溶液相法

溶液相法（精选5篇）

溶液相法 篇1

对于中药液相色谱而言, 其特征峰色谱就是本专业中的“指纹图谱”。该图谱可以看作是多维空间之内的向量, 能够较为准确地反映中药成分之中的化学信息[1]。目前, 在中药制造行业以及药物检测行业, 常常将HPLC指纹图谱法应用于实际的中药成分测定与分析过程之中, 为一种可行性较好的方法。根据中药相关理论, 可以将中药的整体或是局部, 能够反映中药药剂药效的数据与HPLC方法测定的化学数据进行整体性关联, 采用中药质量化学模式识别的具体方法, 可以用来构建客观、整体以及多指标的综合性评价中药质量以及成分的科学体系, 并将这些关联性数据用于指导中药的实际生产, 使其生产更加规范化及国际化。本文主要基于HPLC中的指纹图谱分析方法及原理, 对中药成分溶度参数的分析、测定提供一种科学、详细的方法, 旨在为中药生产行业的规范化提供借鉴与参考。

1 指纹图谱的构建

对于指纹图谱的构建而言, 主要包括如下几个方面:HPLC色谱条件的选择、稳定性试验以及精密度试验等方面的内容, 具体而言, 包括如下几点。

1.1 HPLC色谱条件的选择

在使用指纹图谱对中药成分溶度参数进行测定分析时, 首先一步也是关键性的一步就是要科学选择色谱条件。在实际的选择过程中, 首先应该考虑的一个因素为物质成分能够在液相色谱中进行完全地显示出来, 也就是说特征峰的数量应该尽可能地多, 而且其分离度也要保持非常完好的状态, 对于主要的指标成分以及活性成分的分离程度能够非常有效地对其进行分离, 分析时间应该控制在1h之内比较适宜。但是同时也会出现这样的问题, 即它们的特征峰无法完全显示或者分析的时间过长, 一般可以将其控制时间在4h。若在检测的过程之中, 特征峰不能够很好地显示或是分析时间过长, 可以考虑将色谱条件加以变换, 成为指纹图谱, 然后采用梯度洗脱或者选择适宜的检测波长。在允许条件下, 可以选择很多个不同检测波长, 目的是为了达到特征峰有效分离的效果。而且应该保证进样量保持在一定的数值范围之内, 应该使得最小成分特征峰的面积能达到4位数以上。在保证重复性以及专属性的前提条件下, 目的是为了选择更简单、实用以及便于实施的试验条件, 若能应用通用柱, 就不需要使用特殊色谱柱。

1.2 稳定性试验

对样品所制成的供试样品溶液的稳定性加以准确地观察, 一般选取两个时间点, 即24h与48h, 计算这个时间段之内的特征色谱峰的相对保留时间以及相对峰面积二者之间的比值的离散程度, RSD<5%。

1.3 精密度试验

在精密度试验中, 一般可以包括如下两种试验:①同一种可供试验样品溶液在同一个色谱条件之下, 以及在同一个时间段之内进行6～9次的连续进样, 对特征峰的相对保留时间以及相对峰面积之间的离散程度进行计算, 此时应该将相对标准偏差 (RSD) 控制在3%范围之内, 这个值可以称为“精密度”;②按照可供试验样品溶液制备的具体方法同上制备6～9份可供试验样品的溶液, 在相同的色谱条件下, 对不同时间段之内的峰值进行测定分析, 计算出特征峰的相对保留时间以及相对峰面积二者之间的比值大小, 此时应该将相对标准偏差 (RSD) 控制在5%的范围之内, 此种条件可以称之为“重复性精密度”。

2 基本原理

2.1 中药单成分溶度参数与HPLC色谱之间的关系

由前面所述内容可以得知, 溶液的溶解度与HPLC的色谱原理之间建立方程结合起来创建了一个溶度参数的测算公式, 对于等度洗脱公式 (如 (1) 所示) 以及梯度洗脱公式 (如 (2) 所示) :

