高效液相色谱-荧光法

2024-09-02

高效液相色谱-荧光法(共12篇)

高效液相色谱-荧光法 篇1

正二氢愈疮酸(NDGA)又名去甲二氢愈创木酸,是一种酚醛木脂素[1,2,3]。正二氢愈疮酸显示出各种生物活性,包括在体内和体外诱导姐妹染色单体交换[4],能够诱导细胞凋亡[5,6],具有较强药理活性,包括抑制疱疹、抗-HIV、抑制肿瘤、治疗光化性角化病,但后来因出现皮肤过敏病例而被撤出市场[7,8,9,10]。另外,NDGA还具有强的抗氧化活性,常被用作食品防腐剂来保存脂肪和油脂[11,12]。因为它诱发囊性肾病、肝毒性已经被包括美国在内的一些国家禁止使用[13,14],而日本规定正二氢愈疮酸可用于油脂及奶油,最大限量为0.1g/kg[15]。

国内外关于正二氢愈疮酸的报道多是药理学方面的,检测正二氢愈疮酸的检测报道较少,研究报道方法主要有HPLC-DAD[15,16]、HPLC-FLD[17]、LC-MS[18]和毛细管电泳法[19],但大多数报道的方法前处理比较复杂。本文采用了HPLC-FLD对食品中的正二氢愈疮酸进行检测,在优化的前处理和色谱条件下,正二氢愈疮酸能够与样品基质完全分离,该方法简单、稳定,适用于食品中正二氢愈疮酸含量的检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪(包括二元泵,自动进样器,荧光检测器,柱温箱,Chemstation色谱工作站),色谱柱Luna C18(2)(4.6×150 nm,3.0μm),Sartorius BT224S型电子分析天平。

正二氢愈疮酸标准品(纯度97%),甲醇(色谱纯,Tedia公司),乙腈(色谱纯,Tedia公司),抗坏血酸(As A,纯度99.7%,购自上海四赫维化工有限公司),甲酸(分析纯,购自北京化学试剂公司),纯净水(经0.22μm滤膜过滤)。

1.2 实验部分

1.2.1 正二氢愈疮酸标准储备溶液

精密称取正二氢愈疮酸标准品25 mg,用含0.1%As A甲醇溶解并定容至100 m L容量瓶,摇匀,作为储备液。正二氢愈疮酸对照储备液,用含0.1%As A甲醇稀释,制成一系列的标准溶液。

1.2.2 样品处理

精确称取1 g样品于锥形瓶中,加入30 m L含0.1%As A的V(甲醇)∶V(水)=9∶1混合溶剂,密封并称取质量。超声提取15 min,并补足质量,离心10 min,经0.22μm滤膜过滤,滤液供液相色谱分析。

1.2.3 色谱条件

色谱柱:Luna C18(2)(4.6×150 nm,3.0μm),激发波长(λex):280 nm,发射波长(λem):360 nm,柱温:40℃,流速:1.0 m L/min,检测器:荧光检测器(FLD),进样量:10.0μL.流动相:A:0.1%甲酸-乙腈,B:0.1%甲酸水;梯度条件:0~5min,35%A;5~20 min,35%~40%A;20~21min,90%A;30~31 min,90%~35%A。

2 结果与讨论

2.1 正二氢愈疮酸稳定性

正二氢愈疮酸是一种酚类抗氧化剂,结构不稳定,自身容易发生氧化生成苯醌,故正二氢愈疮酸在样品中的含量会随时间的变化发生变化,因此在测定正二氢愈疮酸时需要加入一定量的抗坏血酸(As A)来保持样品的稳定性。图1是同一个加标样品加入抗坏血酸或不加抗坏血酸处理的比较。

从图1可以看出,当样品中加入As A后,NDGA的氧化速度减慢,可在较长时间保持相对稳定。

2.2 检测器和最佳检测波长的确定

测定正二氢愈疮酸的液相色谱方法包括液相色谱荧光检测器方法(HPLC-FLD)和液相色谱紫外检测器方法(HPLC-DAD)。为了能够科学合理的选择实验仪器配置,对这两种方法都进行了考察,首先通过三维扫描的方式确定正二氢愈疮酸紫外和荧光的检测波长,见图2和图3。

采用样品加标的方式,对两种检测方式进行了考察,从图4可以看出,HPLC-DAD相对于HPLC-FLD的选择性较差。本实验选用具有较高选择性的荧光检测器作为正二氢愈疮酸检测的手段。通过荧光光谱扫描,确定荧光检测器检测波长为λex/λem=280/306 nm。

2.2 流动相的确定

当用纯水和纯乙腈作流动相时,正二氢愈疮酸的色谱峰拖尾严重。在流动相中加入少量的酸可消除色谱峰的拖尾现象。当加入甲酸的量为流动相总体积的0.1%时,流动相的pH和正二氢愈疮酸的pKa值接近,故在流动相中各加入0.1%的甲酸来作为抑制剂。

2.3 萃取溶剂环境的选择

通过对乙醇、甲醇和乙腈的比较,发现甲醇的萃取效率高于其它两种有机溶剂,但考虑到食品添加剂中含有多种水溶性的物质,故采用甲醇与水组成的混合萃取溶剂。以加标回收实验的方式,考察了不同萃取溶剂组合的萃取效果。测定结果表明,当V(甲醇)∶V(水)=9∶1时萃取效率最高。

2.4 色谱柱的选择

在同样的色谱条件下,对色谱柱SunfireTMC18(4.6×250 nm,5.0μm)、ZORBAX SB-C18(4.6×250 nm,3.5μm)、Luna C18(4.6×150 nm,3.0μm)进行了比较,通过比较发现:Luna(2)C18(4.6×150 nm,3.0μm)较其他色谱柱对正二氢愈疮酸检测方法而言,具有更好的分离效能,见图5。

2.5 梯度优化结果

在参考了文献[2]的基础上,针对食品样品的特点,采用色谱柱进行了正二氢愈疮酸液相色谱方法梯度优化,获得了1.2.3推荐色谱梯度,采用Luna(2)C183.0μm,4.6×150 mm色谱柱对柱温进行了优化。在液相色谱中,色谱柱应在稳定的温度下工作。分别试验了温度为25℃、30℃、35℃、40℃,发现对样品检测结果影响不大。因此本文用40℃为工作温度,在此工作温度下柱分离较为稳定。

2.6 样品回收率实验

采用标准品溶液对样品进行不同浓度加标实验,按照方法前处理步骤处理样品,最后根据加标回收实验计算其加标回收率,实验结果见表1,加标回收率在92.43%~99.23%之间。

2.7 方法检出限

采用样品加标方式进行方法检出限的实验,加标实验任选一样品作为加标实验本底。

方法检出限实验步骤:首先配置5个浓度加标样品,加标浓度范围:100.4 ng/m L~1255 ng/m L;采用液相色谱仪测定5个浓度加标样品,将其色谱峰高作为纵坐标,相应浓度作为横坐标,制作标准曲线。将最小浓度水平的加标样品进样10次测定,计算检测结果标准偏差(α)。3α数值代入标准曲线计算工作得到方法检出限(ng/m L);正二氢愈疮酸的方法检出限为0.32μg/g。

2.8 精密度

对同一样品进样10次,计算其测定结果的相对标准偏差,正二氢愈疮酸的相对标准偏差为1.1%,结果表明液相色谱测定精密度良好。

2.9 方法重现性

为了考察整个方法的重复性,应用所建立的正二氢愈疮酸检测方法对选用的固体和液体两种类型样品进行加标平行测定,每种类型样品各平行测定10次样品10次平行加标样品测定结果的相对标准偏差均在4.12%以内,说明本方法很稳定,重复性好。

2.10 方法普适性测试

采购了30个食品,采用本方法检测,检测结果表明,检测的所有食品(比如饮料类食品中)均未检出正二氢愈疮酸。

3 结论

研究结果表明,本文所建立的快速检测食品中的禁用氧化剂正二氢愈疮酸的方法操作简便,准确,有效,且实用性较强,能够用于水溶性食品的检测,对保证食品的安全性可发挥重要的作用。

摘要:建立了高效液相色谱荧光法(HPLC-FLD)测定食品中正二氢愈疮酸含量的方法。采用Luna C18(4.6×150 nm,3.0μm)的色谱柱,以0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相,梯度洗脱,流速1.0 mL/min;激发波长为280nm,发射波长为306nm。在优化的前处理和色谱条件下,正二氢愈疮酸能够与样品基质完全分离,且加标回收率范围为92.43%~99.23%。

关键词:正二氢愈疮酸,高效液相色谱法,荧光检测器

高效液相色谱-荧光法 篇2

建立动物肝脏中常见的`10种磺胺类药物(磺胺胍、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺-5-甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲恶唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉)残留量液相色谱同时测定方法.样品通过溶剂提取净化、荧光胺柱前衍生化,用配有荧光检测器的高效液相色谱仪测定,外标法定量.其线性范围分别为2~200μg/L、4~400μg/L、10~1000μg/L,线性相关系数r>0.999;方法检出限(LoD)为2~10μg/kg;其中9种磺胺,在5~100μg/kg的3个添加水平范围内的平均回收率为70.6%~90.2%;相对标准偏差为4.1%~7.6%.

