高效液相色谱荧光检测

高效液相色谱荧光检测（精选12篇）

高效液相色谱荧光检测 篇1

复方刺五加片由刺五加浸膏、玉竹、黄芪、当归、维生素B1组成, 其质量标准收载于卫生部颁药品标准中药成方制剂第四册, 尚未建立维生素B1含量测定项目。文献报道[1]复方刺五加片中维生素B1的测定方法为高效液相-紫外检测法, 鉴于荧光检测具有较强的专属性和高度的灵敏性, 本实验根据维生素B1的理化特性与光谱特点, 参考吕惠卿[2]采用高效液相-荧光检测法对复方刺五加片中维生素B1进行测定, 实验证明, 该方法专属性强、灵敏度高、结果准确, 为制定该制剂的质量标准提供依据。

1 仪器与试药

Agilent1260高效液相色谱仪、G1321B荧光检测器 (美国Agilent公司) , XS205DU电子分析天平 (瑞士梅特勒公司) 。维生素B1对照品 (中国药品生物制品检定研究院, 批号:10039-200703, 供含量测定用) , 复方刺五加片 (市售:批号分别为20130203和130104) 。甲醇为色谱纯, 其它试剂为分析纯, 水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱:

PAKC18键合硅胶柱 (250 mm×4.6 mm, 5μm) ;流动相:甲醇-0.02M乙酸铵 (35:65) , 激发光波长365 nm, 发射光波长475 nm;流速1.0 ml/min;柱温:25℃;进样量10μl。

2.2 溶液制备

2.2.1 碱性铁氰化钾溶液

称取铁氰化钾0.2 g, 加水10 ml, 摇匀后加入0.1 g/ml氢氧化钠400 ml, 摇匀, 即得。

2.2.2 供试品溶液

取本品20片, 除去糖衣, 研细, 精密称取相当于1片的量, 置100 ml量瓶中, 加水适量, 超声提取5 min, 加水至刻度, 摇匀, 取溶液1.0 ml加水至10 ml, 加入碱性铁氰化钾溶液5 ml, 振摇2 min, 加入正丁醇10 ml, 振摇3 min, 放置, 取上清液过滤, 即得。

2.2.3 对照品溶液

精密称取维生素B1对照品10.16 mg, 置200 ml量瓶中, 加水至刻度, 摇匀, 即得对照品贮备液, 精密量取1.0 ml, 同供试品溶液制备项下制得对照品溶液。

2.2.4 阴性样品溶液

称取除维生素B1以外的其他药材, 照复方刺五加片的制备工艺和供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。

2.3 干扰试验

按上述色谱条件, 分别精密吸取维生素B1对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10μl, 进样测定, 供试品溶液主峰的保留时间与对照品溶液主峰的保留时间一致, 阴性样品色谱图在此保留时间无干扰。

2.4 线性关系考察

精密吸取维生素B1对照品贮备液0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.5、2.0 ml, 分别置于25 ml的比色管中, 各管加水至10 ml, 同供试品溶液制备项下的方法制得系列溶液。按上述色谱条件测定, 以浓度为横坐标, 峰面积为纵坐标, 得回归方程为Y=10.900X-11.333, r=0.9998, 结果表明, 维生素B1在5~100μg范围内具有良好的线性关系。

2.5 精密度试验

取同一对照品溶液连续进样6次, 测定其峰面积, 其RSD=0.32%, 结果表明:该方法精密度较高, 能够满足实际样品的测定。

2.6 重复性试验

取同一供试品6份, 按“供试品溶液制备”方法制备, 按上述条件测定, 结果的RSD=1.60% (n=6) , 表明重复性好。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液, 按上述色谱条件每隔3 h测定1次, 共计测定5次, 结果表明, 在12 h内稳定。

2.8加标回收率试验

取已知含量的供试品细粉6份, 称样量相当于半片重, 置100 ml量瓶中, 分别加入维生素B1对照品贮备液50 ml (浓度为0.05 mg/ml) , 同供试品溶液的制备项下方法操作, 测定其维生素B1的含量, 结果平均回收率为98.12%, RSD=1.17% (n=6) 。

2.9 样品含量测定

按“2.2.2”供试品溶液的制备方法和“2.1”色谱条件试验, 测定两批复方刺五加片中维生素B1的含量, 外标法计算含量, 结果2批样品含量分别为:批号:20130203, 4.92mg/片, RSD1.43%;批号:130104, 4.97 mg/片, RSD1.28%。

3 讨论

3.1 测定波长的选择

参考吕惠卿[2]测定波长, 并经G1321B荧光检测器多波长检测, 结果表明:维生素B1在λex365 nm, λem 475 nm处有最大响应值, 故采用λex 365 nm, λem 475 nm作为检测波长。

3.2 流动相的选择

选用甲醇-0.02M乙酸铵 (35:65) 作为流动相, 经实验证明, 维生素B1峰与相邻峰有效分离, 故选用甲醇-0.02M乙酸铵作为流动相[2]。

摘要：目的 建立高效液相-荧光检测法测定复方刺五加片中维生素B1含量。方法 采用PAKC18柱, 流动相为甲醇-0.02M乙酸铵 (35:65) , 流速为1.0 ml/min, 进样量为10μl, 荧光检测激发光波长为365 nm, 发射光波长为475 nm。结果 维生素B1含量在5100μg之间线性关系良好 (r=0.9998) , 平均回收率为98.12%, RSD=1.17% (n=6) 。结论 方法准确、专属性强、灵敏度高, 为制定该制剂的质量标准提供依据。

关键词：高效液相-荧光检测法,复方刺五加片,维生素B1

参考文献

[1]杜波, 王金杰, 荆维荣.高效液相色谱法测定复方刺五加片中维生素B1的含量.中国伤残医学, 2011, 19 (2) :27-28.

[2]吕惠卿.高效液相色谱-荧光检测法测定复合维生素B片中维生素B1含量.中国药业, 2008, 17 (15) :24-25.

高效液相色谱荧光检测 篇2

基于氟喹诺酮类药物与铽离子形成配合物后的荧光增强作用,建立了同时检测鸡肉中氟喹诺酮类(FQs)药物--环丙沙星、诺氟沙星和恩诺沙星残留的`Tb3+增敏高效液相色谱(HPLC)柱后衍生荧光检测方法.优化的实验条件如下:流动相为0.05 mol/L醋酸/醋酸钠缓冲液(pH 6.0)-乙腈(体积比为89:11),色谱柱为Hypersil BDSC18,柱温40 ℃,流速0.8 mL/min;Tb3+浓度为8×10-5 mol/L;衍生反应温度40 ℃,衍生泵流速0.5 mL/min;荧光检测激发波长271 nm,发射波长545 nm.实验结果表明,将上述3种药物以1.0,10.0,50.0,100.0 ng/g水平添加到鸡肉后的回收率范围为66.3%～88.0%,相对标准偏差(RSD)均小于15.0%.定量分析的线性范围为0.1～500 n/mL,方法的日内和日间RSD均小于13.0%;最低检出限分别为0.05(环丙沙星)、0.05(诺氟沙星)和0.08(恩诺沙星)ng/g,比前人报道的非衍生高效液相色谱荧光检测法检测FQs药物的灵敏度有极大的提高.该项研究为FQs药物多残留检测提供了灵敏度更高的新方法.

