间接血凝试验（共5篇）
间接血凝试验 篇1
间接血凝试验 (IHA) 是上世纪60年代在我国发展起来的血清学诊断技术, 是用已知血凝抗原致敏与免疫无关的惰性微粒表面 (载体) 检测未知血清抗体的试验, 迄今仍在许多疫病诊断中广泛应用。林琳等研究表明应用猪瘟正向间接血凝法 (IHA) 与斑点酶联免疫吸附试验 (dot-ELISA) 以及猪瘟抗体免凝金标试纸条比较, 对规模化养猪场138份不同阶段猪血清进行检测, 三种方法检测抗体的阳性率结果接近。数十年来正向间接血凝试验技术不断完善, 它具有简单、经济、快速、实用的特点在我国有很大的用户群, 近年来, 兰州兽医研究所生产的液体猪瘟和口蹄疫正向间接血凝试验的试剂用量在逐年加大, 然而, 实验结果受操作技术影响较大。为做好正向间接血凝试验, 使各地的检验结果一致, 减少误差, 现就正向间接血凝试验谈一点看法, 以抛砖引玉、共同探讨和提高。
1 实验器材的优化
本实验所使用的实验器材包括微量血凝板, 微量振荡器, 移液器和吸头, 为保证实验的顺利进行, 要选择质量有保障, 稳定性好的器材。
1.1 微量血凝板
实验室经常使用的是有机玻璃材质110°底角的96孔V型微量血凝板, 此板可以叠放, 不占实验室台面, 处理样品量较大时合适, 但每次用完需要清洗。清洗方法:一般先用清水浸泡, 然后马上用高压清水冲洗, 洗净后用手甩干板子倒置于37℃温箱中烘干。用前要先检查血凝板孔底是否干净, 如发现有透光性差一点的孔, 可用酒精棉签擦净。除了有机玻璃板以外, 还有一次性血凝板, 不需清洗, 也不用担心板子不干净影响结果, 但不能叠放, 测定少量样品适合。
1.2 微量振荡器
使用振荡器振荡时间不宜超过10秒钟, 振荡强度不能太大, 先从小到大, 中等强度即可。多块板叠加后振荡时要用手压住最上一板, 以防上下的振动造成孔中液体溅出而影响实验结果的准确性。如果实验室没有它, 也可用手轻拍血凝板的边缘即可, 现在一般用微量移液器 (加样枪) , 加样后有一定的冲力, 可以起到混匀的作用。
1.3 单、多道微量移液器
建议使用高质量的移液器, 用定量移液器需要准备50微升和25微升两种。50微升的用来加稀释液和稀释血清, 25微升的用来加血凝抗原。可调的移液器要选择与检测过程中加样量相近量程的移液器, 吸取液体时动作要轻缓, 防止溶液吸入过快, 冲入移液器污染柱塞或造成堵塞漏气。一定要养成移液器用完后放在移液器架上的习惯, 移液器如果掉到地下很容易损坏。用完后移液器用75%的酒精棉擦拭, 并把刻度调到最大值。
1.4 吸嘴
高质量的吸嘴经过处理后可以重复使用。处理方法:吸嘴用完后浸泡在清水里, 先用清水漂洗, 用超声波清洗器处理10分钟, 换水后用二层纱布包好, 用洗衣机甩干, 再用超声波清洗器处理10分钟, 再用洗衣机甩干, 高压消毒灭菌器中121℃, 20分钟即可, 去盖后任水分蒸发, 或放37℃温箱中烘干。吸嘴用完后没有用清水浸泡的很难洗干净, 不必重复使用。接触过高感染性材料的吸嘴要高温消毒后废弃。经过处理后的吸嘴如果尖头变弯, 则质量不好, 不要重复使用。
2 试剂的优化
2.1 抗原
液体正向血凝抗原摇匀后呈咖啡色, 无块状物沉淀, 静置后血球逐渐沉入瓶底。摇匀后能很快形成均匀混悬液的是好抗原, 摇匀后仍有小块黑色沉淀物 (血球团) 的抗原建议不要使用。如果只做筛检看是否达到合格线, 一瓶抗原可以检测30到50份血清。值得一提的是液体正向血凝抗原4～8℃保存, 保存期3个月, 不能冷冻保存。
2.2 对照血清
阴性对照血清呈淡黄色清亮液体, 阳性对照血清微红或淡黄色略微混浊的液体。阴阳性对照血清可在-15℃到-20℃保存, 有效期2年。
2.3 稀释液
