酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附测定法（精选8篇）

酶联免疫吸附测定法 篇1

己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES)是一种人工合成激素类药物,其化学名为1,2-双(4-羟苯基)-1,2-二乙基乙烯,为无色结晶性粉末,在甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、脂肪油或强碱溶液中溶解,在水中几乎不溶。DES作为一种人造雌激素,被用于动物生产中加快其生长速度[1]。其能促进蛋白质的合成代谢、提高动物日增重和饲料效率,作为促生长剂广泛用于畜牧业畜禽以及水产品养殖中。国际癌症研究机构(IARC)研究发现,DES是一种致癌物质,能够在动物源性食品如肝脏、肌肉、蛋、奶中残留,并通过食物链危害人体健康。自从人们发现动物因食用DES在组织中残留给人类健康造成危害以来,世界上绝大多数国家禁止在食品动物中使用DES。2002年我国农业部规定DES及其盐、酯制剂禁用于所有食品中。然而,目前滥用DES的现象依然存在。为了提高食品质量水平,保障人民身体健康,提高我国农业和食品工业的市场竞争力,国家将“食品安全关键技术”列为“十五”重大科技专项。因此,有必要研究灵敏、高效、稳定的己烯雌酚残留检测方法。目前测定DES的方法有薄层色谱法[2]、放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫测定法(EIA)[3]、色谱法[4,5,6]和色谱质谱联用[7]等方法,其中色谱法具有较高的准确性和精确度,是兽药残留检测常用的方法,但色谱法前处理操作要求严格且步骤复杂,因此回收率比较低,影响了方法测定的准确性和精确度,尤其难以满足各类质控考核的要求。酶联免疫吸附测定(ELISA)法有操作简便,灵敏度高,成本低等优点。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

DES酶联免疫反应检测试剂盒;Start Fax 303 Plus Microstrip Reader液晶显示酶标仪,230 V,50～60 Hz。

1.2 方法

1.2.1 检测原理

DES酶联免疫反应检测试剂盒基于竞争性酶联反应原理,含有DES的抗原已经包被于微孔板上,吸附在孔内的药物抗原与被测试的样品中药物竞争性与药物一抗相结合。当样品药物相结合的药物抗体被洗涤去除后,只剩下与微孔内药物相结合的抗体,与经酶标记的二抗相结合,酶底物在本酶作用下产生蓝色产物,加酸终止反应,此时蓝色产物就会转化成黄色,在450 nm波长处测定其吸收值。样品吸光度(A)值与其残留物DES呈反比,与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数,即可得出样品中DES的含量。

1.2.2 样品制备

取1 g样本加入4 ml样品提取液置于匀浆器中匀质,取1.5 g匀质后样品,在室温下4 000 g离心5 min。小心移取0.5 ml上清液到另一个1.5 ml离心管中,在75 ℃水浴中加热5 min。在漩涡振荡器上以最大速度震荡1 min,室温下4 000 g离心5 min。移取0.2 ml上清液到另一个试管,加入5 μl样品平衡液混合均匀。取50 μl上述溶液,直接加样于微孔中,进行ELISA测定。

1.2.3 ELISA测试方法

加入50 μl的标准液,阳性质控和样品所设定的孔中,在每孔中加入100 μl一抗,轻轻摇动微孔板混匀,37 ℃恒温箱30 min,或者室温1 h,洗板3次,每次加入250 μl洗液,最后1次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干。在每孔加入150 μl二抗,37 ℃恒温箱30 min,或者室温1 h,洗板3次,每次加入250 μl洗液,最后1次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干。加入100 μl的过氧化物酶(TMB)底物,在室温下培养15 min,加入100 μl的终止液终止反应,稳定2 min后,在450 nm下读A值。

1.2.4 结果计算

分别计算标准、质控和样品的平均A值和相对A值,以相对A值为纵坐标,标准浓度为横坐标建立标准曲线。从标准曲线上读取质控和样品的浓度值。

相对吸光度值(%)=(标准或样品吸光度值/零标准吸光度值)×100

样品检测下限的定量下限计算方法如下:

样品的检测下限=(0.05 μg/kg)×(稀释倍数)

样品的检测上限=(0.15 μg/kg)×(稀释倍数)

2 结果

2.1 标准曲线绘制

以0、0.05、0.15、0.50、1.5、4.5 μg/L 6个浓度测定其A值,以其A值对浓度值作log-logit曲线,r=-0.999 7,标准曲线见图1。

由图1可得,标准曲线在线性范围0.0～4.5 μg/kg的线性回归方程为Y=-0.127 1 X+1.035 3,R2=0.999 5,相关系数r为0.999 7。

2.2 准确度试验

添加试验是在阴性饲料样品中加入DES标准溶液进行平行测定(n=6),添加标准水平为0.25、0.75、2.25 μg/kg,对样品进行加标回收试验,得到平均加标回收率分别为76.0%、82.7%、94.2%,相对标准偏差RSD为22.8%～6.1%。结果见表1。

2.3 重复点样精密度

对同一浓度的样品连续点样,得到1.42、1.24、1.22、1.35、1.25、1.27 μg/kg,相对标准偏差为5.98%。

2.4 稳定性试验

对同一浓度的样品在一天内连续测定5 h,测定3 d,得到1.40、1.42、1.37、1.54、1.44、1.35、1.26、1.37、1.41 μg/kg,计算相对标准偏差为5.40%。

3 结论

随着经济的发展,人们对食品质量和健康水平的要求提高,研究与发展简便、快速、灵敏、适于现场检测的方法势在必行。目前,DES常用的方法是高效液相色谱(HPLC)法,HPLC-MS/MS法,ELISA法采用抗原抗体特异性结合原理。具有灵敏度高、特异性强、分析成本低、快速等优点,与仪器分析相比,简化了样品预处理和纯化过程,样品不用浓缩处理即可达到较低检出限,操作简便,适合大批量样品筛选,结果满意。ELISA方法由于稳定性好、成本投入低廉等特点,得到了快速发展。通过对部分饲料样品进行分析,结果满意。

摘要：目的 建立高灵敏度的饲料中己烯雌酚的酶联免疫吸附测定(ELISA)方法。方法 利用抗原与抗体间免疫化学反应原理,测定饲料中己烯雌酚的含量。结果 己烯雌酚线性范围0.04.5μg/kg,相关系数为-0.999 7。对样品进行加标回收试验,加标样品浓度为0.25、0.75、2.25μg/kg,得到平均加标回收率分别为76.0%,82.7%,94.2%。结论 该方法灵敏度高,适合饲料中己烯雌酚检测,适用于大批量样品的筛选。

关键词：己烯雌酚,酶联免疫法,饲料

参考文献

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[3]王蓓,胥传来,彭池方,间接酶联免疫吸附检测己烯雌酚条件优化[J].食品科学,2008,29(5):273-278.

[4]邱巍,罗远宏.畜、禽组织中己烯雌酚残留量RP-HPLC测定条件研究[J].中国卫生检验杂志,2007,17(8):1412-1413,1491.

