免疫测定

免疫测定（精选8篇）

免疫测定 篇1

摘要：选取我院200例健康体检者, 分别以免疫透射和免疫散射比浊法检测免疫球蛋白和补体, 对比两种检测方式的准确性。结果两种检测方式结果均比较准确, 预期偏差均在可接受范围。免疫透射和免疫散射比浊法检测结果基本能保证实验室检查的准确性, 透射比浊法的稳定性和重复性优于散射比浊法, 透射比浊法较散射比浊法的检测精密度更高。

关键词：免疫透射,免疫散射比浊法,免疫球蛋白,补体

临床对血清中免疫球蛋白 (Ig G、Ig A、Ig M) 和补体 (C3、C4) 的测定方法主要采取免疫透射和免疫散射比浊法, 本次研究分别采用两种不同的仪器进行检测, 将两种方法的检测结果进行比较分析, 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2012年5月~2012年8月在我院进行健康体检的200例血清标本为研究对象, 其中男106例, 女94例, 年龄22~56岁, 排除感染性疾病及系统性疾病。所有样本浓度均符合 (CISI) Ep9￣A2中的要求, Ig G、Ig A、Ig M、C3、C4各浓度的水平尽量覆盖, 无黄疸、无脂浊、无溶血。

1.2 方法

健康体检者空腹采取静脉血3ml, 放置于不抗凝的无菌试管中, 分离血清并放置于一20℃冰箱中贮存备用;先用生理盐水对待测血清标本进行稀释, 测Ig A和Ig M时, 血清不稀释;测Ig G, 血清与生理盐水按照1:10的比例稀释;免疫透射比浊法采用贝克曼Dx C800生化分析仪, 免疫散射比浊法采用贝克曼IMMAGE800, 分别参照试剂盒及仪器说明书进行操作。

1.3 评估标准

1.3.1 批内重复性试验和批间重复性试验

批内重复性试验操作方法:分别取各检测项目中3份混合血清的高、中、低值, 将每份血清用两种方法重复检测5次。批间重复性试验操作方法:分别取免疫球蛋白 (Ig G、Ig A、Ig M) 和补体 (C3、C4) 的混合血清的高、中、低值, 然后分成8份标本贮存于-20℃冰箱中, 每天检测, 共检测8d, 并且每天检测时用2种方法检测1份标本。

1.3.2 比较方法试验

主要是评估两种测定方法的偏差。用5d时间做比较方法试验, 每天选取两份新鲜样本进行测试, 按照1￣2再2￣1的顺序做两次测定免疫球蛋白 (Ig G、Ig A、Ig M) 和补体 (C3、C4) 五项指标。

1.3.3 线性方案试验

选取6管混合血清 (第1管为原浓度, 第2￣6管分别按比例用生理盐水稀释) , 用两种方法测定免疫球蛋白和补体各指标的高值, 并分析测试结果[1]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0进行统计学分析。计量资料采用t检验, 以均数±标准差 (±s) 表示。P<0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 两种方法重复性试验结果对比

两种方法批内和批间重复性均较好, 批内重复性试验变异系数CV均值除C4 (透射法) 外均小于3%, 批间重复性试验CV均值除C4外均小于5%。见表1。

2.2 两种方法检测各指标的预期偏差和相对偏差对比

两种方法检测结果的偏差在可接受范围内, 检测免疫球蛋白指标时有较高的可靠性, 检测补体C3时, 低浓度点偏差达到15.34%, 补体C4高浓度点偏差达到14.56%, 需引起注意。见表2。

3 讨论

免疫透射和免疫散射比浊法是临床用于检测免疫球蛋白和补体的常用方法, 其检查原理相同, 只是采用的检测仪器和光信号有所区别。散射比浊法是一种免疫化学分析技术, 能快速、微量的对体液中特定蛋白质成分能自动化检测。传统认为散射比浊法比透射法准确度高, 更灵敏, 然而近10年来免疫透射比逐步成熟, 也逐渐替代了散射比浊法[2]。

免疫透射比浊法的原理主要是利用抗原和抗体的特异性结合形成的复合物, 通过对复合物形成量进行测定后对抗原或抗体进行定量的方法。技术要求:待测的抗原抗体复合物有足够大的分子量;保证抗体过量并具备高亲和力;检测过程中具有充分的反应时间;具备足够多的抗原抗体复合物数量[3]。免疫散射比浊法的原理是用一定波长的光沿着水平轴照射经过溶液时遇到其中的抗原抗体复合物, 光线被粒子颗粒折射下发生偏转后会产生散射光, 光线偏转的角度与抗原抗体复合物的大小、多少密切相关, 也与发射光的波长密切相关, 光的强度与抗原抗体复合物的含量成正比, 表示待测的抗原越多, 形成的复合物也就越多, 散射光会越强[4]。技术要求:检测时对光源强度、波长、测量角度及反应时间应进行适当选择, 抗原浓度要保证合适, 对离子的PH值、强度要选择适宜。

就本次研究而言, 两种方法分别检测免疫球蛋白 (Ig G、I-g A、Ig M) 和补体 (C3、C4) 各指标浓度水平具备良好的相关性, 而补体各指标检测时低浓度样本出现偏差较大, 可能因低浓度样本形成抗原抗体复合物较少, 可选择散射比浊法[5]。从检测精密度而言, 两种方法批内与批间重复性试验检测变异系数CV分析, 其中检测免疫球蛋白Ig G时, 散射比浊法CV值均高于透射比浊法, 透射比浊法的CV值较低, 重复试验更加准确, 可见透射比浊法的稳定性和重复性明显优于散射比浊法。其它指标的精密度基本符合要求[6]。透射法与散射法对比还具备抗干扰能力强、仪器投资成本较低、试剂消耗成本低、血样可直接与生化检查样本合用, 降低了采血成本, 检测时间短等优势。总之, 两种检测方法都有各自的优缺点, 相对而言, 免疫透射法更加实用和便利, 值得临床推广应用。

参考文献

[1]曾华, 罗玲, 何桂儿, 等.透射比浊法和散射比浊法测定免疫球蛋白和补体的评价[J].国际检验医学杂志, 2013, 34 (20) :2733-2734.

[2]石莉萍, 张利方, 秦滢, 等.免疫球蛋白、补体及胱抑素C对系统性红斑狼疮病程监测的临床价值[J].国际检验医学杂志, 2014, 35 (7) :901-902.

[3]刘少华, 邓文平, 李燕.免疫散射比浊法和免疫透射比浊法测定免疫球蛋白结果比较[J].重庆医学, 2012, 41 (15) :2034-2035.

[4]阮文清.免疫散射比浊法和免疫透射比浊法测定免疫球蛋白的结果分析[J].求医问药 (下半月) , 2012, 11 (3) :866-867.

[5]张倩, 周敬静, 徐华.免疫透射比浊法与免疫散射比浊法检测特定蛋白的比较[J].国际检验医学杂志, 2012, 33 (2) :2530-2531.

[6]朴美花.免疫球蛋白及补体检测在手足口病治疗中的临床应用研究[J].现代诊断与治疗, 2013, 24 (20) :4661-4662.

