间接测定（精选4篇）
间接测定 篇1
甲巯咪唑( methimazole,2 - Mercapto - 1 - methylimidazole) ,又称他巴唑或甲硫噻唑,是目前甲状腺机能亢进症( 简称甲亢) 患者治疗的首选药物。人体服药后,虽75% ~ 85% 经尿液排出,但也有因甲巯咪唑使用不当而引起皮疹或皮肤瘙痒,白细胞及粒细胞减少,肝功能异常等严重不良反应。因此,寻找简单有效的检测甲巯咪唑含量的方法,对药品检验及临床化验具有重要意义。已报道测定甲巯咪唑的方法主要有返滴定法［1］、高效液相色谱法［2 － 3］、 分光光度法［4 － 5］、 电化学法［6 － 9］、等。但除了分光光度法外,其余几种方法由于试剂昂贵或操作步骤繁琐而没有得到广泛的应用。利用巯基的还原性,以间接地可见分光光度法测定甲巯咪唑的研究尚未见报道。
本实验根据甲巯咪唑分子中巯基能将Cu2 +还原为Cu+,Cu+与新铜试剂形成黄色络合物,利用间接分光光度法测定药物中甲巯咪唑的含量,确立一种测定药片中甲巯咪唑含量的新方法。该方法不仅可以消除温度、湿度等环境影响,且快捷、准确、重现性好,取得了较满意的结果。
1 实验部分
1. 1 仪器和试剂
雷磁p Hs - 3C型精密p H计,上海圣科仪器设备有限公司;721 型可见分光光度计,上海菁华科技仪器有限公司; BS224S电子分析天平,北京塞多利斯仪器系统有限公司。
甲巯咪唑,成都贝斯特试剂有限公司; 甲巯咪唑片,Merck KGa A,Germany; 新铜试剂,上海达瑞精细化学品有限公司; 硫酸铜,洛阳化学试剂厂; 无水乙醇,天津市福晨化学试剂厂; 冰醋酸,中国医药集团上海化学试剂有限公司; 乙酸钠,广州新建精细化工厂; 以上试剂均为分析纯。实验用水为一次蒸馏水。所有实验均在常温下进行。
1. 2 实验方法
移取1. 00 m L的甲巯咪唑溶液、3. 00 m L 0. 50 mg/m LCu SO4、1. 00 m L 0. 15% 新铜试剂的乙醇( 40%) 水溶液和2. 50 m Lp H 4. 5 的HAc - Na Ac缓冲溶液于25 m L比色管中,用蒸馏水定容,摇匀后反应30 min,以空白试剂为参比,用1 cm比色皿在波长460 nm处测定吸光度。
2 结果与讨论
2. 1最佳波长的确定
取1. 00 m L 0. 2 mg/m L甲巯咪唑标准溶液、2. 50 m L0. 5 mg / m L的硫酸铜溶液、2. 50 m L 0. 15% 新铜试剂乙醇( 40% ) 水溶液和2. 50 m L CH3COOH - CH3COONa缓冲溶液( p H4. 8) 于25 m L比色管中,稀释至刻度,摇匀。以不加甲巯咪唑的试剂为参比,待反应30 min后,测定其在不同波长下的吸光度( 图1) 。由图1 可知,产物的吸光度值随着波长的增大而增加,在 λ = 460 nm处达到最大,在此之后随着波长的增加吸光度值反而减小,因此该实验的最佳测定波长确定为460 nm。
2. 2p H的影响
已知Cu+与新铜试剂形成的络合物在p H 2 ~ 9 内吸光度恒定［10］。固定1. 00 m L甲巯咪唑标准溶液、2. 50 m L硫酸铜溶液、2. 50 m L新铜试剂,分别加入2. 50 m L p H值分别为3. 5、4. 0、4. 5、4. 8 的HAc - Na Ac缓冲溶液,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀,以不加甲巯咪唑的试剂为参比,待反应30 min后测定其在不同p H值缓冲溶液下的吸光度。由于甲巯咪唑溶液中含有巯基( - SH) ,当溶液p H值增加时,导致其将Cu2 +还原为Cu+,Cu+与新铜试剂形成黄色络合物的能力增强,溶液吸光度随之增加,在p H为4. 5 时吸光度达到最大。继续增加p H值,由于在较低酸度下溶液中Cu2 +浓度降低,进而使含有巯基( - SH) 降解产物还原Cu2 +生成Cu+的量减少,即生成黄色络合物的量减少。从图2 中可以看出,p H值在达到4. 5 的最大值之后开始下降,故本实验的最佳p H值选为4. 5。