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[6]龙朝阳,吴西梅,朱炳辉,等.高效液相色谱内标法测定鸡肉中己烯雌酚残留量[J].化学通报,2008(6):450-452.

[7]张翠英,李振国,徐金玲.LC-MS测定猪肉中己烯雌酚方法的研究[J].中国卫生检验杂志,2007,17(5):786-787.

酶联免疫吸附测定法 篇2

关键词：酶联免疫吸附分析 综合性实验 教学

中图分类号：G421文献标识码：A文章编号：1674-098X（2013）05（a）-0149-02

食品分析是食品科学与工程专业重要的专业基础课程之一。食品分析实验课是食品分析教学的重要组成，是锻炼学生实验操作能力，分析解决问题能力的重要教学途径之一。酶联免疫吸附分析（ELISA）技术涉及有机化学、食品化学、生物化学和免疫学等综合知识内容，在食品分析学中开展ELISA综合性实验，不仅利于提高教学质量，而且能锻炼学生综合技能运用能力。

1 ELISA综合实验在教学中开展的意义

酶联免疫吸附分析技术是一种固相免疫分析方法，因其具有灵敏、快速、特异性强等特点，迅速发展，在食品安全检测领域应用越来越广泛，成为食品中小分子有害因子主要的快速筛查技术手段[1]。目前，对于食品中的农药、兽药残留，生物毒素，致病微生物等有害物质的分析，市面上已有商品化的ELISA试剂盒[2]。但本科教学极少开展ELISA教学，学生对其原理和操作了解较少，缺乏实验机会，相关知识的理解主要停留在理论教学水平。在食品专业开设ELISA实验课程，已成为一项非常必要的实验教学内容。有助于帮助学生学习对相关知识点的学习及掌握，提高学生对生物分析技术的认识，了解免疫分析技术在食品安全领域应用的优势及重要性，并锻炼学生动手能力，培养学生的综合素质。

2 ELISA实验的原理

ELISA技术是用酶标记的抗原或酶标记的抗体为主要试剂，通过复合物中的酶催化底物呈色反应来对被测物进行定性或定量的一种免疫分析方法[3]。其原理是把抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性，在测定时，将受检样品（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，形成抗原抗体复合物，用洗涤的方法使固相载体上的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与样品中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，通过定性或定量分析有色产物即可确定样品中待测物质的含量[4-5]。目前ELISA 的分类方法众多，主要技术类型有双抗体夹心法、间接法、捕获法、竞争法。在食品安全检测领域，竞争法为主要类型[6]。检测原理示意图见图1。

3 实施过程及具体实验步骤

根据笔者的教学经验，该综合性实验约需教学时数，10～12学时，具体操作过程如下。

（1）带教老师讲述ELISA的原理，应用及注意事项。

（2）通过观看酶联免疫吸附实验操作视频，了解整个实验流程及操作要点。

（3）将学生分组，每组3人，开展ELISA综合实验。

（4）实验操作结束，带教老师与学生共同讨论分析实验结果。

具体的实验操作步骤如下：

以测定牛奶和鱼肉中的氯霉素为例，采用酶标抗原的直接竞争法，介绍本实验具体实验步骤。

（1）包板：将抗体用包被液稀释一定的倍数，加入96孔酶标板中，100 μL/孔。37 ℃孵育，过夜。

（2）封板：洗板两次，加入封闭液120 μL/孔，37 ℃孵育，3小時。

（3）样品前处理：封板时，分别对样品牛奶和鸡肉进行前处理。

（4）烘干：将封闭好的板倒掉封闭液，37℃烘干。

（5）加样：加标准品/样本50 ?L/孔，然后加入酶标记物50 ?L/孔，再振荡混匀，用封板膜盖板，37 ℃条件下反应30 min。

（6）显色：洗板4～5次，每次浸泡30s，拍干。每孔加入底物缓冲液50 ?L，再加底物液50 ?L，轻轻振荡混匀，37 ℃或室温环境避光显色10 min。

（7）测定：每孔加入终止液50 ?L，轻轻振荡匀，设定酶标仪于450 nm处测定吸光度值。

（8）结果判定：以标准品百分吸光率为纵坐标，以氯霉素标准品浓度（ng/mL）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氯霉素实际浓度。

4 结语

ELISA实验是一个综合性实验，涉及到有机化学，食品化学，生物化学以及免疫学等方面的相关知识。因此，学生通过本实验，可以取得以下效果：（1）巩固理论知识，加强对相关知识的理解，并对该技术在食品安全检测领域的重要性有一定的认识。（2）结合视频及具体实验操作，了解整个实验的操作流程。（3）学生之间分组进行实验，加强相互协作及团队意识。

在食品科学与工程、食品营养、食品质量与安全、生物工程等专业的食品分析实验课中，我们为部分同学开设了ELISA综合实验，检测过的对象包括氯霉素、盐酸克伦特罗、三聚氰胺、和孔雀石绿等。本实验内容丰富充实，实验现象生动有趣，深受学生的欢迎。

参考文献

[1]何紫薇，郭琦.酶联免疫吸附（ELISA）技术在食品检验的发展应用[J].生物科技与医药卫生，2011（11）：71-72.

[2]李明尧.酶联免疫吸附（ELISA）技术在食品检验的发展应用[J].中国医药指南，2012，10（35）：380-381.

[3]王守法，阚春月，许学书.酶联免疫吸附试验在食品检测中的应用[J].食品科学，2009，30（23）：489-492.

[4]孙太凡.酶联免疫吸附分析技术在农药残留分析中的应用[J].安徽农业科学，2010，38（22）：11981-11983.

[5]Yu-Dong Shen， Xing-Fei Deng， Zhen-Lin Xu，et al. Simultaneous determination of malachite green，brilliant green and crystal violet in grass carp tissues by a broad-specificity indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay[J].Analytica Chimica Acta， 2011，707（1/2）：148-154.