免疫测定 篇2

关键词：酶联免疫法；水产品；呋喃唑酮代谢物；残留量

硝基呋喃类药物是一种广谱抗生素，常用于水产动物疾病的治疗。常见的硝基呋喃类药物主要指呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林，它们的代谢产物分别为AOZ、AMOZ、AHD和SEM[1]。硝基呋喃类药物在体内代谢分解迅速，很难直接检测。而其代谢产物大部分与蛋白质紧密结合，在体内残留时间较长且较为稳定[2]，采用普通的加工方法也很难使其大量降解。因此一般采用对硝基呋喃类代谢产物的检测[3-5]，以达到硝基呋喃类药物的管理和监控目的。

呋喃唑酮代谢物（AOZ）为硝基呋喃类药物中最具代表性的一种，目前各国对呋喃唑酮的使用都有严格的规定。欧盟规定动物源性食品中不得检出硝基呋喃（包括呋喃唑酮）。美国 1993年禁止呋喃唑酮作为兽药。我国农业部农牧发[2002]1号《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》中规定动物源性食品中呋喃唑酮不得检出。最常用的检测呋喃唑酮的方法主要有：酶联免疫法（ELISA）[6-7]、高效液相色谱法（HPLC）[8]、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[9]。酶联免疫法测定呋喃唑酮代谢物具有精密度和灵敏度较高、检测时间短、且检测样本量大等特点。

1 材料与方法

1.1 材料及设备

1.1.1 实验材料 鲢鱼、牙鲆、鲤鱼和草鱼，均来源于唐山市各县市区水产养殖场及水产公司。

1.1.2 试剂及主要设备 乙酸乙酯，正己烷，三水合磷酸氢二钾，浓盐酸，氢氧化钠，以上试剂均为分析纯。

酶标仪 Thermo MK3；氮气吹干仪（天津艾维欧科技发展有限公司）；恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；均质机（天津市太斯特仪器有限公司）；涡旋仪（上海跃进医疗器械厂）；微量移液器 Thermo Electron；AOZ酶联免疫试剂盒（北京望尔生物技术有限公司生产，灵敏度：0.025 μg/kg，最低检测限：0.1 μg/kg）。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 选取鲢鱼、牙鲆、鲤鱼和草鱼四类样品，剔去鱼皮、鱼骨和内脏，取鱼肉部分均质备用。称取1.00 g±0.05 g已均质样品于50 mL离心管中，分别加入4 mL 去离子水，0.5 mL 1 mol/L盐酸，100 μL衍生化试剂，充分振荡，置于37 ℃孵育16 h。分别加入5 mL 0.1 mol/L磷酸氢二钾、0.4 mL 1 mol/L氢氧化钠和5 mL乙酸乙酯，充分振荡， 4 000 r/min离心 10 min。取2.5 mL乙酸乙酯相于10 mL玻璃试管中，50 ℃ N2吹干。加入1 mL正己烷溶解，加入1 mL复溶液，振荡混合，4 000 r/min 离心10 min，除去上层有机相，取下层水相50 μL用于分析。

2.2.2 检测步骤 取出试验所需数量的微孔板条，插入框架。将样品和标准品对应微孔按序编号，并记录标准孔和样品孔所在位置。加入50 μL的标准液、样品到对应微孔中。然后加入抗体工作液50 μL，轻轻震荡混匀后于室温下避光环境中反应30 min。甩出孔中液体，每孔每次用250 μL洗涤液洗板3～5次，每次间隔10 s，用吸水纸拍干。加入酶标二抗溶液100 μL（将酶标二抗浓缩液用复溶工作液按照1∶10进行稀释），充分混匀，用盖板膜盖板后于避光环境中反应30 min。重复洗板。每个孔中加入底物A溶液50 μL，再加底物B溶液50 μL轻轻振荡混匀，室温环境下避光反应15 min。每孔加终止液50 μL，振荡混匀，酶标仪在波长450 nm/630 nm处读取OD值。

1.3 结果计算

1.3.1 百分吸光率的计算 样品或标准品的百分吸光率等于标准品或样品的吸光度的平均值（B）除以0 μg/kg标准的吸光度值（B0），再乘以100%。

1.3.2 标准曲线的绘制与计算 以标准品百分吸光率的对数为纵坐标，以AOZ标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线图。将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线中读出样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中AOZ的实际浓度。本实验采用试剂盒专业分析软件进行绘制标准曲线和样品浓度的计算。

1.3.3 回收率的计算 添加AOZ样品的计算浓度（x1）减去空白样品中AOZ的浓度（x0）除以实际添加AOZ的浓度（x），再乘以100%。

2 结果与讨论

2.1 样品衍生化与前处理

在AOZ的检测中，一般先加入衍生化试剂进行衍生。AOZ衍生过程反应如图1所示。这主要是由于呋喃唑酮的代谢物AOZ的分子量较小，不易被检测。而在37 ℃酸性条件下，加入衍生化试剂2-硝基苯甲醛后，形成衍生产物2-NP-AOZ，分子量增大，大大提高了检测灵敏度。

2.2 标准曲线绘制和样品残留量测定

分别向微孔中添加浓度为0 μg/kg、0.025 μg/kg、0.075 μg/kg、0.225 μg/kg、0.675 μg/kg、2.025 μg/kg的标准品，以标准品百分吸光率的对数为纵坐标，以AOZ标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线如图2，制得标准曲线为y=-0.844 3 ln（x）-1.708 1，R2=0.998 3。

nlc202309011858

本实验选取四组、共12批水产鱼类样品，分别为鲢鱼、牙鲆、鲤鱼和草鱼。经样品前处理后，采用酶联免疫法进行分析，测得其中AOZ的浓度，结果如表1所示。数据显示四组水产样品浓度均小于1 μg/kg，依据农业部公告第235号进行判定，结果呈阴性。其中第一组鲢鱼样品中测得的AOZ的浓度较小，均小于0.05 μg/kg。而第二组牙鲆样品中AOZ浓度均大于其他三组。这可能是由于牙鲆为海水鱼，其他三组均为淡水鱼。有研究表明，海水养殖场出水口附近的海水及底泥可能有硝基呋喃类代谢物残留[10]。这可能是导致牙鲆中AOZ含量稍高的原因之一。采用LC-MS-MS方法对这四组水产品进行确证检测，所得结果均为阴性。说明采用该试剂盒方法所检测的样品结果无假阴性。

2.3 回收率和相对标准偏差

分别向空白鱼肉中添加0.5、1、2 μg/kg的标准溶液，经计算回收率和相对标准偏差（RSD）结果如表2所示。结果显示，添加样品的回收率均控制在90%～110%之间，RSD值小于5%。说明采用该试剂的方法能够有效检测水产品中AOZ。

3 结论

通过样品衍生化和乙酸乙酯提取AOZ，采用酶联免疫试剂盒的检测方法，测得四组水产样品，所得结果均为阴性。与LC-MS-MS检测结果一致。说明该试剂盒的检测结果无假阴性。在空白样品中添加不同浓度水平的AOZ标准液，回收率在90%～110%之间。该试剂盒的方法能够有效检测水产品中AOZ的残留量。酶联免疫法操作简便，检测时间短，可以作为实验室样品的快速筛选方法。但是由于酶联免疫法的结果有可能出现假阳性，无法作为最后的确证结果，实验结果还需要液相色谱串联质谱方法进行确证。

参考文献：

[1] 王习达，陈辉，左建忠，等.水产品中硝基呋喃类药物残留的检测与控制[J].现代农业科技，2007（18）：152-155

[2] 张海琪，丁血燕，薛辉利，等.呋喃唑酮在泛纳宾对下组织中代谢动力学研究[J].宁波大学学报，2009，22（4）：472-746

[3] 杨琳，傅红，刘强.水产品苗种中硝基呋喃代谢物的高效液相色谱-串联质谱法测定[J].食品科学，2010，31（12）：206-211

[4] 邱建华，陈瑞清.呋喃唑酮在动物体内的代谢及代谢物残留检测研究进展[J].福建畜牧兽医，2006，28（6）：80-81

[5] 沈美芳，宋红波，丁涛，等.酶联免疫法与LC-MS/MS法测定水产品中呋喃唑酮代谢物[J].食品科学，2008，29（05）：363-366

[6] 解秋菊，徐仲.酶联免疫法检测水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ的残留[J].食品研究与开发，2010，31（8）：122-124