2. 3硫酸铜用量的影响
在25 m L比色管中分别用吸量管准确移取1. 00 m L甲巯咪唑标准溶液、2. 50 m L新铜试剂、2. 50 m L p H值为4. 5 的HAc -Na Ac缓冲溶液,再加入不同量的硫酸铜溶液,分别为1. 00 m L、2. 00 m L、3. 00 m L、3. 50 m L、4. 50 m L并标为1 ~ 5 号,定容摇匀,以不加甲巯咪唑的试剂为参比。待反应30 min后,将分光光度计的波长调到460 nm,并以各自的参比溶液调零后测定各组溶液的吸光度。以硫酸铜的体积为横坐标,溶液的吸光度值为纵坐标,绘制硫酸铜用量与吸光度的关系图( 图3) 。实验表明,当Cu2 +液的用量为3. 0 m L时,吸光度达到最大且基本恒定。当继续增大硫酸铜的用量时,吸光度值呈平稳趋势,说明此时溶液中巯基( - SH) 已全部被Cu2 +氧化。因此本研究用3. 0 m L 0. 5 mg / m L的硫酸铜溶液作甲巯咪唑的氧化剂。
2. 4 显色剂( 新铜试剂) 用量的影响
固定甲巯咪唑标准溶液1. 00 m L、硫酸铜溶液3. 00 m L、p H值为4. 5 的HAc - Na Ac缓冲溶液2. 50 m L,再加入不同量的新铜试剂,分别为0. 20 m L、0. 50 m L、1. 00 m L、1. 50 m L、2. 00 m L于25 m L比色管中,并标为1 ~ 5 号,定容摇匀,以不加甲巯咪唑的试剂为参比。待反应30 min后,将分光光度计的波长调到460 nm,并以各自的参比溶液调零后测定各组的吸光度。以新铜试剂的体积为横坐标,溶液的吸光度值为纵坐标,得到新铜试剂的量与吸光度的关系图( 图4) 。如图4 所示,当新铜试剂的加入量为1. 0 m L时,吸光度达到最大,且随着新铜试剂的加入量的增加,吸光度基本恒定。本实验选择0. 15%新铜试剂的加入量为1. 0 m L。
2. 5 反应时间对吸光度的影响
取甲巯咪唑标准溶液1. 00 m L、硫酸铜溶液3. 00 m L、p H值为4. 5 的HAc - Na Ac缓冲溶液2. 50 m L、新铜试剂1. 00 m L于25 m L比色管中,以不加甲巯咪唑的试剂为参比。将溶液放置不同的时间后用参比组调零后测定其吸光度,得到吸光度A随静置时间变化的曲线( 图5) 。由图5 可知,溶液的吸光度值一直随时间在不断增大,当反应时间为30 min时,溶液的吸光度值达到最大,且在30 min后呈平缓趋势。故本实验选择反应时间为30 min。
2. 6标准曲线的绘制
在已确定的最优实验条件下,分别取硫酸铜溶液3. 00 m L、p H值为4. 5 的HAc - Na Ac缓冲溶液2. 50 m L、 新铜试剂1. 00 m L于10 只25 m L比色管中,并编号1 ~ 10,第一只不加甲巯咪唑作为试剂参比。取不同量的甲巯咪唑标准溶液于编号为2 ~ 10 的比色管中,待反应30 min后,将分光光度计的波长调至460 nm处测定各组的吸光度,并绘制标准曲线。如图6 所示,甲巯咪唑溶液在0 ~ 15 mg/L范围内与吸光度( A) 呈良好的线性关系,线性回归方程: A = 0. 101 24c - 0. 013 26,线性相关系数R2为0. 997 9。
2. 7回收率实验
精确移取待测甲巯咪唑片的滤液1. 00 m L分别放入4 个25 m L的比色管中,并标好序号,再分别量取3. 00 m L硫酸铜溶液、2. 50 m L p H值为4. 5 的HAc - Na Ac缓冲溶液、1. 00 m L新铜试剂于25 m L比色管中。按表1 加入甲巯咪唑标准溶液,测定结果见表1。由表1 可知: 平均回收率为94. 63% ,变异系数RSD为1. 66% ,由此可知该方法准确性良好,可用于定量测定。
2. 8 样品测定