作 者：祁克宗 朱良强 孙国仁 施祖灏 彭开松 QI Kezong ZHU Liangqiang SUN Guoren SHI Zuhao PENG Kaisong 作者单位：祁克宗,孙国仁,施祖灏,彭开松,QI Kezong,SUN Guoren,SHI Zuhao,PENG Kaisong(安徽农业大学动物科技学院,安徽,合肥,230036)

朱良强,ZHU Liangqiang(安徽省兽医工作站,安徽,合肥,230022)

高效液相色谱荧光检测 篇3

高效液相色谱技术概述

在色谱法中，高效液相色谱技术是重要分支，使用的流动相为液体，能够利用高压输液系统将流动相泵入色谱柱。而色谱柱内装有固定相，能用于进行不同极性单一溶剂、缓冲液和不同比例混合溶剂的分离，并将分离得到的各成分送入检测器，以实现试样分析。作为在农学、化学和商检等多个领域得到应用的重要分离分析技术，该技术具有较低检测限度，并且灵敏度较高，因此能够在食品检测中得到运用。

高效液相色谱技术在食品检测中的运用分析

在营养成分检测中的运用。在食品检测中，高效液相色谱技术可用于检测营养成分。在食品中的糖含量检测上，运用该技术能够完成多种糖的测定，比如酒类糖分和果聚糖异构体等。在脂肪酸检测方面，运用该方法能够对二十碳五烯酸等脂肪酸物质进行检测，从而为食品的加工、贮存和配比提供科学依据。而蛋白质具有相对分子量大和易发生变性等特点，以至于难以实现分离分析。运用高效液相色谱技术，则可以完成蛋白质和氨基酸分离，所以能够对这些营养成分进行灵敏测定。在食品保鲜方面，有机酸发挥着防腐的作用，同时也是食品鲜味和酸味的组成成分之一。运用高效液相色谱法进行检测，可利用反向C18柱完成有机酸分离，然后利用紫外吸收检测器等设备进行乳酸、柠檬酸和苹果酸等物质的检测。此外，在维生素检测上，可运用高效液相色谱法进行保健食品中多种水溶性维生素的检测。

在添加剂检测中的运用。在食品加工过程中，一般都要使用添加剂进行食品色、香、味得到改进，并对食品进行保鲜。而添加剂为人工合成或天然的物质，可以划分为甜味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂等。但是，人工合成的添加剂具有一定毒性，需限制其使用，所以还要进行食品中添加剂含量的检测。在甜味剂检测方面，运用高效液相色谱技术使用的色谱柱通常为C18柱、-NH2柱和阴离子交换柱，使用的检测器包含电导检测器和紫外-可见光检测器，可完成甜蜜素、糖精钠、安赛蜜和甜味素等多种甜味剂的测定。在防腐剂检测方面，可使用R高效液相色谱法进行脱氢乙酸、BA和对羟基苯甲酸乙酯等防腐剂的测定，具有准确、灵敏和操作简便的特点。在色素检测方面，联合使用高效液相色谱技术和紫外-可见光检测器，并使用C18柱分离的梯度洗脱系统，可完成胭脂红、亮蓝、柠檬黄和日落黄等多种色素的测定。在抗氧化剂检测方面，运用R高效液相色谱法能够完成油脂中的9种抗氧化剂的同时测定，最低检测浓度可以达到2mg/kg。另外，运用高效液相色谱法进行BHA、PG、BHT等物质的分离，可分别达到84%、95%和99%的样品回收率。运用高效液相色谱法检测食品中的增白剂，可使用阴离子柱进行亚硫酸盐的分离，最低检出限能够达到0.2μg/kg。

在有毒有害物质检测中的运用。在食品中，可能含有多种有毒有害物质，如农药兽药残留和霉菌毒素等。如果误食含有霉菌毒素的食品，可能导致人出现急性或慢性中毒现象，甚至引发人体细胞癌变。运用高效液相色谱法，可进行食品中霉菌毒素的检测。从原理上来看，利用该方法能够结合不同微生物的化学组成或代谢产物进行样品中各种细菌的分析，以确定病原微生物的特异性化学组分，进而判定食品是否存在微生物超标问题。比如，在黄曲霉毒素检测方面，运用高效液相色谱法和质谱法进行食品检测，最低检测限可达0.02μg/kg，回收率则在77%-102%范围内。在农兽药残留检测方面，运用高效液相色谱法可完成热稳定性差和沸点高的农药残留检测，使用的色谱柱通常为C18或C8，联合使用的检测器包含荧光检测器、紫外检测器等。比如，联合使用高效液相色谱法和紫外检测器，可完成除虫脲、氟苯脲等蔬菜中苯甲酰脲类农药残留量的测定。此外，还可以利用高效液相色谱法与质谱法完成水果、蔬菜等多种食品中四溴菊酯残留检测。在兽药检测方面，联合使用高效液相色谱法和质谱法，则能完成多种磺胺类药物残留的测定，检出限在1.0-4.5μg/L的范围内，回收率在92%-100%之间，具有准确、方便和快速等检测优势。

通过分析可以发现，由于具有检测灵敏度高、分离效能高和分析速度快等优点，高效液相色谱法在食品营养成分、添加剂和有毒有害物质检测等方面得到了广泛应用，所以能够为食品安全提供更多保障。而相信随着该项技术的不断发展，其未来也将在食品检测领域获得更好的发展前景。

（作者单位：南京汉钦食品有限公司）

高效液相色谱荧光检测 篇4

关键词：金丝桃素,高效液相色谱-荧光检测法,组织分布,药动学

贯叶连翘又名圣约翰草,为多年生金丝桃科金丝桃属的草本植物。贯叶连翘是近年来国际上最畅销草本之一,也是国际医药市场上最重要的抗抑郁植物制剂原料。金丝桃素是贯叶连翘中最具有生物活性的物质,近年来国内外研究发现其具有优良的生物活性,具有抗抑郁、抗病毒和光活性作用,且具有抗逆转录病毒作用,对艾滋病、肿瘤有治疗作用,深受国际医药界重视。以金丝桃素为主要成分治疗抑郁症、甲型肝炎、乙型肝炎及获得性免疫缺陷综合征的药物在德国、英国等国家已上市[1,2,3,4]。本实验采用灵敏度较高的高效液相色谱-荧光检测法,通过静脉注射和灌胃2种给药途径,对贯叶连翘提取物中金丝桃素在小鼠体内的药动学和组织分布情况作了初步探讨,为开发金丝桃素新制剂提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物:

昆明系小鼠,由河北医科大学实验动物中心提供,清洁级,合格证号: 7080118。

1.1.2 药品与试剂:

贯叶连翘提取物(含金丝桃素0.3%,西安天一生物技术有限公司);金丝桃素对照品(上海融禾医药科技有限公司,批号:061230);甲醇(美国TEDIA公司,批号:610078);四氢呋喃(天津市博迪化工有限公司,批号:20070309);乙腈(美国TEDIA公司,批号:608062);磷酸二氢钠(天津市永大化学试剂开发中心,批号:20070315)。色谱分析使用色谱纯;其他试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器:

医用离心机(北京医用离心机厂),旋涡混合器(常州国华仪器厂),Waters高效液相色谱仪600E、四元泵/2475型荧光检测器(美国Waters公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 金丝桃素标准液及提取物溶液的制备:

精密称取金丝桃素对照品配制成100μg/ml的贮备液,精密吸取贮备液一定量,分别配制成0.05、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0μg/ml的系列标准溶液。取贯叶连翘提取物配制成18mg/ml的水溶液,备用。

1.2.2 体内样品色谱条件:

色谱柱规格:YMGC18柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相∶ 甲醇∶四氢呋喃∶0.1mol/L磷酸盐缓冲液=45∶30∶25;流速:1.0ml/min; 激发波长:315nm,检测波长:590nm;柱温:35℃。

1.2.3 小鼠生物样品处理及色谱行为:

取小鼠空白血浆100μl,精密加入10.0μg/ml金丝桃素标准液100μl,加入乙腈500μl,涡旋1min后以 6000r/min离心10min,吸取上层有机相,微孔滤膜过滤后,取 20μl进样,入 HPLC分析。另取小鼠空白血浆100μl,精密加入贯叶连翘提取物水溶液100 μl,加入乙腈500μl,,涡旋1min后以 6000r/min离心10min,吸取上层有机相,微孔滤膜过滤后,取20μl进样,入高效液相色谱(HPLC)分析。小鼠空白血浆同法操作。 取小鼠心、肝、脾、肺、肾及脑组织样品,分别精密称质量,加生理盐水制成组织匀浆,取100μl 组织匀浆,处理方法同血浆。

1.3 金丝桃素标准曲线的测定

分别取空白小鼠血浆及心、肝、脾、肺、肾及脑匀浆样品100μl,精密加入上述标准溶液100μl,使金丝桃素的血浆浓度分别为0.025、0.25、0.5、1.25、2.5、5.0、10.0μg/ml,按样品的预处理与测定方法进行处理与分析。记录样品峰面积(A),A对血浆或组织匀浆液中药物浓度(C)进行线性回归,得到血浆及各组织样品的回归方程。

1.4 精密度和回收率

取小鼠空白血浆及各组织匀浆100μl,分别加入0.5、2.5、10.0μg/ml的金丝桃素标准液100μl,使血浆浓度分别为0.25、1.25、5.0μg/ml,在1d内处理、测定5次,并连续5d分别提取测定,计算日内和日间差异。分别取上述3种浓度的血浆样品,在同1d内提取,测定,将测定结果代入标准曲线方程,计算回收率。

1.5 金丝桃素在小鼠体内的分布和药动学分析

选取体质量为(25±5)g的健康成熟昆明小鼠132只,雌雄各半,随机分成22组,每组6只,其中11组按相当于0.36mg/kg(以金丝桃素计)剂量给予贯叶连翘提取物灌胃,另11组按同等剂量给予小鼠尾静脉注射。分别于给药后1、5、10、20、30、40、60、90、120、180、240min时采眼球血,置肝素化试管中,4000r/min离心10min分离血浆,按样品处理方法操作;并取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑等组织,定量称取各组织,按样品处理方法操作。样品入HPLC分析。采用中国药理学会数学药理委员会编制的3P97药动学程序对2种给药途径所得到的药物浓度-时间数据进行处理。

2 结 果

2.1 方法专属性

小鼠空白血浆色谱图、空白血浆加入对照品、提取物及给药后血浆样品色谱图显示:金丝桃素保留时间为17min,表明在所选用的测定条件下,内源性物质均不干扰测定,方法的专属性较好。见图1~4。

2.2 标准曲线和线性范围

血浆和各组织的线性范围及线性方程及相关系数见表1。

2.3 精密度和回收率

各浓度的血浆和组织样品所测日内差异结果RSD≤3.9%(n=5),日间差异结果相对标准差(RSD)≤4.4%(n=5),平均回收率≥90.5%,RSD≤5.0%。

2.4 给药后血浆和组织浓度

血药浓度-时间曲线结果显示:静脉注射后药时曲线呈现双峰,血药浓度在给药20min后迅速下降,之后趋于缓和,而灌胃给药无明显峰谷现象,整体药时曲线平缓。由组织分布结果可知,灌胃及静脉注射后金丝桃素在肝脏浓度均较高,且有一定程度的蓄积,在脾、肾、肺及脑中消除迅速,在心脏组织中未测出。见图5、表2。

注:◆:静脉给药 ■:灌胃给药

2.5 药动学分析

血药浓度-时间曲线数据以3P97程序经计算机拟合证明,灌胃和静脉注射给药均符合二室模型,绝对生物利用度为34%,药动学参数见表3。

3 讨 论

金丝桃素体外含量测定方法多采用紫外检测器[5,6],而生物样品浓度均很低,紫外检测器很难测出,利用金丝桃素分子

有荧光这一特性[7,8,9],选用荧光检测法测定金丝桃素的生物样品浓度,灵敏度高,专属性强。生物样品处理时采用乙腈为蛋白沉淀剂兼提取溶剂,可简化操作步骤,效果良好。提取物水溶液静脉注射后药时曲线出现双峰现象,而灌胃后药时曲线未出现双峰,分析原因可能是贯叶连翘提取物中其他成分对金丝桃素的体内过程产生干扰所致,具体原因有待进一步研究。

小鼠体内药动学研究表明,灌胃和静脉注射后消除半衰期均较长,药时曲线平缓,提示金丝桃素在体内的排泄或代谢较缓,在进行制剂设计时应充分考虑这一性质。金丝桃素给药后迅速分布于肝脏,并存在蓄积现象,表明金丝桃素与肝脏组织的亲和力较强,肝脏可能是其作用靶器官,对其抗肝炎病毒作用有积极意义,但是否存在蓄积毒性有待研究。

参考文献

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[2]Vacek J,Klejdus B,Kubán V.Hypericin and hyperforin:bioactive com-ponents of St.John's Wort(Hypericum perforatum).Their isolation,a-nalysis and study of physiological effect[J].Ceska Slov Farm,2007,56(2):62-66.

[3]Sosa S,Pace R,Bornancin A,et al.Topical anti-inflammatory activity of extracts and compounds from Hypericum perforatum L[J].Pharm Phar-macol,2007,59(5):703-709.

[4]Zhao J,Zhang ZP,Chen HS.Studies on synthesis and Anti-HIV RT ac-tivity of hypericin and ethylhypericin[J].Acta Pharmaceutica Sinica,1998,33(1):67-71

[5]Rückert U,Likussar W,Michelitsch A.Simultaneous determination of to-tal hypericin and hyperforin in St.John's wort extracts by HPLC with electrochemical detection[J].Phytochem Anal,2007,18(3):204-208.

[6]Rückert U,Eggenreich K,Likussar W.A high-performance liquidchrom-atography with electrochemical detection for the determination of total hy-pericin in extracts of St.John's Wort[J].Phytochem Anal,2006,17(3):162-167.

[7]Han GD.Herbal Pharmacokinetics[M].Beijing:China Medical Tech-nology Press,1999.

[8]Butterweck V,Liefl nder-Wulf U,Winterhoff H.Plasma levels of hyperi-cin in presence of procyanidin B2and hyperoside:a pharmacokinetic study in rats[J].Planta Med,2003,69(3):189-192.

高效液相色谱荧光检测 篇5

高效液相色谱法检测鸡蛋中盐酸环丙沙星残留量

[目的]建立检测鸡蛋中盐酸环丙沙星残留的高效液相色谱法.[方法]鸡蛋样品中残留药物用提取液提取、离心、蒸发,水溶解,然后用预活化的C18固相萃取小柱净化,流动相洗脱,洗脱液用HPLC检测.[结果]结果表明,该法对鸡蛋中盐酸环丙沙星的.检测限和定量限分别是50、100μg/L.在100、150、200μg/L浓度添加范围内,回收率在70%～83%,变异系数CV<10%.标准溶液在2.5-160.0μg/L的浓度范围内线性关系良好.[结论]该方法简单准确,适应于鸡蛋中盐酸环丙沙星的检测,便于推广.

