免疫荧光定量法

免疫荧光定量法（精选7篇）

免疫荧光定量法 篇1

近年来, 随着我国经济和社会的发展, 人们生活方式的不断改变, 我国丙型肝炎的发病率逐年升高, 其中病情严重者较为多见。有研究报道目前我国一般人群丙型肝炎的流行率约为3.2%, 而在吸毒等特殊人群中, 其流行率远远高于此[1,2]。一旦感染丙型肝炎病毒, 如果不能及时有效的治疗, 则极有可能转化为慢性丙型肝炎, 感染过程进一步增长, 继而出现肝脏组织的病变并有进行性加重的趋势, 少部分患者因此而转化为原发性肝癌, 不但增加患者的痛苦, 同时还会增加患者的经济负担[3]。丙型肝炎患者能否得到及时有效的治疗, 首先依赖于临床检验的检测结果, 检测结果的及时及准确与否, 直接影响患者的治疗。目前丙型肝炎病毒的检测方法主要有酶联免疫吸附试验 (ELISA) 及荧光定量PCR检测HCV-RNA, 两种检测方法各有其优缺点, 本文对两种方法的检测结果进行对比分析, 以期为丙型肝炎病毒的检测寻找更为合理有效的检测方法。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2013年1月-2015年12月在我中心体检的体检者750例作为检测对象, 其中男420例, 女330例;年龄30~52 (38.1±6.23) 岁。

1.2 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测方法

使用仪器:MK3全自动酶标仪, MK3全自动洗板机, 移液器 (上海热电仪器有限公司生产) , 生物安全柜 (苏州净化设备有限公司生产) 。试剂生产厂家:上海科华生物制药有限公司, 所有试剂均批批检合格且有效期内使用。操作方法:首先在酶标孔内加入100μl样品稀释液, 阳性及阴性对照空不加, 分别在相应的酶标空内加入10μl样品, 设置2空阳性对照孔, 3空阴性对照孔, 每空加入100μl阳性或阴性对照, 加样完成后封板37℃温育60min, 用MK3全自动洗板机洗板5次, 然后每空加入酶结合物100μl, 再次封板37℃温育30min, 然后用MK3全自动洗板机洗板5次, 每空加入底物缓冲液50μl及底物液50μl, 混匀后再次封板37℃温育30min, 每空加入终止液50μl, 选择酶标仪450/630波长测量结果, 按照试剂说明书判断结果。

1.3 荧光定量PCR检测方法

使用仪器:PCR仪器:PTC200GAJF, 提取仪器:西安天隆科技有限公司。试剂厂家:艾康生物技术有限公司。操作方法:首先使用天隆全自动提取仪进行核酸提取, 提取后使用荧光定量PCR仪进行定量检测, 检测参数的设置及结果判断严格按照试剂说明书进行。

1.4 质量控制

ELISA检测方法及荧光定量PCR检测方法均加入阳性及阴性对照进行质量控制。

1.5 统计学方法

应用SPSS 16.0统计软件进行数据处理。计数资料以率 (%) 表示, 组间比较采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

本组750例体检者中ELISA法检出阳性21例, 阳性率为2.80%, PCR法检出阳性40例, 阳性率为5.33%, 两种检测方法检测结果比较差异有统计学意义 (χ2=6.170, P<0.05) 。

3 讨论

丙型肝炎主要是因机体受到丙型肝炎病毒入侵而引起的一种血液传播性传染病, 目前在世界范围内广泛流行, 普通人群均易感, 感染年龄也无大小之分, 各个年龄阶段均可感染[4]。近年来丙型肝炎在我国的流行趋势也越来越严重, 其中多数会引发严重肝炎, 如果在感染初期不能得到及时有效的治疗, 多数患者会转变为慢性丙型肝炎患者, 丙型肝炎病毒感染的一个重要特点就是慢性转化率很高, 随着病程的延迟, 患者的肝脏组织会出现不同程度的病变, 并且随着时间的推移而进行性加重, 再严重的患者则会出现原发性肝癌, 给患者造成严重的经济及心理负担[5]。丙型肝炎的传播途径多为血液传播, 其次为母婴及性传播, 以前丙型肝炎多在吸毒等特殊人群中传播, 目前已经有向一般人群流行的趋势, 需引起医学界的重视。因此对丙型肝炎进行早发现、早诊断、早治疗是控制病情恶化的主要措施, 丙型肝炎仅依据临床症状很难作出正确的诊断, 因此必须要结合实验室检测结果综合判断[6]。ELISA用于丙型肝炎抗体的检测, 是当前各家实验室较为常用的检测方法, 该方法具有较高的敏感性和特异性, 基本可作出正确的判断。其操作方法主要为患者血清中的抗-HCV, 血清丙型肝炎抗体通过与酶标孔上已经包被好的抗原相结合, 然后与酶标记物相结合, 最后加入底物显色, 加入终止液后使用酶标仪测量吸光度, 通过吸光度值进行结果判断[7]。荧光定量PCR是一种近年来出现的新型检测方法, 其检测原理主要为选用丙型肝炎病毒保守基因片段设计特异引物及特异Tapman探针, 该探针能与引物扩增区域中间的一段c DNA模板特异性结合。在PCR延伸反应过程中, Taq酶的外切酶活性将5’端荧光基团从探针上切割下来, 从而脱离3’端光淬灭基因的屏蔽, 能接受光而发出可供仪器检测的荧光, 从而在全封闭反应体系中对丙肝病毒核酸的自动化检测。该检测方法具有高度敏感性及特异性[8]。本结果显示, ELISA法检出阳性率低于荧光定量PCR法, 说明使用荧光定量PCR检测丙型肝炎感染情况, 检测结果明显优于传统的ELISA法。在临床检测中, ELISA法检出的结果, 有时需采用确诊实验确定患者的感染情况, 对感染的程度也不能作出明确的判断[9,10]。荧光定量PCR检测技术是表示传染性及复制病毒最可靠指标, 是显示丙肝感染状态及治疗效果的重要指标, 不但可判断患者是否感染丙型肝炎病毒, 同时还可跟踪患者的治疗效果。因此, 荧光定量PCR检测方法用于检测丙型肝炎病毒感染准确可靠, 可在临床检测中推广使用。

