 冷却至室温, 分光光度法于490 nm波长处测吸收度, 结果见表1。

2.2 芦荟多糖的提取

采用水提醇沉法提取芦荟多糖。取芦荟叶片洗净、去刺, 在去离子水中浸泡, 以除去表皮渗出的黄色液汁。然后切去表皮, 将内层凝胶至于去离子水中浸洗, 捣碎, 纱布过滤, 冷藏过夜, 次日离心, 抽滤, 所得芦荟汁经浓缩后, 再次离心, 以除尽纤维质, 冷藏备用。然后向芦荟凝胶浓缩汁加入无水乙醇, 使其乙醇终浓度为80%, 沉淀12 h后, 高速离心得多糖沉淀。取沉淀物溶于蒸馏水中配成溶液, 过滤, 摇匀, 定容至200 ml, 即得芦荟多糖溶液。

回归方程为C=0.0145D-0.0169 (r=0.9940)

2.3 总糖含量测定

精密量取芦荟粗多糖溶液5 ml置于50 ml量瓶中, 加蒸馏水溶解并稀释至刻度, 从中精密吸取2 ml于置于试管中, 照2.1项下自加苯酚起依次操作, 测得吸收度为1.524, 依回归方程计算, 再乘上稀释倍数, 得芦荟多糖相对含量为8.796 mg/ml。

2.4 精密度试验

平行取六份甘露糖和芦荟多糖溶液, 苯酚-硫酸法显色后测定D值。结果重现性良好。结果见表2。

2.5 加样回收率试验

取芦荟多糖提取液5份, 分别加入一定量的甘露糖标准液, 进行回收试验。结果见表3。

3 讨论

3.1 芦荟多糖的测定多是以葡萄糖为标准品[4,5], 而芦荟多糖的主要组成单糖是甘露糖, [6]而且在实验过程中, 也采用了葡萄糖标准品、甘露糖标准品与芦荟多糖溶液做对照, 发现芦荟多糖的吸收光谱与甘露糖基本一致, 除了490 nm处的最大吸收峰外, 在430nm处还有一个次吸收峰, 而葡萄糖则无此特征, 因此, 本文采用甘露糖为标准测定芦荟多糖的含量, 能更准确地反映真实值。

3.2 芦荟多糖的研究已有一些报导, 但芦荟产地不同、种植条件不同会影响芦荟多糖的含量, 为详细考察本地产芦荟多糖含量, 为地方经济发展做一定的实验基础研究, 故本文采用的芦荟均为黑龙江省牡丹江芦荟培育基地所产的斑纹芦荟。结果发现本地产芦荟多糖含量丰富, 作为医药保健品来开发利用是很有发展前途的。

3.3 采用苯酚一浓硫酸法测定芦荟多糖含量, 此方法稍繁琐但比较经典, 此外, 还可采用旋光法与高效液相色谱法进行测定, 由于仪器条件限制, 没有采用。

参考文献

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多糖测定 篇5

【关键词】软骨细胞；增殖；药对巴戟天-杜仲；多糖；含量测定；大鼠

doi:10.3969/j.issn.2095-4174.2014.06.006

Assaying Polysaccharide in Couplet Drugs of Bajitian （Radix Morindae Officinalis） and Duzhong

（Cortex Eucommiae） and Its Effects on the Proliferation of Rat Chondrocytes

FU Chang-long,PAN Cai-bin,LIU Guo-qiang,CHEN Xing-qiang,LIN Ping-dong,

LIU Xian-xiang,YE Hong-zhi

【ABSTRACT】Objective:To study the effects of polysaccharide in couplet drugs of Bajitian（Radix Morindae Officinalis）and Duzhong（Cortex Eucommiae）on the proliferation of rat chondrocytes cultured in vitro.Methods:①The total polysaccharide was extracted and purified by the water extraction and alcohol precipitation and the Sevag method,measuring its content by Phenol-sulfuric acid colorimetric method;②By the MTT method,the reproductive activity of rat chondrocytes was detected in the polysaccharide DMEM solution of 800,400,200,100,50 μg·mL-1 for 24,48,72 hs.Results:①The standard glucose linear regression equation was y =

0.010 0x-0.001 8 （r = 0.999 6）.The linear relationship of standard glucose was good in 10～100 μg·mL-1,

the average recovery being 99.59%,RSD being 0.40% and the content of polysaccharide being 43.88%.②The total polysaccharides of Bajitian（Radix Morindae Officinalis）and Duzhong（Cortex Eucommiae）could promote the reproductive activity of rat chondrocytes.The promoting function was strongest when the concentration of polysaccharide was 400 μg·mL-1 for 48 hs.Conclusion:①The Phenol-sulfuric acid colorimetric method can be used to measure the content of polysaccharide in couplet drugs of Bajitian（Radix Morindae Officinalis）and Duzhong（Cortex Eucommiae）;②The function of polysaccharide in promoting the reproductive activity of rat chondrocytes is related to a certain time,quantity and effectiveness.

【Keywords】 cartilage cell;proliferation;couplet drugs of Bajitian（Radix Morindae Officinalis）and Duzhong（Cortex Eucommiae）;polysaccharide;content measurement;rats

骨关节炎（osteoarthritis,OA）属中医学“骨痹”“膝痹”范畴。目前普遍认为，本虚标实、本痿标痹为其基本病机，其中以肝肾亏虚为本，风寒湿为标，治疗的根本法则为补肝肾、祛风湿［1］。巴戟天、杜仲均具有祛风湿、强筋骨功效，是临床常用药对，如《普济方》记载的巴戟丸，就以巴戟天、杜仲合用，奏补肾强筋、祛风除痹之效用。近年来，研究发现中药多糖可有效抑制OA的发生和发展［2］。前期已有研究发现，中药多糖具有调控软骨细胞增殖通路的作用［3］。因此，本研究旨在观察药对巴戟天-杜仲总多糖对体外培养大鼠软骨细胞增殖的影响，为中药治疗OA提供实验依据。

1实验材料

1.1研究对象巴戟天（产地广东，批号10030203）

和杜仲（产地广西，批号13090602）均由福州回春中药饮片有限公司提供；SD雄性大鼠4只，动物许可证号SCXK（沪）2007-0005，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，体质量为90～100 g。