作 者：马素英 杨丽娟 杨利敏 作者单位：新乡医学院药学院,河南新乡,453003刊 名：安徽农业科学 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF ANHUI AGRICULTURAL SCIENCES年，卷(期)：36(26)分类号：O657.7+2关键词：盐酸环丙沙星 残留 鸡蛋 HPLC

高效液相色谱荧光检测 篇6

摘要：多巴胺是人脑中一种重要的神经递质，帕金森病等神经系统病变与其含量异常有密切的关系。目前常用的多巴胺检测方法有光谱法、高效液相色谱法、化学修饰电极法、传感器法、毛细管电泳法，本文就高效液相色谱法做一综述。

关键词：高效液相色谱法；多巴胺；检测

中图分类号：R742.5 文献标识码：A 文章编号：1006-3315（2015）07-188-001

多巴胺（dopamine， DA）是一类儿茶酚胺类物质（CAs），它存在于神经组织及体液中，是下丘脑和脑垂体腺中的一种重要的神经递质，脑垂体内分泌功能的协调与多巴胺在脑内特定区域的分布及含量有密切关系，导致神经功能紊乱，是帕金森病（Parkinsons disease）发病的一个重要影响因素。另外，多巴胺还能够引起心脏兴奋，使血流量增加，以用于感染性休克和心源性休克。所以，进行多巴胺检测的研究具有重要的现实意义[1]。本文就多巴胺的高效液相色谱法检测作一综述。

高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[2，3]也是通用的DA的检测方法。近年来，由于高效液相色谱技术的不断发展，用HPLC法分离测定体液和组织中CAs的方法日趋完善，检测灵敏度可达pmol水平。高效液相色谱法具有高分离率，所以在CAs的分析中受到极大重视，HPLC法同电化学检测和荧光检测相结合是目前最有效且最常用的方法。CAs本身有自然荧光，经HPLC法分离后，可以利用它的荧光进行检测，但是由于其自然荧光相对比较弱，不能用作生物样品灵敏的选择性测定方法。儿茶酚胺类物质具有两个官能团（氨基和邻二羟基），因此可以通过衍生化形成具有强荧光的物质，借此提高检测灵敏度。吴予明等[4]利用HPLC和荧光检测器对嗜铬细胞瘤患者和正常人24h尿中DA含量进行测定，对样品进行调酸、萃取、调碱、吸附、洗涤、解析处理后，100微升进样，结果可见：多巴胺浓度在1.3*10-7mol/L～3.8*10-6mol/L内与色谱峰峰高的线性关系良好（r=0.998）精密度RSD（n=6）4.2%～10.3%。

衍生化可分成柱前衍生化和柱后衍生化两种，在分离前需要制备荧光衍生物的柱前衍生化是，有邻苯二甲醛（OPA）、荧光胺（FA）、丹磺酞氯（DNSCI） l，2一二苯基乙二胺（DPE）及萘一2，3一二羧醛等属于柱前衍生化试剂。这些试剂可用于尿样和一些经提纯的组织样品中的儿茶酚胺类物质的测定，但对血浆中CAs的测定灵敏度较低。

CAs与1，2一二苯基乙二胺有特异性反应，用离子交换树脂柱萃取，经过简单的提纯过程，就可以进行血浆、血红细胞和尿样中CAs的测定。Nohta等用柱前衍生化方法测定了血浆和尿样中的CAs。Ragab等用上述试剂作为HPLC法化学发光检测CAs的灵敏前置柱衍生剂，测定了CAs和异丙肾上腺素，检出限为400～120amol。目前，日本Hitachi公司已研制出基于1，2一二苯基乙二胺衍生化反应的HPLC法CAs自动分析仪，并已投放市场[5]。

参考文献：

[1] 张庆云，李佳林，郑培，李艳霞，车雨轩，董晓东.大脑神经递质多巴胺的检测方法 [J]医学研究与教育，2014，31（1）：87-90

[2] Fotpoulou Maria A， Ioannou Penelope C. Post-column terbi sensitized fluorescence detection for the determination of nopinephrine， epinephrine and domamine using high-performance liq chmmatography[J].Anal Chim Acta，2002，462（2）：179～186.

[3] 马奎蓉，权迎春，秦元满，等.手性荧光衍生化反相高效色谱法分析多巴胺[J]分析测试学报，2005，24（2）：73～75

[4] 吴予明，等.中国卫生检验杂志，2000 ，10 （5） ：526 - 528.

高效液相色谱荧光检测 篇7

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters2695 Alliance高效液相色谱仪(美国Waters公司),Waters2474荧光检测器。刀片内置式均质器;冷热恒温水浴,精度±0.5℃;旋转蒸发器等。

磺胺标准品由德国Dr.公司提供,纯度≥98.0%;实验用水为超纯水,并经0.45μm滤膜过滤;甲醇、乙腈、异丙醇、正己烷为色谱纯;无水硫酸钠分析纯;磷酸二氢钾优级纯;0.02%荧光胺丙酮溶液:称取10.0mg荧光胺(纯度99%),用分析纯丙酮溶解、定容至50mL;0.1mol/L盐酸溶液:吸取分析纯盐酸8.25mL,用水稀释至1000mL;0.6mol/L乙酸钠缓冲溶液:称取优级纯乙酸钠4.92g,用约90mL水溶解,用稀盐酸调pH到3.0,用水定容至100mL。

1.2 标准溶液的制备

1.2.1 磺胺标准储备溶液0.1mg/mL 准确称取适量的每种磺胺标准物质,用甲醇配成0.1mg/mL的标准储备液。

1.2.2 中间浓度的磺胺标准溶液1μg/mL 准确吸取适量的每种磺胺标准储备液,用0.1mol/L盐酸溶液稀释成1μg/mL的中间浓度标准溶液。

1.2.3 根据每种磺胺的灵敏度和仪器线性范围,吸取适量的每种磺胺的中间浓度标准溶液,用0.1mol/L盐酸溶液稀释成混合标准工作溶液。

1.3 试样的制备及测定

准确称取5.0g试样,置于50mL离心管中,加入20g无水硫酸钠和20mL乙腈,均质2min(刀片用装有20mL乙腈的离心管清洗备用),以3000r/min离心3min。上清液倒入100mL鸡心瓶中,残渣加入清洗过刀片的20mL乙腈,重复上述均质及离心操作一次。合并提取液,向鸡心瓶中加入10mL异丙醇,用旋转蒸发器于45℃水浴蒸干。准确加入1mL 0.1mol/L盐酸和1mL正己烷充分溶解残渣,转移至5mL离心管中,重复溶解残渣操作一次,合并残渣于离心管中。涡旋1min,以3000r/min离心3min,吸取上层正己烷弃去,再准确加入1mL正己烷,重复上述涡旋、离心操作一次。取下层清液,过0.45μm滤膜。准确移取0.5mL该样品溶液或标准工作溶液,放入2mL样品瓶中,加入0.5mL乙酸钠缓冲溶液,拧好瓶盖摇匀。再加入0.2mL荧光胺丙酮溶液,拧好瓶盖摇匀,放入18℃水浴中衍生化反应30min。衍生化后的样品溶液用液相色谱-荧光检测器测定。

1.4 色谱条件

色谱柱:Waters Symmetry ShieldTMRP18(150×4.6mm,5μm)或相当者;流动相:乙腈及0.01mol/L磷酸二氢钾溶液,洗脱梯度(见表1);检测波长:激发波长405nm,发射波长495nm;柱温:55℃;进样量:50μL。

注: A液:0.01mol/L磷酸二氢钾溶液, B液:乙腈

2 结果与讨论

2.1 衍生条件的选择

称取一组5.0g空白样品,分别加入0.5mL10种磺胺1μg/mL标准溶液,做每种磺胺添加浓度均为100μg/kg的回收实验,最终检测结果用衍生化30min的标准工作曲线进行定量,考察衍生时间和衍生产物随时间的稳定性(见图1,2)。从图1,2中结果可以看出,衍生化时间选30min比较合适;衍生后应控制在1h内进样,否则荧光物质会逐渐分解,影响实验的准确定量。

