药物测定（精选8篇）
药物测定 篇1
头孢菌素类抗生素是一类广谱半合成抗生素。根据该类抗生素产品问世年代的先后顺序和药理特性的不同可将其分为第一、二、三和四代。就前三代头孢菌素类抗菌活性而言, 其对革兰阴性菌的抗菌活性一代比一代强, 但对革兰阳性菌的抗菌活性却一代不如一代。第四代头孢菌素除具有第三代的特性外同时又对革兰阳性菌有很强的抗菌活性, 头孢菌素类抗生素具有广谱、高效、稳定、过敏反应发生率低等特点, 因此在临床上很受欢迎。对该类药物含量进行检测对指导其临床应用具有极其重要的意义, 用于头孢菌素, 类含量测定的传统检测方法有微生物效价法和分光光度法, , 前者因费时、操作复杂而近年极少采用后者的灵敏度较低, 近年除了在印度应用仍较多外, 在中国和其他国家均应用较少。高效液相色谱法具有分离效率高、选择性好、分析速度快、操作自动化、应用范围广等优点, 是用于头孢菌素类抗生素含量测定的主要方法。高效毛细管电泳法、化学发光法及电化学法在近年中发展很快, 已被大量用于头孢菌素类抗生素的质量分析。由于头孢菌素类抗生素经处理后能发出荧光, 故荧光分析法在该类药物中的应用也较多。近红外光谱法是近年来发展迅速的质量分析方法, 并在头孢菌素类抗生素的含量测定中也有尝试。以下是对上述各分析方法应用状况的概述:
1 高效液相色谱法
C8柱和C18柱是测定抗生素的常用色谱柱, 特别是被称为万能柱的C18柱尤为常用。在用高效液相色谱法对生物样品中的药物含量进行测定时, 须对生物样品进行预处理, 以去除蛋白。头孢菌素类抗生素的生物样品预处理方法主要包括有机溶剂沉淀法和酸性沉淀剂沉淀法。其中常用的有机溶剂有甲醇和乙睛, 而常用的酸性沉淀剂有三氯醋酸和高氯酸。若所测定的头孢菌素类品种在酸性条件下不稳定, 则可采用有机溶剂沉淀法。因头孢菌素类抗生素具有紫外可见吸收, 故测定样品时多用携带紫外检测器的。常用缓冲液有醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液及磷酸盐缓冲液。
2 高效毛细管电泳法
高效毛细管电泳是近年发展起来的一种以高场电压为驱动力, 以毛细管为分离通道, 依据样品中各组分滴度和分配行为的差异来实现组分分离的一类液体分析技术, 其同时兼有电泳和高效液相色谱的特点。常用于测定头孢派酮、头孢拉定等抗生素。药物的毛细管电泳背景电解质有磷酸盐、四硼酸钠等缓冲液。缓冲液浓度越高, 分离效果越好, 但通过毛细管的电流随之增大, 易损坏仪器。
3 化学发光分析法
根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或反应的发光总量来确定反应中相应组分含量的分析方法, 称为化学发光分析法。化学发光法具有灵敏度高、线形范围宽、仪器设备简单等优点, 其与流动注射技术结合后, 更兼有分析速度快、精密度高、易实现自动化的特点。由于高锰酸钾、可溶性锰能与部分头孢菌素类药物反应, 产生微弱的化学发光, 在加人多聚磷酸、甲醛或荧光素等后, 发光强度增强, 所以高锰酸钾与可溶性锰均能作为头孢菌素类药物含量测定化学发光法的化学发光体系。
4 荧光分析法
某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长更长的荧光, 当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时, 物质在一定浓度范围内的发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系。荧光分析法正是利用这一正比关系来对物质进行定量分析的。此法具体应用为用酸或碱将被测物水解, 产生荧光物质, 通过测定其荧光强度来测定样品含量。部分头孢菌素类抗生素如头孢拉定的水溶液具荧光, 其荧光强度与含量成正比。荧光分析法具有灵敏度高、选择性好等优点, 特别适合于药物代谢产物的分析。
5 近红外光谱法
近红外光谱技术是近年来发展迅速的绿色分析技术, 其主要反映的是含氢基团的倍频和合频, 光谱信息丰富, 光谱特性稳定, 非常适用于药品原辅料及制剂的定性及定量分析。现在国内外已用此法对头孢克洛、头孢拉定等头孢菌素类抗生素的含量测定进行了研究, 研究结果证明, 该方法简便可行、无损、无污染、准确度高。
6 电化学分析法
电化学分析法的基础是在电化学池中所发生的电化学反应。电化学池由电解质溶液和浸入其中的个电极组成, 这个电极用外电路接通。在这个电极上发生氧化还原反应, 电子通过连接这个电极的外电路从其中的一个电极流到另一个电极。电化学分析法系根据溶液的电化学性质与被测物质的化学或物理性质之间的关系, 将被测定物质的浓度转化为一种电学参量加以测量一种分析方法。该法灵敏度高、选择性好, 因而被广泛应用于药物分析。
结语
综上所述, 目前对头孢菌素类抗生素的含量测定主要有色谱法、化学发光法、荧光法、近红外光谱法及电化学法等。高效液相色谱法分离效能高, 应用范围八是头孢菌素类抗生素的主要含量测定手段。高效毛细管电泳法是目前研究最多的色谱新方法, 在经济性、实用性等方面显示了巨大的优势, 因此在头孢菌素类抗生素含量检测中有巨大的应用空间。化学发光法是近年来越来越受到重视的一种分析测试方法, 是一种高灵敏度的微量及痕量分析技术, 具有线性宽、仪器设备简单等优点, 将其与流动注射技术联用, 可达到分析快速、重现性好、自动化程度高的目的。随着对化学发光体系的进一步研究, 化学发光法渐渐走向成熟, 将越来越多地应用于各种药物的含量检测。荧光分析法用于测定具有荧光基团的物质, 适用范围窄, 但具有灵敏度高、专属性强等优点, 因此有关该法在头孢菌素类抗生素含量检测方面的研究较多。近红外光谱法作为绿色分析技术具有方便、快速、高效、非破坏、无污染、成本低等优点, 是药物非破坏性分析的一种快捷方法, 但由于该法是一种需要建模的二次分析方法, 故其适用性和推广性受到一定限制。
摘要：对头孢菌素类抗生素分析方法的应用现状作一简单概述, 并分别对目前常用的分析方法高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、化学发光法、荧光分析法、电化学分析法以及极具推广价值的分析方法近红外光谱法等在头孢菌素类抗生素含量测定中的应用作一评述。
关键词：头孢菌素,分析方法,药物质量
药物测定 篇2
关键词：牛奶；蜂蜜；氟喹诺酮类药物；残留量；薄层色谱法
中图分类号： TS207.5 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0380-04
氟喹诺酮类（FQs）系化学合成药物，因价格低廉、抗菌活性强，在医学特别是在兽医学中应用广泛。由于致病菌产生的耐药性和某些FQs的潜在致癌性质，其残留问题已引起广泛关注[1-4]。氟喹诺酮类检测是动物源性食品中药物残留分析的重要研究内容。检测氟喹诺酮类药物残留的方法有微生物法、薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱检测法等[5-6]，牛奶、蜂蜜中氟喹诺酮类药物残留检测方法主要为高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱法，运用薄层色谱法进行检测的研究较少。用于检测食品中喹诺酮类药物残留的国家标准GB 29692—2013《牛奶中喹诺酮类药物残留的测定》和GB/T 23412—2009《蜂蜜中喹诺酮类药物残留的检测》均采用液相色谱-质谱/质谱法测定氟喹诺酮类残留。由于仪器设备昂贵、检测方法复杂、试验成本高的限制，该方法在国内普及还需要较长时间。本研究应用近年来在兽药残留检测中应用日趋广泛的分散固相萃取样品前处理净化技术（quickly，easy，cheap，effective，rugged，safe，QuEChERS）[7-11]，用薄层色谱法对牛奶、蜂蜜中氟喹诺酮类残留进行筛选，以期找出更为经济简便、更适用于基层部门监管食品安全的氟喹诺酮类药物残留检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料
