液相质谱法（通用12篇）
液相质谱法 篇1
原花色素是指从植物分离得到的一切无色的, 在热酸处理下能产生花色素的物质。原花色素作为植物中一类普遍的次级代谢产物, 同花色素、生物黄酮等物质一样, 广泛分布于各种植物的种子、叶子、果实、花和皮、壳等处。在植物的皮、壳中, 原花色素含量以板栗壳中的含量较高, 为4.428%, 其余植物的皮、壳中的原花色素含量相对较低。叶子中原花色素含量以柳树叶为最高, 达22.9 mg/g, 其次分别为山楂叶、松叶、樱桃叶、柿子叶、李子叶, 含量在10.38%～16.10%。在植物的花中, 原花色素含量较高的为樱桃花, 达17.12 mg/g, 其次为垂丝海棠和麦梨, 含量在11～13 mg/g, 李子花、山楂花、柳树花、紫叶碧桃、紫荆、紫藤、单层黄刺玫中含量为3～7 mg/g。已知新鲜葡萄籽中的原花色素含量为最高, 达66.3 mg/g, 酿酒后分离的葡萄籽中的含量为16.94%, 这说明在葡萄酒酿造过程中, 葡萄籽的原花色素大部分会溶解在酒液中。因此, 对白葡萄酒和葡萄汁加工中得到的葡萄籽应更好地利用, 作为提取原花色素的主要原料之一。另外酒脚中仍含有较高的原花色素, 酒脚也应作为提取原花色素的原料之一。目前, 国内外多从葡萄籽中提取原花色素, 其次是从松树皮中提取。
1 材料与方法
1.1 材料
原花色素 (上海梦美化学品有限公司) ;儿茶素标品 (美国SIGMA公司) ;表儿茶素标品 (美国SIGMA公司) 。
1.2 主要仪器及试剂
高效液相质谱联用仪 (美国Agilent公司1100 Series LC—MSD—TrapSL) ;乙腈 (GC级, 天津市瑞金特化学品有限公司) ;冰醋酸 (CR级, 天津化学试剂一厂) ;丙酮 (AR级, 天津市北方天医化学试剂厂) ;甲醇 (CR级, 德国MERCK公司) 。
1.3 实验方法
1.3.1 流动相的梯度条件流动相的梯度条件见表1。
注:A:质量分数为2.5%的冰醋酸溶于双蒸水;B:质量分数为80%的乙腈溶于A
1.3.2 样品处理
将每次过膜前和过膜后的样品处理、稀释、定容后进样, 进样量20μL, 保持25℃, 于波长280 nm下检测。
1.3.3 儿茶素标准曲线的绘制 (外标法)
准确称取一定质量的儿茶素标准品, 稀释定容成几个不同浓度梯度的标准溶液, 按上述色谱条件进样检测, 根据出峰面积绘制儿茶素标准曲线。儿茶素标准曲线见图1。
扫描方式:正离子扫描 (ESI, m/z 100～1 000) , 毛细管电压4.2 k V, 锥孔电压40 V, 光电倍增器电压150 V, 离子源温度120℃, 脱溶剂气温度350℃。
2 结果与分析
采用Sephadex LH—20凝胶柱将原花色素低聚体物分离成如图2的 (1) 、 (2) 2个组分, 根据凝胶柱的分子筛原理, 组分 (1) 中的物质分子量应比组分 (2) 大, 经进一步高效液相法检验, 组分 (1) 如图3, 组分 (2) 如图4。
经高效液相分析, 组分 (2) 主要为儿茶素与表儿茶素的混合物, 还有一种未知成分;组分 (1) 中相对组分 (2) 应包含更高聚合体的物质, 具体的物质成分尚无研究结果, 有待进一步确定。
将上述用体积分数为50%的甲醇洗脱过的凝胶柱, 继续用体积分数为70%的丙酮洗脱, 洗脱液蒸去丙酮, 进行液相分析, 如图所示。
经过葡聚糖层析分离与提纯, 物质 (3) 的含量明显增大了, 为了确定几个主要组分, 在上图试样中加入了标准物儿茶素与表儿茶素, 其液相图如图6所示。
图5与图6比较, 儿茶素与表儿茶素峰明显增大, 从出峰位置与顺序来看, 物质 (3) 即为一种儿茶素与表儿茶素的二聚体, 其质谱图如图7。
经明显分子离子峰 (二聚体-H+Na+=601) 及黄酮化合物常见的RDA裂解方式可确定, 物质 (3) 为一种儿茶素或表儿茶素的二聚体。
3 结论
利用高效液相—质谱法测定样品原花色素的组成, 首先通过色谱条件进样检测确定了儿茶素标准曲线, 经高效液相分析, 原花色素的组分主要为儿茶素与表儿茶素及儿茶素与表儿茶素的混合物。测定原花色素的基本组成, 为原花色素的进一步开发利用奠定了良好的基础, 对该活性物质的进一步应用提供理论依据。
摘要：为了更好地开发利用原花色素, 采用高效液相—质谱法测定原花色素的组成, 确定了原花色素的基本组成为儿茶素与表儿茶素及儿茶素与表儿茶素的混合物, 为原花色素的进一步开发利用奠定了良好的基础。
关键词：原花色素,高效液相—质谱法,分离
液相质谱法 篇2
高效液相色谱-串联质谱法分离鉴定绿原酸及其相关杂质
建立了高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)分离和鉴定绿原酸及其相关杂质的方法.采用C18色谱柱(5 μm,4.6 mm×150 mm),乙腈-水(含0.1%甲酸)(体积比为8:92)为流动相,经HPLC-MS/MS和HPLC-二极管阵列检测器在线检测,对工业绿原酸中的奎尼酸、咖啡酸、绿原酸同分异构体等8个相关杂质的结构进行了鉴定.
作 者：田晨煦 徐小平廖丽云 张洁 刘静 周莎 TIAN Chenxu XU Xiaoping LIAO Liyun ZHANG Jie LIU Jing ZHOU Sha 作者单位：田晨煦,徐小平,张洁,刘静,周莎,TIAN Chenxu,XU Xiaoping,ZHANG Jie,LIU Jing,ZHOU Sha(四川大学华西药学院,四川,成都,610041)廖丽云,LIAO Liyun(成都医学院,四川,成都,610083)
刊 名：色谱 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY 年，卷(期)： 25(4) 分类号：O658 关键词：高效液相色谱-串联质谱法 绿原酸 相关杂质 鉴别液相质谱法 篇3
摘要：建立高效液相色谱-串联质谱法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）测定猪血中盐酸可乐定和盐酸赛庚啶的方法。样品中的盐酸可乐定和盐酸赛庚啶用乙腈提取，UPLC-MS/MS进行分析。分析时采用Waters BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），以0.10%甲酸水-甲醇作为流动相进行梯度洗脱，电喷雾正电子（ESI+）模式电离，多反应监测模式检测，外标法进行定量。结果表明：盐酸可乐定和盐酸赛庚啶标准溶液在1.0～50 μg/L范围内，峰面积与含量呈线性相关。盐酸可乐定和盐酸赛庚啶的检出限均为0.20 μg/kg，样品中添标回收率在85%～110%之间，相对标准偏差小于10%。
关键词：高效液相色谱-串联质谱；盐酸可乐定；盐酸赛赓啶；猪血
Determination of Clonidine Hydrochloride and CyproheptadineHydrochloride in Swine Blood by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
YANG Ting，XU Xiuqin， ZHAO Jian， ZHANG Hao，WU Yinliang， WANG Lijun， ZHU Yong
（Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315040， China）
Abstract： A simple and sensitive ultra performance liquid chromatography-tandem mass （UPLC-MS/MS） method for the determination of clonidine hydrochloride and cyproheptadine hydrochloride in swine blood was developed. Samples were extracted with acetonitrile and analyzed by UPLC-MS/MS on a Waters Acquity BEH C18 column with 0.10% formic acid in water/methanol as the mobile phase by means of gradient elution. Detection was carried out with an electrospray ionisation （ESI） probe and operated in the positive ion mode. Clonidine hydrochloride and cyproheptadine hydrochloride was quantified by the external standard method. There was a good linearity in the range of concentrations between 1.0 and 50.0 μg/L. The limits of detection for clonidine hydrochloride and cyproheptadine hydrochloride were both 0.2 μg/L. The recoveries from spiked samples were in the range of 85% to 110% and the relative standard deviations （RSD） were lower than 10%.