[7] 闵成军，罗晓琴，汪善良，等.酶联免疫法检测猪肉中呋喃唑酮代谢物残留量[J].肉类研究，2011，25（12）：29-32

[8] 刁石强，吴燕燕，李来好，等.高效液相色谱法测定水产养殖底泥中呋喃唑酮残留量的研究[J].南方水产，2010（6）2：53-58

[9] 徐英江，宫向红，田秀慧，等.海产品中硝基呋喃类原药的超高效液相色谱串联质谱测定[J].分析测试学报，2010，29（4）：327-330

[10] 徐英江，宫向红，田秀慧，等.UPLC MS /MS测定海水及沉积物中硝基呋喃类代谢物的研究[J].环境化学，2009，28（4）：606-607

免疫测定 篇3

笔者通过流式细胞术检测经DC/CIK细胞免疫治疗前后胃癌患者外周血T、Th、Ts、NK、B细胞、CD4+CD25+调节性T细胞的变化及细胞因子INF-γ、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10的变化情况, 了解胃癌患者经DC/CIK细胞治疗前后机体的免疫功能情况, 探讨DC-CIK细胞免疫治疗对于胃癌患者免疫功能的影响。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例来源

31例患者, 均经病理活检或影像学检查确认为Ⅲ~Ⅳ期胃癌, 其中男21例, 女10例, 年龄48~71 (平均59岁) 。DC/CIK细胞免疫治疗为上海科莱迅公司提供技术支持, 每位患者细胞生物治疗为1个疗程, 共回输DC细胞4次, CIK细胞4次, 每次回输细胞数不低于109个。回输过程中1例男性患者出现低热, 予对症处理后症状缓解。

1.1.2 主要实验试剂和仪器

PE标记的鼠抗人CD4、CD8、CD19、CD16、CD56、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10抗体, FITC标记的鼠抗人CD3、CD25、IFN-γ、IL-2抗体, 同型对照分别为PE标记的鼠抗人Ig G1免疫球蛋白, FITC标记的鼠抗人Ig G1免疫球蛋白, 均为美国BD公司产品。流式细胞仪为美国BD公司生产的FACSCanto。

1.2 方法

1.2.1 淋巴细胞检测

所有实验对象均于清晨空腹抽取静脉血2 m L, EDTA抗凝。应用荧光直接标记法及流式细胞仪检测外周血淋巴细胞亚群水平:CD3+ (总T淋巴细胞) ;CD3+CD4+ (辅助/诱导T细胞) ;CD3+CD8+ (抑制/杀伤T细胞) ;CD3-CD16+CD56+ (NK细胞) ;CD19+ (B淋巴细胞) ;CD4+CD25+ (Treg细胞) 。取不同荧光标记的单克隆抗体各20μL, 分别加入100μL肝素抗凝的外周血, 室温下孵育20min, 加入红细胞裂解液, PBS洗涤2次, 用流式细胞仪 (BD公司, FACS Canto) 检测, Cellquest软件分析数据, 记录阳性细胞百分率, 减去非特异对照值。

1.2.2细胞因子测定方法

采用Cytodetectsh试剂盒提供的方法常规分离外周血淋巴细胞, 所分离的淋巴细胞用RPMI 640培养液稀释为1×106细胞/m L备用。将淋巴细胞悬液置于24孔培养板, 加佛波酯、离子霉素、莫能霉素各10μL刺激细胞, 孵育、洗涤, 离心后加入500μL冻固定液 (4℃) 固定细胞, 孵育、洗涤、离心后置4℃冰箱过夜。取固定后细胞液, 洗涤、离心后加20μL抗CD4-prep对细胞表面抗原染色, 混匀、孵育后加入1.5 m L打孔液, 离心后取悬浮细胞各加入10μL抗IFN-γ-Fi TC、抗TNF-α-PE、抗IL-2-Fi TC、抗IL-4-PE、抗IL-6-PE、抗IL-10-PE, 并另设一管加10μL该单克隆抗体的同型抗体;孵育, 2 h内上流式细胞仪分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 15.0统计软件进行数据处理, 结果用均数±标准差 (±s) 表示, 两样本均数采用t检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 31例胃癌患者DC-CIK治疗前后外周血淋巴细胞变化情况

经DC/CIK治疗后, 患者CD3+T、NK细胞显著升高 (P<0.05) , 而CD4+CD25+调节性T细胞显著降低 (P<0.05) , 其他变化无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。

2.2 31例胃癌患者DC-CIK治疗前后细胞因子水平变化情况

胃癌治疗前后细胞因子水平变化见表2。其中INF-γ、IL-2在DC-CIK治疗后有显著升高 (P<0.05) , 其他细胞因子变化无统计学意义 (P>0.05) 。

3 讨论

胃癌是世界上常见的恶性肿瘤之一, 目前胃癌的治疗方法主要有手术、放疗、化疗, 但是我国胃癌早期诊治率低, 中晚期胃癌往往无法手术根治, 且术后的放化疗显示出较强的抵抗力。越来越多的研究发现肿瘤细胞可以修饰自身表面抗原及改变肿瘤组织周围的微环境以影响机体免疫细胞的功能, 从而逃避机体的免疫识别与攻击, 基于肿瘤的发生、发展、转移和预后与机体免疫功能之间的关系, 自体免疫治疗是继手术、放疗和化学药物疗法之后的非常有前景的疗法。

细胞因子诱导的杀伤 (cytokine-induced killer, CIK) 细胞是在多种细胞因子存在的条件下, 将外周血、骨髓或脐血中分离出的单个核细胞, 培养一定时间而获得的一种免疫活性细胞, 是目前用于临床过继免疫治疗最主要的免疫活性细胞。CIK细胞对自体和异体起源的大部分肿瘤细胞均表现出强有力的非MHC限制性杀伤作用。但其肿瘤杀伤机制还未完全明了, 目前认为CIK细胞可被淋巴细胞功能相关抗原-1 (IFA-1) 有关识别结构激活, 从而导致胞浆毒性颗粒释放而杀伤肿瘤细胞;也可因表面CD3受体结合而激活, 导致胞浆毒性颗粒释放而产生溶瘤作用;同时也可产生大量炎症细胞因子实现对肿瘤细胞的抑制或杀伤;也可通过可诱导肿瘤细胞凋亡而产生抗肿瘤作用。CIK同其他免疫活性细胞相比, 其增殖快, 杀瘤活性高、对耐药肿瘤细胞同样有效[1]。DC是目前所知抗原提呈功能最强的抗原提呈细胞 (APC) , 它的最大特点是能够刺激初始型T细胞活化和增殖, 是特异性免疫应答的始动者。因此, 它作为肿瘤主动免疫治疗的重要细胞已经应用于临床。成熟的DC依赖细胞表面的共刺激因子、黏附分子及MHCⅠ/Ⅱ类分子等可以诱导特异性CD8+、CD4+T淋巴细胞活化, 进而杀伤肿瘤细胞[2]。

体外实验和动物实验均发现, CIK和DC共同培养后可以增加其细胞毒性, 提高其抗肿瘤作用[3]。目前DC影响CIK细胞的生物学特性的机制还不十分清楚。研究发现DC与CIK共培养后, DC的表面分子CD80、CD86、CD40、HLA-DR等明显增加[4], 而且细胞上清中的IL-12分泌增加, 因此DCs可能通过分泌共刺激因子和细胞因子来促进CIK细胞的活化和分化。FUJII等[5]又进一步证实DC与CIK共培养后, DC可以使CIK细胞IFN的分泌量比同条件下的单纯CIK细胞分泌高, 分泌时间延长。另外, DCs可以通过减少CIK细胞中CD4+CD25+抑制性T细胞的比例[6], 增强CIK细胞的杀伤活性。而随着基因技术的不断发展, 通过对CIK细胞进行基因修饰后, 可以增强其抗肿瘤的活性, 是其今后主要的发展方向[7]。