稀释液无色透明, 一般情况4～8℃保存。用前建议将稀释液放37℃温箱中半小时后摇匀再用较好。试剂不能放置太久, 最好新进现用。
3 样品血清的优化
新分离血清尽快检测完, 未检血清-20℃保存。冷冻血清待检时需融化, 同时避免血清反复冻融影响检测结果。严重溶血、严重污染、腐败或有悬浮杂质的血清样品不宜检测, 以免发生非特异性反应。
4 实验过程优化
正向血凝实验过程包括:加稀释液, 稀释待检血清, 稀释阳性阴性血清, 加血凝抗原, 震荡静置, 结果判定。在试验中要注意以下的问题:
4.1 加稀释液
在血凝板上1～6排的1～9孔;第7排的1～4孔, 第6孔;第8排的1～12孔各加稀释液50微升。
4.2 稀释待检血清
取1号待检血清50微升加入第1排第1孔, 并将枪头插入孔底, 混匀后, 从该孔吸取50微升移入第2孔, 混匀后从该孔吸取50微升移入第3孔, 直至第9孔。此时第1排1～9孔待检血清的稀释度 (稀释倍数) 依次为1∶2、1∶4、1∶8……1∶256、1∶512。每个待检血清样品均按上述方法稀释。在稀释血清操作时注意不要产生很多气泡, 每稀释一份血清要换吸嘴, 每次试验要做阴阳性对照, 最好也做二孔空白对照, 即孔中加50微升稀释液后加25微升抗原。每次检测时阴性、阳性和稀释液对照只需各做一份。
4.3 稀释阴性对照血清
在血凝板上的第7排第1孔加阴性血清50微升, 对倍稀释至第4孔。此时阴性血清的稀释倍数依次为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16。第6孔为稀释液对照孔。
4.4 稀释阳性对照血清
在血凝板上的第8排第1孔加阳性血清50微升, 对倍稀释至第12孔。此时阳性血清的稀释倍数依次为1∶2、1∶4、1∶8……1∶2048、1∶4096。
4.5 加血凝抗原
被检血清各孔、阴性对照各孔、阳性对照各孔、稀释液对照孔均各加血凝抗原25微升。血凝抗原用前要充分摇匀, 瓶底应无血球沉淀。一次实验过程应选择同一批号的抗原, 并先从稀释度高的孔加起, 避免滴头和孔内的液体直接接触。
4.6 振荡混匀
将血凝板置于微量振荡器上振荡10秒钟, 如无振荡器, 用手轻轻摇匀即可。然后将血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀, 以没有血球沉淀为合格。盖上玻板, 室温下或37℃下静置2小时, 判定结果, 也可将板置冰箱中冷藏延至次日判定。
5 判定标准
将血凝板放在白纸上, 先观察阴性对照血清1∶16孔和稀释液对照孔, 均应无凝集 (血球全部沉于孔底形成边缘整齐的小圆点) , 或仅出现“+”凝集 (血球大部分沉于孔底, 边缘稍有少量血球凝集) 。
阳性对照血清1∶2到1∶256各孔 (1～8孔) 应出现“++”到“++++”凝集为合格 (少量血球沉于孔底, 大部分血球凝集) 。如图1所示, 该阳性血清滴度为1∶512倍或记为9log2。
在对照孔合格的前提下, 观察待检血清各孔, 以呈现“++”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。例如1号待检血清1～5孔呈现“++”到“++++”凝集, 6～7孔呈现“++”凝集, 第8孔呈现“+”凝集, 第9孔不凝集, 那么就可判定该份血清的抗体效价为1∶128, 或者说7log2。接种口蹄疫和猪瘟疫苗的畜群免疫抗体效价达到1∶32 (即5log2;第5孔) 呈现“++”凝集为免疫合格。我们不少地方作抗体筛检时样品血清只稀释8个孔, 加血凝抗原时只加第3、4、5、6、7孔, 只要第5孔以上出现凝集的就判该血清为阳性, 否则为阴性。这种方法可以大量减少试剂的用量。
6 值得探讨的问题
6.1 牛病毒性腹泻抗体干扰问题