1.2主要试剂及仪器D-无水葡萄糖（批号110833-201104，中国食品药品检定研究院），II型胶原酶（批号J130038，Sigma公司），MTT（噻唑蓝，Sigma公司），磷酸盐缓冲液（NZB1079，HyClone），DMEM（改良培养基）/LOW GLUCOSE

（批号NZC1118，HyClone）等。旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），紫外分光光度计（岛津），Bio-tek酶标仪（美国BIO-Tek公司）等。

2方法

2.1巴戟天-杜仲多糖的提取将巴戟天、杜仲干燥药材经高速粉碎机粉碎后，过80目筛，备用。各取粉碎药材50 g，石油醚脱脂后，加10倍量水提取2次，每次2 h。合并2次提取液，抽滤，减压浓缩至300 mL，加3倍量乙醇，静置过夜，高速离心，收集沉淀，干燥得粗多糖。将粗多糖重溶于蒸馏水中，采用Sevag法除蛋白，多糖液浓缩，加质量分数95%乙醇分级沉淀，高速离心，收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤、干燥，获得多糖。

2.2苯酚-硫酸比色法测定巴戟天-杜仲多糖的含量

2.2.1最大吸收波长的选择精密称定称取约105 ℃

干燥至恒重的无水葡萄糖0.01 g，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀；量取25 mL溶液置于50 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，制成葡萄糖标准液。精密吸取葡萄糖标准液0.1 mL

加蒸馏水稀释至1 mL，加入质量分数5%苯酚

1 mL混匀；再迅速滴加5 mL浓硫酸，振荡混匀，放置30 min，以蒸馏水作为空白对照，在波长400～800 nm范围内扫描，确定最大吸收波长。

2.2.2葡萄糖标准曲线的制作精密吸取葡萄糖标准液各0.1，0.3，0.5，0.6，0.7，0.9，1.0 mL于试管中，加水稀释至1.0 mL，加入质量分数5%苯酚1 mL混匀；再迅速滴加5 mL浓硫酸，振荡混匀，放置30 min；以蒸馏水作为空白对照，490 nm

波长处测定吸光度；以葡萄糖浓度C（mg·mL-1）为横坐标，吸光度值 A 为纵坐标，绘制标准曲线，得出标准曲线方程。`

2.2.3巴戟天-杜仲多糖的含量测定精密称取样品多糖粉末0.01 g，于50 mL容量瓶中定容，摇匀；量取25 mL溶液置于50 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，制成供试液。取供试液1.0 mL，加入质量分数5%苯酚试剂1 mL混匀；再迅速滴加5 mL浓硫酸，比色测定出吸光度A，由标准曲线方程求出多糖提取液浓度C。

2.3巴戟天-杜仲多糖干预软骨细胞活性研究

2.3.1软骨细胞的分离和培养清洁级4周龄SD大鼠，脱颈处死，消毒双膝并离断，质量分数75 %

酒精浸泡5 min，放入含双抗PBS中。在超净台内剥离关节周围肌肉韧带，清除软骨表面的滑膜，削下软骨，剪碎成1 mm3；PBS冲洗3次后，置入盛有质量分数0.2% II型胶原酶的培养皿，放于37 ℃培养箱中；每45 min取上清，离心收集细胞沉淀，并更换消化液继续消化，重复4次。用DMEM完全培养液（含质量分数10%胎牛血清，维生素C 50 mg·L-1和青链霉素各100 U·mL-1），重悬细胞，血球计数板计数调整细胞悬液为（2～3）×105·mL-1，

接种培养；48 h首次换液，以后每2日换液1次。待软骨细胞铺满至80%的瓶底，用胰酶消化传代［4］。实验使用第2代细胞。

2.3.2MTT比色试验测定软骨细胞增殖取生长良好第2代软骨细胞计数后，以每孔2×103接种于3块96孔板中，常规培养24 h；用每孔加100 μL

无血清的DMEM，置CO2培养箱中37 ℃培养24 h；然后使用正常培养基培养，同时各组分别加入0，50，100，200，400，800 μg·mL-1药对巴戟天-杜仲多糖，每组设8个复孔，培养24，48，72 h。弃去药液，每孔加100 μL质量分数为1 mg·mL-1

的MTT，37 ℃温育5 h；弃去MTT，加150 μL DMSO，充分振荡10 min，使结晶物充分溶解。酶标仪570 nm下检测每孔OD值，记录结果。

2.4统计学方法采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以表示，采用t检验和单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3结果

3.1多糖含量测定

3.1.1吸收波长的选择吸取葡萄糖标准液及供试品溶液，按2.2.1项下方法操作，显色后在分光光度计上测定波长在400～600 nm范围内的吸光度，两者均在490 nm波长处有最大吸收，故选择490 nm作为检测波长。

3.1.2标准曲线绘制以葡萄糖质量分数C（μg·mL-1）为横坐标，吸光度值A为纵坐标绘制标准曲线回归方程为：y = 0.010 0x-0.001 8，r = 0.999 6，说明葡萄糖在10～100 μg·mL-1范围内线性关系良好。

3.1.3精密度实验精密吸取巴戟天-杜仲多糖供试液，各进行6次重复测定，记录结果平均吸光度（A）值为0.439，相对标准偏差值（RSD）为0.30%，

表明仪器具有良好的精密度。

3.1.4稳定性试验取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8 h测定吸光度，结果巴戟天-杜仲多糖吸光度（A）的RSD值为0.30%，表明供试液在8 h

内状态稳定。

3.1.5回收率实验取同一批巴戟天-杜仲多糖供试液6份，每份1 mL，并分别加入葡萄糖标准液0.1，0.2，0.3，0.4 mL，补水至2 mL，测定吸光度，计算回收率，结果平均回收率为99.59%，RSD为0.40%。