上式中, undefined

在线性梯度洗脱的过程中, 水相溶剂的溶解度参数为δa, 有机相溶剂的溶解度参数为δt。根据线性分析可以得知, 水相与有机相二者之间的体积呈现出较好的线性关系 (R=0.992 8) 。t代表洗脱的时间, k代表流动相的浓度变化梯度, b0为最开始时水相比例常数, V为流速。由如上几个常数项, 再根据溶剂溶度参数的加合性, 流动相的溶度参数δm, 该参数主要是随着洗脱时间 (t) 的变化而变化的一个参数, 其二者之间的函数变化关系式如 (3) 所示:

undefined

由式 (3) 可以看出, 当洗脱时间t值为0时, 那么由式 (3) 可以变为初始溶度参数, 具体如 (4) 式所示:

δ20=b0δa+ (1-b0) δt (4)

由上述 (3) 、 (4) 两个式子, 可以计算出求解平均溶度参数的公式, 具体如 (5) 式所示:

undefined

undefined

将 (3) 、 (4) 、 (5) 三式代入公式 (2) 可以得出公式 (6) :

undefined

3 结果

按照上述方法构建了指纹图谱几何平均保留时间与总量表观溶度参数关联的函数表达式或数学模型, 然后根据这一数学表达式计算出所选取的中药成分的溶度参数值大小, 其值为37.55J1/2/cm3/2。

此外, 还对不同洗脱条件下咖啡因以及大黄类药物成分的色谱图进行了绘制, 具体如图1、图2所示。

4 结论

中药指纹图谱总量几何平均保留时间法将指纹图谱看成多个成分响应高斯曲线叠加而成的概率密度函数曲线, 按式 (6) 来分析指纹图谱的总体保留时间内在特征, 其思路与指纹图谱总量统计矩法相似。该法运用统计学原理, 求算指纹图谱曲线的总量零、一、二阶矩, 其中总量一阶矩为总量保留时间对峰面积的算术平均值, 而总量几何平均保留为总量保留时间对峰面积的几何平均值, 因此可以反映整张图谱众多指纹峰的集中趋势[2]: 成分数目众多、含量各异的中药或复方指纹图谱物征峰总体朝平均保留时间集中趋势。综上所述, 高效液相色谱 (HPLC) 指纹图谱构建数学模型方法, 能够同时对中药多个组分进行分析、测定, 从而能够为单味中药药剂的制造工艺提供一定的理论基础与测定技术方面的支持。

摘要：目的:对高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chrotomogrphy, HPLC) 应用于测定中药成分溶度参数进行分析与探究。方法:利用指纹图谱理论以及Hildebrand-Scatchard溶解度理论创立HPLC测定中药成分的溶度参数, 构建数学公式或模型, 运用已知溶度参数的咖啡因验证理论对大黄类成分进行分析、测定。设置HPLC的条件为:Alltech Apollo C18柱子 (高为25cm, 直径为0.46cm, 孔径为5μm) 。其流动相为乙腈-水进行梯度洗脱, 咖啡因的检测长度为430nm, 柱子温度为25℃。结果:按照上述方法构建了指纹图谱几何平均保留时间与总量表观溶度参数关联的函数表达式或数学模型, 然后根据这一数学表达式计算出所选取的中药成分的溶度参数值大小, 其值为37.55J1/2/cm3/2。结论:高效液相色谱 (HPLC) 指纹图谱构建数学模型方法, 能够同时对中药多个组分进行分析、测定, 从而能够为单味中药药剂的制造工艺提供一定的理论基础与测定技术方面的支持。

关键词：高效液相色谱法 (HPLC) ,中药成分,溶度参数,指纹图谱

参考文献

[1]钱浩泉, 谢培山.中药液相色谱指纹图谱的方法学研究——银杏叶总黄酮指纹图谱个例剖析[J].分析测试学报, 2004, 23 (5) :7-11.

[2]张聪, 金德庄.中药山茱萸HPLC色谱指纹特征研究[J].中成药, 2008, 30 (12) :1726-1731.