鉴于有些场猪瘟间接血凝试验1∶32至1∶256倍凝集的样品与ELISA方法相比符合率不满意, 不少学者提出了间接血凝方法虽然简单, 但不能区分猪瘟抗体与牛病毒性腹泻抗体。在实验中如果遇到这种情况, 建议采用猪瘟抗体单抗阻断ELISA方法进行检测, 其结果更可靠些。
6.2 不同血凝板的孵育时间和判定
试剂盒要求使用110°底角的血凝板, 但不少实验室仍在使用90°底角的血凝板。如果使用的是90°底角的血凝板, 结果判断时会存在一定的差异, 一般来讲结果会偏低一些。在判读结果的时间上, 90°底角的血凝板判读结果在1.5～2小时, 低于1小时会判断不准, 多出现高判结果的现象。而110°底角的血凝板, 判读结果时间应在2小时后为妥, 冬天还可适当长一点, 低于1.5小时会判断不准。使用90°底角的血凝板要注意掌握好判读结果的时间, 也要注意样品凝集图形的梯度变化情况。如果前4个孔为100%凝集, 标记为“#”或有的标记为“++++”, 第5孔为成片、块状的凝集, 不是均匀分布, 也不是多数血球沉于孔底, 这时结果可以结合第4孔为100%的情况, 判终点为第5孔。如果判为第4孔则判严了。如果是110°底角的血凝板就不存在这种情况了。第4孔和第5孔的判断是这个试验的关键, 判了第4孔则该份血清为阴性, 判了第5孔则为阳性, 阴阳之差往往就在这一下, 不能不引起重视。
摘要：间接血凝实验 (IHA) 是最简单、快速、适用的血清学诊断技术, 但实验结果受操作技术影响较大, 为规范操作, 本文就实验中器材、试剂、样品、过程和判定标准等方面的优化做一综述, 以期作为本实验的借鉴。
关键词：间接血凝试验
参考文献
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间接血凝试验 篇2
(盐城市射阳县新坍中心卫生院江苏盐城224300)【摘要】总结采用凝血仪测定血凝试验各环节中主要影响因素，并对这些影响因素进行逐个解剖，提出有效地避免措施，使得试验结果更加贴近临床，为临床提供准确的信息。
【中图分类号】R7446.1【文献标识码】A【文章编号】1004-5511（2012）04-0022-01 卫生部颁发了［2000］412文件，停止Pure法测出血时间及玻片法测凝血时间，用其它相关项目（如PT、APTT、TT、PLT等）联合检测代替。其目的是为保证临床检验结果将更加贴近临床，为患者的疾病诊断提供有效地信息。随着血凝仪的广泛使用，血凝常规也步入了自动分析时代，给临床的诊疗工作带来极大的方便。如何确保检验结果的可靠性与准确性呢？这是我们每一位临检工作者不断最求的目标。笔者有意对凝血仪测定血凝试验一些主要影响因素进行剖析，旨在于与同道一起交流学习，达到共同提高的意义。一、标本采集：采集前一星期禁用阿司匹林肝素和华法令等抗凝药物及其它影响凝血试验的药物（特殊病例除外）；采集前三天禁食牛奶、豆浆等含脂肪较多的食物［1］；采血当天早晨空腹抽血，否则影响检验结果。采血时尽量不用止血带来扎血管，若用扎带压力要小，时间短。采血要一针见血，抽血速度要慢且均匀，不能在瘀血部位取血，正在静脉滴注的病人应从对侧静脉采血，不应在点滴的针头处取血，不要拍打抽血部位，避免产生凝血、溶血、气泡和组织液混入。采血后应拔掉针头沿管壁缓慢加入试管（避免气泡，因气泡可使纤维蛋白V因子、Ⅻ因子变性）立即与抗凝剂颠倒混匀避免用力振荡，并加盖防止CO2逸出PH升高使PT和APTT结果延长［2,3］。二、标本处理：草酸钠、EDTA和肝素不适合做抗凝剂。应选择用109mnol/L枸缘酸钠抗凝，血液与抗凝剂的比例应控制为9:1；用硅化试管或塑料管中以免出现冷激活现象；以相对离心力1000g，离心10分钟，或2500转/m2m离心15分钟，避免产生泡沫浑浊、溶血、脂血或黄疸标本可能引起的错误结果。