3.1.6样品含量测定取供试液1.0 mL，加入质量分数5%苯酚试剂1 mL，混匀；再迅速滴加5 mL

浓硫酸，与2.2.3同法操作，比色测定出吸光度A，由回归方程求出多糖含量为43.88%。

3.2巴戟天-杜仲多糖对软骨细胞增殖的时效与量效关系干预24 h，各加药组OD值明显高于空白组（P < 0.05）。200 μg·mL-1和800 μg·mL-1干预的软骨细胞增殖能力比较，差异无统计学意义（P = 0.05）。干预48 h，各加药组OD值明显高于空白组（P < 0.05）。200 μg·mL-1和

800 μg·mL-1干预的软骨细胞增殖能力比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。干预72 h，各加药组OD值明显高于空白组（P <0.05）。200 μg·mL-1和800 μg·mL-1干预的软骨细胞增殖能力比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。当干预浓度为

400 μg·mL-1、作用时间为48 h时，增殖作用达到最大。每个浓度的实验均重复6次，得出以下数据，见表1、图1。

4讨论

药对是遵循中医药基本理论而形成的中药配伍的最小单位，是复方配伍中最基本、最常用的形

式［5］。药对巴戟天-杜仲依据中医理论配伍，其中巴戟天善入肾经血分，功专温补肾阳，兼能祛风除湿；杜仲兼入肝经，功长补益肝肾，兼以强筋壮

骨。二药合用，精血并补，筋骨益盛，并可祛风湿［6］，正与OA本虚标实的病机相契合。由此可见，药对巴戟天-杜仲兼顾肝肾，切合病机，发挥强筋骨、祛风湿之功效。本实验发现的中药多糖成分能有效促进软骨细胞的增殖，与中药多糖能通过改善局部微循环，降低骨内压、清除氧自由基、抑制滑膜炎症、抑制软骨细胞凋亡、调节异常的细胞因子及纠正患者免疫脏器的病理变化，改善关节滑膜病变的研究［7］，共同丰富了中医药治疗OA的机制。

本实验采用苯酚-硫酸比色法测定巴戟天-杜仲多糖的原理，即多糖在浓硫酸的作用下，水解成单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，再与苯酚缩合成有色化合物，起显色反应，在适当波长和一定浓度范围内，吸收值与糖浓度呈线性关系，从而可比色测定其含量［8］。本法操作简单，显色稳定，灵敏度高，结果准确，可作为总多糖含量的测定方法。

此外，MTT实验是检测细胞活力的实验方

法［9］，由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此，也常用来检测细胞的增殖情况。其基本原理是活细胞有琥珀酸脱氢酶，能将MTT还原成棕褐色沉淀。二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞的数量。本实验用MTT比色试验研究巴戟天-杜仲多糖不同浓度对体外培养大鼠软骨细胞的作用，研究发现，巴戟天-杜仲多糖影响软骨细胞增殖与药物浓度有关，低浓度该多糖能显著促进软骨细胞增殖，而高浓度则抑制软骨细胞增殖，浓度为400 μg·mL-1时促增殖最佳。

药对巴戟天-杜仲具有补益肝肾、祛风除湿等功效，符合OA病机。本实验研究也发现其多糖对软骨细胞有一定的促增殖作用，为证实其治疗OA进一步提供了线索。

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多糖测定 篇6

1 材料

1. 1 主要仪器

紫外分光光度计( 型号为752) ,上海奥析科学仪器有限公司生产; 旋转蒸发器( 型号为ZFA84 - Ⅰ) 、循环水式多用真空泵( 型号为SHB - Ⅲ) ,郑州长城科工贸有限公司生产; 索氏脂肪浸提器( 型号为ST310) ,苏州安创仪器有限公司生产; 数显不锈钢电热培养箱( 型号为HPX - 9272MBE) 、立式压力蒸汽灭菌器( 型号为BXM - 30R) 、超净工作台( 型号为SW - CJ - 2FD) ,上海博迅实业有限公司生产; 气浴恒温振荡器( 型号为ZD - 85) ,江苏金坛市医疗仪器厂生产。

1. 2 试剂与中草药

无水乙醇、丙酮、乙醚、葡萄糖、蒽酮、浓硫酸、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钾等,塔里木大学设备科化学试剂库提供。

马齿苋、骆驼刺、红柳、蒲公英、肉苁蓉、花粉、罗布麻、枸杞、黄芪、苦荬菜、石榴皮、芦根,塔里木盆地采集。

2 方法

2. 1 蒽酮- 硫酸比色法测定中草药多糖含量

2.1.1多糖的提取与纯化

分别取12 种中草药干品4. 0 g水煎煮3 次( 1. 5,1. 0,0. 5 h) ,过滤,静置12 h后取上清液,减压浓缩至10 m L,浓缩液以无水乙醇调至浓度为75% ,搅拌,5 ~ 10 ℃静置24 h,沉淀物分别以无水乙醇、丙酮、乙醚回流洗涤,不同中草药洗涤时间不同,一般情况下洗涤1 ~ 2 h,得多糖粉末,于60 ℃烘干,密封备用[1,2,3]。

2.1.2多糖液的制备

精密称取60 ℃ 干燥至恒重的12 种多糖各10 mg,加入少量纯化水溶解定容至100 m L容量瓶中[4,5]。

2.1.3蒽酮溶液的配制

称取蒽酮0. 2 g,加浓硫酸100 m L,混合摇匀即得( 现配现用) 。

2.1.4标准液的配制

精密称取105 ℃ 干燥至恒重的葡萄糖0. 1 g,以纯化水溶解,定容至100 m L容量瓶中,质量浓度为1 mg /m L,绘制标准曲线。

2.1.5多糖的测定与计算

分别量取各样品液1 m L,置具塞试管中,加纯化水1 m L,蒽酮溶液4 m L,于波长623 nm处测定吸光度。

2. 2 多糖抑菌试验

2.2.1培养基的制备

1) 选择直径6 mm的圆形滤纸片作为药敏片,药敏片浓度分别为50,100 μg /片,灭菌后烘干密封,于4 ℃ 冰箱中保存,备用[6]; 2) 采用麦氏比浊管法制备菌液和标准比浊管; 3) 采用贴纸片法测量抑菌圈的直径( mm) ,判定敏感程度。判定标准: 直径小于10 mm为耐药,10 ~ 15 mm为中度敏感,> 15 mm为高度敏感,> 20 mm为极敏感。