溶液相法 篇2

中空纤维液相微萃取-高效液相色谱法测定水中残留的氨基甲酸酯类农药

应用中空纤维液相微萃取(HP-LPME)技术建立了水样中呋喃丹、西维因、异丙威和乙霉威的高效液相色谱分析方法.对影响HP-LPME的实验条件进行了优化.采用Accurel Q3/2聚丙烯中空纤维,以甲苯为萃取溶剂,于室温、搅拌速度为720 r/min条件下在4.5 mL样品溶液中萃取20 min,萃取物在室温下经氮气流吹干后用流动相溶解进样.采用Baseline C18分离柱(4.6 mm×250 mm,5.0 μm),以甲醇-水(体积比为60:40)为流动相,流速为1.0 mL/min.呋喃丹、西维因、异丙威和乙霉威的检测波长分别为200,223,200和208 nm.该方法对4种氨基甲酸酯类农药的.富集倍数均大于45倍;4种氨基甲酸酯类农药在10～100 μg/L质量浓度范围内,其质量浓度与峰面积之间有良好的线性关系,相关系数均大于0.99;呋喃丹、西维因、异丙威和乙霉威的检出限(S/N=3)分别为5,1,5和3 μg/L;实际水样中的加标回收率为82.0%～102.2%,相对标准偏差为2.0%～6.2%(n=6).

作 者：杨秀敏 王志 王春 韩丹丹 陈永艳 宋双居 YANG Xiumin WANG Zhi WANG Chun HAN Dandan CHEN Yongyan SONG Shuangju 作者单位：河北农业大学理学院,生物无机化学重点实验室,河北,保定,071001刊 名：色谱 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY年，卷(期)：200725(3)分类号：O658关键词：中空纤维 液相微萃取 高效液相色谱法 氨基甲酸酯类农药 水样

溶液相法 篇3

材料与方法

仪器。戴安3000；旋涡混合器；离心机。

试剂。甲基氰（色谱纯）；乙酸铵（分析纯）；NaCl（分析纯）；脱氢乙酸（99.9%）。

测定方法。①色谱条件：流动相为15：85的甲基氰（0.02mol/ml）、乙酸铵溶液；流速为1.0 mL/min；进样量为10μL；柱温为35℃。②实验方法：实验样品为市售不同品牌的果汁、酱菜、糕点，分别做如下处理。果汁：准确称量5.00g于50mL离心管中；酱菜、糕点：预先均匀，称取2～3g于50mL离心管中，加入饱和NaCl溶液5mL，1：1的盐酸溶液1mL，在旋涡混合器中混合处理1min，精确添加甲基氰10 mL，再次混合处理3min，然后以3000转/min的速度离心处理15min，取上清液，用0.45μm规格的过滤器进行过滤，待用。③色谱分析：根据上述色谱条件，利用外标法分析样液，保留时间定性，根据峰面积定量，计算脱氢乙酸含量（mg/mL）。

结果与讨论

检测波长的确定。由扫描结果得知，脱氢乙酸在230nm处出现强吸收，但基体干扰较多；在297nm处出现次强吸收，基体干扰较少，因此，选择297nm作为检测波长。

流动相的选择。以甲基氰+水作为流动相时，色谱峰出现拖尾，以0.02mol/L的乙酸铵替代水时，峰形明显改善。甲基氰的比例对出峰时间和响应有一定影响，比例较低时，保留时间长，响应也比较低，反之则出峰时间短，响应较高。经多次试验得出，当甲基氰与乙酸铵（0.02mol/L）的比例为15：85时，可以取得较好的效果。

提取液的选择。脱氢乙酸对水难溶，但脱氢乙酸钠易溶，通常利用水、NaOH溶液、NaCO3溶液等作为提取液，但提取后需要先净化后才能使用。本文研究中，以甲基氰作为提取液，原因是脱氢乙酸可以溶于甲基氰，且甲基氰的水溶性有助于将酸性样液中的脱氢乙酸彻底溶解，而且甲基氰能够沉淀蛋白质，与脂肪不溶，通过离心即可获得纯度较高的提取液。