T细胞是一组具有多功能的细胞群, 在免疫调节中发挥着重要作用。根据T细胞表面分化抗原分子的不同, 可分为Th (CD3+CD4+) 和Ts (CD3+CD8+) 细胞。NK细胞是非抗原依赖性免疫效应细胞, 可以不经致敏直接杀伤肿瘤细胞。而很多研究证实肿瘤患者外周血T细胞, NK细胞等均低于正常人。Th细胞减少, 则更易发生肿瘤免疫逃逸[8], 而Ts细胞减少可能和恶性肿瘤转移相关, Ts细胞减少的肿瘤患者预后均相对较差。本研究通过检测DC/CIK治疗前后患者外周血免疫细胞数, 发现CD3+T、NK细胞显著升高 (P<0.05) , 表明细胞生物治疗在提高患者自身免疫功能方面具有正向作用。B淋巴细胞的特异抗原为CD19, 目前的研究认为, 通过对其的检测在一定程度上可反映出机体的体液免疫状态, 本研究未发现经DC/CIK治疗后患者外周血B细胞数的显著改变, 与柳子川等[9]研究结果一致。

而在T细胞中存在一类具有负性免疫调节作用的细胞, 国际上首次发现抑制性T细胞同肿瘤进展相关是在上世纪70年代依据体外肿瘤模型实验的基础上提出[10]。1995年确定了这种抑制性细胞为调节性T细胞, 它的自然表型为CD4+CD25+T[11]。2001年WOO等人[12]第1次报道在人的卵巢癌患者和肺癌患者CD4+CD25+细胞显著增多。也有报道发现在黑色素瘤患者中调节性T细胞会造成细胞毒性淋巴细胞的缺乏, 降低CTL细胞的肿瘤免疫功能[13]。到目前为止, 许多研究都表明调节性T细胞 (Treg) 会抑制肿瘤免疫, 其中确切的机制尚不明确。但很多研究者发现经过化疗药物治疗后, Treg的数量会相对减少, 推测可能原因是肿瘤患者经治疗自身免疫增强后, Treg数量经过自身免疫调节得到相对抑制。因此, Treg的数量从某种程度上成为检测患者免疫状态及评价抗肿瘤治疗效果的一个指标。

本研究发现经DC/CIK治疗后, 患者Treg水平显著降低 (P<0.05) , 从侧面证实了细胞生物免疫治疗在免疫功能调节方面的有益作用。细胞因子INF-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10已被很多研究者证实参与肿瘤的发生、发展等过程。其中INF-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6在肿瘤免疫监视, 抑制肿瘤生长与转移的过程中起积极的作用, 而IL-10抑制外周血单核/巨噬细胞, 抑制宿主Th1应答和促进无效的Th2应答, 抑制NK细胞增殖、细胞因子的产生。本研究发现, 经DC/CIK治疗后, 患者外周血中INF-γ、IL-2、TNF-α有显著升高 (P<0.05) , 表明细胞生物免疫治疗对于胃癌患者免疫功能的恢复有较好的效果。

总体来说, 生物免疫治疗作为肿瘤3大常规治疗手段之外一个选择, 在某些方面如治疗副作用、患者耐受性等已经显示出其他治疗手段无法比拟的优势, 而其疗效也逐渐被许多临床医生和患者所认可。本研究通过比较胃癌患者DC/CIK治疗前后外周血常见免疫细胞及相关细胞因子水平的变化, 证实了DC/CIK治疗对于胃癌患者免疫系统恢复方面的积极作用, 而生物免疫治疗的远期效果则需要进一步的深入研究。

摘要：目的 通过测定胃癌患者自体免疫细胞 (DC/CIK) 治疗前后外周血总T、Th、Ts、Treg、NK、B细胞及细胞因子INF-γ、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10水平变化, 探讨DC/CIK细胞免疫治疗对于胃癌患者免疫功能的作用。方法 采用流式细胞仪检测31例胃癌患者DC/CIK细胞治疗前后外周血淋巴细胞及细胞因子的水平变化。结果 经DC/CIK细胞免疫治疗后, 胃癌患者外周血CD3+T、NK细胞数升高, 差异有统计学意义 (P<0.05) , CD4+CD25+调节性T细胞显著降低 (P<0.05) , 其他细胞变化差异无统计学意义 (P>0.05) 。DC/CIK治疗后细胞因子INF-γ、IL-2升高, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 其他细胞因子变化差异无统计学意义 (P>0.05) 。结论 DC/CIK细胞免疫治疗在一定程度上可以提高胃癌患者的细胞免疫功能, 增强患者抗瘤能力, 从而更好控制肿瘤生长。

免疫测定 篇4

免疫比浊法测定尿微量白蛋白 (Um ALB) 是近年来检测肾脏病变的早期指标, 并能在某种程度上反映病变的严重程度, 因此越来越受到临床的重视。笔者对免疫比浊法测定尿微量白蛋白进行了探索, 现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本

2013年5月10日在我院门诊进行健康体检的小学六年级一班学生和我院儿科住院患儿的新鲜随机尿液。

1.1.2 仪器

CS800全自动生化分析仪。

1.1.3 试剂

采用宁波瑞源生物科技有限公司生产的试剂。

1.2 方法

1.2.1 标本处理

新鲜随机尿液标本离心取上清液测定:稳定性试验取新鲜尿液离心后上清液分装于4℃和-20℃保存, 测定时取出平衡至室温后, 离心取上清液测定。

1.2.2 测定条件设置

采用免疫比浊法, 用试剂盒提供的标准品及试剂, 按照试剂盒的要求设置参数:双波长, 两点终点法, 定标方式为logit log 5p, 定标液浓度分别为0.0, 12.0, 22.2, 49.5, 103.5, 205.5 mg/L, 批号1335F。

1.3 统计方法

线性试验数据经SPSS1.0统计软件抛物线拟合处理。

2 结果

2.1 线性试验

定标后以标准物浓度为自变量X, 吸光度为因变量Y (吸光度值×104) , 通过抛物线拟合尿微量白蛋白标准曲线, 并与实际标准曲线比较。曲线方程为Y=1 052.10+124.639X-0.114 3X2, 确定系数R2=1.000, P=0.000。因此可认为拟合曲线与实际曲线符合性很好, 检出限为0~200 mg/L。

2.2 重复性试验

2.2.1 批内重复试验

取一新鲜尿液标本连续测定尿微量白蛋白20次, 计算变异系数, 结果见表1。

2.2.2 批间重复试验

取一新鲜尿液标本分装成10份, 同日分3批次测定 (第一批3份, 第二批3份, 第三批4份) , 每份标本均测定尿微量白蛋白两次, 取平均值计算变异系数, 结果见表1。

2.3 回收试验

取一新鲜尿液标本连续测定3次尿微量白蛋白, 计算平均值作为基础浓度, 分别加入3份不同浓度微量白蛋白标准物 (49.5, 103.9, 205.5 mg/L) 混匀后, 测定混合物尿微量白蛋白浓度, 计算回收率, 结果见表2。

2.4 干扰试验

2.4.1 血红蛋白干扰试验

取一肝素抗凝全血标本, 3 000 r/min离心3分钟弃去血浆, 剩余的红细胞以生理盐水洗涤4次, 通过机械搅拌和加入蒸馏水使其溶血, 制成血红蛋白液, 测定其血红蛋白浓度。将已知尿微量白蛋白量的尿液与血红蛋白液以不同比例混匀, 测定混合物尿微量白蛋白含量, 计算干扰率, 结果见表3。

2.4.2 胆红素干扰试验

取一胆红素定位阳性, 尿蛋白定性为阴性的新鲜尿液标本, 以此标本作为胆红素干扰液。另取一胆红素定性为阴性的新鲜尿液标本, 测定其尿微量白蛋白含量, 以此标本作为基础液。将基础液与胆红素干扰液以不同比例混匀, 测定混合物尿微量白蛋白含量, 计算干扰率, 结果见表4。