酶联免疫吸附测定法 篇3

萘是一种重要的化工原料,主要用于生产染料、树脂、溶剂、炸药、消毒剂、杀虫剂、防腐剂、防蛀剂,因萘对环境的污染日益严重而引起重视。据报道,南京某大型矿业企业周边农业土壤中多环芳烃(PAHs)检出率达100%[1]。萘在环境水体中的含量极低,这对检测分析提出了更高的要求。目前,环境水体中萘的检测方法有质谱法[2]、热解析毛细管气相色谱-质谱联用法[3]、高效液相色谱法[4]。色谱法检测精度高、数据稳定,但试样前处理过程复杂,而且试剂价格昂贵,这使得色谱法的应用受到限制。生物检测方法不需要繁琐的前处理过程,检出限更低,利用分子信标法[5]、实时荧光免疫聚合酶链式反应(PCR)法[6]、荧光免疫法等检测环境水体中的萘引起广泛关注。间接竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)法是利用固相抗原与试样和抗体进行竞争,加入酶标记的第二抗体联结同固相抗原结合的抗体,间接检测小分子试样,具有选择性好,灵敏度高,简便快捷等特点,用该方法测定环境水体中PAHs已有报道[7,8,9],但用间接竞争ELISA法测定环境水体中的萘未见报道。常用作载体的免疫原性蛋白质有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白、牛血清丙种球蛋白等,但最常用的是BSA和OVA。

本工作采用以抗萘多克隆兔抗体为基础,以OVA偶联半抗原作为包被原(包被原固定在酶标板上称为固相抗原),建立了一种测定环境水体中痕量萘的ELISA法,该方法检出限低、准确度高且可重复性好。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

96孔酶标板:基因有限公司;OVA:华美生物制品公司;辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(HRP-IgG):上海闪晶分子生物有限公司;抗萘多克隆兔抗体和包被原:本实验室自制[6],-20℃冷冻保存,抗体效价为100;萘标准贮备溶液:萘质量浓度为2 000μg/mL,百灵威化学技术有限公司。碳酸盐缓冲液(CBS):100 mL水中含碳酸钠0.159 g和碳酸氢钠0.293 g,碳酸根浓度为0.05 mol/L,pH为9.6;Na2HPO4-KH2 PO4稀释液(PBS):1 L水中含氯化钠8.000 g,磷酸二氢钾0.240 g,氯化钾0.200 g,磷酸氢二钠2.900 g;洗涤液(PBST):PBS中加入体积分数为0.05%的吐温-20[8],PBS浓度为0.01 mol/L、pH为7.4;封闭液:体积分数为5%的脱脂奶粉的水溶液[8];底物液:TMB liquid-1component[8];终止液:浓度为2 mol/L的H2SO4溶液[8];实验用水均为高纯水。

EL800型酶标仪:美国BIO-TEK公司;W205B型旋转蒸发仪:上海申胜生物技术有限公司;Easy Pure RoDi高纯水制备系统:美国thermo公司;pH SJ-4A型pH计:上海精密科学仪器有限公司。

1.2 ELISA法实验方法

ELISA法基本操作步骤见文献[8]。

实际水样用二氯甲烷萃取三次,收集有机相后置于旋转蒸发仪浓缩富集,PBS稀释后按照间接竞争ELISA法进行测定。

1.3 标准曲线的制作

本实验用抑制率(I,%)表征在间接竞争ELISA法过程中试样对抗体反应的显色抑制程度。

式中:Amax为空白(高纯水)在450 nm处的吸光度;AS为试样的吸光度;Amin为对照孔(酶标板上不加任何试剂的孔)的吸光度。

交叉反应性指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力,不同抗原在相同位置有相同结构时,可能与抗体发生交叉反应。本实验用交叉率(%)表征抗萘多克隆兔抗体的特异性。

2 结果与讨论

2.1 抗萘多克隆兔抗体质量浓度的选择

不同质量浓度包被原与抗萘多克隆兔抗体反应后的吸光度见表1。行业中选择吸光度为1.0时的抗体质量浓度作为最佳工作浓度,同时考虑经济因素应使包被原用量尽量少。由表1可见,吸光度为1.0时,包被原的最佳质量浓度是2.50μg/mL,抗萘多克隆兔抗体质量浓度是3.06μg/mL。

2.2 PBS的pH对I的影响

PBS的pH对I的影响见图1。由图1可见,pH对ELISA法反应体系影响较大,pH在8.3时I最高,故本实验选择PBS的pH为8.3。

2.3 PBS中氯化钠浓度对I的影响

介质中一定水平的氯化钠浓度有利于抑制非特异性反应,可以减少抗体的非特异性吸附。PBS中氯化钠浓度对I的影响见图2。由图2可见:氯化钠浓度在0.1 mol/L时,I最大;氯化钠浓度高于0.5 mol/L时,I随氯化钠浓度的增大急剧减小,故本实验PBS中氯化钠浓度确定为0.1 mol/L。

2.4 PBS中甲醇加入量对I的影响

PBS中甲醇加入量对I的影响见图3。

由图3可见,当甲醇加入量高于5%(体积分数,下同)时,I迅速下降。这是因为萘是亲脂性的,需要用非极性有机溶剂从试样中提取。甲醇可增强抗萘多克隆兔抗体对固相抗原的竞争能力,有利于提高间接竞争ELISA法的灵敏度。故本实验PBS中甲醇加入量确定为5%。

2.5 测定萘的标准曲线

在上述确定实验条件下,ELISA法测定萘质量浓度(ρ)的标准曲线见图4。标准曲线回归方程为I=8.3941ogρ+50.21,相关系数为0.985 6,线性范围为10-3～10μg/L,灵敏度IC50(I为50%时萘的质量浓度)为0.944μg/L,检出限IC20(I为20%时萘的质量浓度)为0.250 ng/L。两者数量级相差比较大的原因可能在于抗体保存时间较长导致效价降低,标准曲线斜率小。

2.6 精密度实验

ELISA法的精密度实验结果见表2。由表2可见,批间误差高于批内误差,而且浓度小误差小,浓度大误差大,其原因可能是浓度大时移液过程中造成的损失多。批间误差为以4块重复操作的酶标板测定结果的平均值求得的总的批间变异系数;批内误差为同一块酶标板上重复操作测定结果的误差。

2.7 萘结构类似物的交叉率

萘结构类似物的交叉率见表3。由表3可见,四种萘结构类似物与萘的交叉率均小于14.0%,表明该抗萘多克隆兔抗体特异性较强。

2.8 水样测定与加标回收实验

ELISA法检测水样中萘回收率的实验结果(n=3)见表4。由表4可见,本方法的回收率在86.00%～106.00%之间,回收效果比较理想。

3 结论

a)以OVA偶联半抗原作为包被原,利用ELISA法检测环境水体中的痕量萘,方法可行,且检测过程简单快速,并能同时进行批量检测。

b)本方法的检出限为0.250 ng/L,灵敏度为0.944μg/L,回收率在86.00%～106.00%之间,批间误差小于15.00%,批内误差小于8.00%,方法的准确度和重复性效果较好,且满足环境水体中的痕量萘的检测要求。

c)四种萘结构类似物与萘的交叉率均小于14.0%,说明该抗萘多克隆兔抗体特异性较强。

参考文献

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[7]邓安平.酶联免疫吸附分析法测定苯并(a)芘和多氯联苯.环境化学,2006,25(3):340-343