2.2 标准品色谱图和样品加标色谱图

按照以上方法测得10种磺胺类药物的标准品、空白猪肝样品及空白猪肝样品加标色谱图(见图3~5)。参考保留时间(见表2)。

2.3 线性范围和检出限

用磺胺混合标准液配制成6点标准工作溶液,其线性范围、线性方程和线性相关系数(见表3)。在信噪比(S/N)大于3的条件下,方法检出限(LOD)为:磺胺胍、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶为2μg/kg;磺胺喹恶啉为10μg/kg;其余6种均为4μg/kg。

2.4 方法回收率和精密度

用不含磺胺类药物的空白猪肝样品进行添加回收率和精密度实验,平行测定5次(见表4)。从表4中结果可以看出,本方法的重现性较好。其他动物肝脏实验也支持这一结果。

3 讨论

实验采用梯度洗脱,在确保良好分离度的前提下,能够缩短检测时间。本实验在原国家标准[1,2]的基础上进一步扩大10 种磺胺类药物可测定的线性范围,有3种在2~200μg/L,6种在4~400μg/L,1种在10~1000μg/L之间,并呈现良好的线性关系。实验根据这10种磺胺不同的仪器响应值列出各自的检出限。除磺胺喹恶啉外,在5~10μg/kg的添加水平,平均回收率在70.6%~83.6%之间,其定量限能达到日本肯定列表制度及欧盟食品安全新法规残留限量的要求,同时也能满足国家出口动物源性产品兽药残留监控计划的检测限量要求。为兼顾10种磺胺同时测定,并得到较好的分离度,磺胺喹恶啉因出峰顺序最后,峰形展宽,使得其检出限不能得到很好的提高,且添加回收率也相对较低。

摘要：建立动物肝脏中常见的10种磺胺类药物(磺胺胍、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺-5-甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲恶唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉)残留量液相色谱同时测定方法。样品通过溶剂提取净化、荧光胺柱前衍生化,用配有荧光检测器的高效液相色谱仪测定,外标法定量。其线性范围分别为2～200μg/L、4～400μg/L、10～1000μg/L,线性相关系数r>0.999;方法检出限(LOD)为2～10μg/kg;其中9种磺胺,在5～100μg/kg的3个添加水平范围内的平均回收率为70.6%～90.2%;相对标准偏差为4.1%～7.6%。

关键词：磺胺,动物肝脏,荧光胺,衍生化,高效液相色谱-荧光检测器

参考文献

[1]中华人民共和国国家标准GB/T20759-2006畜禽肉中十六种磺胺类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法

[2]中华人民共和国国家标准GB/T18932.5-2002蜂蜜中磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲基异恶唑、磺胺二甲氧嘧啶残留量的测定方法液相色谱法

[3]Craig D.C.S,Jason C.S,Roger M.J.AOAC Int,2004,87(5)∶1264～1268

高效液相色谱荧光检测 篇8

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

HPLC-1260液相色谱仪(美国安捷伦公司),固相萃取仪(美国Supelco公司),固相萃取柱(美国安捷伦公司),高速离心机(中国湘仪离心机有限公司),涡旋混匀器(美国Scientific Industries公司),食品粉碎机(中国欧科电器公司)。草甘膦标准溶液:100μg/ml,购自于农业部环境保护科研监测所。甲醇(色谱纯,德国Merck公司);0.25μm水系滤膜(天津东康科技有限公司);实验室用水为Millipore超纯水。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

草甘膦标准溶液:准确移取100μl的草甘膦农药标准品,用纯水做溶剂,配制成10μg/ml储备液,-20℃保存。使用时根据草甘膦对应响应值,吸取适量储备液,用甲醇配制成浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 ng/ml的系列标准溶液,供高效液相色谱测定。FMOC-Cl丙酮溶液(1.0 g/L):称取100 mg FMOC-Cl用丙酮溶解并定容至100 ml,临用现配。5%硼酸盐缓冲溶液(p H=9):称取5 g硼酸钠,用水溶解并定容至100 ml,于4℃下保存。

1.2.2 样品处理

①试样制备:采集市场有代表性的6种茶叶样品,取可食部分,经缩分后,切碎,充分混匀后放入食品粉碎机粉碎,制成待测样品。分装后置于-20℃下保存,待提取。②提取:称取25 g(精确到0.01 g)捣碎的茶叶样品,加入50 ml纯水,高速匀浆2 min。试样转移至具塞离心管中,5 000 r/min离心10 min(离心半径5 cm),收集上清液,待衍生。③衍生化:取茶叶提取液1 ml于进样瓶中,加入200μl硼酸钠溶液,混匀,加入200μl FMOC-Cl衍生液,混匀,室温放置2 h。将C18固相萃取小柱分别用3 ml甲醇和3 ml水活化。将样液过活化后的C18固相萃取小柱,常压下收集初滤液,用1 ml甲醇-水(70∶30,体积分数)溶液洗脱,洗脱液与初滤液合并,过0.25μm滤膜,待分析。标准系列处理方法同上。

1.2.3 色谱参考条件

(1)色谱柱:分析柱,C18,4.6 mm×25 cm,5μm;预柱,C18预柱,4.6 mm×4.5 cm。(2)柱温:35℃。(3)荧光检测器,激发波长265 nm;发射波长315 nm。(4)流动相:甲醇-水(70+30)。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

2.1.1 流动相的选择

本实验以甲醇-水为流动相,以甲醇与水混合溶液的体积比(分别为70∶30、50∶50、40∶60)为条件进行测试,甲醇比例较低时,保留时间延长,灵敏度降低,结果表明甲醇-水体积比为70∶30时,样品的出峰时间、峰形、灵敏度较适宜。另外,实验中采用乙酸铵-甲醇作为流动相进行测试,结果发现乙酸铵-甲醇流动相分离效果不如相同比例的甲醇-水。

2.1.2 柱温的选择

研究中固定其他色谱条件,将色谱柱温度从20升至40℃,结果显示草甘膦保留时间逐渐提前,为有效确证柱效及色谱柱使用寿命,方法采取柱温35℃。

2.1.3 检测波长选择

取草甘膦标准使用液在1.2.3条件下进样,分别采取多发射和多激发模式在波长200~900 nm范围内对草甘膦进行扫描,结果发现草甘膦分别在激发波长265 nm(图1)和发射波长315 nm处最强(图2)。故方法选定320 nm为发射波长,285 nm为激发波长。

2.2 衍生条件的优化

实验中分别配制质量浓度为1、5、10、15、20、25 g/L的FMOC-Cl丙酮溶液和质量浓度为10、20、30、40、50 g/L的硼酸钠缓冲溶液,对二者对草甘膦的衍生效果影响进行试验。结果表明,当FMOC-Cl丙酮溶液质量浓度为20 g/L和硼酸钠缓冲溶液质量浓度为50 g/L时衍生效果最好。在20 g/L FMOC-Cl丙酮溶液和50 g/L硼酸钠缓冲溶液浓度下,对草甘膦分别进行1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0、15.0 h衍生试验,结果发现在衍生时间为2 h时,衍生反应达到平衡。

2.3 固相萃取条件优化

实验根据文献方法采用C18固相萃取柱[22],对影响萃取的主要条件是洗脱条件进行研究。分别采用甲醇-水(90+10,体积分数)、甲醇-水(70+30,体积分数)和甲醇-水(50+50,体积分数)进行洗脱,结果证明采用甲醇-水(70+30,体积分数)可以较好地洗脱目标化合物,同时避免衍生副产物干扰。固相萃取过程中发现初滤液含有较多目标化合物,故实验中需收集初滤液。经固相萃取后两者色谱峰实现较好的分离(图3),避免了未萃取时两峰重叠现象(图4)。