作 者:苏敏 李世雨 许宝香 李晓岩 徐超一 Su Min Li Shiyu Xu Baoxiang Li Xiaoyan Xu Chaoyi 作者单位:苏敏,李世雨,许宝香,李晓岩,Su Min,Li Shiyu,Xu Baoxiang,Li Xiaoyan(新疆出入境检验检疫局,乌鲁木齐,830063)

徐超一,Xu Chaoyi(北京出入境检验检疫局,北京,100026)

高效液相色谱-荧光法 篇3

关键词:氟康唑;高效液相色谱法;血药浓度

中图分类号:R917文献标识码:A文章编号:1673-2197(2007)12-033-03

氟康唑(Fluconazole,FCZ)是新型三唑类抗真菌药物,能特异、有效地抑制真菌的甾醇合成,口服及静脉注射(静注)对各种动物真菌感染,如念珠菌感染、新生隐球菌感染、小孢子菌属感染及毛癣菌属感染均有效。据文献报道,本品口服吸收良好,生物利用度可达静注给药的90%以上。口服1~2h后,一般血药浓度可达峰值,血浆消除半衰期约为30h,血药浓度与剂量成正比。血浆蛋白结合率较低,一般为11%~12%,给药剂量的80%以原型药随尿液排除。患者一般对本药能很好地耐受,常见的副作用有恶心、腹痛、腹泻、胃肠胀气、皮疹等,亦可产生肝酶升高。目前,国内已有多家药厂生产。本研究运用高效液相色谱法(HPLC)对氟康唑血药浓度进行了测定,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与药品

仪器:日本岛津公司LC-10A泵,KromailC18色谱柱(4.6mm×250mm),SiL-10A全自动进样器,SPD-10A型紫外可见分光光度检测器(190~600nm),NC-2000型色谱工作站,TCL-16G高速台式离心机,超声波发生器,YKH-Ⅱ型液体快速混合器(江西医疗器械厂)。试剂:甲醇色谱纯(山东省禹王实业总公司化工厂),其它试剂均为分析纯,水为重蒸馏水,氟康唑对照品由中国药品生物制品检定所提供。内标溶液(0.25mg/mL):精密称取非那西丁适量,加水溶解并稀释成0.25mg/mL,摇匀,置冰箱中冷藏备用,临用时稀释成0.25μg/mL。标准溶液(0.25mg/mL):精密称取氟康唑适量,加水溶解并稀释为0.2mg/mL,摇匀,置冰箱中冷藏备用,临用时稀释成1.0、5.0、25.0、50.0和100.0μg/mL的应用液。 

1.2 血浆中氟康唑HPLC测定法

1.2.1 色谱条件 色谱柱:KromailC18色谱柱(4.6mm×250mm),流动相:0.1mol/L磷酸-磷酸二氢钾缓冲液-甲醇(50∶50,v/v,pH7.0);流速:1.0mL/min;检测波长:210nm;柱温:30℃。检测器灵敏度0.01AUFS,20μL定量环进样。

1.2.2 血浆样品处理方法 精密吸取血浆样品1.0mL置于具塞离心管中,加100μL非那西丁内标溶液(0.25μg/mL),200μL氢氧化铵溶液(1.5mol/L),乙酸乙酯7.0mL,置于YKH-Ⅱ型液体快速混合器中混匀30s,离心5min(4000r/min),分离有机相置于55℃水浴上以氮气吹干,残余物以甲醇100μL溶解,取20μL进样分析。

1.2.3 方法的专属性 将受试者服药前空白血浆、空白血浆加内标和氟康唑标准品及受试者服药后血浆样品同法处理后进样,见谱图1。

1.3 分析方法

1.3.1 血浆标准曲线的绘制 取空白血浆1.0mL5份分置于具塞离心管中,依次加入上述FCZ标准系列溶液100.0μL,按血浆样品处理方法处理后经HPLC测定,以氟康唑峰面积和内标峰面积比(Y)对氟康唑浓度(X)回归分析,方程:Y=0.1769X-0.0449,r=0.9995(n=7),线性范围为:0.3204~20mg/L。

1.3.2 回收率试验 用空白血浆和标准液制成浓度分别为10.0mg/L、2.5mg/L、0.625mg/L的样品各5份,同法操作,进样,氟康唑峰面积为A1,另取相应氟康唑标准液进样,氟康唑的峰面积为A2。按公式:提取回收率(F)=(A1/A2)×100%计算;用空白血浆与标准液制成浓度分别为10.0mg/L、2.5mg/L、0.625mg/L的样品各5份,同法操作,以测得值除以实际浓度值计算方法回收率。测得提取回收率结果分别为(89.2±2.63)%、(91.1±5.03)%、(88.9±2.88)%,方法回收率分别为(97.2±3.13)%、(99.1±2.03)%、(100.9±2.31)%。低、中、高浓度时,提取与方法回收率均符合生物样品分析的要求。

1.3.3 精密度试验 在同一日内,用空白血浆与标准液制成浓度分别为10.0mg/L、2.5mg/L、0.625mg/L的样品各5份,同法操作,计算;同法配制浓度为10.0mg/L、2.5mg/L、0.625mg/L样品,同法测定,连测5d,计算。结果见表1。低、中、高浓度时,该方法的精密度符合生物样品分析的要求。

1.3.4 稳定性试验 用空白血浆与标准液制成浓度分别为5.0mg/L-1、2.5mg/L-1、0.625mg/L-1的样品,于室温(25℃)放置8h后,同法操作,计算;于-40℃冰箱中冷冻24h后,取出完全融化,反复冻融3次(3d)后,同法操作,计算;于-40℃冰箱中放置7、14、21、28、35d后,同法测定,计算。本试验样品稳定性符合生物样本分析过程要求。结果见表2。

2 讨论

本试验采用高效液相色谱法,用醋酸乙酯提取血浆中氟康唑,快速混合1min,一次提取,能有效提取氟康唑并减少了其它物质的干扰,提取回收率高,基线平稳,杂质峰少,分析时间缩短。试验中发现,适当增加非那西丁的用量,可以使内标色谱峰面积加大,结果更准确,更有利于分析。检测波长为260nm时,对浓度为0.3125mg/L的样品测定,灵敏度达不到分析要求。将同一样品在不同波长(260nm,210nm)处进行测定,可知,血浆样品在260nm时,样品峰很小,积分困难;而在210nm处样品峰很大,容易积分。光谱图扫描亦可知,样品在260nm处吸收很不明显,而在210nm处有明显吸收。经过多次试验,选择甲醇-磷酸盐缓冲液(50∶50,v/v)作为流动相,检测波长选择在210nm处,一改以往文献中采用乙腈-磷酸为流动相、检测波长在260nm附近的色谱条件。在本试验色谱条件下,能很好地分离内标、氟康唑及内源性杂质,峰形良好,且缩短了分析时间。

综上所述,本实验所用的测定氟康唑血药浓度的方法与GC、HPLC及其它生物学方法相比,大为优化,完全能满足人体药动学及生物等效研究的要求,可以作为此方面研究的可靠分析方法。

参考文献:

[1] 白林,张志萍,陈秀兰.高效液相色谱法测定氟康唑血药浓度[J].药物分析杂志,1994,14(2):22.

[2] 孙春华,刘蕾,刘风琴.国产氟康唑片在人体生物利用度研究[J].中国临床药理学杂志,1998,14(3):161.

[3] 岗艳云,伍斌,许向阳.人体内氟康唑的药代动力学及其生物利用度[J].中国临床药理学杂志,1999,15(1):29.

[4] Hosotsubo K K,Hosotsubo H,Iishijima M K.Rapid determination of serum levels of a new antifungal agent,fluconazole,by high performance liquid chromatography[J].Chromatogr ,1990 (52):223.