[8]张彦峰,张清敏,戴树桂等.用于测定多环芳烃的酶联免疫吸附分析法的研究.农业环境科学学报,2006,25 (2):537-540

酶联免疫吸附测定法 篇4

目前,关于检测饲料原料、饲料、牛奶、鸡蛋和肉产品中MA的方法国内外有很多报道,包括HPLC[2,3,4,5,6,7,8,9,10]、LC-MS/MS[10,11,12,13,14]、GC/MS[15,16]。这些方法虽可定性定量,但需要昂贵的仪器设备,操作复杂,耗费大量时间和人力物力。而酶联免疫吸附检测法(ELISA)快速、简单、灵敏,一次可同时检测几十份样品,对于国内需要检测样品量巨大的实际情况来说,不失为一种最佳的选择。到目前为止,只有Kim[10]和Garber[17]分别以美国Beacon公司和美国Abraxis公司的商品化试剂盒对宠物饲料中的MA进行了检测,检测限分别为0.02 mg/kg和0.009 mg/kg。而至今国内外均未见有建立ELISA方法对MA进行检测的研究报道。因此,该研究旨在合成MA的人工抗原,制备特异性抗体,建立一种简单、快速、灵敏地检测MA的间接竞争ELISA方法,以对鸡蛋中可能残留的MA进行检测。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试药品。

三聚氰胺标准品由中国兽医药品监察所提供;牛血清白蛋白、卵清蛋白和弗氏佐剂均购自美国Sigma公司;吡啶、琥珀酸酐、四氯化碳及其他试剂均为分析纯,购自北京化学试剂公司;三聚氰胺标准储备液和系列浓度的工作液均由甲醇/水(2∶8,v/v)配制。

1.1.2 供试仪器。

美国550型Bio2Rad酶标仪;JJ-2B型组织捣碎匀浆机。

1.1.3 试验动物。

4周龄(1.5 kg)新西兰白兔8只,雌雄各半。

1.2 MA人工抗原的合成

MA人工抗原的合成过程见图2。将0.248 g(1.96 mmol)MA、0.156 g(1.96 mmol)吡啶和5 m L CCl4置于一圆底烧瓶中加热回流。在回流过程中于25~30 min内逐滴加入10 m L含有0.197 g琥珀酸酐的CCl4,然后回执回流4 h。待冷却后,得到白色沉淀。沉淀物先后用少量水和无水乙醇淋洗,干燥后得MA半抗原(熔点360℃;红外扫描结果:(KBr)Vmax3 342、3 212、1 668、1 627、1 587、1 560、1 498、1 405、1 348 cm-1)。

称取10 mg半抗原溶于2 m L的1 mol/L的碳酸钠溶液中,加入1.6 m L二氧六烷和100μL三乙胺,混合均匀后再加入15μL氯甲酸异丁酯,此混合液于4℃搅拌反应30 min。然后将此溶液逐滴加入到含有60 mg BSA或20 mg OA的碳酸钠溶液中,4℃搅拌反应过夜。最后,将反应液用生理盐水透析3 d,每12 h换液1次,分装后于-20℃保存备用。

分别将偶联物、载体蛋白和半抗原配制成一定浓度的溶液后,在200~300 nm范围内用紫外分光光度计进行全波长扫描,以鉴定是否成功偶联,并计算偶联比。

1.3 MA抗血清的制备

首次免疫,取MA-BSA与等量弗氏完全佐剂充分乳化后,在新西兰白兔背部皮下多点注射,加强免疫以抗原与弗氏不完全佐剂乳化后皮下注射。免疫剂量每只兔子0.5mg(以载体蛋白计算),每隔4周加强免疫1次,共免疫8次。最后心脏采血,分离血清,-20℃保存备用。

1.4 间接竞争ELISA方法的建立

1.4.1采用方阵滴定法确定包被抗原与抗体的最佳工作浓度。每孔加入100μL最佳工作浓度的包被原包被酶标板,4℃过夜。封闭,洗涤后,将50μL工作浓度的抗体与等体积倍比稀释的MA标准液或样品提取液加到酶标板上,以抗体与同体积磷酸盐缓冲液(PBS,0.01 mol/L,p H值7.2)的混合物为零标准,37℃反应1 h。然后加入100μL HRP-羊抗兔Ig G溶液,37℃反应30 min。再加入100μL TMB系统底物显色液,37℃显色15 min,最后加入50μL终止液(2mol/L H2SO4),在酶标仪上测定450 nm处各孔的OD值。

1.4.2以1.4.1中所测MA各浓度的OD值(B)与零标准孔OD值(B0)的比值(B/B0)为纵坐标,以各标准浓度的对数值(Log C)为横坐标,绘制标准抑制曲线。

1.4.3检测抗体与其他同系物的交叉反应率。方法同1.4.1,抑制物分别为环丙氨嗪、三聚氰胺一酰胺、三聚氰胺二酰胺和三聚氰酸。根据抑制曲线计算抑制抗原抗体结合50%时的各竞争物浓度,以抑制率为50%时的MA浓度与各竞争物浓度之比计算交叉反应率。

1.5 样品提取方法

将鸡蛋去壳后充分搅拌均匀,取5 g置于100 m L离心管中(空白样品按20、50、100 ng/g的浓度添加MA标准品),然后加入50 m L含20%氨水的乙腈,剧烈振荡10 min后在4 000 r/min下离心15 min。取10 m L上清液转移至干净分液漏斗中,加入10 m L正己烷,剧烈振荡1 min,静置分层。收集下层乙腈相,在50℃水浴中旋转蒸干后复溶于1m L的甲醇/水(2∶8,v/v)中,用0.45μm的滤膜过滤后供ELISA检测。

1.6 未知样品ELISA检测

从不同超市、农贸市场和养鸡场购得未知的鸡蛋50枚,按上述方法提取后进行ELISA检测。

2 结果与分析

2.1 抗原合成

MA具有环状对称的特殊结构,有3个氨基可供偶联载体。如果采用氨基的反应直接与蛋白连接,则3个氨基都可以同载体蛋白偶合,导致MA完全被大分子蛋白包围,这样的抗原不能刺激产生高效价抗体。因此,该研究采用控制MA和琥珀酸酐等量反应摩尔比的方法,只将其中1个氨基连接上带有羧基的4碳间隔臂以合成半抗原。所得半抗原的熔点高于MA的熔点说明产生了一种新物质,红外扫描的数据可证明半抗原上连接了羧基和羰基。另外,半抗原的全波长紫外扫描曲线和最大波长均与MA相似,说明MA分子中的三嗪环没有被破坏。这些均证明半抗原合成成功。

在用混合酸酐法将半抗原与载体蛋白连接后,将半抗原、载体蛋白和偶联物进行紫外全波长扫描,从图3可以看出,偶联物的曲线是半抗原和载体曲线的叠加,从而证明免疫原和包被抗原均偶联成功。

2.2 抗体灵敏度与特异性

要建立一种ELISA方法,必须要获得针对被测物的特异性抗体。该研究用自制的抗原免疫动物获得了针对MA的特异性抗体,以该抗体为基础首次建立了检测MA的间接竞争ELISA方法。该法对MA的半数抑制浓度(IC50)为42ng/m L,在3、6、12、25、50、100、200、400 ng/m L的浓度范围内,MA对该抗体的竞争抑制曲线见图4。以抑制率为10%计算,该ELISA方法对MA的检测限为8.5 ng/m L,完全可以满足对MA的残留检测要求。因此,该方法的灵敏度等同或优于文献报道的ELISA试剂盒的灵敏度,明显高于报道的仪器方法的灵敏度。由于合成的半抗原中还有2个游离的氨基,与其结构有相似性的物质可对该抗体产生抑制作用。因此,该抗体对环丙氨嗪有70%的交叉反应率,对三聚氰胺二酰胺有5%的交叉反应率,对其他代谢物没有交叉反应。