准确称取15 片甲巯咪唑片( 3. 870 0 g) ,用研钵研细后,除去糖衣准确称取m( 粉末) = 1. 2050 g。称取m = 0. 2410 g( 相当于1 片药片) 的药片粉末,充分溶解后并定容于100 m L的容量瓶中,过滤,静置。取1. 00 m L甲巯咪唑待测液于25 m L的比色管中,再分别量取3. 00 m L硫酸铜溶液、2. 50 m L p H值为4. 5 的HAc - Na Ac缓冲溶液、1. 00 m L新铜试剂,定容并摇匀。按已确定的实验方法显色测定,分别测5 组数据。如表2 所示。通过实验换算得到甲巯咪唑片中甲巯咪唑的含量为10. 05 mg/片,RSD为0. 80% 。
3 结论
本实验采用分光光度法快速且准确测定出药片中甲巯咪唑的含量,确定了测定的最优实验条件为: 缓冲液p H值为4. 5,氧化剂与显色剂的体积比为3∶1,待反应30 min后在波长为460 nm处测定其吸光度。
实验结果表明,甲巯咪唑溶液的浓度在0 ~ 15 mg/L范围内与吸光度( A) 呈良好的线性关系,线性方程: A = 0. 10124c -0. 01326,相关系数R2= 0. 9979。样品测定值与标识值相符,平均回收率为94. 63% ,变异系数RSD为1. 66% 。该分光光度法具有快捷、准确、重现性好、操作简单、成本低等优点,是测定甲巯咪唑含量的最佳方法之一。
间接测定 篇2
针对医疗产品还原物质检测的研究, 付步芳[2]对一次性塑料血袋中的还原物质进行了分析并对还原物质进行了相关安全性评价。李克芳[3]等分析了某些一次性使用输液 (血) 器中部分化学性能重现性差并常常引起不合格的原因, 并提出了生产工艺改进的建议。黄勇[4]对药包材产品监督抽验中易氧化物不合格原因进行了分析。本研究采用间接碘量滴定法测定还原物质总量, 探讨检测过程中对测定结果产生影响的一些因素。
1 试验部分
1.1 仪器与试剂
纯水机 (synergy UV) ;加热板, 水浴, 滴定管, 碘量瓶, 移液管等;KMn O4 (高锰酸钾) , 0.1008 mol/L, 国家化学试剂质检中心;H2SO4 (硫酸) , AR, 广州化学试剂厂;Na2S2O3 (硫代硫酸钠) , 0.1024 mol/L, 国家化学试剂质检中心;KI (碘化钾) , AR, 广州化学试剂厂;可溶性淀粉, AR, 广州化学试剂厂;医用输液器、注射器。
1.2 试验方法和结果分析
按照医用输液 (血) 、注射器检验液制备方法制备检验液后, 在碘量瓶中精密加入10 ml检验液和规定浓度的高锰酸钾溶液, 分别按照以下方法进行试验, 分别考察试验过程中加热时间、指示剂的加入时间与加入量、加入碘化钾后放置时间等因素对结果的影响。
1.2.1 加热时间对结果的影响
精密量取同一样品检验液, 制备6个平行样, 加入硫酸溶液和高锰酸钾溶液后在同一加热板上煮沸, 当试验液加热至冒泡后开始计时3 min, 加入碘化钾0.1 g, 迅速冷却, 密塞摇匀, 立即用相同浓度的硫代硫酸钠滴定至淡黄色, 再加5滴淀粉指示剂, 继续用硫代硫酸钠滴定至无色。见表1。
反应温度的升高使得反应物分子平均动能增大, 反应分子变成活化分子的概率得到提高, 分子间的有效碰撞次数也随着增多, 高锰酸钾与供试液中还原物质的反应速率随着反应温度的增加而增大。高锰酸钾在酸性条件下具有较强的氧化能力, 为了使得供试液中的还原物质与高锰酸钾充分反应, 标准中要求加入高锰酸钾溶液到供试液中后加热煮沸3 min。但是由于试验室用的碘量瓶的厚度不一, 较薄的碘量瓶可能较早看见气泡沸起来, 较厚碘量瓶则看不见气泡。为了能够目测到样品液煮沸, 检验人员会通过延长加热时间或者提高加热温度的方式使得样品液煮沸至冒气泡, 这样使得检验结果的重现性差, 部分样品液由于加热时间过长或者加热温度过高, 导致其中的易氧化物流失, 得到低于实际值的检测结果。因此, 使用较薄的碘量瓶在同一加热板上煮沸, 可以使得结果有较好的重现性。
1.2.2 淀粉指示剂的加入时间与加入量对结果的影响
精密量取同一样品检验液, 制备3个平行样, 加入硫酸溶液和高锰酸钾溶液后在同一加热板上煮沸3 min, 加入碘化钾0.1 g, 迅速冷却, 密塞摇匀, 立即用相同浓度的硫代硫酸钠滴定, 分别于不同时间点加入5滴淀粉指示剂, 继续用硫代硫酸钠滴定至无色, 见表2。