牛奶样品、蜂蜜样品各15批，均为市售。6种氟喹诺酮类标准品：恩诺沙星（纯度为98.50%，货号为C 13170000，批号为lot：91111）、沙拉沙星（纯度为95.50%，货号为C 16908000，批号为lot：10407）、双氟沙星（纯度为97.50%，货号为C 12627000，批号为lot：91103）、诺氟沙星（纯度为9950%，货号为C 15648000，批号为lot：10214）、环丙沙星（纯度为95.00%，货号为C 11668500，批号为lot：00526）、丹诺沙星（纯度为94.00%，货号为C 11960500，批号为lot：00920），以上标准品均来自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。
1.2 仪器与试剂
仪器：ATS-4型自动点样仪[瑞士CAMAG（卡玛）公司]；TD6M型医用离心机（长沙平凡仪器有限公司）；BT2202S型电子分析天平（德国Sanorius公司）；TALBOYS 型涡旋仪（美国亨利特里姆有限公司）。
试剂：乙腈（色谱纯，美国天地试剂公司）；冰乙酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；三乙胺 （分析纯，成都市科龙化工试剂厂）；N-正丙基乙二胺（PSA）（美国SELECTRA公司）；正己烷（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司 ）；无水硫酸镁（分析纯，天津市美琳工贸有限公司）；无水硫酸钠（分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司）；薄层板（Merck板，尺寸为100 mm×200 mm）。
1.3 对照品溶液的制备
1.3.1 标准贮备溶液 分别称取恩诺沙星10.11 mg、沙拉沙星10.27 mg、双氟沙星10.22 mg、诺氟沙星10.89 mg、环丙沙星10.70 mg、丹诺沙星10.81 mg，置于10 mL容量瓶中，加入20 μL甲酸和适量甲醇溶解，最后用甲醇稀释至刻度，摇匀。分别吸取上述溶液1 mL置于100 mL容量瓶，用0.2%甲酸水溶液稀释至刻度，摇匀，即得恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、丹诺沙星浓度分别为9.958 3、 9.907 8、9.964 5、10.835 6、10.165 0、10.161 4 μg/mL的标准贮备溶液。
1.3.2 混合标准使用溶液 分别吸取恩诺沙星、双氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星标准贮备溶液1 mL，沙拉沙星标准贮备溶液5 mL，丹诺沙星标准贮备溶液0.2 mL，置于同一个10 mL量瓶，用0.2%甲酸水溶液稀释至刻度，摇匀，即得0.995 8 μg/mL恩诺沙星、 4.904 1 μg/mL沙拉沙星、 0.996 4 μg/mL双氟沙星、1.083 6 μg/mL诺氟沙星、1.016 6 μg/mL环丙沙星、 0.203 2 μg/mL丹诺沙星的混合标准使用溶液（临用前现配）。
1.4 供试品溶液的制备
1.4.1 牛奶样品溶液的制备 称取牛奶样品10 g于50 mL离心管中，加入5%乙酸乙腈溶液15 mL，涡旋1 min；加入无水硫酸钠1.5 g和无水硫酸镁6 g，涡旋5 min，4 000 r/min离心5 min，取上清液于另1个50 mL离心管中，加入正己烷5 mL，涡旋1 min，分取下層溶液。将上述残渣加入10 mL 5%乙酸乙腈溶液中，涡旋1 min，4 000 r/min离心5 min，取上清液经同一份正己烷萃取，合并下层溶液，置于50 ℃水浴锅上蒸干。将上述残渣加入2 mL 0.2%甲酸水溶液中，再加入PSA净化剂0.2 g和无水硫酸镁0.5 g，涡旋1 min，4 000 r/min离心5 min，上清液过0.45 μm微孔滤膜，备用。
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1.4.2 蜂蜜样品溶液的制备 称取蜂蜜样品5 g，置于100 mL离心管中，加入Mcllvaine缓冲液约5 mL，涡旋1 min；加入5%乙酸乙腈溶液至50 mL，涡旋10 min；加入无水硫酸镁5 g，涡旋2 min。5 000 r/min离心5 min，吸取上清液 25 mL 至蒸发皿中于50 ℃水浴蒸干，加0.2%甲酸水溶液2 mL，加入PSA净化剂0.2 g，涡旋1 min，离心，取上清液过 0.45 μm 微孔滤膜，备用。
1.5 点样
在同一默克薄层板上，距板底边13 mm处依次点6种氟喹诺酮标准使用溶液、混合对照溶液和供试品溶液各5 μL，将溶液点成带状，带状宽度为3 mm。
1.6 展开及检视
以三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水-水（体积比 15 ∶ 10 ∶ 4 ∶ 2 ∶ 1）为展开剂，饱和15 min后上行展开，取出，晾干，再喷3%三氯化铽乙醇溶液，100 ℃烘1 min，取出，冷至室温，在365 nm波长下检视。
2 结果与分析
2.1 样品结果判断
如果供试品色谱中与对照色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，被视为疑似阳性样品。试验表明：15批牛奶样品供试品色谱中，有3批样品在与对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点，则视为疑似阳性样品，分别是2号、4号、11号样品，其他样品在与对照品色谱相应位置上均未显相同颜色的斑点，初步判断其他12批样品中未检出6种氟喹诺酮类药物残留物。15批蜂蜜样品供试品色谱中，有6批样品在与对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点，则视为疑似阳性样品，分别是17号、19号、26号、27号、28号、29号样品，其他9批样品在与对照品色谱相应位置上均无显相同颜色的斑点，初步判断其他9批样品未检出6种氟喹诺酮类药物残留物。从牛奶检测结果图谱（图1）可见，基质对样品测定结果基本无干扰，说明牛奶样品前处理方法是适用的；从蜂蜜检测结果图谱（图2）可见，蜂蜜基质对样品测定结果有干扰，说明蜂蜜前处理方法不够完善。
2.2 专属性
取对照品溶液和自制模拟样品溶液用点样仪点样，然后展开及检视。结果表明，该方法专属性强，阴性样品无干扰，适用于牛奶、蜂蜜中6种氟喹诺酮类药物的快速筛查。结果见图3。
2.3 检出限
供试品溶液色谱中待检查的斑点应与相应的对照品溶液或系列对照品溶液的相应斑点比较，颜色（或荧光）不得更深。结果表明，牛奶、蜂蜜中环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、双氟沙星的检出限均为10 μg/kg，丹诺沙星的检出限为2 μg/kg，沙拉沙星的检出限为20 μg/kg。