2.3 样品提取

对于从生物样品中提取MA的溶剂,国内外有许多文献报道。中国农业部发布的标准方法是采用三氯乙酸作为提取液,国家质检总局发布的公告中采用三氯乙酸和乙腈作提取液。另外,还有采用乙腈∶水(1∶1)[2]、柠檬酸和己烷磺酸钠的缓冲液[3]、盐酸[4]或乙酸[5]、甲醇∶水(1∶1)[10]、酸性乙腈[13]等溶液来提取MA。因为MA属于强极性碱性化合物,它应该在碱性溶液中溶解度更大。因此,有多篇文献报道采用碱性乙腈来提取肌肉、鸡蛋、牛奶[6,7,18]和饲料[19]中的MA,均达到了理想的提取效果。该研究采用含20%氨水的乙腈对鸡蛋中的MA进行提取,然后过滤膜后ELISA检测。从图4可以看出,空白样品提取液中添加MA标准液的抑制曲线与MA标准品的曲线相似,说明该提取方法可基本除去样品基质中的干扰。由于本提取方法未对提取液进行稀释或浓缩,因此,该ELISA方法对MA标准品的检测限也被认定为对鸡蛋中MA的检测限,即8.5 ng/g。在空白鸡蛋中按20、50、100ng/g的浓度添加MA标准液后,按该方法提取,ELISA检测,添加回收率结果见表1。可以看出,在3个添加浓度下,MA的日间和日内回收率范围均在88.9%~96.1%之间,变异系数均小于11.6%。

2.4 未知样品检测

ELISA方法是目前兽药残留检测中常用的筛选方法,但到目前为止,国内外均未见有建立ELISA方法对MA进行检测的研究报道。该研究利用建立的ELISA方法用于对市场购得的50枚鸡蛋进行检测。结果发现,有2枚鸡蛋中检测出含有MA残留,浓度分别为36、84 ng/g。这可能是由于给鸡饲喂了高浓度的环丙氨嗪代谢而来,或是使用了MA非法添加的饲料。但残留浓度较低,远低于国家规定的在奶制品中的含量限值,应该不会对消费者身体健康造成危害。

3 结论与讨论

酶联免疫吸附测定法 篇5

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年1月1日-2013年6月30日于笔者所在医院同时采用免疫印迹法 (LIA) 和酶联免疫吸附法 (ELISA) 检测抗核抗体 (ANA) 的3014例患者, 其中男1049例, 年龄17~80岁, 平均 (40.5±4.1) 岁;女1965例, 年龄3~86岁, 平均 (43.0±1.8) 岁。其中2013年3月-2013年6月收治的AID患者123例设为AID组, 男52例, 女71例, 年龄17~70岁, 平均 (45.7±4.1) 岁。其中包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征等。AID患者的诊断均符合国际相关学会的诊断标准。其中无明显心血管、肝、肾疾病, 无结缔组织病病史的健康体检人群80例设为健康组, 男34例, 女46例, 年龄19~60岁, 平均 (38.2±4.1) 岁。检测标本均为血清标本。AID组和健康组用于计算两组检测方法的特异度和敏感度, 比较两种方法的检测效能。

1.2 试剂和检测仪器

试剂:酶联免疫吸附法 (ELISA) 和线性免疫印迹法 (LIA) 所用试剂盒分别为德国欧蒙公司ELISA法检测抗核抗体试剂盒和抗核抗体谱 (Ig G) 检测试剂盒 (免疫印迹法) 。ELISA法的主要检测总抗核抗体, LIA法的检测膜条上包被以下10种特异性抗原, 包括抗SSA、抗SSB、抗Jo-1、抗Sm、抗Scl-70、抗n RNP、抗着丝点抗体、核小体、组蛋白和核糖体P蛋白。仪器:酶联免疫吸附法 (ELISA) 使用安图生物全自动酶免分析仪检测ANA酶标反应板的吸光度 (OD) 值。免疫印迹法 (LIA) 检测ANAs采用德国欧蒙公司的免疫印迹自动操作仪 (EUROIMMUN AG) 和EURO Line Scan软件进行显色结果扫描分析。

1.3 方法

抽取患者外周静脉血3~5 ml, 3500 r/min离心5 min分离血清, 3 d内完成检测。两种方法均严格按照说明书操作。酶联免疫吸附法 (ELISA) 的操作流程:待测血清1∶101稀释加入ELISA板孔内第一次温育30 min, 专用洗液洗涤3次, 加入酶结合物温育30 min, 同样洗涤3次后加底物温育显色15 min, 加终止液终止反应后酶标仪比色。免疫印迹法 (LIA) 的操作流程:预处理试剂膜条 (5 min温育槽温育) , 使用试剂盒内专用稀释液1∶101稀释待测血清浸泡膜条第一次温育30 min, 专用洗液清洗涤3次, 5 min/次, 后加酶结合物第二次温育30 min, 同样清洗3次加底物温育10 min后蒸馏水清洗终止, 待膜条干燥软件判读膜条抗体谱结果[3]。

1.4 结果判读

酶联免疫吸附法 (ELISA) 检测ANA结果判读按标准酶标仪测定反应板的OD值, 计算待测标本与标准液的OD值比值, <1.0判为阴性, ≥1.0判为阳性[4]。免疫印迹法 (LIA) 的结果判读是根据反应后的膜条与标准谱带图对照, 相应的谱带定位和带型显色时可判断相对应的抗体阳性, 膜条中一个抗体或一个以上阳性就可判读该法检测的抗核抗体 (ANA) 阳性。

1.5 统计学处理

采用SSPS 17.0统计学软件对数据进行Kappa、字2统计学方法分析, P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 LIA法与ELISA法检测抗核抗体ANA的结果

共收集记录3014例标本结果, LIA法检测ANA阳性结果490例, 阳性率为16.26%;ELISA法检测ANA阳性结果有319例, 阳性率为10.58%, 详见表1。LIA与ELISA两种方法检测抗核抗体结果总一致率 (同为阴性和阳性的样本数占总检测样本数) 为92.20%, 经Kappa检验计算两者具有较好的一致性。