淀粉指示剂不宜过早加入, 过早加入, 溶液中的游离碘含量较高, 游离碘会与淀粉指示剂发生氧化还原等副反应, 消耗部分游离碘, 导致试验结果偏低。需要在临近终点的时候加入, 游离碘浓度低, 其与淀粉指示剂发生副反应对结果的影响可以忽略[5]。 (滴定至浅黄色的时候才加入, 这个时候加入淀粉指示剂溶液显浅蓝色, 如果过早加入, 溶液会显深蓝色) , 过早的加入会使得终点变的“迟钝”, 这是由于当溶液中还有大量I2存在时, I2被淀粉牢固吸附, 使得终点提前而产生误差。由于碘分子与淀粉之间存在范德华力, 联系在一起形成络合物[6]。指示剂用量过大, 碘分子被淀粉包裹得更加严格, 增加了硫代硫酸钠与碘分子反应的难度, 从而会消耗过多的硫代硫酸钠。若指示剂用量太少, 则滴定终点变色不灵敏, 结果滴定误差大。
1.2.3 加入碘化钾后放置时间对结果的因素
精密量取同一样品检验液, 制备3个平行样, 加入硫酸溶液和高锰酸钾溶液后在同一加热板上煮沸3 min, 加入碘化钾0.1 g, 迅速冷却, 密塞摇匀, 放置不同时间后, 用相同浓度的硫代硫酸钠滴定至淡黄色时加入5滴淀粉指示剂, 继续用硫代硫酸钠滴定至无色, 见表3。
溶液中高锰酸钾与碘化钾反应的方程式为:
该反应的△rG0m (标准吉布斯自由能差) 等于反应产物的标准生成吉布斯自由能总和减去反应物的标准生成吉布斯自由能, 查阅反应物和生成物的标准吉布斯自由能经过计算得出该反应的△rG0m为-875.076 k J/mol, 说明该反应能够自发进行且反应速率较快。故加入碘化钾密塞摇匀后应立即进行滴定, 若放置一段时间后在进行滴定, 反应产物I2析出后, 在空气中容易被氧化, 导致试验结果产生偏差。
1.2.4 溶液p H值对结果的影响
在酸性条件下高锰酸钾发生氧化还原反应的反应式为:Mn O-1+8H++5e-=Mn2++4H2O, 该反应的标准氧化还原电位为E0=1.51 V。在中性条件下高锰酸钾发生氧化还原反应的反应式为:Mn O-1+2H2O+3e-=Mn O2+4OH-, 该反应的标准氧化还原电位为E0=0.588 V, 高锰酸钾在碱性条件下的氧化性更低。因此, 操作过程中, 应严格按照标准要求, 精密加入1 ml硫酸溶液, 使得供试液中的还原物质被高锰酸钾充分氧化。
1.2.5 其他影响因素
试验前需要对碘量瓶进行预处理, 取洗干净后的碘量瓶加入100 ml的水, 5 ml的稀硫酸和5 ml高锰酸钾溶液, 煮沸5 min[6], 用水冲洗后按照上述方法进行还原物质测定, 碘量瓶是否洗净是保证试验结果可靠的第一步, 对碘量瓶进行预处理可以有效避免测定过程中的异常现象的发生。淀粉指示剂应为临用新配, 指示剂久置会变质、腐败、失效, 灵敏度也会降低。为了使得检测结果具有较高的准确性, 快到滴定终点时, 半滴定的操作可以使得结果的准确性得到提高。滴定时不必剧烈振摇。
2 结论
本研究通过改变不同的测试条件, 分析反应加热时间、指示剂的加入点、引入碘化钾后放置时间等因素对测试结果的影响。采用间接碘量法测定检验液中的还原物质总量时, 为了得到准确可靠的结果, 试验前应对碘量瓶进行预处理, 使用较薄的碘量瓶在同一加热板上煮沸, 加入淀粉指示剂应在滴定溶液至浅黄色时, 并且加入碘化钾密塞摇匀后应立即进行滴定。
摘要：阐述还原物质对医用输液 (血) 、注射器具产品质量控制的重要作用。结合试验分析检测过程中对测定结果产生影响的因素, 指出了检测过程中一些需要注意的问题。
关键词：间接碘量法,还原物质,探讨,影响因素
参考文献
[1]GB15180-2001, 一次性使用无菌注射器国家标准[S].2001.
[2]付步芳.一次性塑料血袋中还原物质的分析及其安全性研究[J].金属与健康, 1995, 21 (1) :27-28.
[3]李克芳, 骆红宇.一次性使用输液 (血) 器化学分析问题与探讨[J].中国医疗器械信息, 2004, 10 (2) :30-31.
[4]黄勇.云南省药包材质量监督抽验情况分析[J].中国药事, 2013;27 (7) :682-685.
[5]桑雅丽, 刘春华, 李鑫娥.常用指示剂用量对滴定反应的影响[J].赤峰学院学报 (自然科学版) , 2015, 31 (1) :9-11.