高效液相色谱-荧光法 篇4

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究所有资料来源于郑州市妇幼保健院2010年1月-2012年7月期间检验科, 空腹静脉采血时间均在上午7∶30-10∶00, 按照实验室操作规范待血清自然析出后行离心分离, 然后在-30℃冰箱中保存待测。将21例经实验室确诊的PKU新生儿作为观察组, 其中男12例, 女9例;出生3~28 d, 平均 (16.4±4.5) d。选择同期22例健康新生儿作为对照组, 其中男12例, 女10例;出生3~28 d, 平均 (16.5±4.5) d。组间性别和出生时间比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 测定设备、试剂和方法

所有新生儿均采用高效液相色谱-荧光检测法测定Phe和Tye浓度, 并计算Phe/Tye比值。高效液相色谱仪及其附件由安捷伦公司提供;实验用水为超纯水, 经美国Millipore公司Milli-Q纯水器处理;苯丙氨酸和酪氨酸标准品由美国Sigma公司提供;其他试剂为常规实验室优级纯或分析纯。测定方法参考蒋姣伏等[2]研究, 按照实验室规范进行操作, 色谱柱为Hypersil C8注, 流动相为100:900体积比的乙腈-水, 流速1 ml/min, 荧光波长303 nm, 激发波长210 nm。苯丙氨酸批内CV为4.08%, 批间CV为7.11%, 线性范围12.21~1220.03μmol/L, 最低检测限3.00μmol/L, 平均回收率102.52%;酪氨酸批内CV为2.98%, 批间CV为5.24%, 线性范围5.52~550.11μmol/L, 平均回收率102.19%, 最低检测限0.82μmol/L。

1.3 计算方法

血清苯丙氨酸 (酪氨酸) =苯丙氨酸 (酪氨酸) 峰面积×标准液中苯丙氨酸 (酪氨酸) 浓度÷标准液中苯丙氨酸 (酪氨酸) 峰面积。

1.4 统计学处理

所有数据采用SPSS 19.0统计软件包进行分析, 计量资料以表示, 采取t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

两组新生儿Phe浓度、Tye浓度及Phe/Tye比值比较见表1。

μmol/L

*与对照组比较, P<0.01

3 讨论

作为人体不能自身合成的必须氨基酸和芳香族氨基酸之一, 苯丙氨酸具有非常显著的生理活性, 在机体内可被辅酶四氢生物蝶呤不可逆地转化为酪氨酸, 再经酪氨酸途径代谢为肾上腺素和黑色素, 最终经转氨基生成少量苯丙氨酸。当机体内辅酶四氢生物蝶呤合成缺陷或编码聚羟基脂肪酸酯途径的基因发生改变时, 酪氨酸羟化生成系统被破坏, 降低或消失了聚羟基脂肪酸酯活性, 肾上腺素和黑色素未能正常代谢而大量蓄积, 从而增多了苯丙酮酸的生成, 如果经实验室检测发现血和尿中出血高浓度苯丙酮酸, 则严重影响婴儿的智力发育, 表现为PKU。现代研究证实, 大量苯丙氨酸能够抑制神经元突触的形成和其他氨基酸进入大脑, 从而影响大脑的发育, 同时苯丙氨酸循旁路途径代谢为苯丙酮酸随尿液排出, 表现为苯丙酮酸尿症[3]。因此, 科学测定正常幼儿血清苯丙氨酸、酪氨酸水平及比值对诊断和鉴别PKU尤为重要。

目前实验室检测的方法较多, 主要有细菌抑制法、高效液相色谱法或荧光法等, 其中细菌抑制法由于操作简便和成本低等因素适用于大规模检测Phe浓度, 但半定量的检测耗时较长, 检测结果容易受血清标本中抗生素影响较大;单纯荧光法测定血清Phe浓度定量优势明显, 在自动化处理系统下灵敏度和精确度等方面优于细菌抑制法, 但检测时间在4h左右, 同时荧光试纸空白校正非特异荧光能够提高精确度, 当不同厂家试剂盒和仪器检测值差距较大, 参考价值有效;高效液相色谱法对仪器和检验人员要求较高, 不仅可以同时定量检测Phe浓度和Tye浓度, 而且具有快速、高效和灵敏度高等特点, 是早期诊断和预防PKU的有效方法之一。高效液相色谱-荧光检测法能够同时检测Phe浓度和Tye浓度, 在短时间内经色谱柱分离后用荧光检测器在选定激发和发射波长完成检测, 临床检测和诊断更加简便、快捷和准确。本研究观察组Phe浓度、Phe/Tye比值明显低于对照组 (P<0.01) ;观察组Tye浓度明显高于对照组 (P<0.01) , 与包日新等[4]研究基本一致。通过高效液相色谱-荧光检测法能够快速、准确测定新生儿Phe和Tye浓度, 在PKU的早期诊断、鉴别、评估疗效和评价预后等方面具有非常重要的意义。

摘要:目的:探讨高效液相色谱-荧光法测定新生儿血清Phe和Tye浓度在筛查新生儿苯丙酮尿症 (PKU) 的价值。方法:回顾21例确诊PKU新生儿的实验室资料作为观察组, 选择同期22例健康新生儿作为对照组, 全部采用高效液相色谱-荧光法测定Phe和Tye浓度, 并计算Phe/Tye比值, 分析测定对筛查新生儿PKU的价值。结果:观察组Phe浓度、Phe/Tye比值明显低对照组 (P<0.01) ;观察组Tye浓度明显高于对照组 (P<0.01) 。结论:通过高效液相色谱-荧光检测法能够快速、准确测定新生儿Phe和Tye浓度, 在PKU的早期诊断、鉴别、评估疗效和评价预后等方面具有非常重要的意义。

关键词:幼儿血清,血清苯丙氨酸,血清酪氨酸,苯丙酮尿症

参考文献

[1]李影林.中华医学检验全书 (上卷) [M].北京:人民卫生出版社, 1996:672.

[2]蒋姣伏, 唐爱国, 洪敏.正常幼儿血清苯丙氨酸、酪氨酸水平及比值测定[J].中国现代医学杂志, 2004, 14 (12) :95-96.

[3]杨志峰.苯丙酮尿症的临床研究进展[J].中国现代医药杂志, 2012, 14 (2) :131-132.

高效液相色谱-荧光法 篇5

高效液相色谱法测定糠醛废水中的糠醛含量

采用HPLC方法,以Symmetry 5 μm C18(3.9 mm×150 mm)为色谱柱,在流动相V(甲醇)∶V(水)=70∶30,流速1.0 mL/min下,采用双波长紫外检测器,利用外标法在275 nm下测定糠醛废水中糠醛的含量.此法相对标准偏差RSD<4.84%(n=6),r=0.999 9,实际样品的平均加标回收率为96.9%~112.5%.

作 者:康春莉 唐晓剑 于宏兵 林学钰 Kang Chunli Tang Xiaojian Yu Hongbing Lin Xueyu  作者单位:吉林大学环境与资源学院,吉林,长春,130012 刊 名:工业水处理  ISTIC PKU英文刊名:INDUSTRIAL WATER TREATMENT 年,卷(期):2007 27(6) 分类号:O657.7 关键词:糠醛   高效液相色谱   废水处理  

高效液相色谱-荧光法 篇6

关键词高效液相色谱;药物分析;应用

中图分类号R917文献标识码B文章编号2075-2156(2009)04-0107-01

高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”等,是一种高压、高效、高灵敏度、应用范围广、分析速度快的分离分析技术,广泛应用于医学、药学、化学、生化、工业、农业、环保、商检和法检等科学领域。高效液相色谱法适用于挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化合物等的定性、定量分析。在中国药典中主要用于药物的含量测定、有关物质检查和鉴别等。

1 高效液相色谱法在药物含量测定中的应用

天然药物的来源有动物、植物和矿物之分。由于化学成分复杂,有效成分可能有一个,也可以有多个,因此精确测定各有效成分的含量对药品质量控制,建立质量标准具有重要的意义。高效液相色谱法可对天然药物的成分进行分离鉴定,并测定有效成分的含量。葛根素是粉葛药材中的主要活性成分之一,具有扩张冠状动脉、降低血压、减少心肌耗氧量、抗心率失常、降血糖、降血脂、抗动脉硬化、改善微循环、抗肿瘤等多种药理作用。刘宁等采用HPLC法测定四川粉葛中葛根素的含量,结果显示该方法简便易行,结果准确,可用于四川粉葛药材的质量控制。中药复方制剂和化学复合制剂通常含有多种有效成分,各有效成份的含量决定了药物的治疗效果。高效液相色谱法适合分子量较大、难气化、对热敏感的等物质的分离分析,因此在中药复方制剂和化学复合制剂的分析中得到广泛的应用。秦丽惠等采用高效液相色谱法测定了金麦胶囊中绿原酸含量,结果显示该方法测定样品分离度佳,灵敏度高,操作简便,结果准确可靠。