2.4 质谱确认结果
将疑似阳性样品经过质谱确认，结果显示所有疑似阳性样品中有3批为阳性样品，其余几批均为假阳性样品。质谱确认结果见表1，色谱图和质谱图见图4至图9。
2.5 展开剂的考察
分别考察了5种展开系统：（1）四氢呋喃-乙酸乙酯-异丙醇-氨水（体积比4 ∶ 3 ∶ 6 ∶ 3）；（2）三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水（体积比16 ∶ 10 ∶ 4 ∶ 3）；（3）三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水（体积比15 ∶ 10 ∶ 4 ∶ 3）；（4）三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水（体积比15 ∶ 10 ∶ 7 ∶ 3）；（5）三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水-水（体积比15 ∶ 10 ∶ 4 ∶ 2 ∶ 1）。结果表
明，系统1中6种喹诺酮只呈现4个点，其中丹诺沙星和沙拉沙星、恩诺沙星和双氟沙星无法分离；系统2中6种喹诺酮只呈现5个点，其中丹诺沙星和沙拉沙星无法分离；系统3/系统4中丹诺沙星和沙拉沙星无法分离；只有系统5中6种喹诺酮均能分离，且Rf值为0.2～0.8。故选择系统5为展开剂，饱和15 min，直立上行展开8～10 cm，取出，晾干。在紫外波长365 nm下观察6种氟喹诺酮的斑点，并测量Rf值进行定性。
2.6 显色剂的考察
分别考察了3%三氯化铋乙醇溶液、3%三氯化铽乙醇溶液2种显色剂，在波长365 nm 下检视。结果显示，3%三氯化铽乙醇溶液显色后在波长365 nm下斑点明显易于观察。另外考察了1%、3%、5%、7%三氯化铽乙醇溶液的显色效果，结果显示， 3%三氯化铽乙醇溶液显色后在波长365 nm下斑
点明显易于观察、无扩散。故选择3%三氯化铽乙醇溶液作为最终显色剂。
2.7 薄层板的选择
在选定条件下，分别运用国产高效硅胶G 预制板、国产普通硅胶G 预制板、自制板、H板、Merck板，观察分离效果。结果表明，在Merck板中的分离效果优于其他薄层板，斑点清晰，条带无扩散，因此选择Merck板进行薄层鉴别。
2.8 耐受性考察
用不同浓度的硫酸溶液来控制薄层板的相对湿度，观察
展开剂在5种湿度下的展开情况。结果显示，湿度为32%～72%时，均能获得较好的分离效果。分别在高温（40 ℃）、室温（20 ℃）、低温（4 ℃）环境下考察温度对展开效果的影响，发现在各温度条件下均能获得较好的分离效果。
2.9 净化剂及其用量选择
目前对于氟喹诺酮类药物残留的净化大多数选择固相萃取。但是此方法操作步骤繁琐、费用较高且回收率普遍偏低。本研究对近年来在农药、兽药残留应用广泛的样品前处理技术QuEChERS进行了探索。目前分散固相萃取技术常用的吸附剂有C18 、NH2、PSA、PAX 等4种，根据牛奶基质特点，选取C18、PSA比较其净化效果及其对目标物的影响。试验表明，2种吸附劑对目标物的影响没有明显区别，但C18对牛奶中蛋白质和蜂蜜中糖提取物净化效果有限，故采用PSA作为净化剂。比较0、25、50、75、100、150、200 mg/mL PSA下的净化效果，发现过量使用吸附剂会吸附目标化合物，吸附剂使用较少时净化效果不佳，当吸附剂用量为100 mg/mL时目标物几乎无损失，且净化效果较好。因此选择PSA净化剂用量为100 mg/mL。
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3 结论
本研究建立了牛奶、蜂蜜中诺氟沙星、环丙沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星等6种氟喹诺酮类的快速检测方法，即薄层鉴别法。本方法简单、快速，灵敏度高，检出限均可满足兽药残留筛查检测要求。本方法为牛奶、蜂蜜中氟喹诺酮类药物残留监测提供了简单、快速的前处理和检测手段，适用于大批量牛奶、蜂蜜样品中氟喹诺酮类药物残留的筛选。本方法也适合其他对象中该类兽药残留的监测，为食品安全快速检测研究提供了研究基础。参考文献：
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药物测定 篇3
1 防突变浓度的提出
最小抑菌浓度的测定之所以不能发现潜在的耐药突变菌株,是由于标准的最小抑菌浓度测定所使用的细菌浓度为每毫升含活菌1×104～1×105 cfu,而细菌自发突变的频率仅为1×10-7。刘静等[1]通过大量药敏实验发现,仅通过药敏实验筛选药物并不完全可靠,最小抑菌浓度测定所需的细菌接种量并不能代表实际的细菌感染量。因此,考虑耐药突变株存在的细菌敏感性测定方法更有意义。Y.Dong等[2]提出的防突变浓度考虑到了突变亚群在高浓度菌群出现的可能性,并在研究中将1×1011 cfu的金黄色葡萄球菌和结核分枝杆菌均匀涂布于含不同浓度氟喹诺酮类药物的琼脂平板上,随着药物浓度的增加,菌落生长出现了2次明显的下降。第1次菌落生长下降出现在MIC99时,此时野生菌株的生长被抑制,之后进入一个相对稳定的平台期,这时对含药平板上的菌落进行DNA测序,证实是耐药突变菌株;随着药物浓度进一步增加,菌落生长出现第2次明显下降,直到药物浓度高至某一限度时含药平板中无菌落生长,提示该浓度能阻断突变菌株的生长,将此药物浓度定义为防突变浓度。也就是说防突变浓度是指当大量细菌存在时,防止耐药突变株被选择性富集所需的最低抗菌药物浓度。值得注意的是,防突变浓度只适用于敏感性评判标准认为对抗菌药物敏感的细菌。
2 防突变浓度的测定方法
测定防突变浓度的常用方法是将浓度大于1×1010 cfu的菌液均匀涂布于含抗菌药物的琼脂平板上,每浓度4个平板,并使每个平板的细菌接种总量大于1×109 cfu,37 ℃孵育48～72 h(视细菌种类而定)后进行菌落计数,以不出现菌落生长的最低抗菌药物浓度为暂定防突变浓度(MPCpr),再以暂定防突变浓度为基准,线性增减(20%)抗菌药物浓度,以不出现菌落生长的最低药物浓度定为防突变浓度。显然,防突变浓度测定方法过于繁琐,不适于临床实验室。J.M.Blondeau[3]尝试用一种改进的肉汤微量稀释法与琼脂稀释法测定的防突变浓度进行比较。结果表明,两种方法都有较好的重复性。简单地说,该方法就是将1×101～1×109 cfu的细菌暴露于倍比递增药物浓度的微量培养板上,经过适当条件及时间的培养,以接种1×105 cfu而未见细菌生长的药物浓度为最小抑菌浓度,以接种≥1×107 cfu而未见细菌生长的药物浓度为防突变浓度。
3 防突变浓度的意义
3.1 突变选择窗假说