2.4 线性范围及检出限

草甘膦储备液用水稀释配制成1.0μg/ml的标准溶液,配制草甘膦标准工作液系列,按方法的实验条件进样,在上述色谱条件下测定,以峰面积(A)对待测物浓度(X,ng/ml)进行线性回归。结果表明在0.5~20.0 ng/ml的标准溶液浓度范围内,草甘膦浓度与响应值有良好的线性关系(图5),其回归方程为:Y=1.005X-0.032 8;相关系数:r=0.999 7。根据色谱响应值S/N≥3标准计算,草甘膦最低检出浓度为0.02 mg/kg。

2.5 方法的回收率与精密度

精密称取阴性茶叶样品进行低浓度的加标回收试验,结果见表1。该阴性样品中加标1.00、2.00、5.00μg/kg,回收率在89.4%~98.9%之间,RSD在4.26%~13.63%之间。

注:以草甘膦标准溶液10.0μg/ml,连续进样6次,每次10μl,测得草甘膦平均峰面积为10.26,RSD为0.108%。

2.6 茶叶监测应用

用本方法对采自本市茶叶专卖店及超市等不同地方的共12份样本进行了检测,结果显示全部样品草甘膦含量均低于检出限。

3 结论

本研究建立了柱前衍生-固相萃取-高效液相色谱法测定茶叶中草甘膦。通过一系列的衍生条件优化得知:该方法操作简单,衍生反应时间短,灵敏度高,而且衍生产物稳定,反应重复性好,HPLC色谱分离条件简单,适用于基层单位开展草甘膦的监测分析。

作者声明

本文无实际或潜在的利益冲突

摘要：目的 建立快速、准确的茶叶中草甘膦的柱前衍生-固相萃取-高效液相色谱荧光测定方法。方法 茶叶提取液样经衍生后经固相萃取,在C_(18)色谱柱上,以甲醇/水(70+30,体积分数)为流动相,流速1.0 ml/min,荧光检测激发波长为265 nm,发射波长为315 nm。结果 草甘膦的加标回收率在89.4%~98.9%之间,其相对标准偏差在4.26%~13.63%之间,在0.5~20.0 ng/ml范围内呈现良好的线性,其回归系数>0.999,最低定量检出限(LOQ)为0.02 mg/kg。结论 该方法回收率高,净化效果好,杂质干扰少,可满足茶叶中痕量草甘膦的残留检测要求。

高效液相色谱荧光检测 篇9

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪(自动进样系统)、美国Supelco公司固相萃取仪(USA SUPELCO SPE),紫外检测器,安捷伦Bond Elut C18固相萃取小柱(100 mg,1mL),YOKO-XR薄层加热器,CAMAG双波长紫外观察箱,Camag Nanomat4点样仪,HX-02B薄层显色用的加热板,真空干燥箱,旋转蒸发仪,KQ5200DA超声仪,水浴锅,Sartorius BT125D电子天平。

1.2 材料

紫丁香苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号:11574-201501,供含量测定用);甲醇(色谱纯);水为超纯水;其余试剂均为分析纯;舒肝快胃丸(陕西辰济药业有限公司,国药准字Z20155396,规格:200丸/瓶,批号:2015010101、2015010102、2015010103)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Bond Elut C18柱(5μm,4.6 mm×150 mm,Sigmar公司);流动相:甲醇-水-冰醋酸(82:18:0.1);流速:1.0 mL/min;荧光检测波长:294 nm。理论塔板数以紫丁香苷计算应不低于3000。

2.2 对照品储备液的配制

精密称取紫丁香苷对照品5.00 mg,用流动相定容于50 mL量瓶中,使成100μg/mL的对照品储备液,置于-4℃冰箱保存。

2.3 供试品储备液的配制

取本品适量,研细,精密称取1.014 g,置20 mL量瓶中,加入甲醇超声处理10 min(功率100 W,频率50 kHz),放冷,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.5μm)滤过,取续滤液即为供试品溶液。

2.4 阴性样品溶液的制备

按处方制备缺丁香的样品,研细,精密称取1.014 g,置20mL量瓶中,加入甲醇超声处理10 min(功率100 w,频率50 kHz),放冷,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.5μm)滤过,取续滤液制备成阴性样品溶液。

2.5 系统适用性试验

取对照品、供试品和阴性样品溶液,按“2.1”项下色谱条件测定,结果阴性样品在紫丁香苷对照品出峰处未出现色谱峰,表明阴性样品对紫丁香苷的测定无干扰。具体色谱图见图1。

2.6 线性关系考察

精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、2.0 mL,分别置于10 mL量瓶中,加10 mL/L盐酸甲醇稀释至刻度,摇匀,即得系列对照品溶液。在上述色谱条件下分别吸取10μL进样测定,以进样量为横坐标(X,g),峰面积为纵坐标(Y),进行线性回归,得回归方程:Y=3800X-0.7300(r=0.9998)。结果提示,紫丁香苷在0.026～0.750 g范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.7 精密度试验

取对照品溶液(浓度为0.090 mg/10 mL),连续进样5次,10μL/次,测定紫丁香苷的峰面积,结果见表1,提示该方法有较高的精密度。

2.8 重复性试验

取样品5份(批号:2015010101),研细,精密称取1.014 g,置20 mL量瓶中,加入甲醇超声(功率100 W,频率50 kHz)处理10 min,放冷,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.5μm)滤过,测定其含量,结果见表2,提示该方法重复性较强。

2.9 稳定性试验

取样品6份(批号:2015010101)0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、2.0 mL,分别置于20 mL量瓶中,加入甲醇超声(功率100 w,频率50 kHz)处理10 min,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.5μm)滤过,每个浓度共做2份,1份室温放置,1份于-20℃下保存备用。取室温浓度质控样品分别于制备后0、2、4、6、8 h后进行样品分析,计算血药浓度及RSD值,结果显示,紫丁香苷RSD分别为2.03%、2.11%、1.24%,提示样品溶液室温放置8 h稳定性良好;取-20℃下保存液样品,解冻后再冷却,进行数据分析,测定5 d内血液样品的浓度及RSD值,结果显示,紫丁香苷RSD分别为2.23%、2.20%、2.67%,提示样品溶液在-20℃下放置5 d内基本稳定。

2.1 0 加样回收试验

精密称取样品0.5 g,共9份,置25 mL容量瓶中,分别精密吸取1 mL浓度为0.5 mg/mL的紫丁香苷对照品溶液,转移至25 mL量瓶中,测定紫丁香苷,计算加样回收率。分别精密加入新鲜配制的0.5005 mg/mL紫丁香苷对照品溶液1.5、1.5、1.5、2.0、2.0、2.0、2.5、2.5、2.5 mL,加入甲醇适量,超声(功率400 W,频率50 kHz)处理30 min,放冷,加甲醇稀释至刻度,摇匀,按“2.1”项下的色谱条件进行含量测定并计算回收率,结果见表3。

2.11样品含量测定

对3批药材样品(批号:2015010101、2015010102、2015010103)进行紫丁香苷含量测定,结果见表4。

3 讨论

凡由于脾胃受损、气血不调所引起胃痛难耐胃脘部疼痛的病证,均可称之为胃脘痛。《素问·六元正纪大论》曰:“民病胃脘当心而痛。”《医学正传》说:“古方九种心痛……详其所由,皆在胃脘,而实不在于心”。导致胃痛原因常见的有寒邪客胃、肝气犯胃、饮食伤胃、脾胃虚弱等。若寒邪客于胃中,寒凝不散,阻滞气机,可致胃气不和而疼痛;肝对脾胃有疏泄作用,恼怒抑郁,气郁伤肝,肝失条达,横逆犯胃,均可引发胃痛的发生,若劳倦内伤,久病脾胃虚弱,或禀赋不足,中阳亏虚,胃失温养,内寒滋生,中焦虚寒而痛;当过食肥甘,食滞不化,气机受阻或饥饱无度,饮食不节,胃失和降可导致胃痛;另气郁日久,气滞血瘀,瘀血内结,中焦气机受阻,而致胃痛发作。可见,胃痛发生的病机有虚实两端之意,实证为气机阻滞,不通则痛;虚证为胃腑失于温煦或濡养,失养则痛。