摘要：目的 分析酶联免疫吸附试验法和荧光定量PCR检测患者感染丙型肝炎病毒的情况, 以期为丙型肝炎病毒的检测寻找更为合理有效的检测方法。方法 选择2013年1月-2015年12月在该中心体检的体检者750例作为检测对象, 分别采用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 和荧光定量PCR进行检测, 统计分析检测结果。结果 ELISA法检出阳性21例, 阳性率为2.80%, PCR法检出阳性40例, 阳性率为5.33%, 两种检测方法检测结果比较差异有统计学意义 (χ2=6.170, P<0.05) 。结论 荧光定量PCR检测方法用于检测丙型肝炎病毒感染准确可靠, 可在临床检测中推广使用。

关键词：丙型肝炎,荧光定量PCR,抗-HCV,结果分析

参考文献

[1]陈作芬, 曹永平.丙肝患者治疗前后HCV RNA与抗-HCV及丙氨酸氨基转移酶水平的分析[J].检验医学与临床, 2010, 7 (12) :1175-1177.

[2]王兰兰.临床免疫学与检验[M].4版.北京:人民卫生出版社, 2007:296.

[3]万学红, 卢雪峰.诊断学[M].8版.北京:人民卫生出版社, 2013:460.

[4]张言超, 陈明, 李强, 等.HCV-RNA和抗-HCV联合检测的诊断意义[J].徐州医学院学报, 2010, 30 (8) :536-537.

[5]冯国钢.抗-HCV抗体与HCV-RNA定量检测相关性分析[J].吉林医学, 2011, 32 (2) :244-245.

[6]Pas S, Molenkamp R, Schinkel J, et al.Performance evaluation of the new Roche cobas Ampli Prep/cobas Taq Man HCV test, Version 2.0, for detection and quantification of hepatitis C virus RNA[J].Clin Microbiol, 2013, 51 (1) :238-242.

[7]European Association for Study of Liver.EASL Clinical Practice Guidelines:management of hepatitis C virus infection[J].J Hepatol, 2014, 60 (2) :392-420.

[8]刘惠媛, 陈志敏, 曾健伟, 等.415例原发性肝癌患者的临床特点分析[J].新医学, 2013, 44 (2) :123-126.

[9]Beinhardt S, Rutter K, Stattermayer AF, et al.Revisiting the predictors of a sustained virology response in the era of direct-acting antiviral therapy for hepatitis C virus[J].Clin Infect Dis, 2013, 56 (1) :118-122.

[10]王江南, 陈秀荣, 李健, 等.ELISA法检测抗-HCV-Ig G抗体以及FQ-PCR检测血清HCV-RNA在丙型肝炎诊断中的应用价值[J].广东医学, 2015, 36 (24) :3797-3801.

免疫荧光定量分析仪设计 篇2

免疫荧光分析技术是新发展起来的精密的免疫标记检测技术, 与传统的酶联免疫法及金标法相比, 免疫荧光分析技术灵敏度高, 特异性强, 操作方便, 不用放射性物质作为标记物, 因此具有无放射性、标记物稳定、便于长期保存、试验重复性好、分析速度快、样品用量少及标准曲线量程宽等优点[1]。荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后, 物质本身所发射的光的强度。荧光的强度与物质数量之间存在正比关系, 可通过测定荧光的光谱和荧光强度, 对物质进行定性或定量的分析。免疫荧光分析技术是目前生物医学检验中常用的快速分析技术, 在微生物、病毒抗原或抗体检测、激素检测、肿瘤标志物检测、毒品海洛因、吗啡、摇头丸、氯胺酮等检测领域具有广阔的应用前景。

1 免疫荧光定量检测原理

将特异的荧光抗体先固体于硝酸纤维素膜的某一区带, 当该干燥的硝酸纤维素一端滴加样品后, 由于毛细管作用, 样品将沿着该膜向前移动, 当移动至固定有抗体的区域时, 样品中相应的抗原即与该荧光体发生特异性结合, 随着进一步的层析作用, 用此抗原的另一个抗体对此复合物进行捕捉, 多余的荧光抗体用其二抗进行捕捉, 两次捕捉的位置分别称为质控线 (C线) 和检测线 (T线) 。当光源照射到检测卡上时, 质控线和检测线分别激发出不同强度的荧光, 光电转换器接收不同强度的荧光产生不同大小的电信号, 电信号的强弱反映出待检测物的浓度, 从而实现特异性的免疫诊断。

2 免疫荧光定量分析仪系统设计

免疫荧光定量分析仪主要由光学部分、硬件电路部分以及系统软件部分组成。光学部分是荧光定量分析仪的核心部分, 用来激发出荧光, 而硬件电路部分和系统软件部分则用来进行荧光信号的检测处理以及控制整个仪器的正常运行。

2.1 光学部分设计

光学部分设计如图1所示, 光学部分由光源发射光路和荧光检测光路两部分组成。

光源发射光路由LED光源、凸透镜1、滤光片1和凸透镜2组成。LED光源的光轴与凸透镜1、滤光片1以及凸透镜2的光轴在一条线上。光源为绿色 (中心波长为580 nm) 高亮度LED光源, LED位于发射光路凸透镜1的焦点, 这样光源发出的光经凸透镜1后变为平行光, 滤光片1采用中心波长580 nm带宽为30 nm的窄带干涉滤光片, 平行光经过滤光片1后, 入射光中565 nm~595 nm范围以外的光被滤除掉, 出射的光为窄带光 (565 nm~595 nm) , 其经过凸透镜2后, 被聚焦到样品上, 激发出荧光, 荧光波长为610 nm。

荧光检测光路由凸透镜3、滤光片2、凸透镜4和光电转换器组成。光电转换器与凸透镜3、滤光片2、凸透镜4的光轴在一条线上。荧光检测光路光轴和发射光路光轴成45°角, 最大程度地减少了激发光对荧光信号检测的影响。荧光检测光路光轴和发射光路光轴的交点在检测试纸上, 且交点为凸透镜2和凸透镜3的焦点。滤光片2采用中心波长610 nm, 带宽为15 nm的窄带干涉滤光片。激发出的荧光被凸透镜3收集后变为平行光, 平行光通过滤光片2后, 原来的少量激发光会被滤光片滤除掉, 仅剩激发出的610 nm左右的荧光信号通过[2,3]。通过滤光片后的光被凸透镜4收集聚焦到荧光检测模块上的光电转换器上, 实现光信号到电信号的转换。