3 结果与分析

结果见表1。

从表1 可以看出,塔里木盆地12 种中草药多糖含量有明显的差异,多糖含量较高的是肉苁蓉、罗布麻、蒲公英等,多糖含量较少的是苦荬菜、骆驼刺、马齿苋等。12 种中草药多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌大多为中度敏感或耐药,说明12 种中草药一般为中度抑菌药,在机体内并非直接抑菌,而是表现出多种生物活性,其机理有待于进一歩研究。

从表1 还可以看出,中草药多糖含量越高,其抑菌圈越大,说明多糖含量的多少是影响抑菌效果的主要因素,但也有例外,如石榴皮中多糖含量不高,而抑菌圈相对较大,这可能是石榴皮中除多糖以外,还有其他化学成分在协同多糖起抑菌的作用。

试验发现,加入蒽酮试剂的操作方法是影响显色结果的主要因素,本试验采用“悬空垂直加入蒽酮试剂立即摇匀”的操作方法,能得到稳定的显色结果。蒽酮试剂在加入过程中,反应时间、温度要严格控制,充分混匀,否则会影响试验结果。

4结论

本试验结果表明,塔里木盆地12 种中草药多糖含量最高的是肉苁蓉,其次为罗布麻,可用作植物多糖的提取; 12 种中草药对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果达到中度敏感的是石榴皮、罗布麻,可作为抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的饲料添加剂替代抗生素; 12 种中草药多糖的含量不一定与抑菌相关。

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[5]白红进,赵小亮,蒋卉.新疆刺山柑多糖的提取及含量测定[J].食品研究与开发杂志,2007(3):120-122.

山药多糖含量的测定方法研究 篇7

关键词：山药,多糖,苯酚-硫酸法,测定方法

山药为薯蓣科植物薯蓣 (Dioscorea opposita Thunb) 的块茎, 多年生宿根蔓草植物。山药是亦食亦药之物, 自古就是药食兼备之品, 早在2000多年前的中国第一部方书《神农本草经》中就有记载。其性平、味甘, 具有补脾养胃、生精益肺、补肾涩精的功效[1]。对于预防和治疗糖尿病及消化系统病症[2]、增强和促进免疫功能[3]、抗衰老[4]等方面都有良好的功效。而其有效成分之一是多糖, 多糖可以改善食品的食用品质、加工特性和外观特性, 可用于抑制脂质氧化[5], 稳定酸性饮料[6], 也可作为乳化剂[7]等。山药多糖是山药中重要的功能成分, 具有多种药理活性。多糖含量的测定国内一般采用分光光度法, 显色剂多为苯酚-硫酸法或蒽酮-硫酸法。但是蒽酮-硫酸法易受色氨酸含量较高蛋白质的影响, 因此本文选用苯酚-硫酸法对山药粗多糖的分析测定进行方法学考察, 为山药多糖产品的质量检测提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

新鲜山药, 苯酚、硫酸、葡萄糖、乙醇等均为分析纯。

1.2 仪器

101型电热鼓风干燥箱 北京永光明医疗器械厂

F80型高速粉碎机 金坛市金城国性实验仪器厂

5804R型离心机 德国Eppendorf公司

RE-52旋转蒸发器 郑州长城科工贸有限公司

LSY型电热恒温水浴锅 北京医疗器械厂

Bs 100s型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司

WFJ 7200型可见分光光度计 上海尤尼可仪器有限公司

SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 上海亚荣生化仪器厂

2 实验方法

2.1 山药预处理

将新鲜削去表皮, 切成2-3mm薄片, 迅速置于鼓风干燥箱中50℃热风干燥。将干燥的山药片粉碎备用。

2.2 山药多糖的提取

将制备好的山药粉按1:15的料水比加入蒸馏水, 置于100℃沸水浴中浸提3h[9], 浸提完毕后取出冷却, 4000r/min, 离心10min, 分离上清液与沉淀物。上清液浓缩冷却, 加入5倍体积95%的乙醇, 可见大量的白色絮状沉淀析出, 静置12h, 收集沉淀后干燥, 即可得山药粗多糖。

2.3 多糖含量的测定

2.3.1 最大吸收波长的确定

取葡萄糖溶液和粗多糖溶液各0.6mL, 加入5%的苯酚1.2mL和浓硫酸4mL, 混合均匀后, 30℃显色30min, 空白对照以重蒸水代替, 在400-600nm波长范围扫描[10], 选取最大吸收波长为测定波长。

2.3.2 标准曲线的制作

将配置好的葡萄糖标准溶液, 用微量取液器分别吸取葡萄糖对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于25mL具塞刻度试管中, 分别加入蒸馏水至体积为1.0mL, 加入1.2mL苯酚和4mL硫酸, 混合均匀后, 30℃显色30min, 在最大吸收波长处测定吸光度, 空白对照以重蒸水代替糖溶液。以糖浓度 (C) 为横坐标, 吸光度 (A) 为纵坐标, 制作标准曲线。

2.3.3 测定方法的优化

(1) 单因素实验

实验选择5%的苯酚用量、硫酸用量、显色时间以及显色温度进行单因素实验。

(2) 正交实验设计

根据单因素实验结果, 选取苯酚用量、浓硫酸用量、显色温度、显色时间为考察因素, 采用正交设计实验, 分别测定吸光度, 优化分析测定条件。因素水平见表1。

2.3.4 显色重现性及多糖含量测定

精密称取适量的粗多糖 (W) 5份分别定容至10mL, 吸取样品液0.6mL, 按正交实验得到的最佳条件加入苯酚和硫酸, 混合均匀后, 30℃显色30min, 分别测定吸光度。

山药粗多糖含量undefined

式中:C 为根据标准曲线计算出的浓度, μg/mL;

D 为样品溶液的稀释倍数;

W为多糖样品的质量[11], mg。

2.3.5 回收率测定

称取适量山药粗多糖定容至25mL。取一定体积溶液, 加入等体积的葡萄糖标准溶液, 加入苯酚和硫酸, 混合均匀后, 30℃显色30min, 测定吸光度值, 计算得平均回收率及RSD值。