突变选择窗(MSW)指MIC99与防突变浓度之间的范围,自从K.Drlica[4]提出防突变浓度后,又提出一个建立在防突变浓度基础之上的假说,该假说的核心内容有两点:一是当抗菌药物浓度在突变选择窗内时,细菌耐药突变株发生富集和扩增;二是当抗菌药物浓度高于防突变浓度时,即可严格限制耐药突变株的富集。该假说提出后,A.A.Firsov 等[5]通过体外药代动力学/药效动力学(PK/PD)模型首先证明了突变选择窗的存在。其具体做法是将金黄色葡菌球菌暴露于4种氟喹诺酮类药物中,分别使药物浓度小于最小抑菌浓度、位于突变选择窗内但大于防突变浓度,通过测定最小抑菌浓度来评价细菌耐药突变体富集的情况。结果表明,只有当药物浓度大部分时间处于突变选择窗内时,耐药突变体被选择性富集扩增,最小抑菌浓度提高。随后,崔俊昌等[6]通过建立兔组织笼金黄色葡萄球菌感染模型,并给予不同剂量的左氧氟沙星灌胃治疗,体内试验结果证实了突变选择窗的存在。在对抽取的组织笼内组织液进行药物浓度测定及监测组织笼内细菌药物敏感性变化时发现,当药物浓度位于突变选择窗内时,导致金黄色葡萄球菌耐药突变体的选择富集,但当药物浓度高于防突变浓度时无耐药菌出现,从而得出保持抗菌药物浓度在突变选择窗以上可以限制耐药突变体的选择性富集。在防突变浓度基础上提出的突变选择窗,人为地给易使细菌耐药突变株富集的药物浓度设定了一个范围,这有助于更好地把握用药剂量,为抗菌药物的合理应用提供了新策略。
3.2 评估及预测药物抗细菌突变能力
对于已经应用于临床的抗菌药物,应根据测得的防突变浓度使给药剂量既能达到治疗细菌感染的目的,同时又能防止耐药突变菌株的富集;通过比较不同药物的防突变浓度,还可以得到较理想的治疗方案。通过测定恩诺沙星、诺氟沙星和环丙沙星对分离于鸡的13株空肠弯曲杆菌的防突变浓度,发现3种氟喹诺酮类药物有不同的防突变浓度范围,其顺序为诺氟沙星>环丙沙星>恩诺沙星,这说明在体外试验中,与环丙沙星和诺氟沙星相比,恩诺沙星能更好地降低空肠弯曲杆菌突变的产生[7]。K.Credito等[8]通过比较左氧氟沙星、吉米沙星、莫西沙星对肺炎链球菌的防突变浓度时得出莫西沙星的防突变浓度最低;因此,对耐药突变株的增殖表现出较低的选择压力。K.Credito等[9]在测定碳青霉烯类抗生素对4种共100株革兰阴性杆菌的防突变浓度时,同样发现建立在防突变浓度上的药物浓度能够降低细菌感染数量,以及限制耐药亚群的选择性扩增。试验充分证实了防突变浓度的临床意义,选择防突变浓度较低的抗菌药物既可以达到治疗效果,还可以防止耐药突变株的富集。使用高于防突变浓度的治疗剂量固然比较理想,但某些药物的防突变浓度过高,甚至超过了机体所能承受的最高剂量,此时再使用高于防突变浓度的治疗剂量显然是不得当的,正是基于这种问题的存在,学者开始尝试联合用药来降低防突变浓度值。刘明涛等[10]通过测定美罗培南、头孢他啶、阿米卡星和环丙沙星单药及与奥美拉唑联用时的防突变浓度,评价其预防铜绿假单胞杆菌耐药突变的能力。结果发现,联合用药可降低防突变浓度。此外,刘洋等[11]研究发现,酒石酸泰乐菌素与阿莫西林钠联合使用时的防突变浓度低于两者单独使用时的防突变浓度,而且缩小了2种单药对猪链球菌的突变选择窗。
临床上测定防突变浓度,或者通过联合用药降低防突变浓度虽然有助于降低耐药突变菌株的产生,却不能从根本上解决细菌的耐药问题。对于已经应用于临床的药物,改变其防突变浓度困难较大,但对于正在研发的新药来说,可将防突变浓度作为新药研发时的一个评价指标,使得新药的正常使用剂量在防突变浓度之上,这样就有可能从根本上杜绝耐药突变株的富集。
4 防突变浓度与最小抑菌浓度的相关性
虽然突变选择窗为MIC99到防突变浓度之间的范围,但最小抑菌浓度和防突变浓度本身却没有显著的相关性。 G.Sindelar等[12]通过测定氟喹诺酮类药物阻断耻垢分枝杆菌生长和野生菌群选择耐药突变的能力。结果表明,防突变浓度和最小抑菌浓度的相关性非常小(r2=0.39)。防突变浓度的提出者K.Drlica等[13]同样得出类似结果,他们通过已测定的几种氟喹诺酮类药物对5种细菌及3种大环内酯类药物对肺炎链球菌的防突变浓度和最小抑菌浓度进行线性回归分析,发现氟喹诺酮类药物的相关性低于0.5,大环内酯类药物高于0.5[13]。防突变浓度与最小抑菌浓度的低相关性非常复杂,K.Drlica等[13]给出的解释是这些临床分离株很可能包含突变亚群,从而使药物敏感性发生很大的改变,当突变富集到一定程度时,会促成最小抑菌浓度的广泛变化。这些分离株也有可能包含许多不同的多阶突变或能代表测定防突变浓度的最敏感亚群;因此,不能通过最小抑菌浓度来估计防突变浓度,对个体使用防突变方案时需测定防突变浓度。
5 防突变浓度与药代动力学或药效动力学
药物代谢动力学(PK)是研究药物在体内如何吸收、分布、代谢和排泄的,而药物效应动力学(PD)是研究药物在体内及感染组织中的活性机制和药效。研究表明,抗菌药物的抗菌活性可受药代动力学或药效动力学影响,所以将最小抑菌浓度与药代动力学、药效动力学相结合来评价药物的抗菌活性更具有临床意义。自从防突变浓度提出后,学者同样期待可以将防突变浓度与药代动力学/药效动力学参数结合起来。S.K.Olofsson等[14]通过研究大肠杆菌对环丙沙星耐药选择的体外动力学模型,从而确定药物暴露与防突变浓度之间的关系,并由此得出药时曲线下面积与防突发浓度的比值(AUC/MPC)将成为预防耐药突变菌群富集的下限。在研究大肠杆菌感染的体外药效学模型中环丙沙星药物剂量与防突变浓度之间的关系时,S.K.Olofsson 等[15]证实了他的推断,当 AUC/MPC>35 时可以防止一步耐药突变,AUC/MPC>105时则可以防止二步耐药突变株。而G.P.Allen等[16]从药效学角度分析了淋球菌对氟喹诺酮类药物的耐药选择时发现,AUC/MPC可变区的最小值可以预防耐药突变的出现,更高值可以增强对耐药突变的抑制,这也进一步证实了以上试验。综上所述,AUC/MPC是预防耐药突变株出现的重要的药代动力学和药效动力学参数之一。
6 小结与展望
防突变浓度是继最小抑菌浓度之后的又一种测定细菌敏感性的新方法,并且已经逐渐得到研究者的重视。目前,对于防突变浓度的研究主要集中在通过测定防突变浓度来预测及评估现有抗菌药物抗细菌耐药突变的能力,以及将防突变浓度与药代动力学和药效动力学相结合找出最合适的给药剂量;但是,因其存在测定方法相对比较复杂、缺少统一标准等问题,使其在临床应用上受到一定的限制;而防突变浓度对于抗菌药物抗细菌耐药突变能力的预测使其在新药开发中的应用更具吸引力,在确定给药剂量时将防突变浓度作为一个指标,制订科学合理的给药方案,可避免耐药菌株的产生。
摘要：防突变浓度指防止细菌的耐药突变株被选择性富集所需的最低药物浓度,作为一种细菌敏感性测定的新方法,防突变浓度可用于预测及评估抗菌药物的防突变能力,从而使临床用药更为合理。文章就防突变浓度的测定方法、意义及其与最小抑菌浓度(MIC)、药代动力学、药效动力学的关系进行了综述,为掌握抗菌药物敏感性测定的新方法及合理使用抗菌药提供参考。
药物测定 篇4
1 方法
1.1 流动相
在有关物质的测定中, 虽然各品种项下对流动相及其比例都有具体的规定, 但对有些分子离子型化合物, 如阿替洛尔, 笔者在测定其项下的有关物质时发现流动相的配制、p H值都对其测定影响较大, 由于其流动相是磷酸盐缓冲液, 在测定中其基线在短时间内很难平衡, 一般需要4h以上才能进样, 其流动相中使用到的辛烷磺酸钠, 不同厂家对其测定影响也比较大, 以下是国产辛烷磺酸钠和进口辛烷磺酸钠在测定阿替洛尔片中的图谱 (见图1、图2) , 可见在测定有关物质时最好使用进口辛烷磺酸钠。另外流动相的p H对阿替洛尔的存在形式 (分子态或离子态) 影响也比较大, 实验中需要严格控制。
1.2 系统适用性试验
系统适用性试验是使用高效液相色谱法必须满足的前提条件, 主要包括理论板数、分离度、重复性、拖尾因子。
1.2.1 理论板数、分离度、检测波长均应符合标准对该品种项下有关物质测定作出的规定。
1.2.2 重复性