2.2 系统硬件电路部分设计

系统硬件电路的结构框图如图2所示, 仪器的测量原理是:处理器控制步进电机带动待检测样本到达检测器的检测口上方, 通过发光控制模块控制LED的发光强度以符合测量的强度要求, 光电传感器检测荧光信号的强弱, 传感器输出信号经放大和滤波处理后进入ADS1252转化为数字信号交给处理器进行处理[4]。

图2中检测器框中所示的部分包括上文2.1所描述的光学部分以及部分硬件电路, 两部分共同封装在检测器内, 提高了检测信号的稳定性和抗干扰能力。检测器硬件电路部分由发光控制模块和荧光检测模块组成。

为了保证光源的稳定性, 发光控制模块采用了恒流源驱动方式, 这样可以有效保证光源发光强度的恒定。对于有的样品, 照射光源不宜太强, 因此, 恒流源采用的是程控调节的恒流源, 通过输入不同的数字值, 可以控制LED的发光强度。即LED驱动电流的大小可以通过程序进行控制。

光电转换器选用内置运放的光电转换芯片OPT101。荧光检测模块包含了光电转换、信号放大滤波、电压偏置、模/数转换等部分。其中, 信号放大采用程控放大, 模/数转换采用24位的A/D转换芯片ADS1252, 可保证足够的转换精度和大的动态检测范围。检测器传输给控制器的是数字电信号, 数字信号比模拟信号有更强的抗干扰能力和准确性, 这就大大提高了系统的检测精度。

2.3 系统软件部分设计

系统软件使用C语言进行编写, 软件流程图如图3所示。系统初始化主要完成系统各外围模块的配置以及历史设置的读取和配置。待系统初始化完成后, 控制电机带动样品卡卡槽出仓, 并在显示屏上提示用户插入检测样品卡。系统循环检测样品卡是否插入卡槽内, 当检测到样品卡插入后系统打开二维码扫描枪并控制电机带动样品卡移动至扫描枪处进行二维码的读取。二维码包含检测项目、产品批号、标准曲线等信息。系统判断二维码信息有效后打开LED并根据二维码相关信息调整LED亮度同时控制电机带动待检测样本移动至检测器上方进行检测。采集到的数据将以txt文件的形式保存在SD卡内, 经一定的算法计算出T线与C线对应波峰的面积比后代入二维码信息中的标准曲线内, 得出待检测样品的浓度并将最终的荧光强度曲线及样品的浓度检测结果显示到显示屏上并自动存储和打印检测信息[5]。

3 测试结果及分析

本文设计的免疫荧光定量分析仪可以测量血液和尿液中多种物质的浓度, 本文以NT-pro BNP (N末端脑钠肽前体) 的浓度测量为例对仪器的运行效果进行分析。NT-pro BNP是由心脏分泌的一种神经内分泌激素, 已被证明是临床上诊断、治疗及判断心力衰竭患者预后的重要指标[6]。

3.1 荧光信号的采集

将样品卡插到仪器的卡槽内进行检测得到荧光强度曲线如图4所示。图中横坐标代表数据个数, 纵坐标代表光电转换器输出的电压值, 单位为m V。

3.2 标准直线拟合

得到样品荧光强度的曲线后, 利用高斯拟合可以计算出T线和C线对应的曲线波峰的面积, 利用T线和C线对应波峰的面积可以计算出待检测样品的浓度。这就需要一组标准浓度校验品, 根据标准浓度校验品的测量结果, 建立一定的数学模型计算出T线和C线对应波峰的面积与样品浓度之间的数学关系。

根据标准浓度校验品得到样品浓度与T线对应波峰的面积 (用AT表示) 与C线对应波峰的面积 (用AC表示) 之比AT/AC的对应关系如表1所示。

由表1中的对应关系, 利用最小二乘法得到的样品浓度与AT/AC数学量化关系, 如图5所示。

由图5可以得出, 最小二乘法拟合直线的表达式如式1所示:

直线拟合相关系数R=0.999 92, 说明这6种标准浓度校验品的浓度与AT/AC之间存在良好的线性关系。

3.3 系统测量误差分析

选择一组同一批次不同浓度标准浓度样品, 依据式1对样品浓度进行测量, 分析系统的检测误差, 得到的测量结果如表2所示。

由表2的实测结果可以看出, 对于标准浓度样品的测量误差在±8%以内, 满足实际的使用要求。下面选取一组医院的病人血液样品, 以进口的锐普智能荧光干式定量分析仪作为标准仪器进行对比测量。每个病例取75μL病人血液样本加到样品缓冲液中, 将溶液充分混匀后取75μL混匀后的样本滴加到样品卡的加样孔内, 等待15 min后将样品卡插入到仪器的卡槽内得到的测量结果如表3所示。

由表3的对比测量结果可以看出, 本文设计的免疫荧光定量分析仪与现已商品化的免疫荧光检测仪相比, 测量误差在±8%以内, 能满足临床应用要求。

4 结论

本文设计了免疫荧光定量分析仪, 对仪器的光学部分、硬件电路部分以及系统软件部分进行了详细介绍。从多个角度对仪器的运行结果进行了分析, 从测试结果可以看出, 仪器可以拟合出线性度良好的标准直线, 通过对标准校验品的测量试验和与标准仪器的对比试验表明仪器在小型化、快速性的基础上, 测量误差能够控制在±8%以内, 可以满足临床应用的要求。

摘要：设计了免疫荧光定量分析仪, 用以对人体血液和尿液中的各种分析物 (CRP、PCT、NTpro BNP、c Tn I等) 含量进行快速准确的定量分析。光源采用大功率LED灯珠, 采用窄带干涉滤光片对激发光和荧光进行滤光, 采用内置运放的光电转换芯片OPT101进行荧光强度的检测。采用步进电机驱动, 皮带传动方式带动双排滚珠宽体滑块在单根精密直线导轨上滑动, 实现对检测样品的扫描式检测。通过与标准仪器进行对比试验, 结果表明样机在小型化、快速性以及低成本的基础上, 测量结果准确, 测量精度高, 稳定性好, 能满足临床应用要求。

关键词：免疫荧光定量分析仪,干涉滤光片,OPT101

参考文献

[1]黄晓群.酶联免疫法、金标法、时间分辨免疫荧光分析法测定HBs Ag对比分析[J].中国保健营养:临床医学学刊, 2009, 18 (10) :7-9.