Key words： ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry； clonidine hydrochloride； cyproheptadine hydrochloride； swine blood
中图分类号：TS251.7 文献标志码：A 文章编号：
doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201506001
盐酸可乐定（clonidine hydrochloride，C9H9Cl2N3·HCl）和盐酸赛庚啶（cyproheptadine hydrochloride，C21H21N·HCl）通常作为人用药品[1]。盐酸可乐定主要用于治疗高血压、高血压急症、偏头痛、绝经期潮热、痛经等症状，盐酸赛庚啶主要用于治疗荨麻疹、湿疹、过敏性和接触性皮炎、皮肤瘙痒、鼻炎、偏头痛、支气管哮喘等症[2-3]。自发现将可乐定添加于饲料中，可以促进猪的生长，并提高瘦肉率，赛庚啶也有一定的刺激食欲的功能后[4]，有发现国内畜产品养殖者将这两种药物滥用于饲料中，以促进猪的生长[5-8]。这种滥用，势必会对人类的健康带来危害，曾发生过可乐定的中毒事件[9-11]，造成34人出现头晕、昏迷并入院治疗。农业部于2010年12月27日发布1519号公告，禁止在饲料和动物饮水中使用盐酸可乐定和盐酸赛庚啶。目前，对于盐酸可乐定和盐酸赛庚啶的测定主要集中于医药领域[12-13]。陈其煌[1， 14]测定了猪尿和猪肝中的盐酸可乐定和盐酸赛庚啶，曹莹[15-16]、李丹妮[4]等测定了饲料中盐酸可乐定和盐酸赛庚啶。柯光明等[17]测定了家兔血液中的可乐定含量，孙成文等[18]测定了人血中的可乐定含量。由此可以看出，可乐定等药物进入动物体内以后，会在血液中呈现出一定的浓度，因此，通过测定血液中药物的浓度，便可知药物是否在动物体内存在。从活体动物抽血检测并不会对动物造成很大的影响，因此测定活体动物的血液可有效的解决兽药残留检测的时滞性问题。本研究采用了高效液相色谱-串联质谱法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）测定猪血中的可乐定和赛庚啶含量，检测限低准确度高，旨在为猪血样品中可乐定和赛庚啶的测定提供参考方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
猪血为抽取的生猪血液，生猪来源于浙江奉化滕头村养猪场。
盐酸可乐定标准品、盐酸赛庚啶标准品购于中国药品生物制品检定所。甲醇、乙腈（色谱纯）美国默克公司；实验用水为Mili Q超纯水仪所制超纯水；其他试剂均为分析纯试剂。
1.2 仪器与设备
UPLC-XEVO超高效液相色谱质谱仪美国Waters 公司；SIGMA3K15离心机北京博励行有限公司；RT SPE全自动固相萃取仪美国Caliper公司；Mili Q 超纯水仪美国Millipore 公司。
1.3 方法
1.3.1标准溶液的配制
1.3.1.1 标准储备液
称取盐酸可乐定、盐酸赛庚啶标准品10.0mg定容至100mL甲醇中，质量浓度为100mg/L，―18℃保存，保质期为6 个月。用甲醇稀释为20.0 mg/L的中间液。
1.3.1.2 标准工作液
用流动相（甲醇：0.1%甲酸水=20：80）稀释标准中间液20.0mg/L的盐酸可乐定、盐酸赛庚啶分别为1.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg/L的标准工作液，现配现用。
1.3.2样品前处理
吸取血浆样品1.0 mL，涡旋30s，加入乙腈5 mL，涡旋3 min，3 500 r/min离心10 min，取上清液，用0.2μm滤膜过滤，于50℃水浴用氮气流吹干。残渣用流动相溶解后，过0.2μm滤膜，待测。
1.3.3 液相色谱条件
色谱柱Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100mm×2.1mm，1.7μm）；流动相：A为0.1%甲酸水，B为甲醇；梯度洗脱程序：0～0.5min，20% B；0.5～2.5 min，20%B～50%B，保持1min；3.5min，50%B保持1.4 min。流速：0.2mL/min，柱温箱温度：25℃；进样量10μL。
1.3.4质谱条件
离子源为电喷雾离子源（ESI）；正离子方式检测，采用多反应离子监测，内标法定量。喷雾毛细管电压1.5kV，离子源温度150℃，去溶剂气温度500℃，去溶剂气流速为1000L/h，碰撞气流速0.20 mL/min，放大倍数为600。
1.4 数据分析
数据应用软件MassLynx version 4.1进行分析。
2 结果与分析
2.1提取溶剂的选择
根据盐酸可乐定和盐酸赛庚啶的化学性质及参考文献[19-20]，选择用乙腈来提取猪血中的可乐定和赛庚啶。
2.2 液相色谱的测定结果
用1000μg/L的盐酸可乐定和盐酸赛庚啶溶液来确定合适的离子。最终确定了盐酸可乐定的母离子为230.16，子离子为171.79、159.75；盐酸噻庚啶的母离子为288.8，子离子为191.2、215.2。图3为盐酸可乐定和盐酸噻庚啶的标准溶液、加标样品和空白样品色谱图。
1.盐酸噻庚啶的色谱图（母离子288.8，子离子191.2）；2.盐酸噻庚啶的色谱图（母离子288.8，子离子215.2）；
3.盐酸可乐定的色谱图（母离子230.16，子离子171.79）；4.盐酸可乐定的色谱图（母离子230.16，子离子159.75）。
图1 可乐定赛庚啶标准溶液（a）、可乐定赛庚啶加标样品（b）、空白样品（c）色谱图
Fig. 1 MRM Chromatograms of standard solution of clonidine hydrochloride and cyproheptadine hydrochloride （a）， fortified sample （b）， and blank sample （c）
由图1可知，空白样品于峰位置处无吸收峰，说明空白样品不含盐酸可乐定和盐酸噻庚啶，对样品的测定无干扰；加标样品的峰位置与标准溶液峰位置完全吻合，说明此方法可以很好的用于测定盐酸可乐定和盐酸噻庚啶。
2.3标准曲线与线性范围
经UPLC-MS/MS测定，以盐酸可乐定和盐酸噻庚啶的质量浓度为横坐标（x），以峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。结果显示：盐酸可乐定和盐酸赛庚啶的回归方程和相关系数分别为y=4270.2x+18352（R2=0.9986），y=4118.8x+6156.2（R2=0.9978）。在质量浓度内线性范围良好。
2.4 检出限和定量限
根据测定标准曲线所得的结果，配制相近质量浓度的阳性添加样品，按照1.3.2节进行操作，测定其实际信噪比。以信噪比RS/N=3为检测限，以信噪比RS/N=10为定量限。结果表明，猪血样品中盐酸可乐定和盐酸赛庚啶的检出限均为0.2μg/L，定量限均为0.6μg/L。
2.5精密度和回收率
取猪血样品1mL，制成1.0、2.0、4.0μg/L的加标样品，按照1.3.2节进行操作，每个添加水平重复3次，每次每个质量浓度做5个平行添加样品，取其平均值进行定量分析。
加标质量浓度
/（μg/L）
测定值
/（μg/L）
回收率/%精密度/%
批内批间
1.00.94±0.06945.75.7
0.88±0.08883.25.3
0.91±0.07912.92.9
2.01.85±0.06933.53.5
1.88±0.09944.85.0
1.92±0.08963.23.2
4.04.08±0.131021.51.5
3.89±0.09971.73.6
3.91±0.06981.21.2
加标质量浓度
/（μg/L）测定值
/（μg/L）
回收率/%精密度/%
批内批间
1.00.95±0.07955.85.8
0.86±0.09864.96.1
0.92±0.06923.23.2
2.01.86±0.06933.93.9
1.89±0.09954.25.4
1.91±0.08965.15.1
4.04.09±0.111022.62.6
3.62±0.08913.74.9
3.75±0.09942.92.9。
3 结 论
本实验研究了一种猪血样品中盐酸可乐定和盐酸赛庚啶的测定方法。利用乙腈作为提取液，过膜后用UPLC-MS/MS法测定。应用这种方法测定猪血中的盐酸可乐定和盐酸赛庚啶，简便、快捷，检出限低，回收率高，为猪血中可乐定和赛庚啶的测定提供了可靠的技术手段。
参考文献：
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液相质谱法 篇4
1 原理
饲料中的吉他霉素经甲醇水提取, Oasis HLB纯化, 初始流动相复溶, 过0.45μm滤膜, 上液质测定, 外标法确证及筛查。
2 样品制备
按照GB/T20195制备试样, 磨碎, 全部通过0.28mm孔筛, 混匀, 装入密闭容器中。
3 仪器设备
AB104-N电子天平、Agilent6410BQQQ液质联用仪、HITACHI CRG离心机。