3 讨论

正常人的肾小球滤液中存在小分子的蛋白质, 在通过近曲小管时绝大部分被重吸收, 因此终尿中总蛋白含量很少, 仅为30~130 mg/24 h。当尿中白蛋白排出量在3.2~22.6 mg/mmol·Cr (30~200 mg/Cr) 或排除率在20~200μg/min这一范围内即为微量白蛋白尿[1]。尿微量白蛋白不仅对糖尿病、肾病的早期诊断、治疗和预后具有重要意义, 而且在高血压、心血管疾病、肾小球疾病等所致的肾损伤中具有举足轻重的作用[1]。

尿微量白蛋白用磺基水杨酸法、加热乙酸法及试带法基本不能查出[2]。故国内外多采用免疫化学技术进行测定。本试验采用免疫比浊法测定尿微量白蛋白, 检出限为0~200 mg/L, 批内CV为0.55%, 平均CV为1.18%, 平均回收率为101.9%, 与文献[3]报道的检出限10~160 mg/L, 批内CV6.3%, 批间CV 6.47%, 平均回收率96.2%比较, 结果较为理想, 该试验方法有良好的精密度和准确性。

干扰试验结果表明, 血红蛋白和胆红素均会对尿微量白蛋白的测定产生负干扰, 并且干扰物浓度越高, 负干扰率也越大。从血红蛋白干扰试验结果分析, 当血红蛋白浓度在0.61 g/L以下时, 对尿微量白蛋白的测定影响可以忽略 (干扰率<-2.60%) ;当血红蛋白浓度超过2.59 g/L时, 干扰率高达-15.61%, 这时测定的尿微量白蛋白结果是不可以接受的, 临床上测定无意义。胆红素干扰试验表明, 胆红素浓度<1.03μmol/L时, 对尿微量白蛋白的测定影响较小 (干扰率<-1.99%) , 可以忽略;胆红素浓度上升到5.18μmol/L时, 干扰率为-7.19%, 对尿微量白蛋白的测定影响较大;胆红素浓度达12.97μmol/L时, 干扰率高达-14.44%, 这时测定的尿微量白蛋白结果不可以接受, 临床上测定无意义。

由于本试验检出限制为0~200 mg/L, 测定前可先将标本离心, 取上清液做蛋白定性试验, 若阴性或弱阳性可直接测定尿微量白蛋白, 若阳性以上需以生理盐水适当稀释后测定, 以免造成尿微量白蛋白试剂不必要的浪费。

关于尿微量白蛋白测定结果的表示现在尚无统一单位。目前文献所采用的表示方法有两种:一是对定时尿样品的测定结果根据分泌的蛋白以μg/min表示;二是对不定时尿样品常用尿微量白蛋白/尿肌酐表示。

总之, 应用免疫比浊法测定尿微量白蛋白准确性高、精密度好, 适于常规实验室采用。

参考文献

[1]齐志宏, 刘振元.尿微量白蛋白测定的临床意义[J].现代诊断与治疗, 1999, 10 (6) :351-352.

[2]寇丽筠.临床基础检验学[M].北京:人民卫生出版社, 1997.

免疫测定 篇5

1 资料与方法

1.1 一般资料:

选取从2012年7月至2013年7月收治的52例门诊患者, 其中有41例女性患者, 11例男性患者, 患者的年龄在18~64岁, 平均为 (37.23±7.45) 岁。

1.2 方法:

采用天津生物技术公司提供放射免疫法试剂, 使用Gambytcr 10探头γ计数器测量仪;采用德国公司提供全自动化发光免疫分析法的系统仪器, Advia centaur XP测量仪[2]。取2 m L的静脉空腹血清, 以4000 r/min的速度进行4 min的离心, 将血清分离, 然后将其放置到零下25℃环境中保存, 两种测定促甲状腺激素方法需要在20 d之内完成, 评价与分析其健全性、相关性、准确性以及精确性等, 检测要根据说明书的操作要求严格进行。二者的方法学采用健全性、相关性、准确性以及精确度等指标进行评价。批内变异系数为5%, 批间变异系数为10%, 回收概率在90%~110%, 在等倍稀释不同浓度的血清以后, 采取相同方式对两组检测方式平行线进行分析。

1.3 统计学分析:

数据的统计与分析采用SPSS15.0软件, 相关性的分析采用Pearson, P<0.05, 其差异有统计学意义。

2 结果

放射免疫法与全自动化发光免疫分析法测定与稀释以后的标准曲线以及反应曲线基本能保持平行, 二者的健全性比较好。采取放射免疫法与全自动化发光免疫分析对52例患者的血清进行促甲状腺激素含量的测定, 二者之间呈现为正相关性, P<0.01, 其差异有统计学意义。在已知的低、中、高浓度中分别加入待测的血清, 采取相同的方式进行测定。两种测定方法回收概率见表1。

采取放射免疫法与全自动化发光免疫分析法对促甲状腺激素质量做重复测定, 对血清进行控制, 并将批内变异系数与批间变异系数计算出来。两种检测方式精确度要同临床检验质量标准相符合。两种方法的批内变异系数与批间变异系数对比见表2。

3 讨论

通常情况下垂体前叶能分泌出促甲状腺激素, 这种激素属于糖蛋白类激素, 能对甲状腺代谢起到一定的促进作用, 其相对分子的质量主要是28000, 要想准确的对甲状腺疾病进行诊断, 需要检测患者血清之中的促甲状腺激素水平, 这是对甲状腺功能进行判定的重要指标[3]。身体血清中的游离甲状腺素以及游离三碘甲状腺原氨酸会对促甲状腺激素产生一定的反馈抑制, 属于负反馈调节系统, 比较典型。在本组研究中, 主要采取全自动化发光免疫分析法, 固相载体主要为链霉亲和素, 发光底物为Lumi-phos503。在受到碱性磷酸酶的影响以后, 磷酸酯基会产生水解, 将一个磷酸基脱去, 获取其中一个比较稳定的AMPD中间体, 在这个中间体的分子之内, 电子会发生转移裂解, 转变为一分子的间气苯甲酸甲酯阴离子以及一份子的金刚烷酮, 在转变为基态时, 会产生光子大约为470 nm, 并且呈现为维持发光反应[4,5]。放射免疫法为体外标记, 是传统的免疫分析方法, 这种检测方法比较成熟、所需费用较低、有着广泛的试剂、不需要太高的实验条件, 适用于基层医院。目前, 是进行新物质研究的重要方法, 并且补充了全自动化发光免疫分析法的一些不足, 尤其是开发以后没有检测的一些项目或者是没有开发的检测项目。全自动化发光免疫分析法属于级联放大体系的ALP-αMPPD系统, 灵敏并且稳定, 同时持续的发光图谱比较稳定, 能使多次计数所求得的平均值的得到满足, 这能在一定程度上保证计算结果的正确性[6]。本组研究结果显示, 在健全性、准确性以及精密度方面, 全自动化发光免疫分析法明显优于放射免疫法。此外, 全自动化发光免疫分析法的操作程序智能化, 具有较高的全自动化程度, 操作灵活, 能使工作效率得到显著提高, 适用于标本检测量比较大的医疗机构或者是规模较大的医院。通过本文研究分析可以看出, 两种检测方法的结果具有较好的相关性, 精密度以及准确性都比较高, 对于临床需求都能满足, 要根据实际情况, 选取相应的检测方法, 在很长一段时间之内两种检测方法都是以体外标记为主, 能够互相补充。

摘要：目的 全自动化发光免疫分析与放射免疫法测定血清促甲状腺激素的对比观察。方法 选取从2012年7月至2013年7月收治的52例门诊患者, 取静脉空腹血清, 分离血清, 测定促甲状腺激素, 要根据说明书的操作要求严格进行, 对比两种方法的批内变异系数、批间变异系数以及回收率。结果 采取放射免疫法与全自动化发光免疫分析对52例患者的血清进行促甲状腺激素含量的测定, 二者之间呈现为正相关性 (P<0.01) 。放射免疫法与全自动化发光免疫分析法测定与稀释以后的标准曲线以及反应曲线基本能保持平行, 二者的健全性比较好。结论 两种检测方法的结果具有较好的相关性, 精密度以及准确性都比较高, 对于临床需求都能满足, 要根据实际情况, 选取相应的检测方法, 在很长一段时间之内两种检测方法都是以体外标记为主, 同时能够互相补充。

关键词：全自动化发光免疫分析,放射免疫法,血清促甲状腺激素

参考文献

[1]赵静峰, 罗天敏, 王攀.全自动微粒子化学发光免疫分析法与放射免疫分析法测定血清促甲状腺激素的对比分析[J].实用心脑肺血管病杂志, 2013, 23 (9) :1100-1102.