[2]纪建伟, 解飞, HARBINSON J.LED激发光源叶绿素荧光参数在线监控系统[J].农业工程学报, 2009, 25 (4) :145-149.

[3]张可可, 闫星魁, 陈世哲.荧光法海水叶绿素a传感器设计[J].山东科学, 2013, 26 (3) :37-40.

[4]王宜怀, 吴瑾, 蒋银珍.嵌入式系统原理与实践:ARM Cortex-M4 Kinetis微控制器[M].北京:电子工业出版社, 2012.

[5]熊有郑, 闵小平, 葛胜祥.基于嵌入式Linux的扫描式荧光检测仪的实现[J].工业控制计算机, 2013, 26 (9) :9-10, 13.

免疫学定量实验操作考核法 篇3

1 考核对象及方法

1.1 考核对象

为本校2007级卫生检验与检疫专业专科班学生, 入校时随机分班, 成绩同一档次, 选择甲班作为实验组共30人, 乙班作为对照组共30人。

1.2 考核方法的建立

根据多种化学物质溶于水时有显著呈色反应, 可用分光光度计测定光密度 (OD) 值分析含量的原理, 选择合适化学物质作为测定物配制成一定浓度, 考核时学生按照定量实验操作方法对该化学物质进行连续稀释, 取其某一稀释度测定光密度 (OD) 值, 以教师操作值作为参考值计算精密度系数 (CV) 、准确度系数 (CB) 及分析系数 (CA) , 并按相应公式转化为百分制分数表示学生操作水平。

1.2.1 呈色化学物质的选择。

在实验室中选取几种呈色化学物质如硫酸铜、高锰酸钾、重铬酸钾、刚果红等, 按照溶于水后稀释度的线性关系及斜率、同一稀释度OD值差异、不同稀释度肉眼观呈色差异等综合评分。综合各方面因素, 刚果红作为测定物质比较合适。见表1。

1.2.2 待测稀释度的选择。

血清学定量实验操作通常连续稀释6管以上, 稀释次数越多, 累积的操作误差越大, 因此应尽量测稀释度高者, 但稀释度越高, OD值越小, 绝对差异量将越小, 易因仪器误差而缩小或夸大操作误差。故选定标准差和变异系数均较理想的24作为待测稀释度[1]。见表2。

1.2.3 计分方法的制定。

考核时发给每个学生三份同质样品即0.1%刚果红水溶液, 用蒸馏水连续2倍稀释6管, 取各份的第3管 (24倍稀释) , 由教师统一在722E分光光度计上以550nm波长、0.5cm光径测各管OD值, 计算CV、CB、CA值, 同时教师在相同条件下进行操作, 以教师的OD值及计算所得CA值为依据, 将学生的CA值转换为百分制分数[2]。计算公式如下:

$\text{R}=\sqrt{(\text{C}\text{V}){}^2+(\text{C}\text{B}){}^2}‚\text{C}\text{A}=100-\text{R}$, 学生得分= (学生CA-教师CA) .K1+60 (学生CA>教师CA) , 学生得分= (学生CA-教师CA) .K2+60 (学生CA<教师CA) , K1= (100-60) ÷ (100-教师CA) , K2=60÷教师CA

2 考核结果

2.1 成绩分析

两组各分数段学生例数分布情况见表3。

从考核成绩看均接近正态分布, 但实验组成绩明显优于对照组。

2.2 准确度与精密度分析

CB与CV按优、良、及格、差进行分类, 实验组的CB与CV构成比的差别无显著性 (P>0.75) , 而对照组的CB与CV构成比的差别有显著性 (0.01<P<0.025) 。见表4。

3 讨论

3.1 从实验考核的成绩看, 无论是实验组还是对照组都接近正态分布, 说明本考核方法能较真实地反映学生的实际操作能力, 用作实验操作考核是可行的。从各组成绩分析, 实验组成绩要明显优于对照组, 实验组学生实验操作的准确度与精密度构成比的差别无显著性, 而对照组的准确度与精密度构成比的差别有显著性, 原因在于两组学生虽然进校时随机分班, 成绩同一档次, 但在教学过程中, 教师对实验组学生的实验操作进行了强化训练, 向学生强调职业道德、行业标准、操作规程, 因此学生操作能力普遍提升, 所以在实验教学过程中加强对学生的训练, 是能够提高学生操作水平的。

3.2 将分析系数引入定量实验操作考核中。分析系数是在两个单独评价精密度和准确度概念的基础上由Louderback等提出的综合评定精密度和准确度的指标, 由计分公式CA=100-KR计算学生实验操作得分比较合理, 既要求学生实验操作有较好的准确度, 又要求有较好的精密度, 因此学生在实验考核过程中既要控制系统误差又要控制偶然误差[3], 这就要求教师在平时的实验教学过程中, 要严格要求学生遵守操作规程, 准确使用各种器具及设备, 并做好记录, 养成良好的职业习惯。

3.3 分析系数 (CA) 主要用于临床质量控制及评价工作者的操作水平, 将其引入学生实验技能考核, 既与临床紧密结合又能很好地促进教学, 将CA换算成百分制分数, 统一了计分标准, 解决了实践技能考核的难题。学生在学习过程中往往存在重理论轻实践的现象, 缘于没有合适的实践考核方法, 特别是像免疫学及检验技术这类课程, 对学生的操作动手能力要求特别高, 如果在校期间学生没有得到较好的训练, 走上工作岗位后将很难适应工作的要求, 因此本考核方法的建立, 将极大地促进实践教学改革, 紧密结合临床促进学生动手能力的培养。

摘要：将分析系数引入定量实验操作考核, 通过分光光度计测定学生对呈色化学物质水溶液连续稀释操作后的OD值, 对其准确度与精密度综合评分, 介绍了考核方法的建立及对考核结果的分析, 该考核方法能较好地区分学生操作水平的优劣, 可作为考核学生操作能力的常规方法。

关键词：分析系数,定量实验,操作考核

参考文献

[1]吕世静.免疫学检验 (M) .第2版.北京:人民卫生出版社, 2007.20.