间接测定 篇3
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
分析天平 (TG 328A, 上海精密) ;恒温水浴 (HH.S21-4, 上海博讯) ;垂熔玻璃漏斗 (G 4规格, 河北虹宇) ;烘箱 (GZX-9146MBE, 上海博讯) ;酸式滴定管 (白色、棕色, 50mL) 。
KMnO4 (固体, 分析纯) ;c (Na2S2O3) =0.1025mol/L的溶液;2mol/LH2SO4;0.5%淀粉溶液;10%KI溶液;Na2C2O4 (固体, 基准物) 。
1.2 高锰酸钾溶液的配制
称取稍小于计算用量的KMnO4 (如称取2.80g) 于1000mL大烧杯中[2], 加水1000mL, 盖上表面皿, 加热至沸并保持微沸状态15min以上, 冷却后于室温下加塞静置2～3d, 然后用垂熔玻璃漏斗过滤, 滤液贮于清洁带塞的棕色瓶中密封保存。这样标定后得到的浓度大约为0.1042mol/L, 与设定浓度0.10mol/L相当, 恰好能满足实际应用的需要。
1.3 间接碘量法
1.3.1 标定原理
由于I-是中等强度的还原剂, 许多标准电位高于+0.54V的氧化剂能被I-还原。所以在酸性溶液中, KMnO4可以和KI发生氧化还原反应而析出I2, 反应式为:
析出的I2再用Na2S2O3标准溶液滴定, 反应式为:
标定时加入KMnO4溶液的体积必须一定, 而KI应加过量, 比理论值大2～3倍。最后通过消耗Na2S2O3标准溶液的体积来计算出KMnO4溶液的准确浓度。
1.3.2 标定方法
用移液管准确移取25mL待标定的KMnO4溶液于250mL碘量瓶中, 加2mol/LH2SO4溶液25mL, 再加入10%KI溶液10mL, 然后用已知浓度的Na2S2O3标准溶液滴定到淡黄色, 加0.5%的淀粉溶液3mL, 用Na2S2O3溶液继续滴定至蓝色恰好消失为止。平行标定8次, 同时做空白试验。
另外, 采用同样的方法, 可以用已知浓度的KMnO4标准溶液对Na2S2O3溶液进行标定, 原理同上。
1.3.3 KMnO4、Na2S2O3溶液浓度的计算
从标定原理中的反应式看出:I-在 (1) 式中被氧化, 在 (2) 式中又被还原, 结果并未发生变化。实际上, 总反应相当于KMnO4氧化了Na2S2O3。在 (1) 反应中, 2molKMnO4氧化产生5molI2, 而在 (2) 反应中, 1molI2和2molNa2S2O3反应。由此可知, KMnO4与Na2S2O3是按2∶10 (即1∶5) 的量比进行反应的。因此, KMnO4溶液浓度的计算式为:
式中:c (1/5KMnO4) 为KMnO4标准溶液的浓度, mol/L;V1为移取KMnO4溶液的体积, mL;c (Na2S2O3) 为Na2S2O3标准溶液的浓度, mol/L;V2为消耗Na2S2O3溶液的体积, mL;V0为空白试验消耗Na2S2O3溶液的体积, mL。
同样, 如果用KMnO4标准溶液来标定Na2S2O3溶液的浓度, 计算式如下:
式中:c (1/5KMnO4) 为KMnO4标准溶液的浓度, mol/L;V1为消耗KMnO4溶液的体积, mL;V0为空白试验消耗KMnO4溶液的体积, mL;c (Na2S2O3) 为Na2S2O3标准溶液的浓度, mol/L;V2为移取Na2S2O3溶液的体积, mL。
重复标定8次, 取算术平均值为标定的结果, 任意两次标定计算值之差应不超过0.0005mol/L。
1.3.4 应注意的问题
1) 淀粉溶液应取直链可溶性淀粉, 在使用前配制, 当滴定接近终点时加入, 以防止较多的I2被淀粉胶粒包裹, 致使终点时蓝色不易消失而影响终点的确定及测定结果的准确度。