HPLC法测定药物中的有关物质在有关标准中没有对重复性作出具体规定, 参照中国药典 (2010年版) 附录ⅤD高效液相色谱法[1]对系统适用性试验作出的规定, 为了评价色谱系统响应值的重复性能, 最大限度的减少系统带来的误差, 外标法和自身对照法均应做重复性试验。对于外标法, 由于其本身属于含量测定, 杂质对照品应连续进样5针, 但根据其含量较低, 一般不超过标示量的百分之几, 其RSD可适当放宽, 对RSD的规定可参照药典中加校正因子的主成分自身对照法项下对对照溶液的规定, 即杂质含量规定<0.5%的, 峰面积的RSD应<10%;含量在0.5%~2%的, 峰面积的RSD应<5%;含量>2%的杂质, 峰面积的RSD应<2%[1]。对于自身对照法, 对照溶液也应连续进样5针, 但如果在含量测定中已经做过重复性试验, 在有关物质的测定中则可以不做, 其RSD的规定也可参照加校正因子的主成分自身对照法中对RSD的规定。
1.2.3 拖尾因子
在用高效液相色谱法测定杂质含量时, 一般没有对此作出具体的规定, 但为了防止拖尾严重对积分面积带来的影响, 从而影响测定的结果, 可根据实际要求将其控制在0.85~1.15之间。
1.3平行试验
由于外标法是定量测定样品中杂质的含量, 因此供试品溶液、对照品溶液应分别配制2份, 每份分别进样2针。对于自身对照法测定药物中的杂质含量, 其本身的测定方法是限量测定且使用自身作为对照溶液, 一般情况下样品溶液可以配制一份, 供试品溶液和对照溶液分别进样2针, 通过2针峰面积的平均值计算其含量, 试验结果存在边缘的数据, 需要进行复验的要进行复验。
1.4 杂质对照品
在用杂质对照品测定药物中的有关物质时选取的方法不同, 杂质对照品所起的作用也不同。如在测定阿司匹林肠溶片中的水杨酸时, 药典规定使用外标法, 杂质对照品在此其定量作用;在测定硝苯地平片中的有关物质时使用的是不加校正因子的主成分自身对照法, 硝苯地平杂质Ⅰ、Ⅱ其定位作用。
1.5 溶剂峰
外标法测定药物中有关物质的含量, 溶剂峰一般不会对测定结果有影响。但在用自身对照法测定药物中的有关物质含量时, 要注意去除溶剂峰带来的影响;在计算杂质总量时, 也要考虑去除溶剂峰;溶剂峰一般进样2次, 待流动相基线平稳后进样, 记录图谱时间应和供试品溶液记录时间一致, 结果取其平均值。
1.6 其他试验条件
根据药物中存在杂质的类型不同, 如一些易发生降解产生杂质的药物, 也要根据试验情况作出具体的调整, 如柱温、流速、避光、实验室温湿度等。如阿司匹林在试验操作中对温湿度比较敏感而易发生降解, 试验操作中如果引入水分或者实验室温湿度太大均会发生降解, 柱温太高也会加速其分解, 从而造成重复性试验不符合要求;硝苯地平见光易发生分子内的歧化反应, 其片剂在除糖衣的过程中易发生降解, 从而造成重复性试验不符合要求, 应在暗室内操作;一些易发生拖尾或者分离度达不到要求的需要降低流速等等。
1.7 积分参数
在最小峰面积的设定中, 标准中一般没有作出具体的规定。根据实际工作经验, 可以考虑小于对照溶液主峰面积的5%的峰给予舍弃, 因此时的峰面积与仪器噪音相当, 可以或略不及;如果标准中作具体规定的应按照标准要求取舍。
1.8 结果表述
对于外标法结果一般表述为杂质xx不得过标示量的xx。对于自身对照法的结果一般表述为供试品溶液的色谱图中如有杂质峰, 单个杂质峰面积不得大于对照溶液的主峰面积, 各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的xx。因两者测定的方法不同, 结果表述也不相同。
1.9 面积归一化法
由于面积归一化法在测定药物中的杂质时误差较大, 现已不多使用, 本文不再做具体的分析。
2 讨论
高效液相色谱法测定药物中的有关物质方便、快捷、仪器自动化程度高, 但是由于受到仪器、流动相、系统试验等多种外在因素的影响, 所以操作者在使用中遇到问题时, 要综合分析以上因素来消除对测定结果带来的影响。
摘要：分析HPLC法测定药物中有关物质时的操作要点。从HPLC法使用的流动相到积分参数的设定等8个环节给予分析。该方法虽方便、快捷, 但易受多种外部因素影响, 试验中要综合考虑以免对测定结果有影响。
关键词：HPLC法,药物测定,有关物质
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典 (二部) [S].北京:化学工业出版社, 2010:附录29.
[2]中国药品检验标准操作规范[s].2010年版/中国药品生物制品检定所编-北京:中国医药科技出版社, 2010, 6.
药物测定 篇5
磺胺类药物残留在动物组织中的检测方法主要有酶联免疫法[4]、高效液相色谱法[5,6]、液相色谱质谱法[7,8],为提高检测效率,多残留检测已成为发展的必然趋势。由于仪器灵敏度以及选择性上的优势,LC-MS/MS以及UPLC-MS/MS 逐渐成为多残留检测的重要手段。本研究建立了同时检测虾中16种磺胺类残留的LC-MS/MS检测方法。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
Agilent 6410B液相色谱三重串联四级杆质谱仪,配有电喷雾离子(ESI)源。分散机,离心机,氮吹仪,旋涡振荡器。
磺胺类药物标准品的纯度均不低于99.0%,均购于Dr.Ehrenstorfer GmbH;乙腈、甲醇、甲酸、醋酸铵均为色谱纯(Merck公司);实验用水均为超纯水(电阻率达到18.2MΩ.cm);硫酸钠为分析纯;0.1%甲酸溶液(含2.5mmol/L醋酸铵)。
标准储备液及工作液的配制:分别称取标准品各10.0 mg,用甲醇溶解后转移至100mL棕色容量瓶中,用甲醇定容,于-20℃条件下保存。使用时将上述标准储备溶液混合,用甲醇稀释成不同浓度的标准工作液。
1.2 分析条件
1.2.1 色谱条件
色谱柱为C18(Kenetex C18, 2.1×100mm, 2.6μm);进样体积为10μL;柱温为30℃;流动相:A为0.1%甲酸水溶液(含2.5mmol/L醋酸铵),B为乙腈,流速为0.2mL/min;梯度条件见表1。
1.2.2 质谱条件
大气压电喷雾离子源(ESI),正离子模式;毛细管电压为4000V,雾化器压力为38psi,氮气温度为350℃,流速为9L/min;采用多反应监测(MRM)模式,各种药物的采集参数见表2。
1.3 样品前处理
准确称取5.0g均质样品置于50mL具塞离心管中,10g无水硫酸钠,再加入20mL乙腈,均质1min,于涡旋混合器上提取1min,以4000r/min离心5min,收集上清液。残渣再加入20mL乙腈提取。合并乙腈提取液,加入10mL异丙醇45℃旋转蒸干。准确加入2.0mL甲醇水(体积比为20:80,水为0.1%甲酸水)涡旋振荡溶解残留物,再加入2.0mL正己烷涡旋混合1min,转移于5mL具塞离心管中,以4000r/min离心5min,取下层液体过0.22m滤膜,滤液用于LC-MS/MS测定。
2 结果与讨论
2.1 结果
2.1.1 线性关系
测定各药物质量浓度均为25,50,100,200,500μg/L的混合标准溶液,得到的线性回归方程。各药物均在25~500μg/L进样质量范围内与其峰面积呈线性关系,相关系数均大于0.99。
2.1.2 检测限和定量限
在5μg/kg添加水平时,各药物峰的信噪比均大于3,故将其定为检出限。在10μg/kg添加水平时,各药物峰的信噪比均大于10,且回收率、相对标准偏差(RSD)满足条件,故将其定为定量限。
2.1.3 回收率和精密度
分别称取2份阴性虾试样,添加混合标准溶液,使加标水平分别达到5,10μg/kg,充分混匀,按照本文建立的方法进行测定,每个添加水平作6份平行测定。结果见表2。
续表
*quantification irons.