4 操作步骤
4.1 试样提取
精确称取试样2g于250m L锥形瓶中, 准确加入20 m L提取液 (甲醇+水=20+80) , 振荡30 min, 转入离心管中, 10 000r/min离心5min, 上清液备用。
4.2 样品纯化
固相萃取柱 (6cc/200mg Oasis HLB) 分别用3m L甲醇和3 m L水活化, 准确移取5 m L上清液过柱, 清洗1:3m L5%甲醇及2%乙酸;清洗2:3 m L5%甲醇及2%氨水;清洗3:3m L65%甲醇及2%氨水, 近干后用甲醇洗脱, 收集洗脱液。在氮吹装置上50℃下用氮气吹干, 准确加入1m L初始流动相 (乙腈+0.1%甲酸水=90+10) 复溶, 过0.45μm微孔滤膜, 上LC-MS/MS测定。上机液中的药物浓度应稀释在线性范围内。
4.3 测定
4.3.1 液相色谱条件。
色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18 2.1×100 mm, 1.8μm;柱温:30℃;流动相:A:0.1%甲酸水溶液;B:0.1%甲酸乙腈, 梯度洗脱条件见表1。
4.3.2 质谱条件。
离子源:电喷雾离子源;扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应监测MRM。使用前, 应调节各气体流量, 以使质谱灵敏度达到检测要求。质谱参数应优化至最佳。定性离子对、定量离子对及碰撞能量的参考值见表2。
min, %
流速:0.3 m L/min;进样量:5 u L。
m/z, V
4.3.3 定性测定。
在相同试验条件下, 样品中待测物的保留时间与标准工作液的保留时间偏差在±2.5%之内, 并且样品图谱中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近标准工作液中对应的定性离子对的相对丰度进行比较, 若偏差不超过表3规定的范围, 则可判定为样品中存在对应的待测物。
4.3.4 定量测定。
按照上述液相色谱-串联质谱条件测定样品和标准工作溶液, 以色谱峰面积进行单点或多点校正定量, 样品溶液中待测物的响应值应在仪器规定的线性范围内。上述色谱和质谱条件下, 对照品的工作曲线图、对照品的色谱质谱图和样品的色谱质谱图见图1~3。
5 结果计算
试样中某种待测物的含量X以质量分数 (mg kg) 表示, 按式 (1) 计算。
式中:
m1—计算机外标法自动计算所得到的某待测物的质量, 单位为微克 (μg) ;
m—试样质量, 单位为克 (g) ;
n—稀释倍数。
测定结果用平行测定的算术平均值表示, 结果保留三位有效数字。
6 重复性
同一分析者对同一试样同时两次平行测定结果的相对偏差不大于20%。
7 结果分析
液相质谱法 篇5
建立了动物组织样品中萘啶酸、恶喹酸、氟甲喹、诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、洛美沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、二氟沙星、麻保沙星、培氟沙星、司帕沙星、奥比沙星等16种喹诺酮类兽药多残留量的`高效液相色谱-串联质谱测定方法.用酸性乙腈萃取样品中的16种喹诺酮类药物残留,然后用正己烷脱脂,旋转蒸发浓缩,以Inertsil C8-3色谱柱分离,在正离子模式下以电喷雾电离串联质谱进行测定.在10,50,100 μg/kg 3个加标水平下进行了验证试验,方法的线性范围为10～100 μg/kg,平均回收率为62.4%～102%,相对标准偏差为1.4%～11.9%.该方法简便、快速、准确,各项技术指标满足国内外法规的要求,可用于鸡肉、鸡肝和鱼肉等动物组织样品中喹诺酮类药物多残留的确证检测.
作 者：岳振峰 林秀云 唐少冰 陈小霞 吉彩霓 华红慧 刘昱 YUE Zhenfeng LIN Xiuyun TANG Shaobing CHEN Xiaoxia JI Caini HUA Honghui LIU Yu 作者单位：岳振峰,林秀云,唐少冰,吉彩霓,华红慧,刘昱,YUE Zhenfeng,LIN Xiuyun,TANG Shaobing,JI Caini,HUA Honghui,LIU Yu(深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心,广东,深圳,518067)
陈小霞,CHEN Xiaoxia(深圳大学教务处,广东,深圳,518060)
液相质谱法 篇6
摘 要：建立鸡肉中22种磺胺及其增效剂多残留检测的液相色谱-串联质谱法。样品经过甲酸-乙腈（1∶199，V/V）溶液提取，正己烷脱脂，液-液分配净化后，C18柱分离，甲醇、水-甲酸水溶液（体积分数0.1%）为流动相梯度洗脱，采用电喷雾电离源（electrospray ionization，ESI）正离子多反应检测（multiple reaction monitoring，MRM）模式检测，外标法定量。结果表明：药物在2.0～100.0 μg/L质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99，方法的检出限和定量限分别为0.5 μg/kg和2.0 μg/kg，在添加量为2.0、5.0、10.0 μg/kg时回收率为61.8%～88.3%，相对標准偏差小于11.3%。该方法简便快捷，可用于鸡肉中磺胺类药物及其增效剂的多残留检测。
关键词：液相色谱-串联质谱；鸡肉；磺胺；增效剂
Determination of Residues of 22 Sulfonamides and One Sulfonamide Potentiator in Chickens by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
WEI Yunji1，ZHU Zhenyi1，FENG Min1，ZHANG Ke1， WANG Xiaojin1，HE Jian1，WEI Bin1，DING Tao2
（1.Huaian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Huaian223001，China；2.Animal，Plant and Food Inspection Center（APFIC）， Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing 210001，China）
Abstract： A multi-residue analytical method for the determination of 22 sulfonamides and 1 sulfonamide potentiator in chicken was developed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS）. The sample was extracted with formic acid-acetonitrile （1：199， V/V）， and the extract was defatted with n-hexane and cleaned up by liquid-liquid partition. The analytes were separated on a C18 column using a mobile phase consisting of methanol and water containing 0.1% （V/V） formic acid with gradient elution. The anaysis of the 23 analytes was performed by electrospray ionization （ESI） mass spectrometry under the positive mode using multiple reaction monitoring （MRM） and quantified by external standard method. The calibration curves showed good linearity. The limit of detection （LOD） and limit of quantitation （LOQ） were 0.5 and 2.0 μg/kg， respectively. At the spiked levels of 2.0， 5.0 and 10.0 μg/kg， recoveries ranged from 61.8% to 88.3%， with relative standard deviations （RSD） less than 11.3%. This method is convenient and suitable for the determination of residues of sulfonamides and the potentiator in chicken.