例

注:Kappa=0.69, P<0.05

2.2 LIA法与ELISA法结果不一致的ANA抗体的特点

LIA法和ELISA法检测结果不一致主要表现两种方法同时检测样本时在LIA法检测呈阳性, ELISA法检测呈阴性。此类样本共203例, 而LIA法阴性、ELISA法阳性有32例。203例LIA法阳性ELISA法阴性患者抗核抗体检测的结果中, LIA法抗核抗体阳性主要表现在单个抗体抗SSA (52例) 、抗SSB (10例) 、抗n RNP (14例) 、抗Jo-1 (16例) 、抗Scl-70 (9例) 、核糖体P蛋白 (9例) 和组蛋白 (23例) 及组合抗Sm/抗核糖体P蛋白 (9例) 这几类抗体, 其中SSA抗体和SSB抗体阳性率最高, 分别为25.6%和5.0%。两种检测方法同为阳性的结果中, LIA法抗核抗体阳性主要表现在单个抗体抗SSA阳性 (91例) 、抗着丝点蛋白抗体阳性 (15例) 。

2.3 LIA法和ELISA法检测抗核抗体ANA效能比较

记录LIA法和ELISA法检测同时检测自身免疫性疾病 (AID) 组、健康组抗核抗体的检测结果, 并计算LIA法和ELISA法检测抗核抗体的敏感度分别82.1%和78.9%, 特异度分别为92.5%和90.0%, 两组特异度、敏感度比较, 差异无有统计学意义 (P>0.05) , 详见表2和表3。

例 (%)

3 讨论

检测人血清中的抗核抗体用于辅助诊断自身免疫性疾病已有50年的历史[5]。抗核抗体检测用于诊断发病率相对较高的自身免疫性疾病系统性红斑狼疮 (SLE) 的敏感性几乎达到100%, 亦可用于其他的自身免疫性疾病的辅助诊断。回顾性研究表明ANA检测阳性可出现于SLE患者起病的前10年[6], 说明早期ANA的筛查对AID预防和治疗起着重要作用, 因此ANA的检测对AID诊断有着重要的临床意义。抗核抗体的检测方法有很大的发展, 目前常用的有免疫扩散法、化学发光法、酶联免疫吸附法、免疫印迹法和作为诊断AID金标准的间接免疫荧光法 (IIF) 等。由于抗原提纯技术的发展, 酶联免疫吸附法和免疫印迹法等越来越多的被实验室所采用。

本研究通过收集记录番禺中心医院使用ELISA法和LIA法同时检测抗核抗体病例3014例的结果计算分析, 两种方法检测抗核抗体的总一致率为92.2%, Kappa值为0.69 (Kappa≥0.75说明取得相当满意的一致度) , 说明这两种方法检测ANA具有较好的一致性, 它们检测ANA的结果总体趋势相同。但LIA法与ELISA法检测抗核抗体结果仍存在不一致, 表现为LIA阳性/ELISA阴性 (203例) 的特点, 占到总例数的8.0%, 在这203例中主要以单个型抗体以抗SSA、抗SSB阳性居多, 其阳性率分别占到25.6%和5.0%, 其他如抗n RNP、抗JO-1、抗Scl-70、核糖体P蛋白和组蛋白及组合型抗Sm/抗核糖体P蛋白这几类抗体为阳性[7]。LIA阳性/ELISA阴性例数较少。分析产生此种不一致的原因可能有两种, 一是因为两种方法检测技术不同所致, LIA法是在硝酸纤维素膜条上包被的高度纯化的单一抗原, 而ELISA法是在聚乙烯酶标板孔底部包被混合粗抗原, 体现两者在检测抗原成分的敏感度上不同。ELISA法对于单个型抗体如抗n RNP、抗JO-1、抗Scl-70、核糖体P蛋白和组蛋白及组合型抗Sm/抗核糖体P蛋白这几类抗体不敏感, 其可能是患者本身抗体含量太少或所用抗原不纯而不能发生抗原抗体反应。其次是ELISA法检测ANA可能存在漏检[8]。抗核抗体检测结果为LIA阴性/ELISA阳性的患者共有32例, 由于ANA是以自身真核细胞成分作为靶抗原的产生一组自身抗体的总和, 迄今已发现这种总抗体包括的抗体成份超过20余种, 故ELISA法中包被的抗原种类要多于LIA法包被的15种特异性抗原, 这也是LIA法检测抗核抗体的局限性。ANA检测结果为LIA阳性/ELISA阳性的患者共有287例, 其中LIA法中单个型抗体阳性主要以抗SSA、抗着丝点抗体、抗n RNP和核小体为主, 说明这几种抗体对ELISA法的检测是比较敏感的, 这主要还是跟患者血清抗体的含量有关。以上信息说明两种方法的敏感度之间的差别主要是由于抗体量的大小, 特异度的差别主要是由于检测抗原的范围差别, 但两种方法的敏感度与特异度都很高均可用于临床检测ANA。

两种方法检测AID组ANA的阳性率远远高于与健康组ANA阳性率, 说明ANA阳性率在AID患者中的检测敏感度显著大于健康组, ANA的检测对AID的诊断有诊断价值。而两种方法敏感度、特异度之间的比较, LIA法和ELISA法的敏感度分别为82.1%和78.9%, 两者的特异度分别为92.5%和90.0%, 差别无统计学意义 (P>0.5) , 两种方法敏感度、特异度的差异原因同前面的分析。可见两组方法都是较好的检测ANA的方法, 相对于间接免疫荧光技术操作流程简单, 对于操作条件和操作人员要求不高, 判读结果客观性强。

综上所述, ELISA法和LIA法检测抗核抗体都有其优势与不足, 但各自检测抗核抗体的敏感度和特异度都很高。两种检测方法的原理相同, 操作流程相似。对于暂时没有条件开展间接免疫荧光技术的检验科实验室, 两种方法在临床检测中联合应用检测ANA, ELISA法作为初筛试验及LIA法作为确认试验来检测抗核抗体具有较好的临床意义。

参考文献

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酶联免疫吸附测定法 篇6

1 资料与方法

1.1 一般资料

健康人血清标本来自于本院2011年8～9月经体检无疾病的健康人群,共100例;活动性肺结核患者血清标本来源为本院结核科2011年5～9月经过临床确诊并住院患者的首次采血血清标本,共260例。

1.2 检测仪器

恒温孵育箱、DM-3全自动洗板机、KPS-KM型微孔板发光分析仪。

1.3 检测试剂及方法

化学发光法检测试剂盒和酶联免疫法检测试剂盒分别由北京科美东雅生物技术有限公司和北京万泰生物药业股份有限公司提供。检测操作严格按试剂盒说明书进行。

1.4 统计学方法

应用SPSS 10.0统计学软件进行数据分析,计数资料用率表示,组间比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

两种试剂盒对血清标本的检测结果见表1。由表1可见,活动性肺结核组中,化学发光检测试剂盒的阳性符合率为71.2%(185/260),ELISA检测试剂盒的阳性符合率为58.5%(152/260),两者差异有统计学意义(χ2=9.18,P<0.05);健康人群组检测中,两者的阴性符合率分别为89.0%(89/100)和93.0%(93/100),差异无统计学意义(χ2=0.98,P>0.05)。