2HPLC在药物鉴别中的应用

中药材是加工中药饮片和生产中成药的原料药,其品种的真伪、质量的优劣直接影响到临床用药的安全有效。中药鉴别是一切重要生产,应用,研究至关重要的第一步。在平时的监督检查中发现许多中药材伪劣品、混淆品出现的频率较高,伪劣品、混淆品与正品药物存在外观相似,但来源不同、性状和功效差异较大,价格相差往往也很大。根据对象的不同,常不能仅从形态上鉴别。而在HPL C法中,因保留时间与组分的结构和性质有关,是定性的参数,可用于药物的鉴别,在中国药典中就有大量的药物采用此法进行鉴别。随着高效液相色谱技术的发展和在药典中的重要性不断提高,出现了一些采用高效液相色谱法鉴别药物的新方法。例如,岗梅等7种冬青属中草药、18种石斛类生药、南北五味子、蜂胶的鉴别。通过对样品各有效成分的组分和含量的测定,从根本上鉴定药物真伪优劣,确定有效性,这无疑为进一步完善、开发药物鉴别的方法提供了一种新的思路。

3HPLC在添加违禁药物检查中的应用

近年来,食品,药品,保健品以及动物饲料等各方面频频出现非法添加违禁药物的事件。一些药品和保健品为了让消费者服用后产生显著效果,居然也在其中非法添加不允许的西药成分,这类成分往往对患者造成病情不受控制,药物中毒等不良反应,严重者甚至威胁到患者生命。对这类非法添加违禁药物的治理与打击,很大程度上依赖于分析检测方法的效能。高效液相色谱法在对添加违禁药物的日常检验工作中,正发挥着越来越重要的作用,为打击药品造假和保障人民用药安全、有效。提供了有力的技术支持。例如,饲料中三聚氰胺的含量测定,降糖类中成药和保健品中是否非法添加降糖成分鉴定。通过HPLC分离样品,用极管阵列检测器检测,可基本确定样品中是否含有某一化学成分,有条件者更可以再采用HPLC-MS联用等手段深入分析,可进一步确保结果的准确无误。在以后的检测工作中有针对性的进行检测,就可以更快更准地发现非法添加物质,为监管部门提供技术支持,为人们的身体健康提供更有效的保证。

高效液相色谱-荧光法 篇7

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

HPLC-1260液相色谱仪(美国安捷伦公司),固相萃取仪(美国Supelco公司),固相萃取柱(美国安捷伦公司),高速离心机(中国湘仪离心机有限公司),涡旋混匀器(美国Scientific Industries公司),食品粉碎机(中国欧科电器公司)。草甘膦标准溶液:100μg/ml,购自于农业部环境保护科研监测所。甲醇(色谱纯,德国Merck公司);0.25μm水系滤膜(天津东康科技有限公司);实验室用水为Millipore超纯水。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

草甘膦标准溶液:准确移取100μl的草甘膦农药标准品,用纯水做溶剂,配制成10μg/ml储备液,-20℃保存。使用时根据草甘膦对应响应值,吸取适量储备液,用甲醇配制成浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 ng/ml的系列标准溶液,供高效液相色谱测定。FMOC-Cl丙酮溶液(1.0 g/L):称取100 mg FMOC-Cl用丙酮溶解并定容至100 ml,临用现配。5%硼酸盐缓冲溶液(p H=9):称取5 g硼酸钠,用水溶解并定容至100 ml,于4℃下保存。

1.2.2 样品处理

①试样制备:采集市场有代表性的6种茶叶样品,取可食部分,经缩分后,切碎,充分混匀后放入食品粉碎机粉碎,制成待测样品。分装后置于-20℃下保存,待提取。②提取:称取25 g(精确到0.01 g)捣碎的茶叶样品,加入50 ml纯水,高速匀浆2 min。试样转移至具塞离心管中,5 000 r/min离心10 min(离心半径5 cm),收集上清液,待衍生。③衍生化:取茶叶提取液1 ml于进样瓶中,加入200μl硼酸钠溶液,混匀,加入200μl FMOC-Cl衍生液,混匀,室温放置2 h。将C18固相萃取小柱分别用3 ml甲醇和3 ml水活化。将样液过活化后的C18固相萃取小柱,常压下收集初滤液,用1 ml甲醇-水(70∶30,体积分数)溶液洗脱,洗脱液与初滤液合并,过0.25μm滤膜,待分析。标准系列处理方法同上。

1.2.3 色谱参考条件

(1)色谱柱:分析柱,C18,4.6 mm×25 cm,5μm;预柱,C18预柱,4.6 mm×4.5 cm。(2)柱温:35℃。(3)荧光检测器,激发波长265 nm;发射波长315 nm。(4)流动相:甲醇-水(70+30)。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

2.1.1 流动相的选择

本实验以甲醇-水为流动相,以甲醇与水混合溶液的体积比(分别为70∶30、50∶50、40∶60)为条件进行测试,甲醇比例较低时,保留时间延长,灵敏度降低,结果表明甲醇-水体积比为70∶30时,样品的出峰时间、峰形、灵敏度较适宜。另外,实验中采用乙酸铵-甲醇作为流动相进行测试,结果发现乙酸铵-甲醇流动相分离效果不如相同比例的甲醇-水。

2.1.2 柱温的选择

研究中固定其他色谱条件,将色谱柱温度从20升至40℃,结果显示草甘膦保留时间逐渐提前,为有效确证柱效及色谱柱使用寿命,方法采取柱温35℃。

2.1.3 检测波长选择

取草甘膦标准使用液在1.2.3条件下进样,分别采取多发射和多激发模式在波长200~900 nm范围内对草甘膦进行扫描,结果发现草甘膦分别在激发波长265 nm(图1)和发射波长315 nm处最强(图2)。故方法选定320 nm为发射波长,285 nm为激发波长。

2.2 衍生条件的优化

实验中分别配制质量浓度为1、5、10、15、20、25 g/L的FMOC-Cl丙酮溶液和质量浓度为10、20、30、40、50 g/L的硼酸钠缓冲溶液,对二者对草甘膦的衍生效果影响进行试验。结果表明,当FMOC-Cl丙酮溶液质量浓度为20 g/L和硼酸钠缓冲溶液质量浓度为50 g/L时衍生效果最好。在20 g/L FMOC-Cl丙酮溶液和50 g/L硼酸钠缓冲溶液浓度下,对草甘膦分别进行1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0、15.0 h衍生试验,结果发现在衍生时间为2 h时,衍生反应达到平衡。

2.3 固相萃取条件优化

实验根据文献方法采用C18固相萃取柱[22],对影响萃取的主要条件是洗脱条件进行研究。分别采用甲醇-水(90+10,体积分数)、甲醇-水(70+30,体积分数)和甲醇-水(50+50,体积分数)进行洗脱,结果证明采用甲醇-水(70+30,体积分数)可以较好地洗脱目标化合物,同时避免衍生副产物干扰。固相萃取过程中发现初滤液含有较多目标化合物,故实验中需收集初滤液。经固相萃取后两者色谱峰实现较好的分离(图3),避免了未萃取时两峰重叠现象(图4)。

2.4 线性范围及检出限

草甘膦储备液用水稀释配制成1.0μg/ml的标准溶液,配制草甘膦标准工作液系列,按方法的实验条件进样,在上述色谱条件下测定,以峰面积(A)对待测物浓度(X,ng/ml)进行线性回归。结果表明在0.5~20.0 ng/ml的标准溶液浓度范围内,草甘膦浓度与响应值有良好的线性关系(图5),其回归方程为:Y=1.005X-0.032 8;相关系数:r=0.999 7。根据色谱响应值S/N≥3标准计算,草甘膦最低检出浓度为0.02 mg/kg。

2.5 方法的回收率与精密度

精密称取阴性茶叶样品进行低浓度的加标回收试验,结果见表1。该阴性样品中加标1.00、2.00、5.00μg/kg,回收率在89.4%~98.9%之间,RSD在4.26%~13.63%之间。