色谱分离。在上述色谱条件下，脱氢乙酸的保留时间为5.775min，峰形和组分的分离情况比较好，色谱图如下：

标准曲线。将70%的甲基氰水溶液作为溶剂，制作不同浓度的脱氢乙酸标准液，得到若干测定结果（见表1）。利用峰面积对脱氢乙酸的浓度做回归方程分析，得Y=2.39X×108-1.33×105，R=0.9997，线性结果良好。然后，对各浓度标准液连续进样5次，所得峰面积及保留时间的相对标准偏差依次为0.35%和0.24，表明此测定方法具有较高的定性及定量准确度。

回收率及精密度试验。取未添加脱氢乙酸的腐乳样品3份，每份3g，分别加入0.1mg、0.2mg、0.4mg、0.6mg、1.0mg脱氢乙酸标准液，利用1.3所述方法及步骤进行处理，最终测定结果显示，加标回收率为96.1～99.5%，平均回收率为98.5%。

取含有脱氢计算的腐乳样品1份，以同样的方法和步骤测定6次，得到下列测定值：0.192、0.195、0.194、0.198、0.195、0.193g/kg，相对标准偏差为1.08%。

样品测定。利用该法对市售不同品牌的果汁、酱菜、糕点等食品中的脱氢乙酸含量进行测定，共检测10份，其中7份为未检出，3份检测出脱氢乙酸，浓度依次为0.052g/kg，0.131g/kg，0.088g/kg，与国际标准气相色谱法的测定结果相一致，表明该法测定结果良好，值得推广使用。

（作者单位：毕节市质量技术监督检测所）

溶液相法 篇4

1 仪器与试药

高效液相色谱仪(安捷伦Agilent-1220);色谱工作站(安捷伦ChemStation for LC systems);溶出度仪(RC-8D,天津光学仪器厂);紫外分光光度计(UV-1801,北京瑞利分析仪器有限公司)。坎地沙坦酯对照品(中国药品生物制品检定所,批号100685-200801);自制坎地沙坦酯速释颗粒;自制坎地沙坦酯缓释颗粒;坎地沙坦酯片(4 mg/片,福州屏山制药有限公司,批号:100601)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5μm);流动相:乙腈-水-冰醋酸(57∶43∶1);流量:1 mL/min;柱温:30℃;进样量:20μL。

通过对照品溶液的吸光度扫描,得到紫外吸收光谱(图1),确定检测波长为254 nm。

2.2 溶液配制

2.2.1 供试品溶液

采用桨法,以0.5%十二烷基硫酸钠(SDS)900 mL为溶剂,转速为50 r/min,水浴温度(37.0±0.5)℃,每个溶出杯放规定量的颗粒,45 min时,取溶液适量,过滤。

2.2.2 空白溶液

按比例取颗粒的辅料,按供试品溶液制备下方法制备,得空白溶液。

2.3 专属性试验

分别取对照品溶液、供试品溶液、空白溶液各20μL,进样,记录色谱图(图2),并进行比较,结果空白溶液在对照品溶液色谱峰处无色谱峰,说明辅料对活性成分的测定无干扰。

2.4 线性试验

精密称取CC对照品52.5 mg,置250 mL容量瓶中,加乙醇溶解并定容,摇匀,为对照品储备液。精密量取0.1、0.25 mL置50 mL容量瓶,精密量取0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL置10 mL容量瓶中,加0.5%SDS溶液定容,摇匀。进样测定,记录色谱图,以CC峰面积(A)对浓度(C)线性回归,得方程A=29.436 3C+31.424 4,r=0.999 8。表明CC浓度在0.42～67.20μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 检测限及定量限试验