3 讨论

结核分枝杆菌感染人体后,机体内会产生针对结核分枝杆菌的抗体,利用血清学方法检测体内抗结核抗体是发现结核病的有效手段。胶金体法虽具有操作简便、快速、成本低廉等优点,但其灵敏度较低,只适用于定性检测。经典酶联免疫吸附试验(ELISA)应用范围较为广泛,还可用于半定量检测,但对于低抗体水平标本表现欠佳。化学发光法对于标本的检测限达到了0.06 ng/mL[6]灵敏度,远高于传统ELISA法1 ng/mL的灵敏度,该方法在其他疾病检测领域己见相关报道,且具有较高的灵敏度[7,8],但国内尚未见其用于结核抗体检测方面的报道。由于发学发光法检测灵敏度高,本试验中应用CLIA法检测试剂盒检测活动性肺结核患者血清中抗结核抗体的阳性标本检出率显著高于普通ELISA法,对于普通ELISA法检测中的“灰区”部分可进行有效区分,达到提高灵敏度的目的,且CLIA法在明显提升阳性标本检出率的同时,假阳性率升高不明显。在本实验中CLIA法检测试剂盒较普通ELISA法检测试剂盒在阳性检出率提高了12.69%的同时,假阳性发生率只提高了4.0%,提示其适合用于结核病的实验室检测。

摘要：目的 比较化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)与酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)两种抗结核抗体检测试剂盒在结核病辅助诊断中的应用价值。方法 分别用CLIA和ELISA检测试剂盒对360例血清标本中的抗结核抗体进行检测,并对检测结果进行比较分析。结果 CLIA和ELISA两种检测试剂盒对260例活动性肺结核患者血清标本的检出率分别为71.2%(185/260)和58.5%(152/260),差异有统计学意义(P<0.05);100例健康人血清标本中两种试剂盒检测的阴性例数分别为89例和93例,两种试剂盒的特异性分别为89.0%和93.0%,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 在结核抗体检测中CLIA检测试剂盒与ELISA检测试剂盒的特异性无显著性差别,CLIA检测试剂盒灵敏度显著高于ELISA检测试剂盒。

关键词：结核,抗体,酶联免疫吸附试验,化学发光免疫分析

参考文献

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[2]Xueqiong W,Yourong Y,Junxian Z,et al.Comparison of antibody re-sponses to seventeen antigens from mycobacterium tuberculosis[J].Clinica Chimica Acta,2010,411(19-20):1520-1528.

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[4]李芳秋,周万青,史利宁,等.检测抗烟曲霉分泌蛋白抗体的ELISA法及其诊断价值[J].临床检验杂志,2010,28(02):107-109.

[5]王文,王锦红,缪晓辉,等.ELISA方法检测肝癌血清标志物的应用[J].中国生物制品学杂志,2010,23(3):307-309.

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酶联免疫吸附测定法 篇7

1 资料与方法

1.1 标本来源

以我院2013年3月~2015年3月门诊与病房送检标本7856份展开研究, 均为无菌采集, 置于低温冰箱中备用。

1.2 检测方法

1.2.1 使用仪器

酶联免疫吸附法仪器为夏门新创试剂和MK3型酶标仪、YR2WASH21型洗板机 (法国ADIL提供) 。Elecsys2010全自动电化学发光仪和配套试剂 (Roche公司提供) 。检测结果判断标准:阳性:样品的A值≥Cutoff值者;阴性:样品A值<临界值。

1.2.2 检测操作

对所有标本分别行酶联免疫吸附法及电化学发光免疫分析法检测, 检测严格执行试剂批号、操作者、实验室一致原则, 按照操作步骤完成。且进行完以下两种检测后行过夜孵育法WB作为金标准评价检测结果, 若WB无法确认结果则行核酸检测。

1.2.2. 1 电化学发光免疫分析法

采用“三明治”法。第一步, 将—份待测样品与一份三联吡啶钌复合标记HIV特异性抗体及一份生物素抗HIV标单克隆抗体共同孵育成“三明治”样抗原-抗体复合体;第二步, 加入已经经由链亲和素标记的磁微粒进行孵育, 利用生物素作用形成固相复合体。反应液吸入流动室中, 用磁铁将磁微粒吸附到电极表面。加入三丙胺后电极加压, 启动电化学发光反应, 利用光电倍增管对光强度进行测量, 光强度与复合体浓度之间存在线性关系, 利用光强度得到样品HIVCutoff值。

1.2.2. 2 酶联免疫吸附法

无菌采集乙二胺四乙酸抗凝全血, 800转/min速度下离心。操作按照HIV抗体诊断试剂盒说明书进行HIV抗体筛查试验。

1.4 统计学方法

应用统计学软件SPSS 19.0处理有关数据, 准确率用n (%) 表示, 行χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种检测方法敏感性与特异性比较

7856份标本中, WB证实共19例为阳性, 阳性率0.24%。其中电化学发光免疫分析法全部检出, 无漏诊与误诊情况, 敏感性与特异性均为100%, 酶联免疫吸附法初筛出22例, 其中3例为假阳性, 敏感性与特异性分别为100%、86.4% (19/22) , 两种检测方法的敏感性与特异性比较均无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。

2.2 两种检测方法HIV阳性分布结果

电化学发光免疫分析法Cutoff指数及酶联免疫吸附法OD/OC (吸光度值/临界值) 均呈现相同趋势及Cutoff指数与OD/OC越大, 阳性符合率越高。

3 讨论

艾滋病为严重威胁人类生命安全的感染疾病, 做好疾病预防及筛查工作以最大限度防止HIV病毒的传播对于公众卫生事业具有重大意义[3]。

本研究为探析更高效抗HIV检测方法, 将电化学发光免疫分析法与酶联免疫吸附法检测结果进行对比, 结果显示, 两种检测方法均具有较高敏感性, 电化学发光免疫分析法特异性更高, 但差异无统计学意义。提示两种检测方法均有较高准确性。国内HIV感染以血清病毒抗体检测作为临床诊断标准, 血清中抗HIV抗体为是否发生感染的依据, 病毒及相关抗原主要作为辅助手段[4]。原因在于体内HIV清除难度极大, 感染往往将终生持续, 因此体内抗体的检出一般即可断定病毒的存在[5]。酶联免疫吸附法为我国大多数医院抗HIV测定方法, 但此方法需将游离态抗原 (或抗体) 与结合态抗原 (或抗体) 分离开来, 因此检测过程需反复加样并洗板, 误差几率随之增大[5,6]。此外, 酶标板孔间也容易存在差异而导致变异系数增大, 这就是酶联免疫吸附法假阳性更高的原因。再有, 该方法操作繁琐, 需等待1~2h才出结果, 增加了判断难度;若标本浓度太低, 还容易导致假阴性结果[7]。电化学发光免疫分析法为磁性微珠包被技术、生物素-亲和素技术、电化学发光技术综合得到的检测技术, 灵敏度较高, 批内、批间误差也可大幅减少, 为临床提供精确检测结果。此外, 该方法的检测过程在封闭、流动系统中完成, 交叉污染情况得以避免, 且试剂稳定, 结果可靠。值得一提的是, 该方法最大优势在于其分析时间与酶联免疫吸附法相比明显缩短, 仅为20min, 更加快速。有研究提出[8], 电化学发光免疫分析法的另一个优势在于其测定线性范围比酶联免疫吸附法高出4个数量级左右, 因此可有效避免前带倒钩等引起的假阴性情况, 稳定性与重复性均较佳, 可实现批量化分析, 诊断窗口期大幅缩短。但也不可忽视, 电化学发光免疫分析法成本较高, 目前尚难以在小医院得到普及。