2) Na2S2O3标准溶液放置不能太长, 因微生物溶解在水中的CO2和空气中的氧气易使它分解, 标好的溶液应贮存于棕色试剂瓶中。
3) KMnO4与KI反应析出的I2容易挥发, 滴定时溶液温度不能过高, 在室温下进行即可, 并且摇动不要太剧烈, 最好使用碘量瓶滴定。
4) 在酸性溶液中I-容易被空气中的O2氧化, 溶液酸度越高, 氧化速度越快, 故溶液酸度不宜太高滴定开始溶液酸度在为好析出后, 应立即进行滴定, 并且滴定速度可适当快些。
5) KMnO4溶液颜色较深, 液面的弯月面下不易看出, 读数时应以液面的上沿最高线为准。
1.4 草酸钠标定法
1.4.1 KMnO4溶液浓度的计算
准确称取0.15～0.20g (称准至0.0002g) 已在105～110℃烘干至恒重的基准Na2C2O4于250mL的锥形瓶中[3], 加入50mL蒸馏水溶解后, 再加入2mol/L的H2SO4溶液25mL, 加热到75～85℃, 趁热用已配好的0.10mol/L (1/5KMnO4) 的溶液滴定。开始时, 每滴加1滴KMnO4溶液, 就应充分摇动至红紫色褪去, 再滴加第2滴溶液, 待溶液中产生Mn2+后, 适当加快滴定速度, 直至溶液呈粉红色并保持30s不褪色为终点。平行标定8次, 同时做空白试验。反应如下:
式中:m为基准草酸钠的质量, g;V1为滴定消耗高锰酸钾溶液的体积, mL;V0为空白试验消耗高锰酸钾溶液的体积, mL;134.00为草酸钠的摩尔质量, g/mol;c (1/5KMnO4) 为高锰酸钾标准溶液的浓度, mol/L。
1.4.2 应注意的问题
1) 温度:常将溶液加热到75～85℃时趁热滴定, 滴定完毕时, 溶液的温度也不应低于65℃, 否则反应不完全。温度若高于90℃, 会使部分H2C2O4发生分解, 使KMnO4用量减少, 标定结果偏高。
2) 酸度:在开始滴定时, 溶液的酸度约为0.5～1mol/L, 滴定终了时, 酸度约为0.2～0.5mol/L。酸度不足时, 容易生成MnO2·H2O沉淀;酸度过高时, 又会促使H2C2O4分解。
3) 滴定速度:第一滴KMnO4溶液加入后, 由于溶液中没有Mn2+, 反应速度慢, 红色褪去很慢, 必须等滴入的第一滴KMnO4溶液褪色后, 才开始加入第二滴, 保持逐滴加入的速度, 否则滴入的KMnO4来不及与Na2C2O4发生反应, KMnO4就分解了, 从而使结果偏低。随着滴定的进行, 溶液中Mn2+的浓度不断增大, 由于Mn2+的自催化作用, 反应速度越来越快, 红色褪去也就越来越快。
4) 滴定终点:用Na2C2O4标定KMnO4溶液时, 滴定终点不太稳定, 这是由于空气中含有还原性气体及尘埃等杂质, 能使KMnO4缓慢分解, 而使微红色消失, 故经过半分钟不褪色即可认为已到达终点。
2 结果与讨论
1) 用两种标定方法分别标定c (1/5KMnO4) =0.10mol/L的溶液, 标定结果见表1、表2。
由表1、表2看出, 两种标定方法得出的结果取得了较好的一致性。
2) 用F检验法对两种标定结果进行对比, 相关数据见表3。
注:Fa, f1, f2值是在95%置信水平 (a=0.05) 时单侧检验查表得到的。
由表3可见, F
4 结论
从上述分析数据来看, 采用基准Na2C2O4标定法, 整个操作过程比较长, 称取基准试剂要花费一定时间, 滴定前溶液还需要加热, 且滴定速度较慢。而间接碘量法中, 由于KMnO4与KI反应速度快, 操作简便, 条件容易控制, 可大大缩短标定时间。两种标定法的相对误差只有0.0986%, 因此用已知浓度的Na2S2O3标准溶液间接标定KMnO4溶液浓度的方法是完全可行的, 而且比较方便。
参考文献
[1]邢文卫, 陈艾霞.分析化学[M].第二版.北京:化学工业出版社.2006.
[2]GB-T601-2002, 化学试剂标准滴定溶液的制备[S].