充分稀释对照品溶液,进样测定,得检测限为0.21 ng/mL,定量限为0.63 ng/mL。

2.6 精密度和稳定性试验

分别取2.1、8.4和33.6μg/mL的对照品溶液,重复测定3次,得CC峰面积的RSD为0.08%(n=9)。取供试品溶液,分别于0、2、4、6、8、24 h进样测定。结果表明,峰面积无明显变化,说明溶液在24 h内稳定。

2.7 回收率试验

分别精密量取对照品储备液5、10和20 mL各3份,置250 mL容量瓶中,按处方量加入颗粒空白辅料,加0.5%SDS溶液溶解并定容,摇匀,过滤。取滤液依法测定,颗粒的平均回收率为99.7%,RSD为0.3%(n=9)。

2.8 溶出度测定

溶出度的测定方法参照《中国药典》2010年版二部附录XC第二法操作。精密称取含CC 8 mg的固体分散体粉末,参照上述药典中的溶出度桨法进行测定,释放介质为0.5%的SDS溶液,转速50 r/min,介质温度(37.0±0.5)℃,依法操作。速释性固体分散体,在1、2、5、10、15、20、30、45、60 min取样;缓释性固体分散体的取样时间为0.5、1、2、4、6、8、10、12 h;普通片剂,在2、5、10、15、20、30、45、55、65 min取样。分别抽取溶液6 mL,同时补充6 mL溶出介质,用0.8μm微孔滤膜滤过,用“2.1”项下方法测定浓度,计算并绘制溶出曲线。

对速释颗粒的测定结果见表1。可以发现,各点平行测试的RSD均小于2.0%。

对同批6个缓释颗粒样品的测定结果见图3。可以发现,各点平行测试的RSD均小于1.5%。

以市售坎地沙坦酯片,用3片进行溶出度测试比较,见图4,所有各点RSD小于1.5%,45 min累积溶出69.0%,RSD=0.9%。

3 讨论

笔者采用分光光度法测定溶出液浓度时,所得的线性范围为6.01～26.8μg/mL;当样品的主药含量为8 mg时,用《中国药典》2010年版一法和二法测量,即使药物完全溶出,其浓度也只有8.88μg/mL,因此对于8 mg及以下剂量的固体制的测量是不适用的。CC浓度测量的HPLC法标准曲线中线性范围为0.42～67.20μg/mL,所以适合于4～32 mg剂量的坎地沙坦酯固体制剂溶出度的测量。对CC浓度的测定,多数文献中HPLC检测器吸收波长都为254 nm,也有采用210 nm[10],国内企业所用标准及《美国药典》采用的是254 nm,所以采用254 nm具有更好的规范性且结果利于比较。

日本药局方及美国FDA规定的溶出介质是吐温20,但吐温20是不同聚合度分子的混合物,不同厂家不同批号的产品存在区别,对测量结果有影响。SDS性质较为稳定,采用0.5%SDS溶液作为溶出介质,对测量无影响,重现性好。笔者测定的CC在37℃温度0.5%SDS溶液中的溶解度是67μg/mL,目前市售坎地沙坦酯制剂的最大剂量是16 mg在900 mL溶出杯中的最大浓度是17.8μg/mL,所以溶出度测量满足漏槽条件。

坎地沙坦酯颗粒,尤其是缓释颗粒,因辅料有一定的溶胀性,不宜采用转篮法,否则颗粒易堵塞筛网。流动相采用乙酸调节pH,避免了磷酸盐缓冲溶液的使用,有利于色谱柱清洗和保养。

摘要：目的 建立用于测定坎地沙坦酯固体分散体颗粒溶出度的高效液相测定方法 。方法 采用《中国药典》2010年版二部溶出度测定法二法,以乙腈-水-冰醋酸(57∶43∶1)为流动相,流速为1 mL/min,检测波长为254 nm,测定溶出液的浓度。结果 所得溶液线性范围为0.42～67.20 mg/L(A=29.436 3C+31.424 4,r=0.999 8),平均回收率99.7%(RSD=0.3%)。结论 本方法准确可靠,可用于坎地沙坦酯速释、缓释颗粒及片剂的溶出度测定。

关键词：坎地沙坦酯,高效液相色谱法,溶出度,固体分散体,颗粒

参考文献

[1]Noda M,Shibouta Y,Inada Y,et al.Inhibition of rabbit aortic an-giotensinⅡ(AⅡ)receptor by CV-11974,a new nonpeptide AⅡan-tagonist[J].BiochenPharmacol,1993,46(2):311-318.