三、标本测定：分离血浆后应立即测定在1h时内测完。若不能立即测定在4℃冰箱中不应超过2h，血浆应在原试管中不宜移出。测定时应用一次性加样器及样品杯。温度控制在37℃±1℃APTT孵育激活时间一定要充分准备3mim，否则血凝因子激活不完全可导致错误结果、若仪器为磁珠法应防止磁场干扰［4］。四、结果报告：PT测定报告应以INR值报告，因为检测PT由于采用不同来源的凝血货酶，其敏感度相差较大［5］。国际敏感度指数（ISI）愈大表明该试剂灵敏度愈低。有时按PT值和比值PTR报告相差很大的标本按INR的报告可能相近。如同一份血标本，两个实验室分别用ISI为3和1.2的凝血活酶分别为1.64和3.5，结果相差悬殊。但是如果换算成INR则1.643＝4.49，3.51.2＝4.49，两者的INR相同。使各实验室之间有对比性和指导临床上口服抗凝药物的用量。综上所述，血凝常规要想有一个准确的报告结果，必须各个环节都有质量保证，各环节紧密衔接，相辅相成，尤其是加强分析前的质量控制，才能保证结果的可靠性、真实性，才能正确的反映病人的出、凝血机制；才不会在工作中出现医疗差错，避免给临床带来误诊。参考文献［1］傅向春，徐友妹，全自動血凝分析参与值调查，江西医学检验，1997，17，（1）:22.［2］杨学敏，李智，血浆凝血酶原和部分凝血活酶时间测定影响因素的探讨，医学检验进修杂志1997，400:17.［3］郭凌云.全自动血凝仪的使用体会［J］.检验医学与临床,2011,4:132-133.［4］张朝明,舒洪丽.凝血常规试验在血凝分析仪上的比对分析［J］.检验医学与临床,2011,16:32-33.［5］钱晓华,夏晓华,张伟民.影响凝血试验室间质量评价结果的主要因素分析［J］,浙江检验医学,2007,1:12-14.
如何做好正向间接血凝试验 篇3
正向间接血凝试验的原理是将可溶性抗原吸附于与免疫无关的载体 (红细胞) 表面, 此吸附抗原的红细胞与相应的抗体结合, 在有电解质存在的适宜条件下发生的肉眼可见的凝集性反应。充分理解正向间接血凝试验的原理, 对整个试验的操作和结果判定都具有很大的指导意义。
实验室正向间接血凝试验常在96孔110°V型血凝板上进行, 操作步骤可简化为: (1) 稀释液→ (2) 待检血清→ (3) 对倍稀释→ (4) 血凝抗原→ (5) 震荡静置→ (6) 结果判定六个环节。
正向间接血凝为一种微量的定量反应试验, 因而, 任何操作环节的纰漏都会使最后判定的结果与正确结论大相径庭。在几年来的基层实验室实际操作中, 通过不断摸索, 我得出如下几点操作体会, 在此和大家共同探讨, 不妥之处敬请各位同行批评指正。
1 反应板
在结果判定结束后应及时置水龙头下冲净血球并放入温水中浸泡, 以便于清洗, 不可放入容器内直接在电炉上加热。洗涤时应用棉签逐孔多次擦拭清洗, 不能用尖硬的器具清除沉淀在孔底的污垢。待最后用蒸馏水清洗2次并甩干后, 将血凝板正对日光灯, 孔底应光洁透明无可见沉淀附着物。
2 待检血清
如存在腐败、严重溶血、有悬浮物等情况, 将会使实验结果不再具有任何客观依据, 因此保证待检血清的正常性状是试验成功的最先决条件。
3 滴头
每次滴加样本后应吸取稀释液并冲洗几次, 最后将滴头内的残液完全排尽, 以尽可能的保证样品被全部加入反应孔。
4 抗原
为悬浮液, 每次滴加前应充分摇匀, 并先从稀释度高的孔开始加起, 同时避免滴头和孔内的液体直接接触。
5 倍比稀释
作倍比稀释前, 应且记将滴头内的空气排尽, 避免稀释时孔内产生气泡, 直接影响结果判定。
6 血清稀释