2.2 讨论
2.2.1 色谱柱的选择
文献[7,8]报道用于SAs分析的色谱柱多采用反相色谱柱,如C8、C18柱。实验分别对Eclipse Plus C18,ZORBAX SB-C18和Kenetex C18色谱柱进行比较,结果发现:在Eclipse Plus C18,ZORBAX SB-C18上一些SAs没能得到很好的分离;而采用Kenetex C18时各种SAs均获得良好的分离效果且比较稳定,并且在普通液相上实现了很好的分离效果。
2.2.2 流动相的选择
流动相的pH值对SAs的分离和保留具有显著的影响。虽然质谱分析并不要求在色谱柱上完全分离,但所要分析的SAs药物中存在3组母离子和子离子均相同的化合物(磺胺邻二甲氧嘧啶和磺胺间二甲氧嘧啶,磺胺氯哒嗪和磺胺氯吡嗪,磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪和磺胺邻甲氧嘧啶),对于这类化合物的质谱分析则要求必须在色谱柱上分离,否则会互相干扰测定。采用0.1%甲酸来控制流动相的pH值,同时在流动相的水相中加入醋酸铵,可以在保持较好分离度的前提下获得理想的色谱峰、减小加合峰、增大分子离子峰的峰强度。本文采用乙腈、0.1%甲酸溶液(含2.5mmol/L醋酸铵)为流动相,采用合适的梯度淋洗条件,很好地实现了SAs的分离,并且各峰峰形尖锐,峰对称性好。
2.2.3 质谱条件的优化
根据磺胺类化合物具有仲氨基或叔氨基的化学电离性质,选用ESI+作为离子化模式,采用仪器自带优化软件opitimer进行质谱条件的优化,实验结果表明,磺胺在离子源ESI+电离方式下,可获得较高丰度的[M+H]+母离子。另外,分析目标物中存在三组母离子和子离子均相同的化合物,在数据分析时,软件自动处理会出现三组分析物的识别错误,必须手动加以修改,这给数据分析带来极大的不方便,可以采用分时间段扫描的方法,在提高灵敏度的同时,增加数据处理的方便性,但是磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪的保留时间软件仍无法区别,必须手动输入。
3 结 论
本文建立了虾中16种磺胺类药物残留的HPLC-MS/MS测定方法。方法准确度和精密度高,且方法的定量限达到5μg/kg,能够满足美国、日本、欧盟等国家的出口限量要求,并且已经用于水产品中磺胺类药物残留的确证检验。所建立的多残留检测方法大大地提高了检测的稳定性和可靠性,对水产品的安全卫生工作意义重大。
参考文献
[1]张海琪,宋琍琍,等.液相色谱-串联质谱法同时测定大黄鱼中20种磺胺类药物残留[J].分析化学研究简报,2007,35(2):268.
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[3]Editorial Board of the Residue Limits of the Agricultural Chemicals inFood.Residue limits of the agricultural chemicals in food.Food vol-ume:Japan positive list system.Beijing:China Standard Press.
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[7]董丹,邵兵,等.液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱法测定鸡肉中17种磺胺类药物的残留[J].色谱,2005,23(4):404.
药物测定 篇6
目前用于该种药物的检测方法有:微生物法、薄层色谱法、分光光度法、化学发光法、液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等[3]。已有的方法存在灵敏度不高、前处理繁琐或重现性不好等问题, 很难满足对药物残留的确证检测[4]。本方法选用鸭肌肉组织为分析对象, 建立了一种检测四环素类药物的快速、简便、灵敏度高的液相色谱-串联质谱 (LC-MS-MS) 方法, 可以满足当前该类药物的残留检测。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂
Waters2695 Quattro micro液质联用仪 (美国WATERS公司) ;高速冷冻离心机 (美国Sigma公司) ;固相萃取装置 (美国Supelco公司) ;旋转混合器 (IKA公司) ;PL203电子天平 (瑞士Mettler-toledo公司) ;氮吹仪 (美国OA-SYS公司) ;酸度计PB-21 (美国Orion公司) ;Sep-pak C18 6CC萃取小柱 (500 mg) 。
四环素、土霉素和金霉素的盐酸盐标准品购自中国兽医药品监察所, 纯度>99.5%;甲醇、乙腈为默克公司的色谱纯;甲酸为美国ACS恩科公司的色谱纯;柠檬酸 (含一个结晶水) 、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠、氢氧化钠均为分析纯;所用水为屈臣氏瓶装纯净水。
1.2 试验方法
1.2.1 标准储备液配制
分别取盐酸四环素、盐酸土霉素和盐酸金霉素对照品适量, 精密称定。按四环素、土霉素和金霉素计, 用甲醇溶解并稀释成浓度均为1 mg/m L的溶液, 作为标准储备液。置-20℃冰箱中保存。
1.2.2 四环素、土霉素和金霉素工作液
精密量取标准储备液适量, 用甲醇-水 (3:7, V/V) 溶液稀释成适宜浓度的四环素、土霉素和金霉素标准工作液。
1.2.3 Mc Ilvaine-Na2EDTA缓冲液
分别取柠檬酸12.9 g, 磷酸氢二钠10.9 g, 乙二胺四乙酸二钠37.2 g, 加水900 m L溶解, 用1 mol/L氢氧化钠溶液调p H值至4.0±0.5, 加水稀释至1 000 m L, 即得。
1.2.4 样品前处理方法
称取均质的鸭肌肉组织2.0 g, 置于50 m L离心管中, 加入Mc Ilvaine-Na2ED-TA缓冲液8 m L, 涡旋充分混匀, 10 000 r/min离心10 min (温度为4℃) , 取上清液于另一离心管中。重复提取一次, 合并上清液, 经快速滤纸过滤后备用。Sep-pak C18固相萃取柱依次用甲醇5 m L、水5 m L预洗。取备用液8 m L过柱, 用3 m L10%甲醇水溶液淋洗, 减压抽干。用5 m L5%氨水甲醇溶液洗脱, 收集洗脱液, 氮气吹干 (温度低于40℃) 。最后用甲醇-水 (3:7) 1.0 m L溶解残留物, 过滤膜后作为试样溶液, 供高效液相色谱-串联质谱仪测定。
1.3 色谱条件
色谱柱:Xbridge C18 2.1*150 mm, 粒径5μm。流动相A为0.3%甲酸乙腈溶液;B为0.3%甲酸水溶液。柱温:35℃, 进样体积20μL, 流速:0.2 m L/min。流动相梯度洗脱条件见表1。
1.4 质谱条件
采用电喷雾正离子检测;毛细管电压:3.8 k V;锥孔电压:25 V;离子源温度110℃;雾化温度:350℃。质谱参数见表2。
2 结果与分析
2.1 标准曲线
分别精密量取标准储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 m L置于10 m L容量瓶, 稀释成含四环素、土霉素和金霉素分别为5、10、20、50、100、200、400 ng/m L的溶液, 见表3。
2.2 方法的检出限和定量限
将标准溶液用样品空白基质稀释后进样, 进样量为20μL, 以信噪比为3倍时的溶液浓度为检出限, 由此得出四环素、土霉素、金霉素的检出限 (LOD) 分别为5 ng/m L、5 ng/m L、10 ng/m L, 结果见表3。以信噪比为10倍的溶液溶度为定量限, 称样量为2.0 g, 前处理后定容至1.0 m L, 则四环素、土霉素、金霉素的定量限均为20 ng/m L。
2.3 方法的精密度和准确度试验
取经检测四环素、土霉素、金霉素含量低于检测限度的鸭肉, 分别添加一定浓度的标准溶液, 相当于50、100和200ug/kg (即1/2的MRLVDs、MRLVDs和2倍的MRLVDs) 3个浓度水平, 每个浓度5组平行样, 按1.2.2所述方法提取制备后进行处理, 进行回收率试验和精密度试验, 回收率均在80.6%~106.3%, RSD均在0.6%~4.2%, 符合方法学要求, 结果见表4。
3 结论
本研究建立了鸭肉中四环素类抗生素的定性和定量方法。样品在4℃条件下高速冷冻离心, 可以较好地去除油脂类杂质, 同时, 收集液用快速滤纸过滤, 极大地加快了固相萃取小柱的净化洗脱速度, 整个前处理过程具有分离度高、快速的特点, 最后用甲醇-水溶解残余物, 可以确保样品溶液的稳定性和检测的灵敏度。
采用该方法, 检测了南方樱桃谷肉鸭生态养殖技术集成与示范项目的鸭肉192批次, 结果均未检测出该类药物, 说明该方法可用于实际样品的测定。
注:带*为定量离子。
摘要：采用液相色谱-串联四极杆质谱多离子反应监测定量法, 通过对试样净化预处理、色谱条件、质谱参数等的优化选择, 进行回收率、精密度等的验证, 建立了快速、准确测定鸭肉组织中四环素、土霉素、金霉素的检测方法。在10400 ug/L浓度范围内, 3种四环素类药物均呈线性, 相关系数r均大于0.99, 回收率均在80.6%106.3%。采用该方法检测了樱桃谷肉鸭192批, 均为阴性。
关键词：液相色谱-串联质谱法,四环素,土霉素,金霉素
参考文献
[1]滑静, 王建立, 张淑萍.动物性食品中四环素类药物残留的检测方法[J].药物检测, 2004, 21 (7) :26-33.