注:以草甘膦标准溶液10.0μg/ml,连续进样6次,每次10μl,测得草甘膦平均峰面积为10.26,RSD为0.108%。

2.6 茶叶监测应用

用本方法对采自本市茶叶专卖店及超市等不同地方的共12份样本进行了检测,结果显示全部样品草甘膦含量均低于检出限。

3 结论

本研究建立了柱前衍生-固相萃取-高效液相色谱法测定茶叶中草甘膦。通过一系列的衍生条件优化得知:该方法操作简单,衍生反应时间短,灵敏度高,而且衍生产物稳定,反应重复性好,HPLC色谱分离条件简单,适用于基层单位开展草甘膦的监测分析。

作者声明

本文无实际或潜在的利益冲突

摘要:目的 建立快速、准确的茶叶中草甘膦的柱前衍生-固相萃取-高效液相色谱荧光测定方法。方法 茶叶提取液样经衍生后经固相萃取,在C_(18)色谱柱上,以甲醇/水(70+30,体积分数)为流动相,流速1.0 ml/min,荧光检测激发波长为265 nm,发射波长为315 nm。结果 草甘膦的加标回收率在89.4%~98.9%之间,其相对标准偏差在4.26%~13.63%之间,在0.5~20.0 ng/ml范围内呈现良好的线性,其回归系数>0.999,最低定量检出限(LOQ)为0.02 mg/kg。结论 该方法回收率高,净化效果好,杂质干扰少,可满足茶叶中痕量草甘膦的残留检测要求。

高效液相色谱-荧光法 篇8

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪(自动进样系统)、美国Supelco公司固相萃取仪(USA SUPELCO SPE),紫外检测器,安捷伦Bond Elut C18固相萃取小柱(100 mg,1mL),YOKO-XR薄层加热器,CAMAG双波长紫外观察箱,Camag Nanomat4点样仪,HX-02B薄层显色用的加热板,真空干燥箱,旋转蒸发仪,KQ5200DA超声仪,水浴锅,Sartorius BT125D电子天平。

1.2 材料

紫丁香苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号:11574-201501,供含量测定用);甲醇(色谱纯);水为超纯水;其余试剂均为分析纯;舒肝快胃丸(陕西辰济药业有限公司,国药准字Z20155396,规格:200丸/瓶,批号:2015010101、2015010102、2015010103)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Bond Elut C18柱(5μm,4.6 mm×150 mm,Sigmar公司);流动相:甲醇-水-冰醋酸(82:18:0.1);流速:1.0 mL/min;荧光检测波长:294 nm。理论塔板数以紫丁香苷计算应不低于3000。

2.2 对照品储备液的配制

精密称取紫丁香苷对照品5.00 mg,用流动相定容于50 mL量瓶中,使成100μg/mL的对照品储备液,置于-4℃冰箱保存。

2.3 供试品储备液的配制

取本品适量,研细,精密称取1.014 g,置20 mL量瓶中,加入甲醇超声处理10 min(功率100 W,频率50 kHz),放冷,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.5μm)滤过,取续滤液即为供试品溶液。

2.4 阴性样品溶液的制备

按处方制备缺丁香的样品,研细,精密称取1.014 g,置20mL量瓶中,加入甲醇超声处理10 min(功率100 w,频率50 kHz),放冷,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.5μm)滤过,取续滤液制备成阴性样品溶液。

2.5 系统适用性试验

取对照品、供试品和阴性样品溶液,按“2.1”项下色谱条件测定,结果阴性样品在紫丁香苷对照品出峰处未出现色谱峰,表明阴性样品对紫丁香苷的测定无干扰。具体色谱图见图1。

2.6 线性关系考察

精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、2.0 mL,分别置于10 mL量瓶中,加10 mL/L盐酸甲醇稀释至刻度,摇匀,即得系列对照品溶液。在上述色谱条件下分别吸取10μL进样测定,以进样量为横坐标(X,g),峰面积为纵坐标(Y),进行线性回归,得回归方程:Y=3800X-0.7300(r=0.9998)。结果提示,紫丁香苷在0.026~0.750 g范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.7 精密度试验

取对照品溶液(浓度为0.090 mg/10 mL),连续进样5次,10μL/次,测定紫丁香苷的峰面积,结果见表1,提示该方法有较高的精密度。

2.8 重复性试验

取样品5份(批号:2015010101),研细,精密称取1.014 g,置20 mL量瓶中,加入甲醇超声(功率100 W,频率50 kHz)处理10 min,放冷,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.5μm)滤过,测定其含量,结果见表2,提示该方法重复性较强。

2.9 稳定性试验

取样品6份(批号:2015010101)0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、2.0 mL,分别置于20 mL量瓶中,加入甲醇超声(功率100 w,频率50 kHz)处理10 min,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.5μm)滤过,每个浓度共做2份,1份室温放置,1份于-20℃下保存备用。取室温浓度质控样品分别于制备后0、2、4、6、8 h后进行样品分析,计算血药浓度及RSD值,结果显示,紫丁香苷RSD分别为2.03%、2.11%、1.24%,提示样品溶液室温放置8 h稳定性良好;取-20℃下保存液样品,解冻后再冷却,进行数据分析,测定5 d内血液样品的浓度及RSD值,结果显示,紫丁香苷RSD分别为2.23%、2.20%、2.67%,提示样品溶液在-20℃下放置5 d内基本稳定。

2.1 0 加样回收试验

精密称取样品0.5 g,共9份,置25 mL容量瓶中,分别精密吸取1 mL浓度为0.5 mg/mL的紫丁香苷对照品溶液,转移至25 mL量瓶中,测定紫丁香苷,计算加样回收率。分别精密加入新鲜配制的0.5005 mg/mL紫丁香苷对照品溶液1.5、1.5、1.5、2.0、2.0、2.0、2.5、2.5、2.5 mL,加入甲醇适量,超声(功率400 W,频率50 kHz)处理30 min,放冷,加甲醇稀释至刻度,摇匀,按“2.1”项下的色谱条件进行含量测定并计算回收率,结果见表3。

2.11样品含量测定

对3批药材样品(批号:2015010101、2015010102、2015010103)进行紫丁香苷含量测定,结果见表4。

3 讨论

凡由于脾胃受损、气血不调所引起胃痛难耐胃脘部疼痛的病证,均可称之为胃脘痛。《素问·六元正纪大论》曰:“民病胃脘当心而痛。”《医学正传》说:“古方九种心痛……详其所由,皆在胃脘,而实不在于心”。导致胃痛原因常见的有寒邪客胃、肝气犯胃、饮食伤胃、脾胃虚弱等。若寒邪客于胃中,寒凝不散,阻滞气机,可致胃气不和而疼痛;肝对脾胃有疏泄作用,恼怒抑郁,气郁伤肝,肝失条达,横逆犯胃,均可引发胃痛的发生,若劳倦内伤,久病脾胃虚弱,或禀赋不足,中阳亏虚,胃失温养,内寒滋生,中焦虚寒而痛;当过食肥甘,食滞不化,气机受阻或饥饱无度,饮食不节,胃失和降可导致胃痛;另气郁日久,气滞血瘀,瘀血内结,中焦气机受阻,而致胃痛发作。可见,胃痛发生的病机有虚实两端之意,实证为气机阻滞,不通则痛;虚证为胃腑失于温煦或濡养,失养则痛。

临床上舒肝快胃丸药理作用主要有促进胃排空,抑制胃酸分泌,加快肠道运动,缓解疼痛等,其是由香附(醋制)、丁香、白芍、佛手、木香、郁金、白术(炒)、陈皮、柴胡、广藿香、炙甘草、莱菔子、槟榔(炒焦)、乌药等研制而成的中药制剂,辅料为蜂蜜。舒肝快胃丸可发挥各种中药之功效,功能主治舒肝解郁、和胃止痛。常用于两胁胀满,食欲不振,呃逆呕吐,胃脘疼痛,大便失调。其主要成分之一丁香中的紫丁香苷是一种强效抗肝毒药物,其恢复微粒体酶系统的酶活性及抑制脂质过氧化作用可以促进肝毒物代谢并改善肝功能使之正常化,并兼有止血功效。目前关于丁香中主要成分紫丁香苷的测定报道较少。为建立一种快速、灵敏的紫丁香苷的测定方法,本研究考察了诸多文献报道[11,12,13,14,15,16,17,18],选取C18柱固相萃取方法,比较甲醇、乙腈等多种溶剂对样品杂质的洗脱情况,最终发现经一定比例的甲醇和缓冲液洗脱,既能有效除去杂质[19,20,21,22,23,24],又能保证紫丁香苷的高回收率,所得色谱图分离完全,无测定干扰,不仅操作简便,而且重现性较好。