综上所述, 酶联免疫吸附法与电化学发光免疫分析法检测抗HIV准确性均较高, 前者比较费时但容易普及;后者更为快速, 但费用高, 各有优势, 医院可结合自身情况选择抗HIV检测方法。

摘要：目的 比较酶联免疫吸附法与电化学发光免疫分析法检测抗HIV的效果。方法 以门诊与病房送检标本7856份展开研究, 对所有标本分别行酶联免疫吸附法及电化学发光免疫分析法检测, 以WB检测结果为基准对两种检测方法的敏感性与特异性进行比较。结果 7856份标本中, WB证实共19例为阳性, 阳性率0.24%。其中电化学发光免疫分析法全部检出, 无漏诊与误诊情况, 敏感性与特异性均为100%, 酶联免疫吸附法初筛出22例, 其中3例为假阳性, 敏感性与特异性分别为100%、86.4% (19/22) , 两种检测方法的敏感性与特异性比较均无统计学意义 (P>0.05) 。结论 酶联免疫吸附法与电化学发光免疫分析法检测抗HIV准确性均较高, 前者比较费时但容易普及;后者更为快速, 但费用高, 各有优势, 医院可结合自身情况选择抗HIV检测方法。

关键词：酶联免疫吸附法,电化学发光免疫分析法,HIV,感染

参考文献

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酶联免疫吸附测定法 篇8

关键词：酶联免疫吸附法,金免疫层析试验,明胶凝集试验

梅毒主要是由苍白密螺旋体 (TP) 感染而引起的一种慢性全身性传播疾病, 严重地危害人们的生命健康。TP一旦进入人体, 血清中会产生非特异性抗体及梅毒特异性抗体[1]。因此, 应加强对梅毒的诊断, 而血清型检测是诊断机体是否为TP感染的唯一途径。临床上检测TP抗体的血清检验学方法有多种, 其检测敏感度与特异度也具有一定的差异性[2]。酶联免疫吸附法 (ELISA) 与金免疫层析试验 (GICA) 常用于TP抗体的临床检测之中。本研究以“金标准”TPPA作为参照, 对比ELISA与GICA法对TP抗体的检测情况, 现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择6250例产前和术前标本, 其中男2350例, 女3900例;年龄19~68 (45.09±5.92) 岁;共检测出梅毒阳性患者50例, 检出率为0.8% (50/6250) , 均符合梅毒临床诊断标准, 其中一期梅毒患者14例, 二期梅毒患者17例, 三期梅毒患者6例, 不明期梅毒患者13例。

1.2 仪器与试剂

ELISA试剂为上海科华公司生产, 生产批号为201003011;TPPA试剂为日本富士康必欧株式会社公司生产, 生产批号为VN00303;GICA试剂为英科新创公司生产, 生产批号为2010020907。主要仪器为:郑州anthos2010酶标仪, 郑州anthos fluido型全自动酶标洗板机。

1.3 检测方法

首先抽取5ml空腹条件下静脉血, 于4000rpm转速下离心5min之后将血清加以分离, 若血清标本不能及时地送检, 则需将其置于温度为4℃的冰箱中保存, 备用, 以避免反复地冻融, 分别采用ELISA法、GICA法及TPPA法进行检测, 检测方法严格按各自试剂盒上的说明进行规范操作。前两种检测方法的结果与TPPA法检测结果进行对比。

1.4统计学方法

采用SPSS 16.0进行数据处理。计数资料以率 (%) 表示, 组间比较采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

GICA法对一期梅毒、三期梅毒、不明期梅毒的检出率及总检出率低于ELISA法和TPPA法, 差异均有统计学意义 (P<0.05或P<0.01) 。ELISA法与TPPA法各时期TP的检出率及总检出率差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表1。

3 讨论

当梅毒进入人体之后, 机体会产生2种类型的抗体, 即:抗心磷脂的非特异性抗体 (“反应素”) 与抗菌体的特异性抗体。非特异性抗体不是机体针对菌体自身所发生的反应, 而是针对菌体破坏患者组织之后释放的内脂所产生的反应[3]。因此, 检出时间一般比检出机体对菌体产生的特异性抗体晚2周, 且在一期梅毒早期、晚期梅毒、潜伏期梅毒及梅毒治疗之后起检出率显著降低甚至呈阴性[4]。因此, 若使用检测非特异性TP抗体的检测方法对特异性抗体进行诊断, 会出现更多的假阴性。笔者认为特异性抗体是诊断TP感染的重要依据。

注:与GICA法比较, *P<0.01, #P<0.05

目前, 临床上常使用非特异性抗体试验, 如TRUST与RPR2种检测方法, 2种方法所使用的抗原均为心磷脂类。此类试验虽具有操作简单、结果易读、试剂成本低、设备要求低及检测快速等方面的特点[5], 然而因该试验方法的局限性以及结果极易受到主观因素的影响, 且灵敏度及特异度较低, 常出现生物学假阴性。因此, 上述检测方法不适合TP特异性抗体的临床检测。目前, 使用较多的ELISA法与GICA法, 通过对这2种方法检测结果的对比分析, 结果显示:50例确诊梅毒病例中, ELISA法与TPPA法对各时期TP的检出率具有较高的一致性, 除二期梅毒外, GICA法对各期TP检出率显著低于ELISA法与TPPA法 (P<0.01) 。由此可见, 与GICA法相比, ELISA法检测梅毒特异性抗体检出率更高, 漏检率更低, 且与“金标准”TPPA检测法检测结果基本一致, 可用于临床梅毒感染患者的诊断之中。

参考文献

[1] 肖春梅, 朴桂花, 李富荣, 等.梅毒血清学实验室检查及临床应用[J].实用医学杂志, 2011, 27 (8) :1485-1486.

[2] 王碧玉.曾自如.胶体金法、酶联免疫吸附试验和明胶颗粒凝集试验检测血清梅毒抗体的结果比较[J].右江民族学院学报, 2011, 33 (2) :209-211.

[3] 张胜兰, 陈翔, 林炳亮.酶联免疫吸附试验与金免疫层析试验检测梅毒特异性抗体的结果评价[J].浙江医学, 2013, 35 (11) :1094-1096.

[4] 徐正红.金标法与滴度法应用于临床检测梅毒的效果观察[J].西南军医, 2011, 13 (1) :51-52.