正向间接血凝试验中待检血清从低稀释度向高稀释度转化过程中, 试验呈现的现象应为血球由凝集 (悬浮) →逐步沉淀的转化过程 (待检血清中抗体效价≥1:2) , 如试验现象不按此规律发展, 则可能是操作环节出现错误或试剂 (包括待检血清) 中存在非特异性反应的因素。
7 结果判定
以出现“++” (50%的血球凝集) 孔的血清稀释倍数为该份血清的抗体效价, 因此正确识别“++”的凝集现象是最后结果判定的先决条件。一般的判定方法是将血凝板放在白纸上, 在各对照孔符合要求的前提下, 从开始出现沉淀的孔观察起, 至血球全部沉淀孔, 综观这几孔, 前后对比血球凝集和沉淀的发展情况, 以1/2血球沉淀孔的血清稀释倍数为该份血清的效价。
猪支原间接血凝诊断抗原制备 篇4
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验试剂。
牛心浸液 (自制) 、猪胃消化液 (自制) [1]、无支原体新生牛血清 (杭州四季清生物工程材料有限公司生产) 、健康绵羊 (雄性) 血液、健康家兔血液、酵母浸粉、牛肉浸膏、水解乳蛋白、葡萄糖、青霉素G、迭氮钠、硫柳汞、戊二醛、0.15 moL/L pH值为7.2的磷酸盐缓冲盐水 (PBS液) 、0.15 moL/L pH值为6.4的PBS液、1/20 000鞣酸PBS液、1%兔血清缓冲盐水、阿氏液等。
1.1.2 培养基。
供试培养基为肺炎支原体肉汤培养基, 按常规方法制备备用。
1.1.3 试验设备。
组织捣碎机、恒温培养箱、低温冰箱、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、冷冻离心机、低速离心机、超声波破膜仪、水浴锅、微量振荡器、分析天平。
1.2 试验方法
1.2.1 抗原制备。
(1) 菌株扩大繁殖。按1%～10%接种量, 将猪肺炎支原体菌液接种于300 mL肺炎支原体肉汤培养基中。培养基用40支中号试管分装, 棉塞封口, 分别标记为1～40号, 置于37℃恒温培养箱中培养, 每天观察培养基颜色变化, 待颜色变黄 (即pH值由7.6降至6.8) 时收获。 (2) 浓缩。将收获的培养物以6 500 r/min低温 (-4℃) 离心60 min, 除去上清液, 沉淀的菌体用0.15 moL/L pH值7.2的PBS液离心洗涤2次, 每次6 500 r/min离心10 min。最后一次离心沉淀的菌体, 用含0.01%硫柳汞的PBS液配成原培养物体积1%的菌悬液。 (3) 裂解。将浓缩制得的菌悬液置于冰浴中经超声波间隙裂解15 min, 吸取上清液作为抗原, 置于-20℃冰箱中冻存, 且不得超过6个月[2]。 (4) 绵羊红细胞戊二醛化。取保存在阿氏液中的公绵羊血液, 以2 000 r/min离心15 min, 沉淀用0.15 moL/L pH值7.2的PBS液反复离心洗涤3次, 每次均为3 000 r/min离心3 min, 除去上清液, 取沉淀的红细胞, 按每10 mL红细胞体积滴加1%戊二醛0.15 moL/L pH值7.2的PBS液100 mL, 5 min内滴加完毕, 于4℃冰箱中醛化50 min, 中间振荡4～5次, 取出后仍呈深红色, 非常黏稠地沉积于离心管底, 须强力才能搅拌起, 再以上述PBS液洗涤3次, 每次均以3 000 r/min离心3 min。最后一次去上清液, 加入含0.01%硫柳汞的0.15 moL/L pH值7.2的PBS液, 配成10%戊二醛红细胞悬液, 置4℃冰箱中保存且不得超过6个月[2], 供抗原致敏和吸收被检血清用。 (5) 醛化红细胞鞣酸化。