3.1 流动相的选择

本研究考察了不同浓度的甲醇-水-冰醋酸溶液,发现有机相的种类、浓度对舒肝快胃丸中紫丁香苷出峰时间的影响较大,且冰醋酸可消除色谱峰拖尾现象[25,26,27,28,29]。最后选定甲醇-水-冰醋酸(82:18:0.1)为流动相,紫丁香苷的峰形较好,保留时间适宜,与其他杂质峰达到基线分离,效果较为理想。

3.2 提取方法的选择

采用超声提取法,分别以不同提取时间(10、20、30 min)提取后,进行测定,结果显示,超声处理10、20、30 min的提取结果差异不显著,为保证提取效率,故采用超声(功率100 w,频率50 kHz)处理10 min为提取方法,分别以甲醇、水、10 mL/L盐酸甲醇作为提取溶媒,超声提取10 min后进行比较。结果显示,以水为溶媒的提取结果略高于其他溶媒,但是用水作溶媒时,由于极性增大,杂峰较多,紫丁香苷的峰形较差[30,31,32];而以甲醇作溶媒时基线较为平稳,色谱峰对称[11,12,29,31,32,33],故选择甲醇超声提取10 min。

综上所述,本文建立的高效液相色谱-荧光联合检测法灵敏度高,能快速、准确地测定舒肝快胃丸中紫丁香苷浓度,并通过阴性辅料干扰试验和一系列破坏性试验证明,该方法的专属性强,耐用性好,且可控制舒肝快胃丸的质量。

摘要:目的 探讨高效液相色谱-荧光联合测定舒肝快胃丸中紫丁香苷的含量方法的可行性。方法 采用高效液相色谱-荧光联合测定舒肝快胃丸中紫丁香苷的含量,Agilent 1200高效液相色谱仪Bond Elut C18柱(5μm,4.6 mm×150 mm),流动相:甲醇-水-冰醋酸(82:18:0.1);流速:1.0 mL/min;荧光检测波长:294 nm。结果 线性关系考察中,以进样量为横坐标(X,g),峰面积为纵坐标(Y),进行线性回归,得回归方程:Y=3800X-0.7300(r=0.9998)。紫丁香苷在0.0260.750 g范围内与峰面积呈良好的线性关系。对3批药材样品中紫丁香苷的含量进行测定,结果紫丁香苷的平均含量为1.113 mg/g,RSD为0.53%。结论 本研究建立的高效液相色谱-荧光联合检测法灵敏度高,能快速、准确地测定舒肝快胃丸中紫丁香苷浓度,方法可行。

高效液相色谱-荧光法 篇9

对苹果、番茄、水稻、马铃薯和棉花等多种作物的炭疽病、霜霉病及白粉病等病害具有较好的防效[2]。其主要作用机理是妨碍病原真菌的呼吸过程。目前有关克菌丹多种色谱分析法的比较尚未见报道。本文采用气相色谱法和高效液相色谱法, 分别对有效成分进行分析和定量, 结果都满足农药分析方法验证的要求, 都适用于克菌丹原药及其制剂的分析。两种方法各具特点, 因此在检测时可根据实际情况进行选择。

1 实验部分

1.1 气相色谱分析法

1.1.1 材料与试剂

甲苯:色谱纯 (CNW) ;克菌丹标样 (纯度98.5%±1.0%, 德国Dr.Ehrensorfer公司) ;50%克菌丹可湿性粉剂试样。

1.1.2 仪器与设备

分析天平:梅特勒-托利多XP205;气相色谱仪:Thermo Trace 1310GC-ECD;检测器:ECD;亲水PTFE针式过滤器:滤膜孔径为0.22μm。

1.1.3 气相色谱操作条件

色谱柱:1701 (规格:30m×0.25mm×0.25μm) ;进样口温度:250°C;进样模式:不分流 (衬管去掉玻璃棉) ;恒流:1.5m L/min;ECD检测器温度:280°C;升温程序:80°C保持1min, 以30°C/min升至260°C保持5min;流速:1.5m L/min;进样体积:1.0μL;保留时间:9.147min;气相色谱图详见图1。

1.1.4 实验溶液配制

称取克菌丹标样0.02g (精确至0.0001g) , 置于100m L容量瓶中, 用甲苯溶解并定容至标线, 摇匀, 即为标样溶液。

称取50%克菌丹可湿性粉剂试样0.02g (精确至0.0001g) , 置于100m L容量瓶中, 用甲苯定容至标线, 摇匀, 即为试样溶液。

1.2 液相色谱分析法

1.2.1 材料与试剂

水:超纯水;甲醇:色谱纯 (CNW) ;磷酸:色谱纯 (CNW) ;克菌丹标样 (纯度98.5%±1.0%, 德国Dr.Ehrensorfer公司) ;50%克菌丹可湿性粉剂试样。

1.2.2 仪器与设备

分析天平:梅特勒-托利多XP205;高效液相色谱仪:Thermo Ulti Mate 3000;检测器:紫外检测器 (UV) ;亲水PTFE针式过滤器:滤膜孔径为0.22μm。

1.2.3 液相色谱操作条件

色谱柱:ZORBAX Eclipse Plus C18 (规格:4.6×100mm, 粒径:3.5μm) ;流动相:0.1%磷酸溶液:甲醇=40.0:60.0 (V:V) ;流速:0.800m L/min;检测波长:220nm;柱温:30.0℃;进样体积:10μL;保留时间:约3.25min;高效液相色谱图详见图2。

1.2.4 实验溶液配制

称取克菌丹标样0.02g (精确至0.0001g) , 置于100m L容量瓶中, 用甲醇溶解并定容至标线, 摇匀, 即为标样溶液。

称取50%克菌丹可湿性粉剂试样0.02g (精确至0.0001g) , 置于100m L容量瓶中, 用甲醇定容至标线, 摇匀, 即为试样溶液。

2 结果与讨论

2.1 气相色谱分析法

2.1.1 分析方法的线性相关测定

配制克菌丹浓度均为0.00200mg/L、0.00500mg/L、0.0100mg/L、0.0500mg/L、0.100mg/L的一系列标样溶液, 在上述操作条件下进行测定, 以标样溶液浓度为横坐标, 以峰面积的值为纵坐标, 建立坐标系进行线性分析, 克菌丹的线性方程:Y=5.87195X+0.00395, 相关系数r:0.9999 (详见图3) 。

2.1.2 分析方法的精密度试验

对浓度为0.100mg/L的标样进行6次重复测定, 在0.100mg/L浓度下, 克菌丹的标准偏差为0.00555, 相对标准偏差为0.874%。

2.1.3 分析方法的准确度试验

于空白样品中分别加入不同浓度的克菌丹标准品, 按照本文的方法和操作条件进行重复测定, 测得克菌丹回收率为84.4%~92.8%。

2.2 液相色谱分析法

2.2.1 分析方法的线性相关测定

配制克菌丹浓度均为0.500mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L、5.00mg/L、10.0mg/L的一系列标样溶液, 在上述操作条件下进行测定, 以标样溶液浓度为横坐标, 以峰面积的值为纵坐标, 建立坐标系进行线性分析, 克菌丹的线性方程:Y=0.0109X-0.0006, 相关系数r:0.9992 (详见图4) 。

2.2.2 分析方法的精密度试验

对浓度为10.0mg/L的标样进行6次重复测定, 在10.0mg/L浓度下, 克菌丹的标准偏差为1.91, 相对标准偏差为1.95%。

2.2.3 分析方法的准确度试验

于空白样品中分别加入不同浓度的克菌丹标准品, 按照本文的方法和操作条件进行重复测定, 测得克菌丹回收率为86.7%~91.2%。

2.3 气相色谱法与高效液相色谱法的比较

分别用气相色谱法和高效液相色谱法检测分析克菌丹的含量, 并将两种分析方法进行线性相关、精密度、准确度试验, 从结果看出两种方法的线性相关系数、相对标准偏差、回收率均符合农药分析方法验证的要求。证明这两种方法都可用于克菌丹原药及其制剂的分析。

此外, 气相色谱法的检出限:0.000971mg/L, 定量限:0.00324mg/L;高效液相色谱法的检出限:0.170mg/L, 定量限:0.568mg/L。证明气相色谱法的检出限与定量限均明显低于高效液相色谱法, 灵敏度较高。

由图1、图2看出, 气相色谱法和高效液相色谱法的保留时间分别是9.147min和3.25min, 证明高效液相色谱法出峰时间更短, 检测效率较高。

3 结语

本文采用了优化的气相色谱条件和高效液相色谱条件, 建立了能有效检测克菌丹的气相色谱法和高效液相色谱法。综上所述, 气相色谱法检出限与定量限都较低, 灵敏度较高, 样品含量低也能检出;高效液相色谱法出峰时间较短, 检测效率较高, 节约时间。两种方法各具特点, 因此生产企业与质检机构在对克菌丹原药及其制剂进行质量监督与控制时可根据实际情况进行选择。

参考文献

[1]李智文.克菌丹在苹果及土壤中的残留动态及最终残留研究[D].杨凌:西北农林科技大学农药学, 2003.