3 结果与分析

3.1 最大吸收波长的选择

由图1可见, 随着吸收波长的不断增大, 葡萄糖和粗多糖溶液的吸光值也不断增大, 当吸收波长增大到400nm时, 葡萄糖和粗多糖溶液的吸光值均达到最大, 因此本文选择440nm作为测定波长。

3.2 标准曲线绘制

葡萄糖标准曲线线性回归方程为:A=0.4085x+0.0205, R2=0.9994。其中A为吸光度;C为葡萄糖溶液浓度 (μg/mL) 。该标准曲线回归性好, 设计合理, 从而由该回归方程式可以准确得给出山药多糖含量 (以葡萄糖计) 。

3.3 单因素实验结果

3.3.1 苯酚用量对吸光度值的影响

由图3可知, 随着苯酚用量的不断增加, 所测吸光值也逐渐增大, 当苯酚用量达到0.8mL时, 所测的吸光值最大, 随着苯酚用量的继续增大, 大于0.8mL, 所测吸光值逐渐减小, 在苯酚用量为1.2mL～1.4mL时, 所测吸光值又逐渐增大, 但是增大后达到的最大值小于0.8mL时的吸光值, 随后一直呈波浪状延伸。因此认为硫酸用量为4mL、显色温度20℃、显色时间30min条件下, 5%的苯酚加入量为0.8mL时, 吸光度值最大。

3.3.2 硫酸用量对吸光度值的影响

由图4结果显示, 随硫酸添加量增大, 吸光度值逐渐增大。当硫酸添加量为6mL时, 所测吸光值最大, 且添加量为7mL时, 所侧吸光值逐渐减小, 因此认为苯酚用量为0.6mL, 显色温度20℃, 显色时间30min的条件下, 硫酸添加量为6mL时, 所测吸光值最大。

3.3.3 显色温度对吸光度值的影响

由图5结果表明, 随着温度的不断升高, 所测吸光值逐渐增大, 当显色温度为30℃时, 吸光值达到最大, 随着显色温度的继续升高, 所测吸光值又逐渐减小, 因此可以认为, 当5%的苯酚用量0.8mL、硫酸用量6mL、显色时间30min条件下, 不同显色温度对吸光度值的影响, 为30℃时最大。

3.3.4 显色时间对吸光度的影响

由图6可以看出, 随着显色时间的不断增大, 所测吸光值也不断增大, 当显色时间为30min时, 所测吸光值达到最大。随着时间的继续增大, 吸光值又不断减小。因此可以认为, 不同显色时间对吸光度的影响, 显色30min时, 吸光值最大。

3.4 正交实验与方差分析结果

由正交实验结果可知, 影响吸光度值诸因素的主次顺序依次是硫酸用量 (B) 、显色温度 (C) 、显色时间 (D) 、5%的苯酚用量 (A) ;最佳组合为A2B3C2D2, 即硫酸用量为7mL、显色温度为30℃、显色时间30min、5%的苯酚用量为0.8mL。

由表3方差分析表的F值可以得出苯酚用量、硫酸用量、显色温度、显色时间对总多糖含量影响的显著性。对实验结果的影响程度是硫酸用量>显色温度>显色时间>苯酚用量, 因此在影响山药多糖含量测定的4个因素中, 硫酸用量对山药多糖含量的测定有显著影响, 提取温度对山药多糖含量的测定有一定影响, 苯酚用量的影响最小。

3.5 显色重现性与含量测定

重现性与含量测定的结果见表4。由表可知, 山药粗多糖中多糖的平均含量为32.86%, RSD=7.58% (n=5) 。

3.6 回收率实验

加样回收实验的结果见表5。由表5可知, 该方法的平均回收率为98.16%, RSD=5.98% (n=5) 。

4 结 论

本文以葡萄糖为标准品, 苯酚-硫酸法测定山药多糖含量的最佳条件为:5%的苯酚0.8mL、硫酸用量7mL、显色温度30℃和显色时间30min, 影响显色的重要因素。葡萄糖标准曲线线性回归方程为A=0.4085x+0.0205, R2=0.9994, 山药多糖平均含量为32.86%, RSD=7.58% (n=5) ;加样回收率为98.16%, RSD=5.98% (n=5) 。该方法快速, 准确, 可用于山药多糖的含量测定。

多糖测定 篇8

关键词：杭白芷多糖/分离和提纯,杭白芷/分析,多糖

杭白芷系伞形科植物, 是常用中药白芷的品种之一, 气芳香, 味辛苦, 根入药, 具有散风除湿、通窍止痛、消肿排脓之功效。对白芷的现代研究多集中在其所含有的香豆素类和挥发油上, 具有解热镇痛、抗菌消炎、解痉平喘、降低血压、预防肿瘤等药理作用[1,2,3], 而对白芷中含量丰富的多糖却研究甚少。本实验参考文献方法[4], 提取分离杭白芷多糖并测定其生药中多糖含量, 以期为白芷多糖的进一步开发利用及其多糖生物学活性研究奠定基础。

1 实验材料

1.1 药材

杭白芷购自安徽亳州药材市场, 经本院生药学教研室周红英教授鉴定为伞形科植物杭白芷Angelica dahurica (Fisch.ex Hoffm.) Benth.et Hook.f.var.formosana (Boiss.) Shan etYuan的干燥根, 粉碎成粗粉备用。

1.2 试剂与仪器

石油醚、乙醇、丙酮、氯仿、正丁醇、浓硫酸、苯酚、葡萄糖等均为国产分析纯。中药粉碎机、RE-52A旋转蒸发仪、S-54紫外可见分光光度计、离心机、干燥箱等均为国产仪器设备。