间接测定 篇4
葛根素的含量测定主要采用高效液相色谱法 ( high performance liquid chromatography,HPLC)[6,7,8]。 近年来,基于小分子单克隆抗体[9,10,11,12,13,14]建立的间接竞争酶联 免疫分析 法 ( indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA ) 具有特异性 强,灵敏度高,重复性好,简便快捷,前处理简单,经济无污染[15]等特点,特别适用于微量基质生物样品中小分子含量的分析。在ic-ELISA基础上建立的胶体金快速检测试纸可实现中药材的现场快检,更是引起了药品监管部门的关注。
本研究利用实验室制备的抗葛根素单克隆抗体[16],建立了葛根素ic-ELISA法,准确测定了葛根中葛根素的含量,为微量基质生物样品中葛根素的含量分析及葛根素胶体金快速检测试纸的研究奠定了基础。
1材料与仪器
葛根素对照品( 中国食品药品检定研究院,含量96% ,批号: 110752-200912) ,不同批次( 3批) 葛根饮片均购于同仁堂药店。
高效液相色谱仪( Agilent Technologies 1260 Infinity) ,甲醇 ( 色谱纯,fisher ) ,双蒸水 ( 娃哈哈 ) , ELISA分析及其他相 关药品如 磷酸盐和Tween-20等均为国产分析纯。酶标二抗( HRP标记羊抗鼠Ig G,Gene Script公司) ,四甲基联苯胺 ( TMB) ( 美国Amercso公司) ,96孔酶标板,酶标仪 ( Themo MK3型酶联检测仪) 。
2方法与结果
2.1葛根素单克隆抗体的制备
本实验室采用高碘酸钠法[17]成功合成了葛根素的人工抗原,并成功筛选出能够分泌抗葛根素单克隆抗体的细胞株AA9,通过腹水生产法制备出葛根素单克隆抗体[16]。具体过程为: 取6 ~ 8周龄的雄性BALB /C小鼠腹腔 注射弗氏 不完全佐 剂0. 2 m L / 只; 5天后,接种细胞株AA9; 接种10天后, 待小鼠腹部明显膨大,收集腹水,3000 rmp离心20分钟,离心后收集上清,分装,于 - 20 ℃冻存。
2.2葛根素单克隆抗体最佳工作浓度的确定
葛根素单克隆抗体以PBS( 0. 01 mol/L p H 7. 4磷酸盐缓冲液) 分别稀释为1 ∶ 2000,1 ∶ 4000, 1∶ 8000,1∶ 16000,1 ∶ 32000之后,以每孔100 μL加入到已预先包被并封闭好的酶标板中。按照常规ic-ELISA法测定A450值,恒温培养箱37℃ 孵育1小时,PBST洗板3次; 辣根过氧化氢酶标记的羊抗鼠Ig G用磷酸盐缓冲液1∶ 20000倍稀释后,以100μL / 孔加入,恒温培养箱37℃ 孵育1小时,PBST洗板3次; TMB显色液100 μL/孔加入,恒温培养箱37℃ 孵育30分钟,以50 μL / 孔加入终止液( 2 mol / L硫酸) 后立即放入酶标仪,检测450 nm处的吸光值。选定葛根素单克隆抗体的最佳工作浓度。
结果测得上述由1∶ 2000至1∶ 32000的5个稀释比的A450值分别为1. 43,1. 28,1. 02,0. 83, 0. 63。因酶标仪测定A值的敏感 范围在1. 00左右,为保证测定结果的灵敏可靠,抗体稀释比可选择为1∶ 8000。因此,选取葛根素单克隆抗体最佳稀释比为1∶ 8000。
2.3Ic-ELISA方法学考察
2. 3. 1线性关系( 1 ) 包被: 96孔酶标板加入经0. 01 mol / L p H 7. 4磷酸盐缓冲液( PBS) 1∶ 4000稀释的包被原,孵育1小时后,用洗涤缓冲液 ( PBS with Tween-20,PBST) 洗板3次; ( 2) 封闭: 以10% 马血清为封闭液,37 ℃ 封闭反应1小时; ( 3) 加样: 不同质量浓度梯度的葛根素对照品溶液( 以水溶解稀释) 与葛根素单克隆抗体( 1∶ 8000稀释) 的混合液 ( 1∶ 1) 加入酶标板的测定孔中,孵育0. 5小时,洗板。以加有葛根素质量浓度为0的混合液的测定孔为阳性对照孔,以只加PBS溶剂的测定孔为空白对照孔; ( 4) 加酶标二抗: 加入经PBS 1∶ 10000稀释的酶标二抗,孵育0. 5小时,洗板; ( 5) 显色与测定: 加入显色液TMB,显色15分钟,以2 mol/L硫酸溶液终止反应,用酶标仪测定各孔在波长450 nm处的吸光度A值。以上孵育过程均在37 ℃ 恒温孵育箱中完成。以葛根素对照品质量浓度的对数( X) 为横坐标,其对应计算所得的A/A0 ( A0为阳性对照孔的吸光度) 为纵坐标,绘制标准曲线,求得回归方程为: Y = - 0. 159ln( x) + 1. 2145,R2= 0. 9921,以抑制率达到50% 时所对应 的葛根素 质量浓度 为ic-ELISA的灵敏度IC50,结果显示该单克隆抗体抗葛根素的灵敏度为89. 5 ng /m L。该法检测葛根素的线性范围为15. 6 ~ 500 ng /m L。见图1。