[2]石建国, 孙燕冰.生化检验学实验技能考核初探 (J) .医学检验教育, 1997, 2:45-46.

免疫荧光定量法 篇4

实时荧光定量PCR技术是一种新的DNA/RNA定量检测技术,具有操作简便、结果直观、特异性强、敏感性高、重复性好、稳定性好等优点,克服了以往PCR技术中存在假阳性和不能准确定量的缺点,已被越来越多地应用于病毒的定量分析、病原体的分型鉴定和基因的快速诊断分析方面[1]。

试验应用荧光定量RT-PCR方法定量检测PRRSV变异株(HuN4)活疫苗和PRRSV变异株(JXA1)灭活苗免疫仔猪攻毒前后病毒在体内各组织中的动态分布规律,揭示HuN4活疫苗和JXA1灭活苗免疫仔猪攻毒后病毒在体内的复制情况,以期为PRRSV变异株疫苗免疫机理的研究和更好地预防PRRS提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗和毒株

PRRSV变异株(HuN4)活疫苗由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所蓝耳病课题组提供,10头份/瓶,用PBS稀释至10 mL,病毒含量为1×105.0TCID50/mL;PRRSV变异株(JXA1)灭活苗由某公司生产;强毒为PRRSV变异株HuN4-F5,也由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所蓝耳病课题组提供,病毒含量为3×105.0TCID50/mL。

1.1.2 试剂和仪器

总RNA抽提试剂盒,购自上海生工生物工程技术服务有限公司;CIVTEST SUIS PRRS抗体检测试剂盒,购自LSI公司;禽原反转录酶(AMV)、RNA酶抑制剂、rTaq DNA 聚合酶、Ex Taq DNA聚合酶(Hot Start Version),TaKaRa公司产品;RotorGene3000荧光定量PCR仪,Corbett 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 试验动物及设计

取25头约35日龄的健康断奶仔猪,经RT-PCR和ELISA血清学检测PRRSV抗原和抗体均为阴性,隔离饲养1周后随机分为3组(见表1)。免疫后第21天3个组仔猪均用PRRSV变异株HuN4-F5强毒攻毒, HuN4活疫苗组和JXA1灭活苗组仔猪在免疫后7,14,21天剖杀,每次每组1头;3个组仔猪于攻毒后1,5,9,14,21天剖杀,每次每组1头;剩余仔猪在攻毒后21天全部剖杀;无菌取脑、扁桃体、颌下淋巴结、腹股沟淋巴结、肺门淋巴结、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃等组织器官,备用。

1.2.2 病毒RNA的提取和cDNA的合成

无菌取各脏器任意部位,重量在0.01～0.1 g之间;用1 mL预冷PBS研磨成匀浆,反复冻融3次;3 000 r/min离心5 min,取300 μL上清液,提取总RNA;溶于30 μL DEPC处理水中,进行反转录PCR,合成cDNA。反转录PCR体系(10 μL):总RNA模板 5.25 μL、5×AMV Buffer 2 μL、dNTP(10 mmol/L) 1 μL、随机引物(50 mmol/L) 0.5 μL、AMV(5 U/μL)1 μL、RNA酶抑制剂(40 U/μL)0.25 μL。反转录PCR程序:25 ℃ 10 min,42 ℃ 1 h,0 ℃ 2 min。

1.2.3 荧光定量RT-PCR检测组织中的病毒含量

采用韦天超等[2]的猪繁殖与呼吸综合征病毒Taq Man-MGB荧光定量RT-PCR方法检测血清中的病毒含量,并对其取以10为底的对数值作图。

2 结果与分析

2.1 HuN4活疫苗免疫仔猪攻毒前后PRRSV在各组织中的动态分布

HuN4活疫苗免疫仔猪后,免疫期间病毒在颌下淋巴结、肺门淋巴结、肺脏和肾脏中持续存在,病毒载量较低,而在肝脏和脾脏中始终检测不到;免疫后第7天仅在颌下淋巴结、肺门淋巴结和肺脏中检测到,肺脏中病毒载量最高,达4.9×105copies/g;脑、扁桃体、腹股沟淋巴结、心脏和胃仅在免疫后14天检测到,免疫后14天病毒在各组织分布最广,病毒载量最高,达1.7×106copies/g;免疫后21天病毒载量呈下降趋势(见图1)。攻毒后病毒在淋巴结、脾脏和肺脏中持续存在,胃中没有检测到病毒;脑仅在攻毒后9天检测到,病毒载量较低,达1.5×104copies/g;心脏、肝脏和肾脏仅在攻毒后9,14天检测到;攻毒后1天仅在扁桃体、颌下淋巴结和肺门淋巴结中检测到,病毒载量较低,最高达6.4×105copies/g;攻毒后5天仅在肺门淋巴结检测到,病毒载量为1.83×104copies/g;攻毒后9天病毒遍布除胃以外的所有组织,病毒载量达到高峰,最高达1.0×108copies/g;攻毒后14天各组织中的病毒载量开始呈下降趋势;攻毒后21天仅在淋巴结、脾脏和肺脏中检测到,但淋巴结中病毒载量较高,达2.4×107copies/g(见图2)。

2.2 JXA1灭活苗免疫仔猪攻毒前后PRRSV在各组织中的动态分布

JXA1灭活苗组免疫期间各组织中没有检测到病毒。攻毒后病毒在免疫器官、心脏、肺脏和肾脏中持续存在,脑和胃中很少检测到,且病毒载量较低,最高达3.2×105copies/g;攻毒后1天仅在扁桃体、淋巴结和肝脏中检测到,腹股沟淋巴结中病毒载量最高,达2.7×108copies/g;攻毒后5天病毒遍布除脑和胃以外的其他组织,但扁桃体和淋巴结中病毒载量降低;攻毒后9天病毒遍布所有组织,免疫器官、心脏和肺脏中病毒载量较高,最高达5.9×107copies/g;攻毒后14天病毒载量开始呈下降趋势;攻毒后21天病毒仍存在于除脑、肝脏和胃以外的其他器官中(见图3)。