[2]陈凌,潘静薇,秦永文,等.坎地沙坦酯治疗轻中度高血压患者的疗效及安全性[J].药学服务与研究,2004,4(2):139-141.

[3]ButerH,NarisG,de Zeeuw D,et al.Pharmacokinetics and pharmaco-dynamics of candesartan cilexetil in patients with normal to severelyimpaired renal function[J].Eur J Clin Pharmacol,1999,54(12):953-958.

[4]Hoogkamer JF,Kleinbloesem CH,Ouwerkerk M,et al.Pharmacoki-netics and safety of candesartan cilexetil in subjects with normal andimpaired liver function[J].Eur J Clin Pharmacol,1998,54(4):341-345.

[5]王美荣,王利珍,林建英.坎地沙坦固体分散体的制备及溶出度、稳定性研究[J].中国现代应用药学,2011,28(7):654-658.

[6]The United States Pharmacopeial Convention.USP35-NF30[S].US-A:The United States Pharmacopeia,2011:2468.

[7]耿仕霞,李存福.高效液相色谱法测定坎地沙坦酯片的有关物质及含量[J].中国药业,2005,14(06):45.

[8]赵晓妍,李丽.坎地沙坦酯氨氯地平片中两种组分的含量测定[J].医药导报,2012,31(9):1203-1205.

[9]Lunn G.HPLC Methods for recently approved pharmaceuticals[M].New Jersey:John Wiley&Sons Inc.,2005:104-105.

溶液相法 篇5

高效液相色谱 (HPLC) 是7O年代开始发展起来的分析蛋白质的一项新技术, 目前已广泛用于蛋白质化学领域。使用RP—HPLC能有效进行种子贮藏蛋白的分离, 它的原理是根据不同蛋白质组分的表面疏水性的差异将其分离开, 与蛋白质分子量及所带电荷数无关;而蛋白电泳技术是依据分子大小和电荷的不同来分离的, 因此, 二者的原理不同, 其蛋白分离图谱可以相互印证, 互为补充。[1,2]而超高效液相色谱 (UPLC) 与HPLC相比, 大幅度地改善了液相色谱的分离度、样品通量和灵敏度, 因而具有更高的效率和更强的分离能力。目前为止利用UPLC分析孜然芹种子醇溶蛋白的研究还未见报道。因此, 本试验借鉴HPLC的方法, 以新孜然1号为实验材料, 研究洗脱时间、色谱柱温度等对孜然芹醇溶蛋白超高效液相色谱分离的影响, 确立孜然芹种子醇溶蛋白超高效液相色谱法 (UPLC) 分离的最佳实验条件, 为孜然芹种子醇溶蛋白分离分析建立一种有效的方法;然后对比研究10个品种贮藏蛋白的色谱图, 评价使用这种方法作为品种鉴定手段的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料见表1。

1.2 种子蛋白提取

单粒种子研磨15 min, 加入0.5 mL的70% (v/v) 甲醇溶液浸泡2 h[3]。样品继续研磨10 min后, 12000 r/min离心10 min, 通过0.45μm孔径的滤膜后进样上柱分析。

1.3 反相高效液相色谱

色谱分析选用Waters Acquity Ultra performance LC分析系统, 溶剂输送选用Waters高压泵, 自动进样。Waters Acquity Ultra performance LC TUV紫外检测器210nm检测洗脱蛋白。

2 结果与分析

2.1 色谱分离条件选择:

用含0.10%的三氟乙酸的乙腈和0.05%的三氟乙酸水溶液作为溶剂A和溶剂B, 随时间改变溶剂A和B的浓度梯度变化, 来优化色谱分离条件。结果, 使用Waters Acquity UPLC BEH C18粒径1.7μm的反相色谱柱 (2.1×50 mm) , 溶剂A以10%～35%的流速梯度、0.30 mL/min的流速洗脱19 min, 孜然芹种子主要贮藏蛋白在此条件下能够得到分离。

2.2 色谱柱温度对分离结果的影响

由色谱理论可知, 在一定范围内, 随着温度的升高分离效率将逐渐提高, 但温度太高会缩短色谱柱寿命, 使蛋白质变性。为确立温度对UPLC分离孜然芹种子醇溶蛋白的影响, 本试验设计40℃、50℃、55℃三个对比温度, 测定结果见图1。

由图1可以看出, 随着温度的升高特征峰出现的越早, 但总的峰数没有随着温度的升高而发生变化。结合仪器的使用情况, 我们认为40℃柱温最好。

2.3 洗脱时间对分离效果的影响

洗脱时间是影响色谱分离的主要因素之一。前人研究HPLC所用的洗脱时间在40～60 min之间, 而超高效液相色谱 (UPLC) 较HPLC效率高, 为明确洗脱时间对色谱分离的影响, 本试验设计40 min进行试验。从试验结果 (见图2) 来看, 在20 min以后基本没有较明显的特征峰出现。经过重复试验, 我们选择20 min洗脱时间为试验的优选条件。

2.4 不同品种间UPLC色谱图

由图3可以看出, 10个孜然芹品种的醇溶蛋白蛋白洗脱峰顺序较相似, 无显著的特征峰, 只是在含量上有些差别, 不能说明孜然芹品种间的纯度的差异;但是, 小茴香的色谱图与孜然芹有很大差异, 可以很容易把它与孜然芹种子区分开来。

3 结果与讨论

(1) 孜然芹种子醇溶蛋白UPLC分析技术受孜然芹及近缘种测定对象的影响, UPLC分析孜然芹醇溶蛋白的标准方法必须根据实际情况进行反复试验才能确定。本研究结果表:明流速0.3 mL/min、柱温40℃下, 流动相A液在16 min内由10%升至35%, 通过210 nm波长检测紫外吸收为孜然种子醇溶蛋白UPLC分离的最佳条件。

(2) UPLC技术分析孜然芹种子醇溶蛋白与A-PAGE相比, 具有如下优点: (1) 试验速度快, 试验周期短, 一个样品只需20 min。 (2) 试验条件稳定, 易于控制重复性高。 (3) 图谱清晰, 数据分析准确可靠, 易于比较。 (4) 能实现自动化控制, 节省人力。UPLC技术的分辨率和定量性优于单向电泳, 这样就有可能对某些用单向电泳不能鉴定的育种系谱相近的品种进行鉴定。

(3) UPLC分析中, 温度是最重要的影响因素。不同色谱柱的性能指标有差异, 在实际应用中必须因地制宜, 结合蛋白质的特性确定最适温度。洗脱时间对实验效率有一定的影响, 根据孜然芹及近缘种的倍性及组成差异, 进行相应的改进, 从而缩短实验时间, 节省成本, 提高工作效率。

(4) 由于10个孜然芹品种的醇溶蛋白蛋白各组分疏水性相近, 在该方法中没有完全分开, 洗脱峰顺序较相似, 无显著的特征峰, 只是在含量上有些差别, 不能说明孜然芹品种间的差异。但是, 小茴香的色谱图与孜然芹有很大差异, 在今后研究中还应继续研究其他提取蛋白的色谱图, 找出品种间的有显著差异的洗脱峰。

参考文献

[1]晏月明, 刘保国, 杨长寿.反相高效液相色谱在作物品种鉴定中的应用[J].中国农学通报, 1993, (9) 3:41~44.

[2]赵龙刚, 宋希云, 史雪辉等.小麦胚乳醇溶蛋白反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 分离方法的建立[J].现代仪器, 2006, (06) :78～80.