[2]李俊锁, 邱月明, 王超.兽药残留分析[M].上海:上海科学技术出版社, 2002:365.
[3]刘艳华, 张纯萍, 门立强, 等.液相色谱-串联质谱法测定鸡肌肉组织中的四环素类药物残留[J].色谱, 2005, 24 (2) :171-173.
药物测定 篇7
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 牙周炎常见菌。
牙周炎常见致病菌株: (1) 国际标准菌株:卟啉单胞菌 (牙龈卟啉单胞菌、不解糖卟啉单胞菌、牙髓卟啉单胞菌) 、普氏菌 (中间普氏菌、卢氏普氏菌、躯体普氏菌) 、放线菌 (伴放线杆菌、黏性放线菌、内氏放线菌) 、嗜二氧化碳菌 (牙龈嗜二氧化碳菌、黄褐色嗜二氧化碳菌) 、血链球菌、嗜沫嗜血杆菌、巨核梭形杆菌、韦荣氏球菌; (2) 药敏指示菌:多形类杆菌、脆弱类杆菌; (3) 分离菌株, 主要为从临床上牙周炎患者牙周袋内鉴定、分离的菌株, 包括18株类杆菌、56株放线菌、82株产黑色素菌群、57株梭形杆菌、13株伴放线杆菌、12株嗜沫嗜血杆菌、10株韦荣氏球菌、15株其他厌氧菌。
1.1.2 牙周炎抗菌药物。
本次研究共选用18种牙周炎抗菌药物:四环素类 (强力霉素、二甲胺四环素) 、大环内酯类 (克拉霉素、罗红霉素、红霉素、麦白霉素、阿奇霉素、交沙霉素、乙酰螺旋霉素) 、硝咪唑类 (替硝唑、甲硝唑) 、喹诺酮类 (曲氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、左旋氧氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星) 、克林霉素。
1.1.3 培养基:
选择放线菌、伴放线放线杆菌、梭形杆菌、产黑色素菌群作为培养基。
1.2 方法
1.2.1 对抗菌药物的筛选。
(1) 配置细菌悬液:在固体CDC培养基上接种上述国际标准菌株, 采取厌氧培养, 并保持温度在37℃, 5 d后即在液体培养基中置于新鲜细菌菌落, 继续进行厌氧培养, 2 d后再把液体CDC培养基稀释到一定浓度留置待用。 (2) 配置药敏培养基:对18种牙周炎抗菌药物进行稀释, 由浓到稀分为13个浓度, 把55℃混有5%羊血的CDC培养基与1 m L药液加14 m L的培养基进行混合, 分置到13个实验器皿中, 并设两个无药培养基以进行对照。 (3) 细菌点种:把稀释好的菌液用点种仪分先后点种到其中一个空白培养基和药敏培养基上, 进行先前对照观察;13个浓度的药敏培养基点种完后, 再把菌液点种到另一个空白培养基上, 进行后对照。将器皿放置到35℃的厌氧环境中进行培养, 5 d后观察最低抑菌浓度 (MIC) 。
1.2.2 对抗菌药物的活性测定:
(1) 用选择培养基对牙周炎患者牙周袋内取下的龈下菌斑进行致病菌株的培养; (2) 用分离的263株致病菌进行细菌悬液的配置; (3) 选用经对抗菌药物筛选试验后的三种效果最好的抗生素进行药敏培养基的配置; (4) 进行细菌点种; (5) 分析观察263株临床分离的菌株对三种抗生素的药物活性。
1.3 结果判断:
针对对抗菌药物的筛选, 平均血药浓度<MIC即为耐药, MIC≤平均血药浓度<MIC的5倍即为中度敏感, 平均血药浓度≥MIC的5倍即为高度敏感;针对对抗菌药物的活性测定, 用平均血药浓度分别与90%抑菌范围、50%抑菌范围、有效抑菌范围 (MIC) 进行比较。
2 结果
通过对牙周炎常见致病菌进行药物的筛选试验后取得了克林霉素、二甲胺四环素、环丙沙星这三种抑菌效果最好的抗生素, 并用临床分离的263株菌株进行了药物活性的测定, 得出了90%抑菌范围、50%抑菌范围、有效抑菌范围 (MIC) 。
其中二甲胺四环素的抑菌效果最好, 除了对产黑色素菌群的有效抑菌范围在0.06~64 mg/L, 对其他菌株的抑菌活性范围 (MIC) 均<0.06~64 mg/L;克林霉素对类杆菌、放线菌、产黑色素菌群、梭形杆菌的有效抑菌范围相同 (<0.06或>256 mg/L) , 对其他菌株的有效抑菌范围则不同;环丙沙星则对类杆菌、韦荣氏球菌的有效抑菌范围相同 (<0.06~16 mg/L) , 对其他菌株的有效抑菌范围都不同。
3 讨论
牙周炎是由特定的可疑致病菌所引起的慢性感染性疾病, 牙龈卟啉单胞菌、伴放线杆菌、福赛类杆菌这三类均属于革兰阴性杆菌、具有多种毒力因子的牙周致病菌已被世界牙周病研讨会所公认[2]。在大部分研究中, 黄褐色嗜二氧化碳菌、伴放线杆菌是导致青少年患上牙周炎的主要致病菌, 其中克林霉素、二甲胺四环素、强力霉素、环丙沙星对它们有较高的敏感性。而中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、巨核梭形杆菌、黏性放线菌则是导致成年人出现牙周病的主要原因, 克林霉素、二甲胺四环素、环丙沙星这三种抗生素对他们的敏感性最高[3]。
本次试验中得出的抑菌效果最好的三种抗生素中尤以二甲胺四环素的抗菌效果最好, 它是一种半合成的四环素类抗生素, 与同类其他药物相比, 具有更广的抗菌谱, 抑菌作用更强, 因此可作为临床上治疗牙周炎的首选药物。
参考文献
[1]杨暤.茶多酚联用奥硝唑对牙周可疑致病菌的体外抑菌活性研究[D].重庆:重庆医科大学, 2012.
[2]张研.克拉霉素治疗重度慢性牙周炎的基础与临床研究[D].天津:天津医科大学, 2012.