高效液相色谱-荧光法 篇10

关键词:高效液相色谱法,利福霉素钠,含量测定

利福霉素钠属安莎类抗生素,是半合成的利福霉素中的广谱抗生素,也是国内惟一供注射用的利福霉素类药物,对金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌有较强的杀菌作用。是临床九大抗结核药物的首选药物。由于利福霉素钠结构复杂、不稳定、容易产生降解杂质,主要杂质为利福霉素S与利福霉素B,使用高效液相色谱法测定利福霉素钠的含量。该方法简便、快速、精密、准确。

1 仪器与色谱条件

采用岛津LC-6A型高效液相色谱仪;岛津SPD-6AV紫外检测器;Kromasil-C8色谱柱(250×4.6mm,5um)(瑞典NobelLEka生产),甲醇(0.075mol/L):磷酸二氢钾溶液(1.0mol/L):枸橼酸溶液(60:26:4)为流动相,检测波长为254nm,流速1.0ml/min,柱温35℃,进样量10μl。

2 方法与结果[1,2,3,4]

2.1 标准溶液的制备

利福霉素标准品(批号0333—200606,832μg/mg)、利福霉素S (130539?200601)和利福霉素B(130540?200601)均由中国药品生物制品检定所提供;利福霉素钠原料由四川制药股份有限公司提供,批号分别为2005-10-21,2005-10-22,2005-10-23,2005-10-25,2005-10-28与200605001、200605002、200605003;注射用利福霉素钠(批号为051128,规格0.25g)由海南三元阳普医药有限公司提供;培养基为I号6.0~6.5,批号:051112(北京三药科技开发公司生产,中国药品生物制品检定所监制);菌种为藤黄微球菌[CMCC(B)2800 1](中国药品生物制品检定所);甲醇与乙腈为Merck公司生产(色谱纯),其余试剂均为分析纯。精密称取对照品0.2g,加入5ml甲醇使溶解并稀释到100ml,精密量取0.6ml,0.8ml,1.0ml,1.2ml,1.5ml,2.0ml分别加流动相稀释到25 ml摇匀备用。

2.2 标准曲线的绘制

按1项下的色谱条件,取2.1项下的标准溶液分别进样测得的结果见表1。

回归方程:Y=1578749-64917,r=1.0001。说明利福霉素浓度和色谱峰面积的线性关系良好

2.3 溶液稳定性试验

取2.1项下的标准溶液于不同时间进样,每样20?l,在室温下放置12h分别在(0、2、4、8、12)h取样测定,其平均峰面积为1473250,表明本品在甲醇:乙腈:0075mol/L磷酸二氢钾溶液:1.0 mol/L枸橼酸溶液中稳定。结果表明利福昔明溶液在12小时内是稳定的。

2.4 精密度试验

精密称取利福霉素对照品0.2g,精密称定6份,分别加5ml甲醇使溶解并稀释到100ml,精密量取1.0ml,分别加流动相稀释到25 ml摇匀,分别进样,每样20?l,结果见表2。

RSD=1.56%结果表明:本法精密度较好

2.5 样品含量测定

精密称取细粉取利福霉素1.623g,置100ml量瓶中,加入甲醇溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,弃去初滤液,精密吸取续滤液5ml置50ml量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,照高效液相色谱法中(中华人民共和国药典2005年版二部)方法测定,取20μl注入液相色谱仪中,记录色谱。另精密称取于105℃干燥至恒重的利福霉素对照品0.8g,置100ml量瓶中,加入甲醇溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,精密吸取5ml置50ml量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,同法测定。按外标法以峰面积计算,结果见表3。

依据试验结果,规定含量限度为90.0%~105.0%

3 讨论

采用高效液相色谱法测定利福霉素的含量,我们用高效液相色谱法,色谱柱为KromasilC8,(甲醇:乙腈:0075 mol/L磷酸二氢钾溶液:1.0 mol/L枸橼酸溶液)=50:22.5:22.5:5为流动相,流速为1.0 ml/min,检测波长为240nm,利福霉素在(41.02~164.08)μg/mL范围内线性关系良好(r=0.99997),平均回收率为99.79%,RSD为0.2%,该方法准确、灵敏、可靠,能有效地控制该制剂的质量,可作为该制剂含量测定的检测方法。

参考文献

[1] 张兵.Rp-HPLC测定利福昔明的含量及有关物质[J].华西药学杂 志,2003,18(4) :281.

[2] 吴小英,童成亮,钟淮滨.利福昔明中有机溶剂残留量的测定[J].安 徽医药,2004;02:45-46

[3]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典(第二部附录Ⅳ) [s].2005版.北京:化学工业出版社.2005,65

高效液相色谱-荧光法 篇11

关键词:高效液相色谱法;斑蝥黄;水产品

中图分类号:O657.7+2 文献标志码:A

文章编号:1002-1302(2014)08-0308-02

斑蝥黄(astaxanthin)化学名称β-胡萝卜素-4,4′-二酮,亦称角黄素,分子式为C40H52O2。天然的斑蝥黄具有抗氧化、消除自由基的作用,在生物体内的含量甚微。随着人工合成斑蝥黄的工业化,其在饲料、食品、化工、医药等行业得到了广泛的应用[1]。然而,近年来的研究结果表明,人体吸收斑蝥黄后会积累在视网膜上,从而造成视力减退等眼疾。为此,欧盟于2003年出台法规将饲料中的斑蝥黄最高含量从原来的80 mg/kg降低到25 mg/kg[2]。日本于2006年5月29日实施的“肯定列表制度”规定:禽蛋和猪、牛、水产品等动物源性食品中角黄素最大残留限量为0.1 mg/kg。2008年我国农业部1126公告即《饲料添加剂品种目录》中规定,斑蝥黄被允许添加在家禽养殖饲料中,而不允许在水产饲料中添加。斑蝥黄重要用途之一是作为蛋黄着色剂饲喂产蛋家禽,使蛋黄变成人们喜爱的橙红色,但不法商贩将着色剂超量饲喂家禽现象依然存在。虽然在水产养殖中禁止使用斑蝥黄,但是由于其具有较好的着色效果,喂养后的鱼类色泽更好、销售价格更高,违规使用的现象较多。给水产品质量安全带来了隐患。目前,斑蝥黄的检测方法主要有色谱法[3-6]、分光光度法[7]、薄层色谱法[8],但主要是针对饲料或者家禽类产品。由于水产品的特殊性,在检测技术上要求更高。本研究设立了水产品中斑蝥黄的高效液相色谱测定方法,有效消除了脂类及其他杂质对待测物的干扰,降低了损耗,减少了有机溶剂用量,提高了回收率、准确度和精密度。该方法满足水产品质量安全检测的需要,对于应对日本肯定列表制度,克服技术性贸易壁垒,增加出口,保护渔民和消费者权益具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Thermo Accela PDA液相色谱仪(美国Thermo公司),配紫外检测器;电子天平(瑞士梅特勒公司),感量0.000 1 g;SK3300LH超声仪(上海科导仪器公司);TDD-4离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司);B-490旋转蒸发仪(美国 BUCHI公司)。

标准物质斑蝥黄,纯度≥98%,由德国Dr. Ehrenstorfer公司生产。乙腈为色谱纯,购自国药集团化学试剂有限公司。滤膜:0.22 μm。

1.2 斑蝥黄标准溶液配制

1.2.1 标准贮备液

准确称取斑蝥黄标准物质10 mg(精确到0.1 mg),用乙腈溶解,转入容量瓶定容至100 mL,摇匀,配成浓度为100 μg/mL的标准贮备液,4 ℃以下避光保存,有效期3个月。

1.2.2 标准中间液

准确吸取斑蝥黄标准贮备液1.0 mL于10 mL容量瓶中,用乙腈稀释定容,摇匀,配成浓度为10.0 μg/mL的标准中间液。临用前配制。

1.2.3 标准工作溶液

在室温下,分别取标准中间液0、10、20、50、100、200、500、1 000 μL,各置10 mL容量瓶中用乙腈稀釋定容,摇匀。该标准系列浓度分别为0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL。临用前配制。