2.3 对照组攻毒后PRRSV在各组织中的动态分布

对照组攻毒后病毒在免疫器官和心脏中持续存在,攻毒后1天病毒遍布除胃以外的所有器官,免疫器官扁桃体和淋巴结中病毒载量达到高峰,腹股沟淋巴结中病毒载量最高,达2.4×109copies/g;攻毒后5天扁桃体和淋巴结中病毒载量降低,其他组织中病毒载量升高,胃中病毒载量最高,达4.1×109copies/g;攻毒后9,14天除脾脏和胃中病毒载量降低外,其他各组织中病毒载量均明显升高;攻毒后21天病毒载量呈下降趋势(见图4)。

3 讨论与小结

目前,用于预防PRRS的疫苗主要是常规疫苗,即灭活苗和弱毒苗,其在控制PRRS传播和蔓延方面发挥了巨大作用,灭活苗的优点是安全性好,缺点是免疫剂量大、免疫次数多、免疫产生期较长,因而不适合仔猪免疫[3]。弱毒苗虽然具有免疫产生期快等优点,但存在着安全性和毒力返强问题。

试验结果表明,HuN4活疫苗免疫仔猪攻毒后PRRSV在体内各组织的分布、持续时间及载量明显较对照组和JXA1灭活苗组低,表明HuN4活疫苗能够明显抑制病毒在体内的复制,攻毒后1天仅在扁桃体和淋巴结两个免疫器官中检测到病毒且含量较低,表明免疫产生期较快,攻毒前后病毒均主要分布在免疫器官扁桃体、淋巴结和肺脏中,表明扁桃体和淋巴结是产生免疫反应的主要器官。 JXA1灭活苗免疫仔猪攻毒后病毒在各组织中的分布和复制情况与对照组相似,但较对照组病毒载量降低,表明JXA1灭活苗也对病毒复制具有一定的抑制作用,而且JXA1灭活苗组于攻毒前期病毒在各组织的分布和载量一直居高不下,直到攻毒后14天才有降低趋势,表明JXA1灭活苗的免疫产生期较长,但是攻毒前没有检测到病毒,表明JXA1灭活苗安全性好。对照组攻毒后病毒遍布所有组织,且在各组织中持续时间较长,而HuN4活疫苗和JXA1灭活苗免疫仔猪攻毒后脑和胃中没有检测到病毒或持续时间明显减短,表明疫苗免疫后能明显抑制病毒在脑和胃中的复制,各组攻毒后在扁桃体和淋巴结中病毒载量较高,而且病毒在淋巴结中持续存在,表明淋巴结是PRRSV持续性感染的主要位置。

Nilubol D等[4]报道,灭活苗免疫后攻毒不能保护仔猪对PRRSV的感染。 本试验结果表明:HuN4活疫苗免疫仔猪后能够快速激发免疫反应,攻毒后明显抑制病毒在体内的复制;而JXA1灭活苗免疫仔猪攻毒后病毒在体内的复制情况与对照组相似,但较对照组轻,对病毒的复制也具有一定的抑制作用。

摘要：为了更好地了解高致病性PRRSV疫苗的免疫机理,试验应用荧光定量RT-PCR方法比较了PRRSV变异株(HuN4)活疫苗和PRRSV变异株(JXA1)灭活苗免疫仔猪攻毒前后PRRSV在体内动态分布的差异。结果表明:HuN4活疫苗组攻毒后,病毒在各组织中的含量明显低于JXA1灭活苗组和对照组;JXA1灭活苗组攻毒后,病毒在各组织中的分布、载量与对照组相似,但较对照组轻。说明HuN4活疫苗免疫仔猪攻毒后,能明显抑制病毒在各组织中的复制,其免疫效果明显优于JXA1灭活苗。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒,荧光定量RT-PCR,抗原的动态分布

参考文献

[1]SIRINARUMITT,SORDEN S D,MOROZOV I,et al.Double in situ hybridization for simultaneous detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)and porcine circovirus(PCV)[J].J Vet Diagn Invest,2001,13(1):68-71.

[2]韦天超,田志军,安同庆,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒Taq Man-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用[J].中国预防兽医学报,2008,30(12):944-948.

[3]蔡雪辉,李艳华,刘永刚.PRRS疫苗研究进展及PRRS的综合防制[J].畜牧兽医科技信息,2004(4):49-51.

免疫荧光定量法 篇5

1 X射线荧光光谱法概述

现阶段发展起来的X射线荧光光谱分析仪在应用中具有灵敏度高、分析速度快、操作简单、应用范围广以及自动化程度高等优势。在稀土元素定量分析中发挥着重要作用。在稀土元素定量分析中主要的元素有镧、铈, 通过对这两种元素的定量分析, 能够得到试样中稀土元素的含量水平[1]。

2 X射线荧光光谱法在快速半定量分析催化剂中的稀土总量应用分析

(1) 仪器设备以及工作条件本次研究中采用的一期为3070E型号的全自动X射线荧光光谱分析仪, 该仪器是由日本理学公司生产的, 设置管电压为50k V, 管电流为40m A, 同时采用配套的相关设施, 比如:研钵25mm的压片模具以及80吨的手动压片机等。在元素测量过程中的条件如表1所示。

(2) 试验材料以及相关试剂本次研究中的需要的试验材料以及相关试剂主要有氧化镨 (光谱纯) 、氧化镧 (光谱纯) 、氧化铈 (分析纯) 、氧化钐 (优级纯) 、氧化钕 (优级纯) 、无水乙醇 (分析纯) 。混合稀土试样为18.0%的Re2O3, 使用的载体为O-D新鲜剂。

(3) 试验操作步骤试验操作步骤主要有以下几点:

(1) 标准试样的制备以及处理, 采用分析天平对已知含量的混合稀土标样进行称量, 要求称取不同量。称量的稀土试样需要加入到O-D新鲜剂中, 使用研钵研磨, 在充分均匀后, 将其装入压片模具, 在1200MPa压力下使其成为光滑的圆形, 总共制作8种试样, 要求其稀土含量在1.0%~8.0%, 制作完成后保存中干燥器中。 (2) 制作工作曲线, 按照表1中的工作条件, 按照仪器操作顺序实施测量, 得到标样中镧和铈的三次测量强度, 并求取平均值[2]。在计算机中输入平均值以及对应的标样浓度, 使用回归处理程序进行数据处理, 并得到浓度与辐射强度的关系式, 也就是:

式中:Xi为元素i的浓度;Ii为元素i的荧光强度;B、C分别为

校正系数, 经过处理后镧和铈的方程式可分别为:

(4) 系数校正在定量分析中仪器不稳定性以及电源波动都会影响到测量的真实性, 对此需要进行系数校正, 也就是α系数强度的自动校正。将其输入计算机, 在计算中可自行校正。α系数公式可用下式表示:

式中:α为标准化系数;Is为参考强度;Im为标准样品中的测量强度;Ip为待测元素的净强度;Ii为待测元素漂移校正后的强度值。

(5) 试验结果分析按照上述实验操作步骤的要求, 对催化剂中的稀土元素含量水平进行测定, 在测定过程中分别将镧、铈元素作为指示元素。测量结束后, 将实际测量值与参考值进行比较。结果显示, 以铈元素作为指示元素测量的稀土元素其测量结果更加准确, 对此, 在催化剂的稀土总量测量中, 可通过对铈元素含量的测定代表整个催化剂中的稀土总量。

3 结语

在催化剂种稀土元素总量测量过程中采用X射线荧光光谱法测量具有操作简单、结果准确、工作效率高、分析速度快等优势, 测量的结果其进度满足测量要求, 对此, 在化学领域研究中可采用X射线荧光光谱法对催化剂中的稀土总量进行测定, 具有重要的应用价值。

参考文献

[1]杨一青, 张海涛, 王智峰, 等.X射线荧光光谱法在催化剂分析领域的应用进展[J].炼油与化工, 2014, (01) .

免疫荧光定量法 篇6

酶联免疫法定量检测黄曲霉毒素B1采用固相直接竞争性酶联免疫原理, 相比较国家标准而言具有简单、快速、重复性好的特点。微孔中包被有对黄曲霉毒素B1具有高亲和力的抗体。黄曲霉毒素B1酶标物与标准品或样品中的黄曲霉毒素B1竞争结合微孔中包被的抗体。孵育一定时间后, 倾倒微孔中的内容物, 洗涤非特异反应物。随后加入底物试剂, 溶液变为蓝色。颜色强度与黄曲霉毒素B1酶标物的量成正比, 与样品或标准品中黄曲霉毒素B1的浓度成反比。最后加入酸性终止液, 终止反应并将微孔中溶液颜色变为黄色。使用酶标仪在450nm下检测微孔中溶液的OD值。比较样品OD值与试剂盒提供的标准品的OD值, 即可获得检测结果。

2 样品制备

2.1制备提取溶液 (70%甲醇) (以单个待测样品为单位) :向70ml分析纯级甲醇中加入30ml蒸馏水或去离子水。

2.2使用粉碎机将样品粉碎, 使颗粒大小与速溶性良好的咖啡颗粒相同 (50%可通过20目筛) 。

2.3称取20克粉碎后的样品, 加入100ml提取溶液 (70%甲醇) , 用震荡器震荡混合10分钟。注:样品与提取试剂的比值为1:5 (w/v) 。

2.4待颗粒物质沉淀后, 用Whatman1#滤纸 (或等效的) 过滤5-10ml提取物, 收集滤液待测。

3 检测步骤

3.1使用前将所有试剂恢复至室温。

3.2取出相应数量的稀释孔置于微孔架上 (每个标准品或待测品对应一个稀释孔) , 再取出等量包被抗体的微孔置于另一个微孔架上, 向每个稀释孔加入200ul黄曲霉毒素B1酶标物。

3.3向每个稀释孔加入100ul标准品或样品 (每次移取均使用新枪头) , 吸打混匀, 至少吸打3次。

3.4从每个稀释孔中移取100ul混合液, 转移至相应的抗体包被微孔中 (每次均使用新枪头) , 室温孵育15分钟。

3.5孵育完成后, 将微孔中内容物倒入废液缸, 采用蒸馏水或去离子水洗涤微孔, 共洗涤4次。然后拍打微孔板, 去除残留的洗涤液。

根据样品和标准品个数, 向每个微孔中添加100ul底物 (显色剂) , 室温孵育5分钟。

按照与底物相同的添加顺序和速度向每个微孔中添加100ul终止液。

3.8使用酶标仪在450nm下读取并记录每个微孔中的OD值。

4 标准曲线的建立

根据标准品浓度及吸光值建立一个半对数坐标系统, 在标准曲线上一段范围内呈线性。

5 样品的测定

6 结果分析

将样品吸光值袋代入酶标仪特定程序, 可以得出样品1、样品3、样品4、样品5的吸光值大于于标准品浓度4.0 (ng/ml) 的吸光值, 黄曲霉毒素B1含量都小于20ppb, 合格;而样品2、样品6因吸光值小于标准品浓度4.0 (ng/ml) 的吸光值, 黄曲霉毒素B1含量都高于20ppb, 不合格。

样品2、样品6样品制备后的滤液, 分别用70%甲醇水稀释2倍、稀释4倍、稀释8倍后, 重新进行检测, 检测结果如下:

由于样品先经过70%甲醇水5:1稀释, 产品中的黄曲霉毒素B1的浓度应将读取的数据乘以5 (ppb) 。标准品中黄曲霉毒素B1的最高浓度为4.0ng/ml (ppb) , 对应样品中的黄曲霉毒素B1的最高浓度为20ppb, 因此, 如果样品黄曲霉毒素B1浓度高于20ppb, 应用70%甲醇水适当稀释再检测。所得霉变玉米的实际黄曲霉毒素B1的浓度为:19.74×8=157.92ppb;DDGS的实际黄曲霉毒素B1的浓度为:19.16×8=153.28 ppb。两种样品中黄曲霉毒素B1的含量远大于20ppb, 当牛食用这种饲料后, 所产的牛奶黄曲霉毒素M1势必超标。由此可见, 防控好牛奶中黄曲霉毒素M1的关键是把好饲料关, 严格控制好其中的黄曲霉毒素B1含量, 显而易见黄曲霉毒素B1检测的至关重要, 它能从源头杜绝牛奶中黄曲霉毒素M1超标, 保证牛奶质量安全。