临床上舒肝快胃丸药理作用主要有促进胃排空,抑制胃酸分泌,加快肠道运动,缓解疼痛等,其是由香附(醋制)、丁香、白芍、佛手、木香、郁金、白术(炒)、陈皮、柴胡、广藿香、炙甘草、莱菔子、槟榔(炒焦)、乌药等研制而成的中药制剂,辅料为蜂蜜。舒肝快胃丸可发挥各种中药之功效,功能主治舒肝解郁、和胃止痛。常用于两胁胀满,食欲不振,呃逆呕吐,胃脘疼痛,大便失调。其主要成分之一丁香中的紫丁香苷是一种强效抗肝毒药物,其恢复微粒体酶系统的酶活性及抑制脂质过氧化作用可以促进肝毒物代谢并改善肝功能使之正常化,并兼有止血功效。目前关于丁香中主要成分紫丁香苷的测定报道较少。为建立一种快速、灵敏的紫丁香苷的测定方法,本研究考察了诸多文献报道[11,12,13,14,15,16,17,18],选取C18柱固相萃取方法,比较甲醇、乙腈等多种溶剂对样品杂质的洗脱情况,最终发现经一定比例的甲醇和缓冲液洗脱,既能有效除去杂质[19,20,21,22,23,24],又能保证紫丁香苷的高回收率,所得色谱图分离完全,无测定干扰,不仅操作简便,而且重现性较好。

3.1 流动相的选择

本研究考察了不同浓度的甲醇-水-冰醋酸溶液,发现有机相的种类、浓度对舒肝快胃丸中紫丁香苷出峰时间的影响较大,且冰醋酸可消除色谱峰拖尾现象[25,26,27,28,29]。最后选定甲醇-水-冰醋酸(82:18:0.1)为流动相,紫丁香苷的峰形较好,保留时间适宜,与其他杂质峰达到基线分离,效果较为理想。

3.2 提取方法的选择

采用超声提取法,分别以不同提取时间(10、20、30 min)提取后,进行测定,结果显示,超声处理10、20、30 min的提取结果差异不显著,为保证提取效率,故采用超声(功率100 w,频率50 kHz)处理10 min为提取方法,分别以甲醇、水、10 mL/L盐酸甲醇作为提取溶媒,超声提取10 min后进行比较。结果显示,以水为溶媒的提取结果略高于其他溶媒,但是用水作溶媒时,由于极性增大,杂峰较多,紫丁香苷的峰形较差[30,31,32];而以甲醇作溶媒时基线较为平稳,色谱峰对称[11,12,29,31,32,33],故选择甲醇超声提取10 min。

综上所述,本文建立的高效液相色谱-荧光联合检测法灵敏度高,能快速、准确地测定舒肝快胃丸中紫丁香苷浓度,并通过阴性辅料干扰试验和一系列破坏性试验证明,该方法的专属性强,耐用性好,且可控制舒肝快胃丸的质量。

摘要：目的 探讨高效液相色谱-荧光联合测定舒肝快胃丸中紫丁香苷的含量方法的可行性。方法 采用高效液相色谱-荧光联合测定舒肝快胃丸中紫丁香苷的含量,Agilent 1200高效液相色谱仪Bond Elut C18柱(5μm,4.6 mm×150 mm),流动相:甲醇-水-冰醋酸(82:18:0.1);流速:1.0 mL/min;荧光检测波长:294 nm。结果 线性关系考察中,以进样量为横坐标(X,g),峰面积为纵坐标(Y),进行线性回归,得回归方程:Y=3800X-0.7300(r=0.9998)。紫丁香苷在0.0260.750 g范围内与峰面积呈良好的线性关系。对3批药材样品中紫丁香苷的含量进行测定,结果紫丁香苷的平均含量为1.113 mg/g,RSD为0.53%。结论 本研究建立的高效液相色谱-荧光联合检测法灵敏度高,能快速、准确地测定舒肝快胃丸中紫丁香苷浓度,方法可行。

高效液相色谱荧光检测 篇10

我国对固体废物烷基汞浸出毒性的控制标准为不得检出, 即甲基汞<10ng/L、乙基汞<20ng/L, 但无专门的固体废物烷基汞浸出毒性提取方法, 测定方法参照水质烷基汞测定方法 (水质烷基汞的测定气相色谱法 (GB/T14204-93) ) 。 本实验研究了3 种浸提液和2 种提取方式提取固体废物烷基汞浸出毒性的方法, 并对提取液进行液液萃取, 采用高效液相色谱-原子荧光光谱联机测定烷基汞。 实验证明, 硫酸硝酸法提取-高效液相色谱-原子荧光光谱联机测定固体废物烷基汞浸出毒性操作简单、样品处理率高、毒性较小, 是固体废物烷基汞浸出毒性测定的可行方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

安捷伦公司agilent1200 高效液相色谱仪, 北京吉天公司AFS-930 原子荧光光度计, 北京吉天公司SA-20 原子荧光形态分析仪, 昌玻仪器厂ZD-2 水平振荡仪、Associateddesign&MFG.CO.2200 翻转振荡仪。

甲苯中的甲基汞、乙基汞标准储备液 (10mg/L) , 半胱氨酸、乙酸铵、氯化钠、硫酸铜固体试剂, 盐酸、硫酸、硝酸、醋酸、乙腈, 微孔滤膜。 所用试剂均为优级纯试剂, 所有试剂配制均用Milli-Q超纯水。

1.2 溶液制备

半胱氨酸-乙酸铵溶液: 称取5g半胱氨酸、4g乙酸铵, 溶于500m L超纯水。 硫酸铜溶液:称取7.8g硫酸铜, 溶于500m L超纯水中。 解析液:称取58g氯化钠溶于500m L1mol/L的盐酸中[6]。

硫酸硝酸提取液: 将质量比为2:1 的浓硫酸和浓硝酸混合液加入到超纯水中, 使p H为3.20±0.05 (固体废物浸出毒性浸出方法硫酸硝酸法 (HJ/T299-2007) ) 。

醋酸提取液:将17.25m L冰醋酸加入超纯水中, 稀释至1000m L, 使p H为2.64±0.05 (固体废物浸出毒性浸出方法, 醋酸缓冲溶液法 (HJ/T300-2007) ) 。

1.3固体废物样品浸出毒性浸出方法

本实验所选用固体废物p H>5。

水平振荡法:测定样品含水率, 称取一定量的样品于2L聚四氟乙烯瓶, 根据样品含水率按液固比为10:1 (L/kg) 加入所需量的水提取液/醋酸提取液/硫酸硝酸提取液, 安装好水平振荡装置, 调节振荡频率为110±10 次min, 振幅为40mm, 于室温下振荡8h后静置16h, 提取液经微孔滤膜过滤后冷藏保存待分析。

翻转振荡法:测定样品含水率, 称取一定量的样品于2L聚四氟乙烯瓶, 根据样品含水率按液固比为10:1 (L/kg) 加入所需量的醋酸提取液/硫酸硝酸提取液, 安装好浸提装置, 调节转速为30±2r/min, 于23±2℃下振荡18±2h, 提取液经微孔滤膜过滤后冷藏保存待分析。