2 方法与结果

2.1 杭白芷多糖的提取与精制

称取杭白芷粗粉150g, 加4倍量石油醚回流脱脂2次, 每次2小时;滤渣加4倍量80%乙醇回流提取2次, 每次2小时。经脱脂、醇提后的滤渣60℃烘干, 分别加6倍量、5倍量、4倍量蒸馏水在95℃水浴中浸提3次, 每次2小时, 合并滤液, 减压浓缩至200ml左右。以每100ml浓缩液加20ml氯仿正丁醇 (4:1) 液, 剧烈振荡30分钟, 以4000r/min离心15分钟, 去除下层氯仿及中层变性蛋白, 取上部水层再重复去蛋白操作, 至无明显中层为止。收集去蛋白后的上部水层, 加无水乙醇至溶液含醇量达80%, 静止过夜, 以4000r/min离心15分钟, 收集沉淀物, 再依次用95%乙醇、无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤各2次, 得多糖粗品。再以水-乙醇重结晶纯化2次, 60℃烘干, 得白色粉末状精制杭白芷多糖9.68g, 得率6.45%。

2.2 标准曲线的制备

2.2.1 葡萄糖标准溶液的配制

精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品100mg, 加适量水溶解, 转移至100ml容量瓶中, 加蒸馏水至刻度, 摇匀, 配成1mg/ml葡萄糖标准液备用。

2.2.2 5%苯酚溶液的配制

取苯酚100g, 加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g, 常压蒸馏, 收集182℃馏分10g, 加蒸馏水200ml溶解, 置棕色瓶内放冰箱备用。

2.2.3 标准曲线的制作

分别吸取葡萄糖标准液10、20、40、60、80、100μl置于大试管中, 各补加蒸馏水至2.0ml, 葡萄糖浓度分别为5、10、20、30、40、50μg/ml, 然后各加入5%苯酚溶液1ml, 缓慢沿壁加浓硫酸5ml, 混匀, 放置5分钟后, 再沸水浴加热15分钟, 流水冷却至室温, 在波长490nm处测定吸光度。以蒸馏水代替葡萄糖溶液作空白对照。结果表明, 葡萄糖浓度在5~50μg/ml范围内, 吸光度与浓度具有良好的线性关系。以吸光度 (A) 为纵坐标, 浓度 (C, μg/ml) 为横坐标, 绘制标准曲线, 得回归方程:A=0.0128C-0.0404, r=0.9964。

2.3 换算因子的测定

精密称取干燥至恒重的精制杭白芷多糖20mg, 置100ml容量瓶中加蒸馏水, 定容至刻度, 作为多糖储备液。精密吸取多糖储备液0.2ml, 3份, 按标准曲线制作方法测定其吸光度。

经测定, 3份多糖储备液平均吸光度为0.127, 从回归方程中求出多糖液中折合葡萄糖的浓度为13.08μg/ml。按下式计算换算因子:F=W/C·D

其中W为多糖的重量 (μg) , C为多糖液中折合葡萄糖的浓度 (μg/ml) , D为稀释因素。测得F=1.5291。

2.4 杭白芷多糖含量的测定

精密称取杭白芷粉末0.5g, 3份, 分别置圆底烧瓶中加80%乙醇150ml。回流提取2小时, 趁热抽滤, 滤渣用80%乙醇洗涤3次。然后滤渣连同滤纸置烧瓶中, 加蒸馏水150ml, 95℃水浴加热提取2小时, 趁热抽滤, 用热水洗涤烧瓶和滤渣, 洗液并入提取液中, 待冷却后转移于250ml容量瓶中, 补加蒸馏水定容至刻度, 如此制作样品溶液3份, 置冰箱中备用。

精密吸取样品溶液0.2ml, 按标准曲线制作方法测定其吸光度。每份样品溶液重复操作2次, 取平均吸光度。3份样品溶液的平均吸光度分别为0.216、0.212、0.223, 平均0.217。从回归方程中求出样品溶液折合葡萄糖浓度为20.11μg/ml。按下式计算杭白芷中多糖的百分含量:

多糖含量 (%) =C·D·F/W×100%

其中W为杭白芷样品的重量 (μg) , C为样品液中折合葡萄糖的浓度 (μg/ml) , D为样品的稀释因素。计算杭白芷中多糖含量为15.38%。

2.5 回收率测定

采用加样回收法。取样品溶液0.2ml, 4份, 分别加入葡萄糖标准液10、20、40、60μl, 按标准曲线制作方法测定其吸光度, 根据葡萄糖的检出量, 计算其回收率。

回收率 (%) = (实验测值-供试品液多糖量) /葡萄糖加入量×100%。测得平均回收率为99.03%, RSD=1.56% (n=4) 。

2.6 稳定性试验

将供试品溶液完成显色后, 每隔0.5小时测吸光度 (A) 1次, 连测5次。结果表明2小时内稳定性良好, 以A值计算, RSD=1.27% (n=5) 。

3 讨论

多糖是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子聚合物, 是构成生命的分子基础之一, 是自然界含量最丰富的生物聚合物。人们陆续发现, 多糖不仅作为广谱免疫促进剂, 具有免疫调节功能, 还在抗肿瘤、抗病毒、抗炎、降血糖、降血脂、抗辐射等方面具有广泛的药理作用[5]。多糖的测定方法很多, 本实验通过脱脂, 再以80%乙醇提取以除去单糖、寡聚糖、苷类及生物碱等醇溶成分, 再用水提醇沉法分离多糖成分, 并以苯酚-硫酸法测其含量。通过回收率试验和稳定性试验可知, 本法所测多糖含量, 简便可靠、重现性好、显色稳定, 实验结果表明杭白芷中多糖含量丰富, 达15.38%。有资料表明, 白芷多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等单糖组成[6], 但其理化性质及药理学活性还有待于进一步研究。

参考文献

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新疆赤芍多糖中糖醛酸含量的测定 篇9

1 主要材料、仪器及设备

1.1 主要材料

新疆赤芍(学名:新疆芍药)购自新疆乌鲁木齐头屯河区柯坪路民健药店。品种来源于毛茛科植物新疆芍药(Paeonia Sinjiangensis K.Y.Pan.)的根[1]。D- 半乳糖醛酸(Fluka,进口分装),无水乙醇、丙酮、无水乙醚、正丁醇、氯仿、四硼酸钠、浓硫酸、间羟基联苯、氢氧化钠均为分析纯。