取制成的10%戊二醛化红细胞液10 mL, 以0.15moL/L pH值7.2的PBS液洗涤3次, 每次均为3 000 r/min洗涤3 min, 去上清, 加入上述PBS液32.4 mL (去掉了1 mL的红细胞量) , 配成3%戊二醛化红细胞悬液, 加等量体积 (33.4 mL) 现配的1∶20 000浓度的鞣酸PBS液, 充分混匀后置于37℃水浴中鞣化20 min, 用pH值7.2的PBS液洗涤3次, 每次均为3 000 r/min洗涤3 min, 最后一次去上清液, 往沉淀物中加0.15 moL/L pH值6.4的PBS液33.4 mL配成3%红细胞悬液, 即为3%鞣酸化红细胞。置2～8℃保存, 在7 d之内供抗原致敏用。 (6) 抗原致敏醛化鞣酸化红细胞。取3%醛化鞣酸化红细胞10 mL加1%抗原10 mL, 于37℃水浴箱中感作30 min, 以3 000 r/min离心3 min, 去上清, 沉积物用含0.5%兔血清pH值7.2的PBS液洗涤2次, 每次均为3 000 r/min离心3 min, 去上清。往沉淀物中加入含1/10 000硫柳汞的兔血清pH值7.2的PBS成20 mL, 即为1.5%的间接血凝诊断抗原[3]。
1.2.2 灵敏度检测。
(1) 血清的处理。取猪肺炎支原体阳性血清0.2 mL于无菌小管中, 56℃水浴30 min灭活。冷却后加入2%戊二醛化红细胞悬液0.3 mL, 摇匀, 置37℃水浴30min, 离心后吸出血清供检验用。 (2) 试验对照用红细胞液的制备。取3%醛化鞣酸化红细胞液5 mL与0.15 moL/L pH值7.2的PBS液等量混合后, 置37℃水浴箱中30 min, 以3 000r/min离心3 min, 去上清, 用含0.5%兔血清pH值7.2的PBS液将沉积物洗涤2次, 每次均为3 000 r/min洗涤3 min, 去上清。往沉积物中添加含1/10 000硫柳汞的1%兔血清pH值7.2的PBS配成10 mL, 即为1.5%对照用红细胞。 (3) 检测方法。采用间接血凝试验方法进行。取洁净干燥的微量反应板, 选取相邻的2排孔, 用移液枪吸取1%正常兔血清0.15 moL/L pH值7.2的PBS液分别加入2排孔中, 每孔加入25 mL。稀释血清, 用移液枪吸取56℃灭活30 min的猪肺炎支原体阳性血清25 mL加于第1排第1孔中, 反复吹打使其充分混匀后, 吸取25 mL于第2孔同前混匀后吸至第3孔, 如此反复直至倒数第2孔, 最后一孔不加阳性血清作为对照。用移液枪吸取支原体抗原致敏的红细胞诊断液, 加入第1排孔中, 每孔25 mL, 再吸取对照用醛化鞣酸化红细胞液加入第2排孔中, 每孔25 mL。将血凝反应盘置于微量振荡器上, 振荡3～5 min, 充分混匀, 取下反应盘, 将其置于事先铺有纱布的搪瓷盘内, 置37℃恒温培养箱中1.0～1.5 h后取出观察结果, 必要时可放室温下过夜, 次日观察反应结果, 并作出最终判断。 (4) 结果判定。判定时, 应首先看对照孔, 只有在各个对照孔完全正确的情况下, 说明反应条件正常, 方可判定结果。
1.2.3 特异性检测。
(1) 血清的处理。取猪肺炎支原体阳性血清和猪鼻支原体阳性血清各0.2 mL于2支无菌小管中, 56℃水浴30 min灭活。冷却后分别加入0.3 mL 2%戊二醛化红细胞悬液, 摇匀, 置37℃水浴30 min, 离心后吸出血清供检验用。 (2) 试验方法同灵敏度检测方法。若所制备的猪肺炎支原体间接血凝诊断抗原与猪肺炎支原体阳性血清出现凝集现象, 而不与猪鼻支原体阳性血清发生凝集, 则可判定所制备的诊断抗原具有特异性。
2 结果与分析
2.1 抗原制备
菌株扩大繁殖, 接种菌液后置于37℃恒温培养箱中培养, 每天观察培养基颜色变化。第1～3天均未出现颜色变化。第4天观察有10支试管中培养基出现微黄色, 分别是2、5、11、18、21、25、26、32、35、39号, 剩下的30支试管中的培养基无明显变化。直至第7天时40支试管中培养基全部变为黄色, 此时即可收获进行浓缩、裂解等。培养物经浓缩、裂解, 获得浓缩抗原3 mL。绵羊红细胞经醛化鞣酸化处理后致敏抗原, 最后获得1.5%的间接血凝诊断抗原20 mL。