2. 3. 2精密度试验取6个不同质量浓度的葛根素对照品溶液,按照“2. 3. 1”项下ic-ELISA法进行测定,每个浓度设置3个平行孔,每个样品重复3次,分别测定孔间差和板间差,对测定结果进行数据分析可知,平行孔之间检测值的RSD为0 . 1 % ~ 3 . 3 % ,各酶标板 之间检测 值的RSD为0. 5 % ~ 3 . 5 % 。见表1 。
2. 3. 3回收率实 验精密吸取 已知含量 的 ( 20 ng /m L) 葛根素溶液共6份,分别加入等体积的葛根素对照品10、20、40、80、160、320 ng /m L,混匀后葛根 素的质量 浓度为15、20、30、50、90、170 ng / m L。按照本实验所建立的ic-ELISA法测定其在450 nm波长处的吸收值。每个浓度平行测定6次,带入标准曲线线性方程计算,测得浓度分别为14. 1、21. 2、28. 4、52. 3、95. 0、180. 3 ng / m L。回收率为94. 0% 、106. 0% 、94. 7% 、104. 6% 、105. 6% 、 106. 1% ,回收率均值为101. 8% 。
2. 3. 4含量测定不同批次的葛根饮片分别称取3 g,加6倍量水煎煮2次,每次2小时,合并煎液, 滤过,浓缩,去离子水定容至50 m L,制备葛根供试品溶液[18]。分别采用本实验建立的ic-ELISA法和传统HPLC对葛根中葛根素含量进行测定,平行测定3次。Ic-ELISA测定: 回归方程为: Y = - 0. 159 ln( x) + 1. 2145,稀释至适宜倍数后,按照“2. 3. 1 ” 下方法检测葛根提取液中葛根素的含量。HPLC测定: 参考2010年版中国药典( 一部) ,选用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱 ( 4. 6 mm × 150 mm,5 μm) ,流动相为甲醇与水( 25∶ 75) ( V∶ V) ,检测波长250 nm,进样量10 μL( 标准曲线为Y = 43. 475x + 0. 4417) 。两种方法检测结果见表2,采用Excel软件进行t检验,P = 0. 478 > 0. 05,两组数据差异无统计学意义。因此,ic-ELISA与HPLC检测结果具有一致性,从而验证了所建立的ic-ELISA的准确性。
3讨论
本实验室合成了葛根素人工抗原,筛选出能稳定分泌抗葛根素的特异性杂交瘤细胞系,制备出抗葛根素的单克隆抗体,检测抗体效价大于128 000, 检测灵敏度为89. 50 ng /m L,且对结构类似黄酮类化合物显示极低的交叉反应( < 0. 01% ) ( 另文发表) 。在此基础上,本研究建立了葛根素ic-ELISA方法。
Ic-ELISA方法的建立会受到很多因素的影响, 除了单克隆抗体的质量因素外,还包括包被原的工作浓度、封闭液种类、单抗的工作浓度等。按照常规ic-ELISA法测定,本实验最终确定: 包被原最佳工作浓度为1∶ 4000,封闭液为10% 马血清,葛根素单抗最佳工作浓度为1∶ 8000。
Ic-ELISA法逐渐应用于 中药现代化 的化学成 分检测与质量控制评估领域,成为仪器分析技术的补充。目前,对于葛根素的含量测定主要采用高效液相色谱法、薄层色谱法、毛细管电泳法等,其中高效液相色谱法最为常用。但是上述方法或样品前处理过程复杂,或仪器昂贵、检测成本高,或对操作人员实验技能要求较高。Ic-ELISA法的优势主要体现在: ( 1) 与常规理化分析技术相比,具有特异型强、灵敏度高的特点,甚至可检测到飞摩尔或亚飞摩尔低浓度水平; ( 2) 方便快捷,取样量少,前处理简单,仪器化程度低,分析效率约为HPLC或GC的几十倍。
本实验准确测定了葛根中葛根素的含量,因此利用此技术的准确性以及灵敏度高、特异性强等优点,可分析中药复方中葛根素在血液、器官及组织样品中的含量分析; 甚至可以制成葛根素胶体金试纸条、试剂盒等,从而为中药质量控制以及中药作用机制的阐明奠定基础。
摘要：目的 利用间接竞争酶联免疫分析法(indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA)测定葛根中葛根素的含量。方法 利用抗葛根素单克隆抗体,通过线性关系、精密度、回收率的考察,建立葛根素的ic-ELISA分析方法。结果 该方法的线性范围为15.6~500ng/m L,孔间差和板间差均不大于3.5%,平均回收率为101.8%,并且该法检测结果与高效液相色谱法检测结果一致。结论 本实验为葛根质量控制以及含葛根药材的中药复方中葛根素的含量测定提供了一种新技术方法。