Keywords： liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS）； chicken； sulfonamides； potentiator
中图分类号：TS251.7文献标志码：A 文章编号：
doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201508001
磺胺类药物是具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，用于预防和治疗细菌感染性疾病，具有抗病原体范围广、化学性质稳定、使用方便、易于生产等特点，能抑制大多数革兰氏阳性菌和某些阴性菌，可单独使用，也常与抗菌增效剂甲氧苄氨嘧啶配伍，通过干扰细菌的二氢叶酸形成，影响细菌核蛋白合成而抑制细菌的生长繁殖。在畜牧业和兽医临床中，被广泛用于预防和治疗食源性动物疾病。磺胺类药物在体内的作用时间和代谢时间较长，长期使用可能导致在人体中蓄积，进而对人体机能产生危害[1-2]，破坏人的造血系统，造成溶血性贫血，并导致病原体产生抗药性。近年来，动物源食品中磺胺类药物残留量超标现象十分严重，尤其是在猪、禽、牛等动物源食品中。欧盟规定肉类食品中的磺胺类药物的最高残留限量（maximum residue limit，MRL）为单一磺胺类药物25.0 μg/kg，磺胺类药物总量100.0 μg/kg，甲氧苄氨嘧啶的最大残留限量50.0 μg/kg[3-5]。
目前用于检测磺胺类药物及其增效剂残留的方法有高效液相色谱法[6-11]、气相色谱法[12]、气-质联用法[13]、液-质联用法[14-20]、免疫测定法[21]等。液相色谱法、气相色谱法、气-质联用法、免疫测定法大多只能检测几种磺胺类药物，操作比较复杂，而且灵敏度低；液相色谱-串联质谱法具有较高的专属性和灵敏度，常用于药物的多残留分析，目前关于鸡肉中磺胺类药物检测的方法已有报道，但是测定的药物种类不多，连同磺胺增效剂同时测定的文献尚未有报道。本文经过不断的优化改进样品前处理提取方法与仪器方法，建立了鸡肉中22种磺胺和一种磺胺增效剂同时测定的分析方法。经过验证，该法具有快速、准确、检测限量较低，适用于鸡肉磺胺类药物及磺胺增效剂的残留量测定，满足日常检测工作的需要。
1 材料與方法
1.1 材料与试剂
鸡肉样品为市购。
23种药物标准品：磺胺胍（sulfaguanidine，SG）、磺胺二甲基异嘧啶（sulfisomidine，SMD）、磺胺醋酰（sulfacetamide，SA）、磺胺嘧啶（sulfadiazine，SD）、磺胺噻唑（sulfathazole，ST）、磺胺吡啶（sulfapyridine，SPD）、磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine，SMR）、磺胺二甲基噁唑（sulfamoxol，SM）、磺胺二甲基嘧啶（sulfadimidine，SDMD）、磺胺对甲氧嘧啶（sulfameter，SMT）、磺胺甲噻二唑（sulfamethizole，STZ）、磺胺甲氧哒嗪（sulfamethoxypyridazine，SMPD）、磺胺间甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine，SMM）、磺胺氯哒嗪（sulfachlorpyridazine，SCP）、磺胺邻二甲氧嘧啶（sulfadimoxine，SDX）、磺胺甲基异噁唑（sulfamethoxazole，SMZ）、磺胺氯吡嗪（sulfaclozine，SCZ）、磺胺二甲异噁唑（sulfisoxazole，SIZ）、磺胺苯酰（sulfabenzamide，SBZ）、磺胺间二甲氧嘧啶（sulfadimethoxine，SDM）、磺胺喹噁啉（sulfaquinoxaline，SQX）、磺胺苯吡唑（sulfaphenazolum，SP）、甲氧苄氨嘧啶（trimethoprim，TMP），纯度均在98% 以上 德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈、正己烷、甲酸均为色谱纯；水为超纯水；无水硫酸钠为分析纯。
1.2 仪器与设备
TSQ Quantum Ultra EMR串联质谱仪（配有电喷雾离子（ESI）源）、Surveyor液相色谱系统（包括Autosampler 1.3自动进样器）、MS Pump 2.0质谱泵 美国ThermoFisher公司；C18柱（150mm×3.1mm，3.5 ?m） 美国Agilent公司；C18固相萃取小柱（3mL/500mg） 美国Supelco公司；氮吹仪美国Organomation公司；超纯水器 美国Millipore公司；离心机 美国Sigma公司；超声波清洗仪宁波新芝生物科技公司；Oasis HLB固相萃取小柱（3 mL/60mg）、Oasis MCX固相萃取小柱（3 mL/60mg） 美国Waters公司。
1.3 方法
1.3.1 标准储备液的配制
分别精密称取上述23种标准品适量，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L标准储备液，于冰箱中冷冻避光保存。
1.3.2 混合标准溶液的配制
分别准确吸取上述储备液各适量，置同一容量瓶中，用甲醇稀释制成含有上述23种物质各1.0 mg/L的混和标准溶液。
1.3.3 样品提取
准确称取（5.00±0.05）g样品于50 mL 离心管中，加入10 mL甲酸-乙腈（1：199，V/V）溶液，于涡旋混合器上混匀1 min，超声波提取10 min；加10 g无水硫酸钠，以8000 r/min的速率离心3 min，转移上层有机溶液至20 mL氮吹管中；再用10 mL甲酸-乙腈（1∶199，V/V）溶液重复提取残渣1次，合并2 次提取液于氮吹管中，于45 ℃水浴中氮吹至干，用1.0 mL甲醇-水（2∶8，V/V）溶解，加入1.0 mL正己烷溶液，涡旋混匀，于4 ℃、10000 r/min离心3 min，下层溶液经0.22 μm滤膜过滤至进样瓶中，供液相色谱-串联质谱仪分析。
1.3.4 仪器参数及测定条件
1.3.4.1 色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 ?m）；进样量：25 μL；柱温：30 ℃；流动相：A为体积分数为0.1%甲酸-水溶液，B为甲醇；梯度洗脱条件：0～2 min，流动相A为90%；2.5～4.5 min，流动相A为30%；6.3～10.5 min，流动相A为70%；11～14 min，流动相A为10%；流速：250 μL/min。
1.3.4.2 质谱条件
采用电喷雾电离源（electrospray ionization，ESI）源；正离子方式扫描；喷雾电压：3000 V；离子源温度：400℃；鞘气：45bar，辅助气：10 bar；毛细管温度：350 ℃；多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）方式检测；优化质谱条件见表1。
2结果与分析
2.1 提取溶解的选择
本实验在查阅大量参考文献[15-17，22]的基础上比较了乙腈、甲酸-乙腈（1∶199，V/V）、甲酸-乙腈（1∶99，V/V）、甲酸-乙腈（2∶98，V/V）和乙酸乙酯的提取效率。结果表明：上述几种溶剂对磺胺类药物及其增效剂均有较好的效果，使用乙酸乙酯提取时，会提取出较多的脂肪，后续的脱脂净化较难，影响色谱柱的使用寿命；乙腈和酸性乙腈都具有沉淀蛋白的效果，提取出的脂肪含量较低，有利于后续脱脂净化，由于磺胺类药物具有弱碱性，易溶于酸性溶液，采用甲酸-乙腈混合溶剂提取效率高于乙腈，同时实验对甲酸的用量进行优化，当随着甲酸浓度增加，大部分磺胺的回收率下降，因此采用甲酸-乙腈（1∶199，V/V）混合溶液作为提取溶剂。
2.2净化方法的比较
鸡肉样品中蛋白质和脂肪含量较高，提取过程中需要去除蛋白质、脂肪干扰物质，实验研究了液-液分配萃取净化结合冷冻高速离心脱脂除蛋白和固相萃取净化后的效果，同时结合磺胺类药物具有弱碱性的化学性质。本实验选取理论上适合其净化的C18、HLB和MCX小柱进行比较，结果表明：液-液分配萃取净化结合冷冻高速离心处理的方法回收率最高，HLB小柱净化效果优于C18和MCX小柱。样品经正己烷脱脂，高速冷冻离心后大部分脂肪和蛋白质被除去，固相萃取小柱对目标物可以净化和富集，但在操作过程中目标物会损失导致回收率降低，从实验周期、经济和环保方面考虑选取正己烷脱脂液-液分配净化。
2.3质谱条件的优化
磺胺类药物为弱碱性，结构式中具有仲氨基或叔氨基的化学电离性质，理论上选用ESI+作为离子化模式，在ESI+离子模式下容易得到H+形成较为稳定的[M+H]+准分子离子峰。实验采用注射泵直接进样的方式，将质量浓度为1μg/mL的每种标准物质，以5μL/min的流速分别注入离子源中在正离子模式下对每种物质进行一级质谱分析，得到每种分子离子峰，再对每种物质的准分子离子峰进行二级质谱分析，得到其相应的碎片离子信息，然后对每种物质的二级质谱进行碰撞能量、碰撞气、辅助气、喷雾电压、透镜补偿电压等参数优化，使每种物质的分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大时为最佳。
2.4 色谱条件的优化