1.2 仪器及设备

T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);AB104-N电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);TDL-5A离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司);EYELA SB-1000型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 新疆赤芍多糖的制备

称取新疆赤芍粉末50g(60目筛),置圆底烧瓶,加石油醚(沸程60~90℃)400mL回流2h,脱脂后,抽滤,风干;加入80%乙醇500mL,回流2h,抽滤,残渣挥干乙醇;加入蒸馏水500mL浸泡过夜;回流1h,趁热抽滤,连续提取2次。残渣用热水洗涤20mL×3次,抽滤,合并洗液于滤液中。减压浓缩至200mL,加Sevag试剂(氯仿-正丁醇5∶1)30mL,手摇10min,离心3000r/min,15min萃取去除蛋白质,重复3次,收集水层,加入无水乙醇使成80%的乙醇溶液4℃醇沉过夜,离心取沉淀依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤10mL×3次,经真空干燥后得新疆赤芍多糖。

2.2 试剂的制备

2.2.1 半乳糖醛酸标准溶液

精密称取5.00mg半乳糖醛酸,加蒸馏水溶解并定容至100mL的量瓶中,混匀,制备成50μg/mL的标准溶液。

2.2.2 四硼酸钠-浓硫酸溶液

精密称取四硼酸钠0.956g,置于200mL容量瓶,加浓硫酸使其溶解并定容至刻度,即得。

2.2.3 间羟基联苯溶液

准确称取间羟基联苯0.15g,用0.5%氢氧化钠溶液溶解并定容至100mL的量瓶中,即得。

2.2.4 葡萄糖标准溶液

精密称取25.00mg葡萄糖,加蒸馏水溶解并定容至50mL的量瓶中,混匀,制备成500μg/mL的标准溶液。

2.3 试验方法及最大吸收波长的选择

取半乳糖醛酸标准溶液1.0mL置于20 mL具塞试管中,冰水浴中缓慢加入5.0mL四硼酸钠-浓硫酸溶液,摇匀,沸水浴中加热5min,取出,冰水浴中冷却后加入100μL间羟基联苯溶液,混匀后振摇5min,静置待气泡完全除尽。同时以1.0mL蒸馏水同上操作制得空白液,于紫外可见分光光度计上扫描,确定其最大吸收波长为525nm。

2.4 间羟基联苯法显色条件的优选

2.4.1 四硼酸钠-浓硫酸溶液用量考察

取半乳糖标准溶液1.0mL,在冰水浴中分别加入四硼酸钠-浓硫酸溶液4.0~6.0mL,其余操作同“2.3”项,测定吸光度。结果见表1。

结果显示,随着四硼酸钠-浓硫酸溶液用量的加大,吸光度相应增高,但当四硼酸钠-浓硫酸溶液用量超过5.0mL时吸光度降低。因此5.0mL的四硼酸钠-浓硫酸溶液为最佳用量。

2.4.2 沸水浴加热时间考察

取半乳糖标准溶液1.0mL,加入四硼酸钠-浓硫酸溶液5.0mL,分别加热3、5、7、9、11、13min,其余操作同“2.3”项,测定吸光度。结果见表2。

结果显示,水浴加热5min即可反应完全。

2.4.3 间羟基联苯用量考察

取半乳糖标准溶液1.0mL,加入四硼酸钠-浓硫酸溶液5.0mL,水浴加热5min,分别加入间羟基联苯溶液70、80、90、100、110、120、130μL,其余操作同“2.3”项,测定吸光度。结果见表3。

结果显示,加入80μL间羟基联苯溶液吸光度最大,且较为稳定,因此80μL为最佳用量。

2.4.4 显色时间考察

取半乳糖标准溶液1.0mL,加入四硼酸钠-浓硫酸溶液5.0mL,水浴加热5min,冰水浴冷却后加入间羟基联苯溶液80μL,摇匀,分别于不同显色时间测定吸光度,结果见表4。

结果显示,显色时间对吸光度影响不大,故直接选取了10min。

最终确定显色条件为:四硼酸钠-浓硫酸溶液5.0mL,沸水浴中加热5min,加入间羟基联苯80μL,显色时间10min。

2.5 中性糖对糖醛酸含量测定的影响

采用“间羟基联苯法”测定糖醛酸含量时,需考察中性糖(如葡萄糖)对其测定结果的影响,即在一定浓度的半乳糖醛酸标准溶液中添加不同质量的中性糖,用来考察不同质量浓度的中性糖对半乳糖醛酸溶液的吸光度是否具有影响,结果见表5。

结果显示,随着中性糖含量的增加,吸光度值变化不大,此结果表明,采用间羟基联苯法测定糖醛酸含量时,中性糖对其测定结果的影响很小。

2.6 标准曲线制备

分别取半乳糖醛酸标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL置于20mL具塞试管中,冰水浴中缓慢加入5.0mL四硼酸钠-浓硫酸溶液,摇匀,沸水浴中加热5min,冰水浴冷却后再加入80μL间羟基联苯溶液,混匀后振摇5min,静置,以1.0mL蒸馏水制得空白液,显色10min后在525nm处测定吸光度。以标准糖醛酸含量(μg)为横坐标,吸光度A为纵坐标,绘制标准曲线(图1)。计算标准曲线的回归方程和相关系数,A=0.00843C+0.00312(R2=0.9996),标准曲线的线性范围为:5~30μg/mL。

2.7 方法学考察

2.7.1 精密度试验

精密称取新疆赤芍多糖10.0mg置100mL容量瓶中,加水溶解并定容至刻度,精密移取1.0mL,按“2.6”项下方法连续测定6次, RSD为0.37%。

2.7.2 稳定性试验

精密移取上述供试品溶液1.0 mL,按“2.6”项下方法操作,在0~2h内每隔20min测定1次吸光度,RSD为0.92%,结果表明供试品溶液2h内稳定。

2.7.3 重复性试验

精密移取上述供试品溶液6份,每份1.0 mL,按“2.6”项下方法操作,RSD为1.37%。

2.7.4 加样回收率试验

精密移取上述供试品溶液9份,每份0.4mL,分别加入不同体积已知含量的半乳糖醛酸标准溶液,按 “2.6”项下方法测定吸光度,计算得半乳糖醛酸的平均回收率为101.73%,RSD为1.80%,结果见表6。