1.3 样品前处理

称取5 g均质后的水产品样品于50 mL离心管中,加入10 mL乙腈,超声提取2 min,匀浆提取30 s,以4 000 r/min离心5 min。另取一支50 mL离心管加10 mL乙腈,洗涤匀浆刀头10 s,洗涤液移入前一离心管中,涡旋混合30 s,超声提取 2 min,以4 000 r/min离心5 min;合并上清液,旋转蒸发至干,用乙腈定容至10 mL,过0.22 μm滤膜,待上机分析。

1.4 色谱分析条件

色谱柱:Hypersil GOLD C18液相色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.9 μm),流动相:A相为乙腈,B相为水,梯度洗脱程序见表1;流速:200 μL/min;柱温:30 ℃;样品盘温度 15 ℃;进样量:20 μL;检测波长:475 nm。

2 结果与分析

2.1 标准溶液色谱图

在“1.4”节规定的色谱条件下,斑蝥黄标准溶液的色谱图如图1所示,浓度为2.00 μg/mL。

2.7 方法检出限

以空白水产品为基质加标,按照3倍信噪比(S/N≥3)估算最低检出限,本方法检测限为10 μg/kg。

3 结语

本研究采用乙腈萃取,流动相为乙腈和水,萃取率高,出峰快,峰形良好;该方法简便,准确度和精密度好,灵敏度高,检出限低,满足水产品质量安全检测分析的要求。

参考文献:

[1]汪洪涛,徐学明,金征宇. 角黄素的性质与开发应用[J]. 粮食与饲料工业,2003(6):31-32.

[2]EU. Animal Feed-Brighter Eyesight or Brighter Salmon? Commission Decides New Rules on Colouring Feed Additive[EB/OL]. (2002-01-27)[2013-09-03]. http://www.foodlaw.rdg.ac.uk/news/eu-03009.htm.

[3]Del Campo J A,Rodríguez H,Moreno J,et a1.Accumulation of astaxanthin and lutein in Chlorella zofingiensis (Chlorophyta)[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2004,64(6):848-854.

[4]余孔捷,钱 疆,杨 方,等. 高效液相色谱法测定动物源性食品中角黄素、虾青素的研究[J]. 食品与发酵工业,2008,34(3):145-148.

[5]王全林,史萍萍,张书芬,等. 反相高效液相色谱法同时测定咸鸭蛋黄中的斑蝥黄和苏丹红[J]. 色谱,2007,25(6):864-866.

[6]张 华,马 鑫,杨 莺,等. 固相萃取-反高效液相色谱法同时测定饲料中角黄素和虾青素[J]. 色谱,2008,26(3):392-394.

[7]刘良忠,彭光华,王海滨,等. 天然红心鸭蛋中红色素的化学及光谱性质研究[J]. 食品科学,2004,25(11):265-268.

高效液相色谱-荧光法 篇12

关键词:高效液相色谱法,微囊藻毒素,测定

微囊藻毒素测定中HPLC的应用极为常见, 其可直接引入如HPLC- FL、HPLV- UV或HPLC- CL等方式, 其中前两种方式在应用中尽管可满足pg级检测限要求, 然而整个操作过程中较为复杂, 且有较多的杂质干扰, 所以不具备较强的实用性。而后者在应用中较为简便易行, 但因藻毒素在识别中容易因干扰问题而影响测定准确度。因此, 本文在试验过程中对HPLC的应用考虑将这三种方式进行配合应用, 可使水中微囊藻毒素得以有效检测。

1水中微囊藻毒素检测中的HPLC应用试验分析

1.1试剂与仪器的选择与色谱条件设定

试验中在试剂选择方面, 主要以MC- YR、MC- RR、MC- LR为标样, 且选取相应的双蒸水、甲醇、三氟乙酸等作为试剂。在仪器选用方面, 可将Agilent1100型设备引入, 并将其他相应的超声波仪器、萃取柱以及可调氮吹仪等仪器引入。另外, 试验中所设定的色相分析条件主要为, 色谱柱恒温箱、进样量分别设定在25℃与20u L, 而甲醇主要以45:55 (V/V) 为主, 且在流动相方面, 使水溶液包含0.05%的三氟乙酸。同时, 做好紫外检测波长的设定, 在此基础上使MC- YR、MC- RR、MC- LR等峰面积能够在谱图中体现出来, 最后根据标样峰面积与谱图中显示的峰面积比值, 便可判定藻毒素在水样中的浓度[1]。

1.2相关标准液的制备

试验过程中, 可选择2.00m L甲醇, 使其与0.100mg藻毒素进行相溶, 对于该溶液应保证在放置中做好避光冷冻工作, 其可作为储备液。因在标准液制备中, 完全选用甲醇, 将存在测定时间较短问题, 容易影响最终结果。所以可考虑, 在甲醇水溶液方面控制于55%, 这样藻毒素测定中, 可使其出峰时间保持适中, 且测定结果准确度较高。

1.3实际样品的制备

在样品制备中, 主要需考虑到铜绿微囊藻冷冻、藻毒素提取以及样品制备等问题。如在铜绿微囊藻方面, 需将其置于一定环境下进行冷冻干燥, 确保其在离心后能够使沉淀物形成干藻粉。 而在提取藻毒素过程中, 需选择10m L蒸馏水, 将干藻粉置于其中, 此时通过超声波仪器完成清液的提取, 并对清液做好存储工作。另外, 在制备样品过程中, 主要需将制备好的清液进行过滤, 在此基础上使10m L甲醇加入滤液中。此时需将萃取柱引入, 使水样按照一定的流速从的萃取柱进行流过, 以此达到富集浓缩的目标。完成这些操作后, 要求对样品利用甲醇水进行净化, 直至萃取柱被吹干后, 将过滤后的溶液收集于瓶内。最后, 对甲醇水溶液进行分析, 完成微囊藻毒素浓度判定过程[2]。

2 HPLC测定微囊藻毒素的结果分析

2.1流动相选择与灵敏度判断

通过试验测定分析, 在等度洗脱情况下, MC出峰在甲醇体积具有较高的分数时较早, 以MC- RR为典型, 其受到的干扰较为明显, 但在甲醇体积分数减小情况下, 出峰时间较晚, 尤其MV- LR较为明显。另外, 当流动相中甲醇体积分数为其55%情况下, 无论MC- YR、MC- RR或MC- LR, 在谱图中都保持平滑的谱线, 且分离效果较为明显, 杂质对测定结果的干扰影响较小。而从灵敏度情况看, 根据试验中的色谱分析条件, 测定中可发现三种藻毒素都具有较高的分离度, 假定以3为信噪比, 可测得的绝对量检测限可达到1ng。由此可见, 在流动相、灵敏度等方面, HPLC测定方法的应用都可起到明显的效果。

2.2样品处理优化效果分析

试验过程中选取甲醇水溶液进行杂质的清除, 能够判定在甲醇水溶液具有较高浓度的情况下, 很容易使微囊藻毒素流失, 不利于检测结果准确性的提高。所以在试验中考虑所选用的甲醇溶液水控制在10%用量上。另外在洗脱液方面, 试验中主要以100% 甲醇为主, 这样可使浓缩时间得以缩短, 杂质干扰问题因此得到解决, 同时回收率与准确度等都可得到保障。所以HPLC方法运用下, 样品处理优化效果也较为明显。

2.3 HPLC方法精密度分析

在微囊藻毒素测定过程中, HPLC方法运用下可对其加标回收率进行判定, 可得到MC- YR、MC- RR、MC- LR都超出94.0%的回收率。另外, 在样品分析过程中也可发现, HPLC方法测定微囊藻毒素过程中, 检测限可维持在0.01ug/L~0.05ug/L。由此得出HPLC在精密度、回收率等方面都较高[3]。

3结语

微囊藻毒素的测定是保证水质的关键所在。实际测定中高效液相色谱法的应用可取得良好的效果, 由文中试验可发现, HPLC方法应用下, 流动相、灵敏度、样品处理优化以及精密度等方面都可得以保障, 有利于微囊藻毒素的准确测定。

参考文献

[1]施俭, 景澍闽, 陆峰, 向华.在线固相萃取-二维高效液相-串联质谱法测定水中微囊藻毒素-LR[J].净水技术, 2013, 03:52-54+58+66.

[2]林瑶, 张琼, 李一丹.固相萃取-高效液相色谱法测定水中痕量微囊藻毒素[J].中国卫生检验杂志, 2010, 09:2174-2175.

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