实验同时测定的物质有23种，磺胺类药物存在多组同分异构体，特别是磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲氧哒嗪，3种物质性质极为相似很难将其分离。实验中比较了Thermo Hypersil GOLD柱（150 mm×2.1 mm，5 ?m），Thermo Hypersil GOLD柱（100 mm×2.1 mm，3 ?m），Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 ?m）和Agilent Polaris 5 C18-A柱（100 mm×2.0 mm，5 ?m）对正离子模式下23种物质的分离效果、响应强度和峰型。结果表明：23种物质在Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 ?m）上有最理想的分离效果、响应强度和峰型。磺胺类药物结构中含有氨基，水溶液中呈弱碱性，色谱峰易出现拖尾现象，当在流动相中加入一定量的甲酸，在酸性条件下促进磺胺类物质的电离，提高了离子化效率；同时甲酸有助于色谱柱内硅醇基的质子化，消除硅醇基与目标物之间的相互作用，减少色谱峰的拖尾，提高了分离效果。实验比较了在流动相中添加体积分数为0.02%、0.05%、0.1%、0.2%和0.5%甲酸对目标物的响应和峰型的影响，结果表明：选用0.1%甲酸水溶液和甲醇作为流动相获得了最好的分离效果、响应强度和峰型。磺胺类化合物极性差异大和存在同分异构体现象，采用等度洗脱不容易将多组分磺胺分离，需要采用梯度洗脱进行分离。在梯度洗脱的开始阶段以10%甲醇作为流动相将极性较强的组分先洗脱出来，3 min后逐渐增加甲醇的比例，提高了同分异构体的分离度，使极性弱的组分逐一分离，实现了23种物质的有效分离。
2.5线性范围、检出限和定量限
为消除基质效应按照1.3.3节处理步骤提取阴性鸡肉样品，配制6个不同质量浓度的标准溶液，溶液中磺胺类及其增效剂质量浓度为2、5、10、20、50、100ng/mL；在本法所确定的色谱和质谱条件下进样测定，以标准溶液质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，23种化合物的线性方程、相关系数如表1所示。
在空白鸡肉中添加混合标准品，以信噪比（S/N）≥3，确定方法的检出限为0.5 μg/kg；以信噪比≥10确定方法的定量限为2.0 μg/kg；鸡肉样品中添加2.0 μg/kg 23种混合标准物质的MRM色谱图见图1。
2.6方法的回收率和精密度
选取阴性鸡肉样品，添加23种磺胺及增效剂混合标准品，添加水平为2.0、5.0、10.0 μg/kg，每个添加5次平行，按上述优化的实验方法测定个组分的回收率和相对标准偏差，结果如表5所示。
3 结 论
实验建立了鸡肉中22种磺胺及其增效剂残留量同时测定的高效液相色谱-串联质谱法。样品经过甲酸-乙腈（1：199，V/V）溶液提取，正己烷脱脂，液-液分配净化，无需固相萃取净化，高效液相色谱-串联质谱测定。方法的定量限为2.0 μg/kg，空白鸡肉添加回收率为61.8%～88.3%，本方法检测周期短，灵敏度较高，回收率较好，满足实际检测工作的需要，適用于鸡肉中22种磺胺及其增效剂残留量的定性定量分析及确证。
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液相质谱法 篇7
关键词：牛肉,磺胺类药物,残留,液相色谱—串联质谱法
磺胺类药物(sulfonamides,SAs)是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物,广泛用于预防和治疗食源性动物的疾病,然而过量使用会导致该类抗生素在食用动物产品中残留[1]。人长期摄入含磺胺类药物的动物性食品后,药物会不断在人体内蓄积,当积累到一定程度后,就会对人体产生毒性作用,可导致肾受损害,破坏人的造血系统,引起溶血性贫血症、粒细胞缺乏、血小板减少症等;对于过敏体质的人,轻者引起皮肤瘙痒症,重者引起血管性水肿,甚至导致死亡[2]。因此,欧盟将磺胺类药物列为必须严格监控的药物,并规定动物源食品中磺胺的最大残留限量为100μg/kg,日本规定食品中不得检出SAs,我国也将磺胺类药物列为动物饲养过程中限制使用的药物[3]。因此,对动物源性食品中SAs的检测分析非常重要。
目前,国内外对SAs的分析检测方法主要有分光光度法[4]、酶联免疫吸附法[5,6]、气质联用法[7]、高效液相色谱法[2,3]及高效液相色谱—串联质谱法[8]等。分光光度法和酶联免疫吸附法定量不准确,高效液相色谱法虽然定量功能较强,但该法只能依据化合物的保留时间对样品进行定性,灵敏度不够高,对于一些含量低的样品无法检测;对于基质复杂的样品,其定性和定量结果容易受到基质的干扰,从而导致假阳性或者定量结果不准确;而目前液相色谱法及液质联用法对SAs残留分析主要集中在鸡肉[9]、鸡蛋[10]、水产品[11,12,13]、化妆品[14]和牛奶[2,4,15]等方面,对牛肉中残留测定的报道较少。液质联用法(HPLC-MS/MS)采用多重反应监测(MRM)模式,结合液相保留时间及MRM特征离子对进行定性和定量,可以大大减少由于保留时间相同而待测离子不同所带来的干扰,同时大大提高了检测灵敏度,尤其适于对牛肉这样基质复杂样品的分析。
该文选择国内外关注较多的磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺地索辛(SDT)、磺胺二甲嘧啶(SDM)、磺胺甲氧嗪(SMP)、磺胺甲噁唑(SMZ)、磺胺喹噁啉(SQX)共7种SAs为研究对象,建立高效液相色谱-串联质谱法同时测定牛肉中7种SAs的方法,该方法具有操作简便、灵敏度高等优点。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器。
Agilent 1260-6430QQQ液相色谱串联质谱联用仪(美国安捷伦科技有限公司),Buchi R-210型真空旋转蒸发仪(瑞士步琪有限公司);KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);L-550型离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。
1.1.2 试剂。
甲醇、正己烷、乙腈均为色谱纯,德国Merck公司生产;无水硫酸钠,分析纯,广州化学试剂厂生产。7种标准品:磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺地索辛(SDT)、磺胺二甲嘧啶(SDM)、磺胺甲氧嗪(SMP)、磺胺甲噁唑(SMZ)、磺胺喹噁啉(SQX),均购于德国Dr.Ehrenstorfer公司,纯度均大于97%,分别用甲醇配制成浓度为1 000μg/mL的标准储备液。
1.2 检测条件
1.2.1 色谱柱。
ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1×150 mm,3.5μm);流速:0.5 mL/min;柱温:45℃;进样量:10μL;流动相:A为0.1%甲酸水溶液,B为甲醇溶液。梯度洗脱程序:0～3.5 min,20%B;3.5～6.0 min,20%～40%B;6.0～10.0 min,40%B;10.0～10.5 min,40%～20%B;10.5～12.0 min,20%B(post run:5 min)。
1.2.2 电离方式。
ESI+;毛细管电压:4.0 kV;干燥气温度:350℃;干燥气流速:11 L/min;雾化器压力:50 psi;监测模式:多反应监测(MRM);多反应监测各药物离子对及对应的驻留时间、碎裂电压和碰撞能见表1。
注:*表示定量离子。
1.3 试验方法
1.3.1 标准曲线的绘制。
用流动相稀释7种磺胺类药物标准品,配制成5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、100.0μg/L 5个等级的标准曲线,过0.22μm微孔滤膜后上机测定。以各定量离子色谱峰面积为纵坐标,对照溶液的浓度为横坐标,绘制标准曲线。回归方程及相关系数见表2。
1.3.2 样品提取。
用组织捣碎机捣碎牛肉混匀,准确称取4g(精确到0.01 g)于50 mL具塞离心管中,加入8 g无水硫酸钠,再加乙腈20 mL,35℃超声提取20 min,6 000 r/min离心10 min,取全部上清液至150 mL鸡心瓶中,再用20 mL乙腈均质残渣1 min,6 000 r/min离心10 min,合并上清液于150mL鸡心瓶中,50℃水浴旋蒸浓缩至近干,用2 mL甲醇涡旋溶解残渣待净化。
1.3.3 样品净化。
向上述溶解液中加入5 mL正己烷脱脂,涡旋2 min,转移至15 mL离心管中,4 000 r/min离心5 min,去除上层正己烷,重复脱脂1次。取下层溶液过0.22μm有机滤膜,供HPLC-MS/MS测定。
1.3.4 回收率测定。
在牛肉空白中分别添加10.0、20.0、40.0μg/L 3组浓度混合标准溶液,按照上述方法操作进行回收率测定。
2 结果与分析
2.1 准确度和精密度
7种磺胺类药物在5.0～100.0μg/L浓度范围内呈良好的线性关系,r2均大于0.997。在相同的分析条件下,在牛肉空白中分别添加10.0、20.0、40.0μg/L 3组浓度混合标准溶液进行回收率和精密度试验,做5个平行样,试验结果见表3。高、中、低3档加标回收率为92.5%～100.6%,相对标准偏差为2.0%～4.5%,表明该方法具有较好的精密度、准确度和回收率。
2.2 灵敏度
以最低浓度点5.0μg/L的响应值与空白样品中的噪声响应的3倍计算最低检出限,具体检出限结果见表3。7种SAs的检出限为1.0～4.5μg/L,检测灵敏度明显优于同类标准方法。