[2]王攀, 李雪, 喻荣华, 等.全自动化发光免疫分析与放射免疫法测定血清促甲状腺激素的对比分析[J].实用医技杂志, 2013, 9 (10) :1133-1135.

[3]李红丽.不同甲状腺功能状态下游离三碘甲状腺原氨酸与游离甲状腺素和超灵敏促甲状腺素检测的意义研究[J].临床合理用药杂志, 2013, 25 (12) :1156-1158.

[4]周黎, 陈捷, 吴坚敏.血清甘胆酸、促甲状腺激素、甲状腺过氧化物酶抗体和总胆汁酸检测在妊娠期肝内胆汁淤积症的临床意义及优生意义[J].中国优生与遗传杂志, 2013, 16 (2) :1153-1155.

[5]李丽波, 刘一兵, 官国英, 等.人促甲状腺激素酶促化学发光免疫分析方法的建立[J].原子能科学技术, 2013, 12 (10) :1111-1113.

免疫测定 篇6

萘是一种重要的化工原料,主要用于生产染料、树脂、溶剂、炸药、消毒剂、杀虫剂、防腐剂、防蛀剂,因萘对环境的污染日益严重而引起重视。据报道,南京某大型矿业企业周边农业土壤中多环芳烃(PAHs)检出率达100%[1]。萘在环境水体中的含量极低,这对检测分析提出了更高的要求。目前,环境水体中萘的检测方法有质谱法[2]、热解析毛细管气相色谱-质谱联用法[3]、高效液相色谱法[4]。色谱法检测精度高、数据稳定,但试样前处理过程复杂,而且试剂价格昂贵,这使得色谱法的应用受到限制。生物检测方法不需要繁琐的前处理过程,检出限更低,利用分子信标法[5]、实时荧光免疫聚合酶链式反应(PCR)法[6]、荧光免疫法等检测环境水体中的萘引起广泛关注。间接竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)法是利用固相抗原与试样和抗体进行竞争,加入酶标记的第二抗体联结同固相抗原结合的抗体,间接检测小分子试样,具有选择性好,灵敏度高,简便快捷等特点,用该方法测定环境水体中PAHs已有报道[7,8,9],但用间接竞争ELISA法测定环境水体中的萘未见报道。常用作载体的免疫原性蛋白质有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白、牛血清丙种球蛋白等,但最常用的是BSA和OVA。

本工作采用以抗萘多克隆兔抗体为基础,以OVA偶联半抗原作为包被原(包被原固定在酶标板上称为固相抗原),建立了一种测定环境水体中痕量萘的ELISA法,该方法检出限低、准确度高且可重复性好。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

96孔酶标板:基因有限公司;OVA:华美生物制品公司;辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(HRP-IgG):上海闪晶分子生物有限公司;抗萘多克隆兔抗体和包被原:本实验室自制[6],-20℃冷冻保存,抗体效价为100;萘标准贮备溶液:萘质量浓度为2 000μg/mL,百灵威化学技术有限公司。碳酸盐缓冲液(CBS):100 mL水中含碳酸钠0.159 g和碳酸氢钠0.293 g,碳酸根浓度为0.05 mol/L,pH为9.6;Na2HPO4-KH2 PO4稀释液(PBS):1 L水中含氯化钠8.000 g,磷酸二氢钾0.240 g,氯化钾0.200 g,磷酸氢二钠2.900 g;洗涤液(PBST):PBS中加入体积分数为0.05%的吐温-20[8],PBS浓度为0.01 mol/L、pH为7.4;封闭液:体积分数为5%的脱脂奶粉的水溶液[8];底物液:TMB liquid-1component[8];终止液:浓度为2 mol/L的H2SO4溶液[8];实验用水均为高纯水。

EL800型酶标仪:美国BIO-TEK公司;W205B型旋转蒸发仪:上海申胜生物技术有限公司;Easy Pure RoDi高纯水制备系统:美国thermo公司;pH SJ-4A型pH计:上海精密科学仪器有限公司。

1.2 ELISA法实验方法

ELISA法基本操作步骤见文献[8]。

实际水样用二氯甲烷萃取三次,收集有机相后置于旋转蒸发仪浓缩富集,PBS稀释后按照间接竞争ELISA法进行测定。

1.3 标准曲线的制作

本实验用抑制率(I,%)表征在间接竞争ELISA法过程中试样对抗体反应的显色抑制程度。

式中:Amax为空白(高纯水)在450 nm处的吸光度;AS为试样的吸光度;Amin为对照孔(酶标板上不加任何试剂的孔)的吸光度。

交叉反应性指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力,不同抗原在相同位置有相同结构时,可能与抗体发生交叉反应。本实验用交叉率(%)表征抗萘多克隆兔抗体的特异性。

2 结果与讨论

2.1 抗萘多克隆兔抗体质量浓度的选择

不同质量浓度包被原与抗萘多克隆兔抗体反应后的吸光度见表1。行业中选择吸光度为1.0时的抗体质量浓度作为最佳工作浓度,同时考虑经济因素应使包被原用量尽量少。由表1可见,吸光度为1.0时,包被原的最佳质量浓度是2.50μg/mL,抗萘多克隆兔抗体质量浓度是3.06μg/mL。

2.2 PBS的pH对I的影响

PBS的pH对I的影响见图1。由图1可见,pH对ELISA法反应体系影响较大,pH在8.3时I最高,故本实验选择PBS的pH为8.3。

2.3 PBS中氯化钠浓度对I的影响

介质中一定水平的氯化钠浓度有利于抑制非特异性反应,可以减少抗体的非特异性吸附。PBS中氯化钠浓度对I的影响见图2。由图2可见:氯化钠浓度在0.1 mol/L时,I最大;氯化钠浓度高于0.5 mol/L时,I随氯化钠浓度的增大急剧减小,故本实验PBS中氯化钠浓度确定为0.1 mol/L。

2.4 PBS中甲醇加入量对I的影响

PBS中甲醇加入量对I的影响见图3。

由图3可见,当甲醇加入量高于5%(体积分数,下同)时,I迅速下降。这是因为萘是亲脂性的,需要用非极性有机溶剂从试样中提取。甲醇可增强抗萘多克隆兔抗体对固相抗原的竞争能力,有利于提高间接竞争ELISA法的灵敏度。故本实验PBS中甲醇加入量确定为5%。

2.5 测定萘的标准曲线

在上述确定实验条件下,ELISA法测定萘质量浓度(ρ)的标准曲线见图4。标准曲线回归方程为I=8.3941ogρ+50.21,相关系数为0.985 6,线性范围为10-3～10μg/L,灵敏度IC50(I为50%时萘的质量浓度)为0.944μg/L,检出限IC20(I为20%时萘的质量浓度)为0.250 ng/L。两者数量级相差比较大的原因可能在于抗体保存时间较长导致效价降低,标准曲线斜率小。

2.6 精密度实验

ELISA法的精密度实验结果见表2。由表2可见,批间误差高于批内误差,而且浓度小误差小,浓度大误差大,其原因可能是浓度大时移液过程中造成的损失多。批间误差为以4块重复操作的酶标板测定结果的平均值求得的总的批间变异系数;批内误差为同一块酶标板上重复操作测定结果的误差。