2.8 样品含量测定

按上述糖醛酸含量测定方法,同时重复3次,经测定吸光度值分别为 0.204、0.208、0.211,计算得新疆赤芍多糖中糖醛酸含量分别为 24.05%、24.54%、24.88%, 平均含量为 24.49%,相对平均偏差为1.20%。可以看出3个样品中糖醛酸含量的结果基本相同,无显著差异,该方法简便可靠稳定性良好,准确度高。

3 讨论

在热的浓硫酸作用下,多聚半乳糖醛酸水解为半乳糖醛酸单体,浓硫酸用量影响其水解的程度,适量的四硼酸钠可增加半乳糖醛酸显色的敏感性,而四硼酸钠-浓硫酸溶液与多聚半乳糖醛酸的水解反应须在沸水浴加热的条件下才能进行,间羟基联苯可与半乳糖醛酸单体进行反应,并将其转化衍生后显色。目前多糖中糖醛酸含量的测定大都选用间羟基联苯法,但其测定条件各文献报道中存在着较大的差异,为此,本研究逐一考察了影响测定的几个主要因素,并筛选出最佳试验条件,进一步提高了实验结果的科学性与准确性。方法学考察的结果表明间羟基联苯法适用于对新疆赤芍多糖中糖醛酸含量测定,最终测得新疆赤芍多糖中糖醛酸的平均百分含量为24.49%,相对平均偏差1.20%,为今后新疆赤芍多糖的进一步研究和开发利用奠定了基础。

摘要：目的:测定新疆赤芍多糖中半乳糖醛酸的含量。方法:采用间羟基联苯法对新疆赤芍多糖中的半乳糖醛酸进行含量测定,并研究四硼酸钠-浓硫酸溶液用量、加酸后沸水浴时间、间羟基联苯溶液用量、显色时间及中性糖对测定结果的影响。结果:最佳测定条件为:四硼酸钠-浓硫酸溶液用量5.0mL,沸水浴加热5min,间羟基联苯用量为80μL,显色时间10min,测定波长为525nm。新疆赤芍多糖中糖醛酸的平均含量为24.49%。结论:间羟基联苯法适用于新疆赤芍多糖中半乳糖醛酸的含量测定。

多糖测定 篇10

1 实验部分

1.1 主要试剂和仪器

海参多糖标准溶液:精密称取海参多糖标准品以水配制成0.26mg/mL溶液。天青Ⅰ试液:取天青Ⅰ试剂0.5g,以水稀释至500mL,放置一星期。过滤除去不溶物,得天青Ⅰ储备液,冷藏保存。临用时取储备液1mL加水至加20mL。海参多糖样品:本实验室自制。GS54型紫外可见分光光度计。

1.2 实验步骤

1)标准曲线绘制

精密量取海参多糖标准溶液10.0、20.0、30.0、40.0、50.0μL分别加水至50μL,依次加入天青Ⅰ试液5.0mL,混匀后10min内于515nm波长处测定吸光值,以水为空白对照,绘制标准曲线,经整理后结果如下:

式中:y为吸光值(A);x为多糖质量浓度(μg/mL)

2)测定方法量程的确定

精密量取海参多糖标准溶液20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、120.0、140.0μL,依次加入天青Ⅰ试液5.0mL,混匀后10min内于515nm波长处测定吸光值,以水为空白对照,绘制吸光度曲线。结果见图1。

由图1可知,在一定的天青Ⅰ试液浓度下,随着多糖加入量的增大,吸光值会达到饱和,其变化脱离线性范围。所以此方法的测定量程为多糖20~80μL,质量浓度为0.26mg/mL,即含5.2~20.8μg多糖,相对应的吸光值为0.29~0.44。

2 样品分析

2.1 多糖样品的提取

将刺参匀浆,加入蛋白酶完全水解,离心后浓缩,用Sevage法去除蛋白质后离心。得到的上清液双氧水脱色后用乙醇沉淀多糖,经凝胶柱纯化后冷藏备用。

2.2 样品含量测定

精密量取供试多糖样品1.0mL置于10mL容量瓶中以水定容,摇匀,得样品液。量取25μL样品液,加入天青Ⅰ试液5.0mL,混匀后10min内于515nm波长处测定吸光值,以水作为空白对照。如果样品的吸光值在量程范围内,则参照标准曲线计算多糖含量;否则将稀释样品的浓度作适当调整,以使吸光值最终落在量程范围内。

2.3 加标回收实验

分别取海参多糖标准溶液50μL,连续测定5次,结果为:此方法精密度RSD值1.5%,回收率范围是(96.0±2.0)%。

2.4 稳定性实验

取质量浓度为0.11mg/mL的自制海参多糖样品溶液1.00mL,加入天青Ⅰ试液50mL,混匀后平均分成10份,每隔1h测定1次含量,结果含量的RSD值0.58%,表明此方法的成色物质在10h内稳定。

3 结论

天青Ⅰ试剂测定海参多糖含量方法在量程范围内线性关系良好,较其他分光光度法能够较好地避免杂质的影响。须要注意的是:

其一,多糖溶液在进行测定之前必须先除盐,并且调整样品溶液的pH值至中性。金属离子的存在或酸碱会严重地干扰测定。

其二,测定时的天青Ⅰ试液在515nm处吸收值应为0.25±0.01,必要时用水或储备液进行调整。天青Ⅰ试液的浓度不能太大或太小:如果浓度太大,其本身的吸光值就超过最佳测量范围,增加系统误差;如果浓度过小,则导致量程减小,也会增加系统误差。因此经过使用不同浓度的天青Ⅰ试剂进行实验,确定天青Ⅰ试液在515nm处吸收值为0.25±0.01为宜。

参考文献

[1]樊绘曾,陈菊娣,林克忠.刺参酸性粘多糖的理化性质、毒性及抗肿瘤研究[J].药学学报,1980,15(5):263-269.

[2]马同江,周清凯,蔡云见.海参的药理作用及应用[J].海洋药物,1982,2(2):9-13.