3 结论
液相质谱法 篇8
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Waters超高效液相色谱/ 串联质谱仪(ACQUITY UPLC/Quattro Premier);MassLynxTM4.0;Zymark全自动固相萃取仪;Accu BONDⅡODS C18固相萃取柱(1 000 mg,6 ml); TurboVapⅡ型氮吹仪(Caliper)。乙腈、甲酸均为液相色谱纯;水为Millipore纯水机出水;MCYST-LR标样为瑞士ALX公司生产(100 μg)。
1.2 液相色谱条件
传统的液相色谱测定MCYST-LR所需时间较长。本方法能在5 min之内完成,极大提高分析速度。图1为标样MRM的总离子流色谱图。流动相中加入适量甲酸可增强ESI+的灵敏度。本文对比了流动相中不同甲酸含量(V/V分别为0%、0.05%、0.10%)对灵敏度的影响,随着甲酸浓度的升高,能显著改善分析灵敏度。综合考虑,选择甲酸浓度为0.10%。本实验液相色谱条件为:Waters超高效液相色谱柱,C182.1 mm×50 mm×1.7 μm,柱温30℃,流动相为乙腈和0.10%(V/V)甲酸的水溶液,流速为0.25 ml/min,进样体积为5 μl,流动相梯度见表1。
1.3 质谱条件
995.7是MCYST-LR的[M+H]+离子质荷比,MCYST-LR裂解产生碎片较多,本实验中离子135.2为特征离子碎片,并且丰度最大,因此选择其为MRM定量分析时的子离子。见图2。本实验质谱条件为:采用ESI+离子源,毛细管电压为3.0 kV,锥孔电压60 V;离子源源温为100℃,脱溶剂气温度为350℃,流量为600 L/h,锥孔反吹气流量为50 L/h;碰撞池压力4.44×10-3mbar。
质量分析器低端分辨率LM1:13.0 V,高端分辨率HM1:13.0 V,离子能量1∶1.0;低端分辨率LM2:13.0 V,高端分辨率HM2:13.0 V;离子能量2∶4.0。
注:1为即时变化,6为线性变化。
1.4 样品的前处理
分别用10 ml甲醇、水活化固相萃取柱,流量为5 ml/min。取水样1.0 L,加入5 ml甲醇,上样速度为4 ml/min。用10 ml 5%甲醇的水溶液淋洗小柱,氮气吹干10 min,5 ml甲醇洗脱两次,氮吹仪浓缩至1 ml,待上机分析。
2 结果与讨论
2.1 标准曲线
将MCYST-LR标准样品逐级稀释成1 000、100、50、10 μg/L,在上述检测条件下测定。以样品峰面积为纵坐标,样品浓度为横坐标,得到标准曲线,见图3。线性范围及相关系数见表2。在信噪比S/N=3的条件下,MCYST-LR检出限达到0.04 μg/L。
2.2 精密度和回收实验
取同一水样,分别加入高、中、低不同浓度的MCYST-LR标准溶液,样品按本文1.4方法进行处理,分析并测定其精密度及回收率。结果表明:相对标准偏差≤5.4%,平均相对标准偏差为4.71%;平均回收率为97.2%。
2.3 实际样品分析
在地表水全分析中,采集4个地表水水质样品,按上述方法进行分析MCYST-LR,分析结果为未检出。
笔者采用超高效液相色谱/ 串联质谱法,乙腈-水-甲酸作为流动相,对水中的MCYST-LR进行测定。结果表明,该法具有快速、准确、灵敏度高、分析周期短、适用范围广等优点,可满足WHO规定饮用水中MCYST-LR浓度低于1 μg/L限量直接测定的要求。
参考文献
[1]张维昊,徐小清.固相萃取高效液相色谱法测定水中痕量微囊藻毒〔J〕.分析化学,2001,29(5):522-525.
[2]刘碧波,肖邦定,刘剑彤,等.天然水体中痕量微囊藻毒素的高效液相色谱测定方法优化〔J〕.分析化学,2005,33(11):1577-1579.
液相质谱法 篇9
磺胺类药物残留在动物组织中的检测方法主要有酶联免疫法[4]、高效液相色谱法[5,6]、液相色谱质谱法[7,8],为提高检测效率,多残留检测已成为发展的必然趋势。由于仪器灵敏度以及选择性上的优势,LC-MS/MS以及UPLC-MS/MS 逐渐成为多残留检测的重要手段。本研究建立了同时检测虾中16种磺胺类残留的LC-MS/MS检测方法。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
Agilent 6410B液相色谱三重串联四级杆质谱仪,配有电喷雾离子(ESI)源。分散机,离心机,氮吹仪,旋涡振荡器。
磺胺类药物标准品的纯度均不低于99.0%,均购于Dr.Ehrenstorfer GmbH;乙腈、甲醇、甲酸、醋酸铵均为色谱纯(Merck公司);实验用水均为超纯水(电阻率达到18.2MΩ.cm);硫酸钠为分析纯;0.1%甲酸溶液(含2.5mmol/L醋酸铵)。
标准储备液及工作液的配制:分别称取标准品各10.0 mg,用甲醇溶解后转移至100mL棕色容量瓶中,用甲醇定容,于-20℃条件下保存。使用时将上述标准储备溶液混合,用甲醇稀释成不同浓度的标准工作液。
1.2 分析条件
1.2.1 色谱条件
色谱柱为C18(Kenetex C18, 2.1×100mm, 2.6μm);进样体积为10μL;柱温为30℃;流动相:A为0.1%甲酸水溶液(含2.5mmol/L醋酸铵),B为乙腈,流速为0.2mL/min;梯度条件见表1。
1.2.2 质谱条件
大气压电喷雾离子源(ESI),正离子模式;毛细管电压为4000V,雾化器压力为38psi,氮气温度为350℃,流速为9L/min;采用多反应监测(MRM)模式,各种药物的采集参数见表2。
1.3 样品前处理
准确称取5.0g均质样品置于50mL具塞离心管中,10g无水硫酸钠,再加入20mL乙腈,均质1min,于涡旋混合器上提取1min,以4000r/min离心5min,收集上清液。残渣再加入20mL乙腈提取。合并乙腈提取液,加入10mL异丙醇45℃旋转蒸干。准确加入2.0mL甲醇水(体积比为20:80,水为0.1%甲酸水)涡旋振荡溶解残留物,再加入2.0mL正己烷涡旋混合1min,转移于5mL具塞离心管中,以4000r/min离心5min,取下层液体过0.22m滤膜,滤液用于LC-MS/MS测定。
2 结果与讨论
2.1 结果
2.1.1 线性关系
测定各药物质量浓度均为25,50,100,200,500μg/L的混合标准溶液,得到的线性回归方程。各药物均在25~500μg/L进样质量范围内与其峰面积呈线性关系,相关系数均大于0.99。
2.1.2 检测限和定量限
在5μg/kg添加水平时,各药物峰的信噪比均大于3,故将其定为检出限。在10μg/kg添加水平时,各药物峰的信噪比均大于10,且回收率、相对标准偏差(RSD)满足条件,故将其定为定量限。
2.1.3 回收率和精密度
分别称取2份阴性虾试样,添加混合标准溶液,使加标水平分别达到5,10μg/kg,充分混匀,按照本文建立的方法进行测定,每个添加水平作6份平行测定。结果见表2。
续表
*quantification irons.
2.2 讨论
2.2.1 色谱柱的选择
文献[7,8]报道用于SAs分析的色谱柱多采用反相色谱柱,如C8、C18柱。实验分别对Eclipse Plus C18,ZORBAX SB-C18和Kenetex C18色谱柱进行比较,结果发现:在Eclipse Plus C18,ZORBAX SB-C18上一些SAs没能得到很好的分离;而采用Kenetex C18时各种SAs均获得良好的分离效果且比较稳定,并且在普通液相上实现了很好的分离效果。
2.2.2 流动相的选择
流动相的pH值对SAs的分离和保留具有显著的影响。虽然质谱分析并不要求在色谱柱上完全分离,但所要分析的SAs药物中存在3组母离子和子离子均相同的化合物(磺胺邻二甲氧嘧啶和磺胺间二甲氧嘧啶,磺胺氯哒嗪和磺胺氯吡嗪,磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪和磺胺邻甲氧嘧啶),对于这类化合物的质谱分析则要求必须在色谱柱上分离,否则会互相干扰测定。采用0.1%甲酸来控制流动相的pH值,同时在流动相的水相中加入醋酸铵,可以在保持较好分离度的前提下获得理想的色谱峰、减小加合峰、增大分子离子峰的峰强度。本文采用乙腈、0.1%甲酸溶液(含2.5mmol/L醋酸铵)为流动相,采用合适的梯度淋洗条件,很好地实现了SAs的分离,并且各峰峰形尖锐,峰对称性好。
2.2.3 质谱条件的优化
根据磺胺类化合物具有仲氨基或叔氨基的化学电离性质,选用ESI+作为离子化模式,采用仪器自带优化软件opitimer进行质谱条件的优化,实验结果表明,磺胺在离子源ESI+电离方式下,可获得较高丰度的[M+H]+母离子。另外,分析目标物中存在三组母离子和子离子均相同的化合物,在数据分析时,软件自动处理会出现三组分析物的识别错误,必须手动加以修改,这给数据分析带来极大的不方便,可以采用分时间段扫描的方法,在提高灵敏度的同时,增加数据处理的方便性,但是磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪的保留时间软件仍无法区别,必须手动输入。
3 结 论
本文建立了虾中16种磺胺类药物残留的HPLC-MS/MS测定方法。方法准确度和精密度高,且方法的定量限达到5μg/kg,能够满足美国、日本、欧盟等国家的出口限量要求,并且已经用于水产品中磺胺类药物残留的确证检验。所建立的多残留检测方法大大地提高了检测的稳定性和可靠性,对水产品的安全卫生工作意义重大。
参考文献
[1]张海琪,宋琍琍,等.液相色谱-串联质谱法同时测定大黄鱼中20种磺胺类药物残留[J].分析化学研究简报,2007,35(2):268.