参考文献

免疫荧光定量法 篇7

1 抗核抗体简介

从传统定义上看, ANA是一组专门针对细胞核内脱氧核糖核酸 (DNA) 、核糖核酸 (RNA) 、蛋白质、脂类、酶类及这些物质分子复合物的抗体, 其无器官特异性和种属特异性, 大多数属于Ig G类抗体。随着分子生物学、细胞生物学和免疫学等学科的不断发展及免疫荧光技术的日益改进, 目前对ANA的研究已不再仅仅局限于细胞核成分, 其靶抗原的分布已由传统的细胞核拓展到整个细胞, 除细胞核外, 还包括细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期蛋白等。

随着对ANA研究的不断深入, 目前已发现具有明确不同临床意义的ANA 20余种, 形成了初具体系的抗核抗体谱 (antinuclear antibodies, ANAs) , 这些抗体对风湿免疫性疾病如系统性红斑狼疮 (SLE) 、类风湿性关节炎 (RA) 、强直性脊柱炎、多发性硬化症 (MS) 、干燥综合征 (SS) 、皮肌炎及混合性结缔组织病 (MCTD) 等的诊断、鉴别诊断及衡量疗效, 判断预后都具有重要的临床价值[3,4,5]。值得注意的是, 某些非结缔组织病如慢性活动性肝炎、重症肌无力和慢性淋巴性甲状腺炎等也可见ANA阳性, 正常老年人也可出现低滴度的ANA。

2 间接免疫荧光法

IIF是公认进行ANA筛查的首选方法, 多以Hep-2细胞和灵长类动物肝脏如猴肝冰冻切片为抗原底物片。Hep-2细胞即人喉癌上皮细胞, 其核抗原丰富、特异性强、含量高, 核大、细胞结构清晰, 易于判读荧光染色核型结果, 该基质片较鼠肝 (肾) 冰冻切片检测ANA, 阳性率可提高10%~20%[6]。

2.1 荧光染色模型IIF检测ANA, 主要有以下6种常见荧光染色模型 (以Hep-2细胞为基质) :

(1) 核均质型 (homegeneous pattern, H) , 间期细胞核呈均匀的荧光, 分裂期细胞浓缩染色体亦呈均匀的荧光, 荧光更强, 该型的靶抗原主要有ds DNA、ss DNA、核小体和组蛋白。 (2) 核颗粒型 (spekled pattern, S) , 又称核斑点型或核斑块型, 间期细胞核呈颗粒样荧光, 分裂期细胞浓缩染色体阴性, 染色体周围区域为颗粒样荧光, 可细分为核粗颗粒型和核细颗粒型, 其靶抗原主要有n RNP、Sm、SS-A和SS-B。 (3) 核仁型 (nucleolar pattern, N) , 间期细胞核仁阳性, 分裂期细胞染色体阴性, 主要包括抗PM-Scl抗体、抗RNA多聚酶Ⅰ抗体、抗原纤维蛋白抗体和抗Scl-70抗体。 (4) 核膜型 (membranous pattern, M) , 间期细胞核呈均匀的荧光, 核周增强, 此型与抗板层素 (Lamins) 抗体相关。 (5) 着丝点型 (centromere pattern) , 间期细胞大小、数目 (40~60个) 相同的点状荧光均匀的分布于整个细胞核中, 分裂中期细胞的中间位置出现带状的浓缩点状荧光, 此模型对局限型进行性系统性硬化症具有很高的特异性和敏感性。 (6) 胞浆型 (cytoplasmic pattern, C) , 即细胞浆荧光染色阳性, 主要包括抗线粒体抗体 (胞浆粗颗粒型) 、抗核糖体P蛋白抗体 (胞浆细颗粒型, 有时可见核仁阳性) 、抗Jo-1抗体、抗高尔基抗体、抗溶酶体抗体、抗肌动蛋白抗体和抗波形蛋白抗体等。实际工作中, 同一份标本同时检出2种或2种以上荧光染色模型的混合型也比较常见, 此外, 还有一些较少见的荧光染色模型, 如中心粒型、中间体型和纺锤体型等。

2.2 抗体滴度。

应用IIF检测结果应报告抗体滴度, 以便于临床对病情程度进行判断, 其对观察疗效、判断预后也具有重要作用。有时一份血清内含有多种自身抗体, 高滴度的核均质型ANA往往会掩盖其他核型, 此时需用不同稀释度的血清进行检测, 有助于区分所含有的各种荧光染色模型。

3 报告模式

一个合乎规范、能体现所有检测信息的报告单至少应该包括以下要素:检测项目、检测结果 (包括滴度) 、参考范围和检测方法等。笔者推荐的报告模式见表1。

此外, 应用IIF检测ANA, 由于不同的抗体可能会出现相同的荧光染色模型, 也就是说抗体和荧光染色模型并不是一对一的关系, 因此仅根据荧光染色模型特点来推断抗体的特异性往往是比较片面的 (抗着丝点抗体、抗高尔基体抗体及抗中心体抗体等特殊荧光染色模型除外) , 而免疫印迹法则可以准确地鉴定部分靶抗原。因此在ANA的检测中, 强烈建议IIF和IBT联合应用, 以相互补充, 相互佐证, 避免误诊漏诊[7]。

参考文献

[1]郭大文, 张英辉, 单娜, 等.抗核抗体核型与条带免疫抗体谱相关性分析[J].中华实用诊断与治疗杂志, 2012, 26 (6) :560-562.

[2]邢艳, 唐中, 袁国华.抗核抗体的研究进展[J].国外医学·内科学分册, 2006, 33 (5) :218-221.

[3]Egner W.The use of laboratory tests in the diagnosis of SLE[J].J Clin Pathol, 2000, 53 (6) :424-432.

[4]李本忠, 光辉, 陈家东.抗核抗体谱在自身免疫性疾病中的临床应用[J].分子诊断与治疗杂志, 2010, 2 (4) :260-262.

[5]陈永峰, 王晓华.抗核抗体在结缔组织病中的临床意义[J].皮肤性病诊疗学杂志, 2014, 21 (4) :269-271.

[6]汤春园, 陶瑕, 李山.抗核抗体、抗双链DNA抗体研究与实验室检测的进展[J].内科, 2008, 3 (3) :421-423.