2.2 灵敏度检测
所制备间接血凝诊断抗原, 经间接凝集试验检测, 与《国家生物制品制备和检验规程》结果相符, 结果表明, 其具有较高的灵敏度 (表1) 。
2.3 特异性检测
所制备间接血凝诊断抗原, 经间接凝集试验检测, 结果表明有较强的特异性 (表2) 。
3 结论与讨论
试验结果表明, 猪肺炎支原体阳性血清稀释到1∶128时仍出现“++”凝集现象, 说明该猪肺炎支原体间接血凝诊断抗原具有很高的灵敏度。同时特异性检测结果显示, 制得的猪肺炎支原体间接血凝诊断抗原与猪肺炎支原体阳性血清发生凝集, 而不与猪鼻支原体阳性血清发生凝集, 说明该猪肺炎支原体间接血凝抗原特异性较强。微量抗原间接血凝试验可缩短猪肺炎支原体检测时间, 避免猪肺炎支原体分离培养过程中成本较高、耗时较长等缺点。因此, 猪肺炎支原体间接血凝抗原的制备在临床辅助诊断可显示出其快速、灵敏、特异性强的优越性[4]。
摘要：通过对猪肺炎支原体的扩大繁殖, 在培养基颜色变黄时收集菌液, 通过浓缩、裂解、致敏、醛化鞣酸化绵羊红细胞而制备出猪肺炎支原体间接血凝诊断抗原, 并应用微量间接血凝试验对所制备的抗原进行灵敏度和特异性检测。结果表明, 所制备的猪肺炎支原体间接血凝诊断抗原灵敏度高、特异性强, 可以为猪支原体肺炎的血清学诊断提供材料。
关键词：猪,肺炎支原体,间接血凝诊断,抗原制备,灵敏度
参考文献
[1]陈天寿.微生物培养基的制造与应用[M].北京:中国农业出版社, 1995:64, 94-95, 470-483, 613.
[2]农业部.猪支原体肺炎微量间接血凝试验抗原与阴、阳性血清制造及检验规程[S]//中华人民共和国兽用生物制品规程, 2000.
[3]王世若, 王兴龙, 韩文瑜.现代动物免疫学[M].2版.长春:吉林科学技术出版社, 2001:452-462.
间接血凝试验 篇5
1 材料与方法
1.1 原料与试剂
猪瘟病毒抗体检测试剂盒 (阻断ELISA) 购自北京爱德士元亨生物科技有限公司 (美国IDEXX公司生产, 试剂盒批号43200.Q651) 。猪瘟正向间接血凝诊断抗原及稀释液、猪瘟阳性血清、阴性血清均由中国农业科学院兰州兽医研究所生产, 批号为100605、100603和100712
检测样本选自江苏某养殖场的二元杂交猪。
1.2 试验仪器
ST-360型酶标仪, 上海科华实验系统有限公司;HWS-250型恒温恒湿培养箱, 上海森信实验仪器有限公司;GENIUS 6K-M型台式离心机, 长沙市鑫奥仪器仪表有限公司;WZ-2A型微量振荡器, 北京海淀电子医疗器械仪器厂。
1.3 试验方法
1.3.1 阻断ELISA法检测猪瘟抗体
1.3.1. 1 操作步骤试剂盒在使用前, 分别将各组分摇匀, 18~25℃下放置30min以上以恢复试剂温度。
(1) 在反应板上各空分别加入50μL样品稀释液。
(2) 分别加入50μL的阳性对照和阴性对照, 对照要做双份。
(3) 将被检样品分别加入其余的检测孔, 50μL/孔, 为防止交叉污染, 不同样本应更换滴头。
(4) 将反应板用振荡器振荡, 以混匀溶液。
(5) 封条封闭微量反应板, 20℃温箱中孵育2h。
(6) 以300μL/孔的量, 用洗液清洗微量反应板, 每孔3次, 清洗后在吸水纸上扣板, 甩去多余液体。
(7) 以100μL/孔的量在各孔中加入抗CSFV酶标抗体, 封条封闭微量反应板, 20℃温箱中孵育30min。 (加样前要确保板空未完全干涸, CSFV酶标抗体需即取即用)