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[3]Editorial Board of the Residue Limits of the Agricultural Chemicals inFood.Residue limits of the agricultural chemicals in food.Food vol-ume:Japan positive list system.Beijing:China Standard Press.
[4]张鸿雁,崔小军,等.动物源性食品中磺胺类药物的多残留酶联免疫测定方法研究进展[J].食品研究与开发,2008,29(9):181.
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[6]李存,江海洋,等.高效液相色谱-荧光-紫外法测定动物肌肉组织中多类药物残留[J].分析化学(FENXI HUAXUE)研究报告,2009,37(8):1102.
[7]董丹,邵兵,等.液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱法测定鸡肉中17种磺胺类药物的残留[J].色谱,2005,23(4):404.
液相质谱法 篇10
目前用于该种药物的检测方法有:微生物法、薄层色谱法、分光光度法、化学发光法、液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等[3]。已有的方法存在灵敏度不高、前处理繁琐或重现性不好等问题, 很难满足对药物残留的确证检测[4]。本方法选用鸭肌肉组织为分析对象, 建立了一种检测四环素类药物的快速、简便、灵敏度高的液相色谱-串联质谱 (LC-MS-MS) 方法, 可以满足当前该类药物的残留检测。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂
Waters2695 Quattro micro液质联用仪 (美国WATERS公司) ;高速冷冻离心机 (美国Sigma公司) ;固相萃取装置 (美国Supelco公司) ;旋转混合器 (IKA公司) ;PL203电子天平 (瑞士Mettler-toledo公司) ;氮吹仪 (美国OA-SYS公司) ;酸度计PB-21 (美国Orion公司) ;Sep-pak C18 6CC萃取小柱 (500 mg) 。
四环素、土霉素和金霉素的盐酸盐标准品购自中国兽医药品监察所, 纯度>99.5%;甲醇、乙腈为默克公司的色谱纯;甲酸为美国ACS恩科公司的色谱纯;柠檬酸 (含一个结晶水) 、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠、氢氧化钠均为分析纯;所用水为屈臣氏瓶装纯净水。
1.2 试验方法
1.2.1 标准储备液配制
分别取盐酸四环素、盐酸土霉素和盐酸金霉素对照品适量, 精密称定。按四环素、土霉素和金霉素计, 用甲醇溶解并稀释成浓度均为1 mg/m L的溶液, 作为标准储备液。置-20℃冰箱中保存。
1.2.2 四环素、土霉素和金霉素工作液
精密量取标准储备液适量, 用甲醇-水 (3:7, V/V) 溶液稀释成适宜浓度的四环素、土霉素和金霉素标准工作液。
1.2.3 Mc Ilvaine-Na2EDTA缓冲液
分别取柠檬酸12.9 g, 磷酸氢二钠10.9 g, 乙二胺四乙酸二钠37.2 g, 加水900 m L溶解, 用1 mol/L氢氧化钠溶液调p H值至4.0±0.5, 加水稀释至1 000 m L, 即得。
1.2.4 样品前处理方法
称取均质的鸭肌肉组织2.0 g, 置于50 m L离心管中, 加入Mc Ilvaine-Na2ED-TA缓冲液8 m L, 涡旋充分混匀, 10 000 r/min离心10 min (温度为4℃) , 取上清液于另一离心管中。重复提取一次, 合并上清液, 经快速滤纸过滤后备用。Sep-pak C18固相萃取柱依次用甲醇5 m L、水5 m L预洗。取备用液8 m L过柱, 用3 m L10%甲醇水溶液淋洗, 减压抽干。用5 m L5%氨水甲醇溶液洗脱, 收集洗脱液, 氮气吹干 (温度低于40℃) 。最后用甲醇-水 (3:7) 1.0 m L溶解残留物, 过滤膜后作为试样溶液, 供高效液相色谱-串联质谱仪测定。
1.3 色谱条件
色谱柱:Xbridge C18 2.1*150 mm, 粒径5μm。流动相A为0.3%甲酸乙腈溶液;B为0.3%甲酸水溶液。柱温:35℃, 进样体积20μL, 流速:0.2 m L/min。流动相梯度洗脱条件见表1。
1.4 质谱条件
采用电喷雾正离子检测;毛细管电压:3.8 k V;锥孔电压:25 V;离子源温度110℃;雾化温度:350℃。质谱参数见表2。
2 结果与分析
2.1 标准曲线
分别精密量取标准储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 m L置于10 m L容量瓶, 稀释成含四环素、土霉素和金霉素分别为5、10、20、50、100、200、400 ng/m L的溶液, 见表3。
2.2 方法的检出限和定量限
将标准溶液用样品空白基质稀释后进样, 进样量为20μL, 以信噪比为3倍时的溶液浓度为检出限, 由此得出四环素、土霉素、金霉素的检出限 (LOD) 分别为5 ng/m L、5 ng/m L、10 ng/m L, 结果见表3。以信噪比为10倍的溶液溶度为定量限, 称样量为2.0 g, 前处理后定容至1.0 m L, 则四环素、土霉素、金霉素的定量限均为20 ng/m L。
2.3 方法的精密度和准确度试验
取经检测四环素、土霉素、金霉素含量低于检测限度的鸭肉, 分别添加一定浓度的标准溶液, 相当于50、100和200ug/kg (即1/2的MRLVDs、MRLVDs和2倍的MRLVDs) 3个浓度水平, 每个浓度5组平行样, 按1.2.2所述方法提取制备后进行处理, 进行回收率试验和精密度试验, 回收率均在80.6%~106.3%, RSD均在0.6%~4.2%, 符合方法学要求, 结果见表4。
3 结论
本研究建立了鸭肉中四环素类抗生素的定性和定量方法。样品在4℃条件下高速冷冻离心, 可以较好地去除油脂类杂质, 同时, 收集液用快速滤纸过滤, 极大地加快了固相萃取小柱的净化洗脱速度, 整个前处理过程具有分离度高、快速的特点, 最后用甲醇-水溶解残余物, 可以确保样品溶液的稳定性和检测的灵敏度。
采用该方法, 检测了南方樱桃谷肉鸭生态养殖技术集成与示范项目的鸭肉192批次, 结果均未检测出该类药物, 说明该方法可用于实际样品的测定。
注:带*为定量离子。
摘要：采用液相色谱-串联四极杆质谱多离子反应监测定量法, 通过对试样净化预处理、色谱条件、质谱参数等的优化选择, 进行回收率、精密度等的验证, 建立了快速、准确测定鸭肉组织中四环素、土霉素、金霉素的检测方法。在10400 ug/L浓度范围内, 3种四环素类药物均呈线性, 相关系数r均大于0.99, 回收率均在80.6%106.3%。采用该方法检测了樱桃谷肉鸭192批, 均为阴性。
关键词：液相色谱-串联质谱法,四环素,土霉素,金霉素
参考文献
[1]滑静, 王建立, 张淑萍.动物性食品中四环素类药物残留的检测方法[J].药物检测, 2004, 21 (7) :26-33.
[2]李俊锁, 邱月明, 王超.兽药残留分析[M].上海:上海科学技术出版社, 2002:365.