2.7 萘结构类似物的交叉率

萘结构类似物的交叉率见表3。由表3可见,四种萘结构类似物与萘的交叉率均小于14.0%,表明该抗萘多克隆兔抗体特异性较强。

2.8 水样测定与加标回收实验

ELISA法检测水样中萘回收率的实验结果(n=3)见表4。由表4可见,本方法的回收率在86.00%～106.00%之间,回收效果比较理想。

3 结论

a)以OVA偶联半抗原作为包被原,利用ELISA法检测环境水体中的痕量萘,方法可行,且检测过程简单快速,并能同时进行批量检测。

b)本方法的检出限为0.250 ng/L,灵敏度为0.944μg/L,回收率在86.00%～106.00%之间,批间误差小于15.00%,批内误差小于8.00%,方法的准确度和重复性效果较好,且满足环境水体中的痕量萘的检测要求。

c)四种萘结构类似物与萘的交叉率均小于14.0%,说明该抗萘多克隆兔抗体特异性较强。

参考文献

[1]计勇,张洁,朱智.多环芳烃污染土壤的微生物修复技术.化工环保,2008,28(3):243-246

[2] Perez Pavon J L,Nogal Sanchez M,Fernadez Laespada M E,et al.Determination of naphthalene and total methylnaphthalenes in gasoline using direct injection mass spectrometry. Talanta,2007,72(1):256-262

[3] Wauters E,Van Caeter P,Desmet G,et al.Improved accuracy in the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in air using 24 h sampling on a mixed bed followed by thermal desorption capacity gas chromatography mass spectrometry.J Chromato A,2008,1190(1- 2):286-293

[4] Lubov O,Mikhail S,Grigoriy T,et al.On-line solidphase extraction and HPLC determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in water using fluorocarbon polymer sorbents.Anal Chim Acta,2005,538(1-2): 35-40

[5] Ye Qiyan,Zhuang Huisheng,Zhou Chun.Detection of naphthalene by real-time immuno-PCR using molecular beacon.Mol cell Probes,2009,23(1):29-31

[6]周纯.多环芳烃类环境激素的实时定量免疫PCR检测方法研究:[学位论文].上海:东华大学环境科学与工程学院,2008

[7]邓安平.酶联免疫吸附分析法测定苯并(a)芘和多氯联苯.环境化学,2006,25(3):340-343

[8]张彦峰,张清敏,戴树桂等.用于测定多环芳烃的酶联免疫吸附分析法的研究.农业环境科学学报,2006,25 (2):537-540

免疫测定 篇7

胶体金免疫层析技术(Gold immunochromatographic assay,GICA)是近年来发展迅速的一项免疫标记技术,它以抗原抗体特异性结合为基础、大孔径微孔滤膜为载体、胶体金为固相标记物来定性检测样本中的待测物质[6]。因其快速、便捷,因此继氯霉素残留微生物检测法[7,8]、理化分析法(高效液相色谱法[9]、气相色谱法[10]、液相色谱-串联质谱法[11]等)和酶联免疫吸附法[12,13]后,GICA分析法逐渐被广泛应用于氯霉素检测中。本文对胶体金试纸条检测动物组织中氯霉素的残留进行了研究,为氯霉素残留监控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

猪肉、鸡肉、鱼、虾(市售);氯霉素快速检测试纸(北京勤邦生物技术有限公司),其中包括冻干有氯霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂、试纸条和样品复溶液;氯霉素标准品(美国Sigma公司),纯度≥99%;乙酸乙酯、乙腈、正己烷(北京化学试剂公司),分析纯。

8010S匀浆机(上海斯伯明仪器设备有限公司);2000SBL电子天平(美国Setra公司);QL-901漩涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);Anke GL-20G-Ⅱ高速离心机(上海安亭科学仪器有限公司);DSY-Ⅲ氮吹仪(北京金科精华苑科技有限公司);微量移液器(美国Thermo公司);Acquity液相色谱串联质谱仪配有电喷雾离子源(美国Waters公司)。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

取已去脂肪的组织样品10 000 r/min均质1 min;称取(5±0.05)g均质样品至50 m L聚苯乙烯离心管中,加入8 m L乙酸乙酯,漩涡混合器涡动2 min,室温(20～25℃)4 000 r/min离心5 min;移取全部上层有机相至10 m L干净的玻璃试管中,于50～60℃水浴氮气流下吹干;加入1mL正己烷,用漩涡混合器涡动1 min,再加1 m L样品复溶液,用漩涡混合器涡动30 s,室温(20～25℃)4 000 r/min离心5 min;除去上层有机相,取下层无机相用于分析。

1.2.2 检测步骤

将原包装预先平衡至室温,打开后取出所需数目的微孔试剂和试纸条,并做好标记;用微量移液器移取200 L待检组织提取液于微孔中,缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀,室温(20～25℃)孵育5min;将标记好的试纸条插入微孔中-印有“MAX”线端朝下,使之充分浸入溶液中;室温(20～25℃)孵育10 min后,取出试纸条,根据检测线和质控线是否出现红色条带即可判定结果。检测结果示意图及其说明见图1。

注:(1)阴性(-):T线显色强于C线或与C线无明显差异;(2)阳性(+):T线显色明显弱于C线显色;(3)无效:未出现C线。

2 结果与分析

2.1 样本检测限试验

采用1.2.1所述的样品前处理方法时,在空白样品中分别添加氯霉素标准品至终浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.6 g/kg。取三批试纸条进行检测,每批测定5个重复,结果见表1,部分试验结果见图2。

由表1可知,氯霉素快速检测试纸条测定猪肉、鸡肉、鱼、虾样品中氯霉素含量的检测限为0.3 g/kg。

注:从左到右氯霉素添加浓度依次为0、0.1、0.2、0.3、0.6 g/kg。

2.2 假阳性率、假阴性率试验

取阴性猪肉、鸡肉、鱼、虾样品及其对应的阳性样品(氯霉素添加浓度为0.3 g/kg)各20份,按1.2.1所述的方法将样品前处理后用三批试纸条分别进行检测。结果发现,阴性样本的检测结果均为阴性,阳性样本的检测结果均为阳性,可见试纸条的阴阳性符合率达到100%,假阳性率、假阴性率都为0。

2.3 特异性试验

将链霉素、青霉素、四环素、恩诺沙星、磺胺二甲基嘧啶5种抗生素溶于pH7.2、0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液,配成浓度为500 g/L的溶液,按1.2.2所述步骤用试纸条进行检测。结果发现,5种抗生素的C线和T线均显色,显示阴性结果,表明本试纸条对其他抗生素无交叉反应,具有较好的特异性。

2.4 与仪器方法的比较

用试纸条方法和国标方法《GB/T 22338-2008动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》(液相色谱-串联质谱法对氯霉素的检出限为0.1 g/kg)[14],分别对空白猪肉、鸡肉、鱼、虾样本及添加不同浓度组氯霉素药物(浓度分别为0、0.05、0.5、1.0)的加标样本进行测定,每组两个平行,结果见表2。

由表2可知,氯霉素添加浓度为0、0.05 g/kg时,试纸条检测结果均为阴性(-),LC-MS/MS法检测结果未检出,即低于仪器方法检测限;添加浓度为0.5、1.0 g/kg时,试纸条和LC-MS/MS法检测结果均为阳性,可见两种方法的测定结果基本一致,符合度达到100%,该试纸条可用于动物组织中氯霉素残留的快速筛选。

3 结论

本研究采用胶体金法对动物组织中的氯霉素残留进行检测,试纸条对猪肉、鸡肉、鱼、虾样本的最低检测限为0.3 g/kg,检测阴、阳性样本时,假阳性率和假阴性率皆为0;对其他抗生素无交叉反应,特异性较好;在测定氯霉素含量为0、0.05、0.5、1.0 g/kg的加标样本时,检测结果与液相色谱-串联质谱法一致,符合度达到100%。