(8) 重复步骤6的清洗步骤。
(9) 以100μL/孔的量在各孔中加入底物溶液, 在20℃避光的温箱孵育10min。 (以加完第一孔后开始计时)
(10) 以100μL/孔的量在各孔中加入100μL的硫酸终止液终止反应, 终止反应的顺序要与加入底物的加样顺序保持一致。
(11) 在酶标仪上检测各孔在450nm处的吸光度值。
1.3.1. 2 计算方法和判定标准阴性对照平均值= (阴性对照1OD450值+阴性对照2OD450值) /2
阳性对照平均值= (阳性对照1OD450值+阳性对照2OD450值) /2
样本阻断率= (阴性对照平均OD450值-样品OD450值) /阴性对照平均OD450值×100%
只有当阳性对照的阻断率大于50%且阴性对照的平均OD450值大于0.50, 实验方成立, 否则应重新检测。若样本的阻断率小于或等于30%, 判为阴性 (无抗CSFV抗体) ;如果被检样本的阻断率在30%~40%之间, 该样本可判为可疑;若样本的阻断率大于或等于40%, 判为阳性 (存在CSFV抗体) 。
1.3.2 用IHA法检测猪瘟抗体
1.3.2. 1 操作步骤
(1) 在血凝板上加入稀释液, 50μL/孔。
(2) 在第1排第1孔, 加入1号待检血清50μL, 并将枪头插入孔底, 混匀, 然后从该孔吸取50μL混匀后的液体, 移入第2孔内, 再混匀后吸取50μL混合液移入第3孔, ……按照此规律一直倍比稀释至第9孔混匀, 然后吸出50μL弃去。此时该待检血清的稀释度 (稀释倍数) 依次为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512 (分别对应第一排1~9孔) 。
取2号待检血清加入第2排;取3号待检血清加入第3排……均按上述方法进行稀释。
(3) 其他待检测血清及阴、阳性对照血清均按照上述方法进行稀释。
(4) 留好稀释液对照孔
(5) 被检血清孔、阴性、阳性对照孔和稀释液对照孔, 分别加入25μL血凝抗原 (使用前血凝抗原要充恢复室温并充分摇匀, 保证瓶底要无血球沉淀) 。
(6) 将血凝板置于微量振荡器上振荡1~2min, 用白纸衬在血凝板下方观察各孔红血球是否和混匀, 确保没有血球沉淀。盖上玻板, 室温过夜, 次日判定结果。
1.3.2. 2 判定方法将玻璃板移开, 用白纸衬在血凝板下方观察稀释液对照孔和1:16阴性对照孔。血球均应全部沉于孔底形成边缘整齐的小圆点 (无凝集) , 或仅出现血球大部分沉于孔底, 边缘稍有少量血球悬浮 (“+”凝集) 。
阳性对照血清1~8孔 (1:2~1:256) 应仅有少量血球沉于孔底, 大部分血球悬浮于孔内 (“++-++++”凝集) 为合格。如以上对照不成立, 则实验方无效, 应重新进行检测。当对照孔合格时, 再观察检测孔, 待检血清以呈现“++”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。当稀释倍数大于或等于1:16时判为猪瘟抗体阳性。
2 结果与分析
2.1 采用两种不同方法分别检测同一批样品中猪瘟抗体水平
分别采用两种方法对同一批, 共计350份血清进行检测。采用液相阻断ELISA法检测出阳性样品206份, 总阳性率为58.9%;采用正向间接血凝法 (IHA) 检测出阳性样品267份, 总阳性率为76.3%。
2.2 两种方法检测同一批样品, 检测结果的符合度及相关性
分别采用液相阻断ELISA法和正向间接血凝法 (IHA) 检测同一批共计350份样品的猪瘟抗体水平, 结果如表2、表3所示, 两者总体符合率为68.3%。采用卡方检验, 对两种方法的相关性进行检验如表4, 发现两种方法检测结果存在差异。 (x2=32.4, p<0.01)
3 讨论