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液相质谱法 篇11
关键词 罗丹明B；超高压液相色谱串联质谱
中图分类号 O657 文献标识码 A 文章编号 1673-9671-(2012)051-0216-02
罗丹明B（rhodamine B），俗称花粉红，分子式为C28H31ClN2O3，分子量479，是一种碱性荧光染料，由于其颜色鲜艳，不易退色，并且价格低廉作为荧光试剂已被广泛用于食品、环保、矿业和钢铁等领域。而有关研究[1]表明，罗丹明B会引致老鼠皮下组织生肉瘤，半数致死量（大鼠，经口）500 mg/kg，美国曾对该物质进行研究，显示其具有致癌性，由于其潜在的危害性，欧盟等国已不允许使用。目前食品中罗丹明B的检测方法主要有固相萃取-液相色谱法，凝胶色谱净化浓缩后串联质谱法。2011年各地质监局开展了食品中违法添加罗丹明B的专项检查，建立一种快速准确的检测方法在质检日常检测工作中显得尤为重要。本文采用有机溶剂快速提取后，用UPLC-MS/MS进行测定，外标峰面积定量，建立适用于食品中罗丹明B的检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
罗丹明B标准品（Rhodamine B，CAS号：81-88-9，C28H31ClN2O3，纯度≥99.0%）；甲醇、甲酸、乙腈（均为色谱纯）Merck公司。Waters PDA TQD高效液相色谱串联质谱仪（配超高效液相色谱系统，包括四流路二元泵、自动进样器、柱温箱、电喷雾离子源（ESI）、三重四级杆质量分析器）美国Waters公司；MultiReax振荡混匀器，Heielolph公司；Allegra X-22R冷冻离心机，美国贝克曼库尔特公司；0.22 μm针式过滤器等。
1.2 标准储备液及工作液的配制
准确称取适量罗丹明B标准品，用乙腈配制成质量浓度为100 μg/mL的标准储备液。此溶液在0℃～4℃避光保存，可使用3个月。标准工作溶液：取适量标准溶液配制成浓度为1.0 ng/mL，5.0 ng/mL，10.0 ng/mL，25.0 ng/mL，50.0 ng/mL，100 ng/mL的工作曲线溶液，避光保存。
1.3 液相色谱-质谱条件
色谱柱：Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱温：30℃；流动相A：甲醇（含0.1%甲酸溶液），流动相B：水（含0.1%甲酸溶液）梯度洗脱程序见表1；流速：0.25 mL/min；进样量：5 μL；离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子；检测方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：130℃；脱溶剂气温度：400℃；锥孔气流量（氮气）：50 L/h；脱溶剂气流量（氮气）：600 L/h；碰撞气压力（氩气）：0.18 mL/min；定性离子对、定量离子对、锥孔电压、碰撞能量、驻留时间见表2。
1.4 样品前处理
称取2.0样品于50 mL离心管中，准确加入10 mL乙腈，于振荡混匀器上混匀振荡30 min，于8000 r/min离心10 min，上清液过
0.22 μm微孔滤膜后直接进样。
2 结果与分析
2.1 提取方法的优化
在前处理方法的试验过程中，首先采用了固相萃取方法，选择了OASIS 的HLB小柱，菲罗门的C18小柱，其回收率在70%-128%之间，回收率不稳定且方法繁琐。同时我们采用了GPC作为净化手段，样品经过净化后杂质减少，但是处理一个样品耗时长，有机试剂量大，不适用于日常工作中大批量样品的快速分析，后我们采用乙腈直接提取，通过高速离心去掉大部分杂质，方法回收率好，操作简单快速。
2.2 色谱质谱条件的确立
通过梯度洗脱程序优化，罗丹明B保留时间为2.0 min，峰形对称尖锐；通过对质谱参数的优化，确定了最佳实验参数，罗丹明B标准品的色谱图见图1。
2.3 线性范围和检出限
配制罗丹明B质量浓度为0.5、1、2、5、10、50 ng/mL的标准溶液，测定峰面积，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准溶液的工作曲线，在0.5 ng/mL～10 ng/mL质量浓度范围内，标准品质量浓度与峰面积值均有良好的线性关系。本方法的检出限为5 μg/kg，满足国家风险监测中对罗丹明B检测的限量要求。
2.4 加标回收率和测定精密度
取空白辣椒样品，加入不同浓度的标准品做加标回收试验，分别添加5.0 μg/kg、10.0 μg/kg、50.0 μg/kg三个不同水平质量浓度，每个添加水平做6个平行样品，表3数据表明该方法测定罗丹明B精密度和回收率良好。
3 结论
使用乙腈对样品中的罗丹明B进行提取后用UPLC-MS/MS进行分析，样品前处理简单快速，方法回收率好检测限低，有利于监督部门开展大量的日常检测工作。
参考文献
[1]吴云龙,熊玉峰,房晖.一种潜在的激光制冷介质-罗丹明B掺杂PMMA[J].功能材料与器件学报,2004,10(2):383-396.
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[3]黄亮.固相萃取-液相色谱法测定食品中罗丹明B[J].食品工业,2011,8:114-116.
液相质谱法 篇12
1 材料和方法
1.1 试剂和材料
乙腈(HPLC级),甲醇(农残级),三环锡(97%)标准品一德国DR·EHRENSTORFER公司。
1.2 主要设备
液相色谱仪:岛津公司LC20AD配用SIL20A自动进样器,MS/MS:ABSCIEX API3200。
1.3 实验方法
(1)混匀蜂王浆后,称取2.00 g样品于离心管中,加水5 ml,加1%乙酸乙腈25 ml,棒状均质器均质2 min,取重量1/10至离心管,加5 ml 50%甲醇溶液,涡旋5 min后为A液。将OASIS HLB(60 mg)固相萃取柱,加5 ml甲醇,5 ml水,平衡柱子(或称活化)。将A液加到活化后的柱上,用5 ml50%甲醇溶液淋洗,滤液弃去,抽干3 min。准确加2 ml 1%甲酸甲醇溶液洗脱,离心管接收洗脱液,抽干(定容),超声混匀后,过0.2μm微孔滤器,供LC-MS/MS分析。
(2)质控实验:称取检测相同质量样品,添加浓度1μg/ml的标准溶液20μl、25μl、50μl,用与检测样品同样的方法进行处理。同时作7组相同实验,以确定回收率。
(3)标准工作曲线:配成1 ng/g、2 ng/g、10 ng/g、20 ng/g、50 ng/g标准溶液,以供LC-MS/MS测试使用。
1.4 液相色谱条件
色谱柱:symmetry C18 150 mm×2.1 mm,5μm;柱温:40℃;进样量:10μl;流动相:A:0.1%甲酸2 mmol/L乙酸铵/水梯B:甲醇;梯度:(如表1)。
1.5 质谱条件
ESI+;IonSpray Voltage5000;C U R:18.0;Collision Gas:6;Tem perature:450℃;GS1:60;GS2:60(如表2)。
2 结果与分析
2.1 标准曲线、线性范围和相关系数
分别配制相当于样品中1 ng/g、2 ng/g,10 ng/g、20 ng/g、50 ng/g浓度的标准溶液,进样检测,建立回归曲线。得到回归方程Y=4.52e03+939,相关系数为r=0.998,线性范围1～50 ng/g。
2.2 特征离子谱图(20 ng/g)(如图1)
2.3 样品添加回收率和检测限
以空白蜂王浆添加浓度为20 ng/g、25 ng/g、50 ng/g进行7次测定,平均回收率为80%～105%,相对标准偏差3.9%～8.8%。以10倍信噪比计算,仪器定量限为1 ng/g。
3 讨论
三唑锡在环境中水解为三环锡,所以本方法采用检测三环锡为目标物的分析方法。中国商检行业标准采用含有溴化氢环境的丙酮溶液提取,使用石油醚进行反萃取,再进行减压浓缩来进行脱换溶剂,过程复杂,耗时长;而本方法,采用与水可任意比混溶的酸化乙腈来提取,经过SPE小柱精制后,样液直接进入仪器进行分析。有多种气相分析方法,前处理采用后氢化试剂、烷基化试剂等;而本文不采用衍生实验,直接提取分析,工作效率高,采用LCMSMS来进行目标物的定性,结果准确,为采用液相色谱分析的科学方法。
摘要：本实验研究建立了蜂王浆中三唑锡残留量的液相色谱-质谱串联检测方法。三环环锡经过酸化乙腈提取,经固相萃取柱,C-18色谱柱梯度洗脱分离,取36 5.1→201.1,365.1→283.2,365.1→219.1 m/z为主要特征离子365.1→201.1 m/z为定量离子,以三重四级杆为质量检测器检测三环锡的方法。该方法线性范围:150 ng/g,仪器检出限:1 ng/g:添加浓度20 ng/g、25 ng/g、5 0 ng/g回收率:80%105%,相对标准偏差3.9%8.8%。
关键词：液质质联用,质谱表征,蜂王浆,三环锡
参考文献
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