本研究所使用的胶体金试纸条将胶体金标记的抗体直接冻干在微孔试剂中,在检测过程中,能够使金标抗体与待检样品液充分接触,充分反应,从而减少误差,增加整个体系的反应灵敏度,易于对样品中的药物残留情况进行分析。尽管结构的改进提高了试纸条的灵敏度,但由于通过颜色判断结果比较主观,可能出现假阳性问题,因此对于阳性样本,还需要用LC-MS/MS等仪器方法进行确证。

摘要：应用胶体金免疫层析法对动物组织中的氯霉素残留进行检测,研究该方法的灵敏度、假阳性率、假阴性率及特异性。结果表明,用胶体金免疫层析法测定猪肉、鸡肉、鱼、虾中的氯霉素,检测限均为0.3g/kg,假阳性率和假阴性率皆为0%;方法的特异性较好,对其他抗生素无交叉反应;检测加标样本的结果与液相色谱-串联质谱法基本一致。可见,该方法简便、快速、准确、稳定,可作为动物组织中氯霉素残留现场快速检测的一种有效手段。

免疫测定 篇8

关键词：微粒子酶免疫检测法,FK506,血浓度

FK506(tacrolimus,他克莫司,商品名Prograf,普乐可复)是中性、疏水性大环内酯类新型免疫抑制剂,系日本藤泽(Fujisawa)制药公司于1984年首次从链霉菌肉汤培养基中分离得到,目前已能全合成[1]。FK506目前在临床上主要应用于治疗器官移植的排斥反应及各种自身免疫性疾病;但有效血药浓度范围较窄。国外推荐的治疗窗浓度并不适合我国肾移植接受者[2]。血药浓度稍高,即可出现毒副作用,如:轻微的肾毒性、神经毒性及高血压、失眠、恶心等;稍低则出现排斥反应。由于病人疾病状态、器官移植类型、年龄、剂量等因素在药物吸收和代谢上都有影响[3],特别是本品生物利用度和药物动力学参数个体差异大,不易估计给药后的血药浓度[4,5]。此外,治疗中的合用药物中,一些影响细胞色素P450 3A4系统的药物将导致FK506血药浓度改变。为使FK506产生最佳的免疫抑制作用,减少毒副作用,对器官移植后接受FK506治疗的病人进行药物监测是很有必要的[6]。本文即是用微粒子酶免疫法(microparticulate enzyme immunoassay,MEIA)对FK506的血药浓度进行检测。

1 材料与方法

1.1 试剂

IMX Tacrolimus II试剂盒,美国雅培(Abbott)公司生产。包括:抗他克莫司(鼠单克隆)抗体包被的微粒子(Anti-Tacrolimus Antibody Coated Microparticles)、他克莫司碱磷酸酶结合体(Tacrolimus Alkaline Phosphatase Conjugate)、色原(四甲基联苯胺,4-Methylumbellifery1 Phosphate),冲洗液;空白血样;标准血样;质控血样;蛋白沉淀剂(硫酸锌的甲醇、异丙醇溶液)。

1.2 仪器

IMX Tacrolimus Ⅱ检测仪,美国雅培公司,X-SYSTEMS离心机,美国雅培公司,旋涡混合器,上海医科大学仪器厂,微量加样器。

1.3 检测原理和程序

1.3.1 样品的采集

在病人清晨服药前抽取血样,放入EDTA抗凝管中保存。血样如不能立即检测,即放冰箱中4℃保存,24 h内测定[7]。

1.3.2 样品的处理

精确量取150 μL混旋均匀的全血样品加入离心管再向内加入精确量取的150 μL沉淀剂,混旋均匀,离心转速10 800 r/min,取上清液至少150 μL加入样品池上机检测。

1.3.3 自动检测

在检测仪内,探针将样品加到抗他克莫司(鼠单克隆)抗体包被的微粒子中,加入他克莫司碱磷酸酶结合体,孵化温育。他克莫司与结合体竞争结合抗他克莫司微粒,形成“抗体-抗原”和“抗体-抗原-碱性磷酸酶”的混合物,被转移到玻璃纤维铸模上并与其发生不可逆转的结合。用冲洗液洗去不与其结合的物质,然后加入色原产生荧光,最后由MEIA的光学设备测出荧光强度。由标准血样所得的标准曲线计算血样测定结果,即得血样中的FK506浓度。

2 结果

2.1 标准曲线的绘制

将IMX TacrolimusⅡ六种浓度的标准血样,每个浓度两份,用上面的方法测定,结果见表1。

回归方程为Y=-226.88x+403.811,相关系数r=0.999。工作范围0～30 ng/mL。

2.2 精密度试验

2.2.1 日内精密度

用已知浓度的六份高、中、低质控血样一次测定完。结果见表2。

2.2.2 日间精密度

用已知浓度的六份高、中、低质控血样测定,一天只测定一份。结果见表3。

2.3 回收率试验

用已知浓度的高、中、低质控血样进行测定。结果见表4。

2.4 稳定性试验

Freeman等[8]考察了贮存时间和温度对病人全血及质量控制样品中FK506的影响。FK506血样贮存时间分别为0、2、3、4、7和14 d,贮存温度22℃、冰箱4℃、-70℃冷冻,样品均稳定。样品-18℃～-25℃贮存可稳定六个月。样品采集在EDTA抗凝管中可以在2℃～8℃下保存14天再检测(回收率范围90.5%～114.7%)。

3 讨论

目前用于FK506血药浓度的检测的方法较多,有放射受体分析法、酶联免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、微粒子酶免疫法(microparticulate enzyme immunoassay,MEIA)、高效液相色谱(HPLC)化学发光法、HPLC与酶免疫分析法联用、HPLC/质谱(MS)法、生物分析法等[9]。其中HPLC/MS是目前测定FK506浓度中专属性及灵敏度最高的方法[10]。 MEIA所用的单克隆抗体与FK506的代谢物存在交叉反应,过高地估计了FK506的浓度,不适于其药物动力学分析。但由于一些具交叉反应的代谢物是有活性的,且本法与专属性好的测定方法测得的结果有较好的相关性,[MEIA值]=0.94[HPLC-MS2值]+0.63, r=0.987[11]。本法与临床治疗效应相关性好,操作简便、快速、自动化程度高,适于大量样品测定,仍可达到治疗药物监测的目的,故是目前临床的主要监测方法。

参考文献

[1]Kino T,Hatanaka H,Hashimoto M,et al.FK506,a novel immunosup-pre,～sant imlated from a Streptomyces.I.fementation,imlation,and physicochemical and biological characteristic.J Antibiot,1987;40(9):1249—1255

[2]王守春,韩丽萍,司凯英,等.56例患者肾移植术后他克莫司治疗窗浓度范围再探讨.中国药房,2005;16(23):1802—1803

[3]Staatn C E,Tett S E.Clinical pharmacokinetics and pharmacody-namics of tacrolimus in solid organ transplantation.Clin Pharmacoki-net,2004;43:623—653

[4]武国军,王禾,文爱东,等.他克莫司药代动力学特点及其在肾移植术后的应用.中国现代医学杂志,2006;16(10):1521—1522

[5]顾健,张春燕,李玉珍.他克莫司治疗药物监测进展.中国药学杂志,2007;42(1):6—9

[6]夏东亚,郭涛,蒋苓.ELISA法监测肝移植患者他克莫司全血浓度.中国临床药理学与治疗学,2006;11(8):933—936

[7]文爱东,杨志福,赵磊,等.酶联免疫法与微粒子酶免疫法检测全血他克莫司浓度的比较.中国医院药学杂志,2002;22(6):346—348

[8]Freeman D J,Stawecki M,Howson B.Stability of PK506in whole blood samples.Ther Drug Monit,1995,17(3):266—267

[9]Jysko W J.Analysis of tacrolinus(FK506)in relation to therapeutic drug monitoring.Ther Drug Monit,1995;17:596—601

[10]徐新军,刘皋林,张正行.国外医药抗生素分册.2001;22(5):222—227