药物测定 篇8
有关畜禽产品中磺胺类药物残留检测的方法有很多种, 分为分光光度法、酶联免疫法、色谱分析法和质谱分析法, 其中以高效液相色谱法 (HPLC法) 的应用最广泛, 它也是国际公认的分析磺胺类药物残留的方法, 具有选择性强、灵敏度高、检出限低等优点[4]。研究建立了同时测定猪肉组织中7种磺胺类药物残留的高效液相色谱法, 为猪肉组织中磺胺类药物多残留的检测提供了重要的理论和实践依据, 可应用于畜产品质量安全监控。
1 材料
1.1 仪器
高效液相色谱仪 (型号为Agilent 1100) 、固相萃取装置 (型号为5982-9124) , 美国安捷伦公司生产;电子分析天平 (型号为AE-240) , 梅特勒仪器 (上海) 有限公司生产;均质机 (型号为AM-9) , 上海季诺科贸有限公司生产;司高速离心机, 德国Biofuge公司生产;涡旋混合仪 (型号为MS2) , 广州IKA分析仪器有限公司生产;旋转蒸发仪, 德国Heidolph公司生产;氮气吹干仪 (型号为OA-SYS) , 美国Organomation公司生产。
1.2 试剂
0.1 mol/L盐酸溶液、0.1%甲酸-乙腈溶液、50%甲醇-乙腈溶液、5%氨水甲醇溶液、乙腈、甲酸、乙酸乙酯、正己烷、盐酸、氨水、超纯水、磺胺醋酰、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺二甲异恶唑、磺胺苯吡唑, 均购自中国药品生物制品检定所。
1.3 标准溶液的配制
精密称取7种磺胺类药物对照品10 mg置于100 m L容量瓶中, 用乙腈溶解并稀释至刻度, 获得终浓度为100μg/m L的混合对照品储备液, 临用前用0.1%甲酸-乙腈溶液将储备液稀释成所需浓度的标准工作液。
2 方法
2.1 仪器条件
色谱柱为Symmetry C18柱 (250 mm×4.6 mm, 粒径5μm) , 流动相为乙腈 (A相) +0.1%甲酸水 (B相) , 梯度洗脱见表1, 检测波长为270 nm, 流速为1.0 m L/min, 柱温为室温, 进样量为20μL。
2.2 样品处理
称取样品 (5.00±0.05) g, 置于50 m L离心管中, 加入乙酸乙酯15 m L, 涡动10 min, 5 000 r/min离心10 min, 吸取上清液于100 m L鸡心瓶中, 再用乙酸乙酯重复提取1次, 合并两次提取液。40℃旋转蒸发近干, 加入0.1 mol/L盐酸溶解残渣5 m L, 转至50 m L离心管中, 加入0.1 mol/L盐酸3 m L洗涤鸡心瓶, 再用正己烷5 m L洗涤鸡心瓶, 转入同一离心管中, 涡动30 s, 3 000 r/min离心5 min, 弃正己烷, 取下层液, 备用。
依次用甲醇3 m L和0.1 mol/L盐酸活化MCX小柱, 全部备用液过柱, 用0.1 mol/L盐酸3 m L和50%甲醇-乙腈溶液淋洗, 用5%氨水甲醇5 m L洗脱, 洗脱液于40℃氮气吹干, 加入0.1%甲酸-乙腈溶液1.0 m L溶解残渣, 经0.45μm滤膜过滤后注入高效液相色谱仪进行测定。
2.3 线性关系考察
精密吸取一定量的对照品溶液, 用0.1%甲酸-乙腈溶液稀释成浓度分别为0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 5.0μg/m L的系列混合标准溶液, 由低浓度到高浓度供液相色谱仪测定。以峰面积为纵坐标, 对应的标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线, 求回归方程和相关系数。
2.4 灵敏度的测定
取一定量的标准工作液, 加入空白猪肉样品中制成空白添加样品, 经前处理后采用HPLC法进行测定, 观察不同浓度时各组分色谱峰信噪比, 以3倍信噪比 (S/N) 对应的药物浓度为检出限, 以10倍信噪比 (S/N) 对应的药物浓度为定量限。
2.5 回收率和精密度的测定
在空白猪肉样品中添加50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg浓度的样品, 每个浓度设5个平行, 计算加标回收率及相对标准偏差 (RSD) 。
3 结果与讨论
3.1 色谱图
7种磺胺类药物标准溶液、空白猪肉和空白猪肉添加标准溶液的色谱图, 见图1~3。
由图1~3可知, 在试验确立的条件下, 各组分得到了较好的分离, 7种磺胺类药物的峰形良好且互不干扰。
3.2 色谱条件的确定
在270 nm检测波长下, 试验比较了甲醇-水和乙腈-水体系作为流动相时的分离效果, 还分别在流动相中加入了0、0.05%、0.1%、0.3%、0.5%的甲酸, 结果表明, 以0.1%甲酸-乙腈溶液作为流动相可获得较好的分离度和色谱峰。这是由于磺胺类药物的分子结构中带有氨基, 呈弱碱性, 在流动相中加入适当浓度的甲酸能增加Symmetry C18柱内硅胶硅醇基的质子化, 可以减少硅醇基与磺胺之间的相互作用, 具有改善峰形, 减少拖尾的作用[5]。
1.磺胺醋酰;2.磺胺噻唑;3.磺胺吡啶;4.磺胺二甲嘧啶;5.磺胺氯哒嗪;6.磺胺二甲异恶唑;7.磺胺苯吡唑。
多组分磺胺的极性存在差异, 采用0.1%甲酸-乙腈溶液作为流动相等度洗脱时, 很难将各组分较好地分离。根据7种化合物极性的强弱, 试验采用梯度洗脱程序逐渐增加流动相中有机相的比例, 使7种磺胺类药物在23 min内实现有效分离。
3.3 样品提取条件的确定
磺胺类药物具有热不稳定性, 受热易分解, 可大大降低回收率。试验选择在40℃条件下进行旋转蒸干和氮气吹干操作, 能有效减少药物的流失, 提高了提取效率。
磺胺类药物带有氨基, 为碱性化合物, MCX混合型阳离子交换固相萃取小柱对碱性化合物具有较高的选择性和灵敏度, 能选择性地吸附磺胺, 达到净化的目的, 因此试验选择MCX小柱对样品进行净化处理。
3.4 方法线性相关性
精密量取一定量的对照品溶液, 制备0.05~5.0μg/m L一系列浓度的标准工作液并进行高效液相色谱测定, 以色谱峰面积 (y) 为纵坐标, 对照品溶液浓度 (x) 为横坐标绘制标准曲线。试验结果表明, 磺胺类药物浓度在0.05~5.0μg/m L范围内呈线性关系, 回归方程和相关系数, 见表2。
3.5 方法的准确度
在空白猪肉样品中添加3个浓度水平的标准溶液, 按照试验方法进行回收试验, 计算各组分加标回收率和精密度, 结果见表3。
3.6 方法的灵敏度
在本法操作条件下, 根据信噪比理论测得该方法的检出限为20μg/kg, 定量限为50μg/kg。
4 结论
研究建立了HPLC同时测定猪肉中7种磺胺类药物残留的方法, 在23 min内完成了7种磺胺组分的快速分离测定。在该方法的液相色谱条件下, 磺胺类药物在0.05~5.0μg/m L浓度范围内线性关系良好, 具有较高的灵敏度和精密度, 具有较好的重现性和回收率。
参考文献
[1]赵旭壮, 李明元.动物性食品中磺胺类药物残留检测研究进展[J].中国食品卫生杂志, 2012, 24 (3) :292-296.
[2]胡海燕, 徐倩, 孙雷, 等.猪肉和牛奶中10种磺胺类药物残留检测超高效液相色谱法研究[J].中国兽药杂志, 2009, 43 (8) :1-5.
[3]徐士新.欧盟动物源食品安全管理法规[M].北京:中国农业科学技术出版社, 2003.
[4]张萍, 陈燕, 王晓玲.固相萃取-高效液相色谱法同时测定鸡蛋粉中12种磺胺类药物残留量[J].药物分析杂志, 2010, 30 (12) :2338-2343.