1.4 仪器条件

通过测定空白、空白加标、基体加标3 个指标进一步优化仪器参数, 仪器工作参数见表1。

2 结果与讨论

2.1 样品浸提方法比较

称取100g固体废物样品, 选择不同的浸提剂 (水、硫酸-硝酸、醋酸) , 分别利用水平振荡法和翻转振荡法浸提, 提取液经微孔滤膜过滤, 加入1m L硫酸铜溶液, 调节p H=3.0±0.05, 用二氯甲烷萃取, 然后加3m L半胱氨酸-乙酸铵溶液反萃取[7], 然后测定样品甲基汞、乙基汞基体加标回收率见表2 (样品甲基汞、乙基汞未检出) 。 由实验可见, 翻转振荡法的提取效果优于水平振荡法, 硫酸硝酸提取剂对固体废物中甲基汞和乙基汞的提取效率最高, 即翻转振荡-硫酸硝酸提取法对样品种烷基汞的提取效率最高。

2.2 标准曲线和检出限

本实验中共配置4 个不同浓度的甲基汞、 乙基汞标准使用液, 其浓度分别为2μg/L、4μg/L、6μg/L、8μg/L, 以峰面积为纵坐标, 测定标准曲线, 标准色谱图如图1 所示。 本实验所测定的甲基汞、乙基汞标准曲线的线性相关系数均在0.999 以上, 满足实验要求。

连续11 次测定空白溶液计算高效液相色谱-原子荧光光谱联机测定烷基汞的检出限[8]为0.2μg/L, 由于固体废物浸出液经萃取、反萃取浓缩, 所以, 本方法测定固体废物烷基汞浸出毒性的检出限为0.6×10-4μg/L。

2.4 实际样品测定

选取5 种固体废物, 称取样品100g, 加入1L硫酸硝酸提取液, 翻转振荡提取, 提取液用微孔滤膜过滤后用液液萃取法浓缩[7], 然后测定样品甲基汞、乙基汞, 测定结果见表3。

3 结论

本文比较了三种浸提剂、两种提取方式对固体废物中烷基汞浸出毒性的提取效率, 硫酸硝酸-翻转振荡提取对甲基汞和乙基汞的加标回收率最优, 硫酸硝酸-翻转振荡提取-高效液相色谱-原子荧光光谱联机测定固体废物中烷基汞浸出毒性的方法具有操作简便、灵敏度高、重现性好等优点。 同时较高的准确度和精密度满足实际样品的测试要求。

参考文献

[1]杨正标, 闻欣, 刘晶等.固相萃取-HPLC-ICP/MS法测定水中的烷基汞[J].化学分析计量, 2014, 23 (1) :39-41.

[2]张继蓉, 印成, 周金元等.毛细柱气相色谱法测定城市污水中烷基汞[J].广州化工, 2015, 43 (12) :132-134.

[3]邓桂春, 高路, 张渝阳, 等.废水和底泥中烷基汞的气相色谱法测定[J].商丘师范学院学报, 2005 (5) :106-109.

[4]李懿.GC-MS测定水中烷基汞的方法研究[J].广州化工, 2012, 39 (7) :184-186.

[5]刘庆阳, 何滨, 胡敬田, 等.高效液相色谱与原子荧光光谱联用分析海产品中的甲基汞[J].分析试验室, 2009, 28 (5) :41-44.

[6]Roberto Martinez Blanco, Margarita Tagle Villanueva Field sampling, preconcentration and determination of mercury species in river waters[J].Analytica Chimica Acta, 2000 (419) :137-144.

[7]赵芸芝, 钱蜀, 王俊伟, 等.高效液相色谱-原子荧光联用测定天然水中烷基汞[J].中国环境监测, 2011, 26 (3) :17-19.

高效液相色谱荧光检测 篇11

关键词：HPLC 喹乙醇 肉类

中图分类号：S816 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）20-0014-02

喹乙醇是一种畜禽饲料添加剂，合理使用可以缩短养殖周期、降低饲养成本，但其也有一定的毒性，会随动物种属不同存在一定差异，特别对禽和鱼类有较明显蓄积和遗传毒性。因使用剂量过大、重复用药等原因，畜禽中毒事件时有发生。

常用的检测方法主要有GC-MS法、LC-MS/MS法以及HPLC法。虽然前两种方法对实验结果的准确度及灵敏度较高，但仪器价格较高，普通科研机构负担较大。而HPLC法对操作而言较为简便，且灵敏度能达到检测要求，但按国标方法GB/T20797-2006肉与肉制品中喹乙醇残留量的测定方法则存在称样量大，前处理过程较复杂，费时费力，且回收率较较低，对仪器维护保养和检测数据均不利。本文对该方法作了改进，减少了称样量，得到了较好的回收率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

（1）试剂：喹乙醇标准品（>99.6%）美国 sigma公司；盐酸（分析纯）杭州化学试剂有限公司；甲醇、乙酸乙酯、甲酸（均为色谱纯）美国sigma公司；乙酸钠（分析纯）温州润华化工实业公司。（2）仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪；Oasis MAX 3cc固相萃取柱离心机；可变波长紫外检测器。

1.2 试验方法

1.2.1 标准品溶液配制及样品液处理

（1）喹乙醇标准品溶液制备：喹乙醇标准储备液：用万分之一天平称取适量喹乙醇标准品，用甲醇-甲酸溶液 （40：60V/V）溶解，配制成100ug/mL标准液。标准工作液：取适量喹乙醇标准液，用上述甲醇-甲酸溶液稀释至1.0mL，然后分别配制成0.01，0.05，0.25， 0.5，1.0ug/mL梯度的标准工作溶液。提取液：洗脱液：2%甲酸-乙酸乙酯溶液2.0mo1/L；淋洗液：0.05mol/L乙酸钠-甲醇溶液；盐酸水溶液。（2）样品液处理：取适量肉制品捣碎，混合均匀后，称取5g，置于5OmL离心管中，加入15mL 2.0mo1/L盐酸溶液，混匀后，放置于恒温水浴锅（60℃）恒温震荡酸解半小时，然后在4℃环境中10000r/min离心l0min。取上清液过0.2um滤膜滤于另支离心管中，反复多次进行HPLC检测。

1.2.2 色谱条件

色谱柱XTerra Ms C18 3.5μm，2.1mm×100 mm，流速：0.3ml/min，流动相：甲醇∶水=20∶80，柱温32℃，检测波长260nm，进样量：10μl。

1.3 标准曲线绘制

取梯度标准工作液，以进样浓度C（ug/mL）为横坐标X，以峰面积A为纵坐标Y作标准曲线。结果表明，标准工作溶液在0.01-1.0ug/mL范围内有良好线性关系。线性回归方程为：Y=-0.13+68.67X（r=0.9999， n=6）。

1.4 数据处理

应用MATLAB Origin软件处理数据。

2 结果与分析

2.1 喹乙醇标准液和肉品色谱

标准物质谱图如图1所示，肉样波峰如图2所示。

2.2 线性范围与检出限

按方法规定称样量和定容体积进样测定。根据检测限测定信噪比应大于3的原理，检出限和定量限分别得出为4.2ug/kg和12.5ug/kg，与国标方法基本一致，可满足目前检测机构对肉制品的检测要求。

2.3 回收率与精密度

按三平行法取4份肉样，结果为：回收率在71.0%—86.5%，相对标准偏差在3.25%-8.62%，见表1。

3 讨论

本文通过选定适宜的色谱条件，以及通过回收率和精密度的测定，建立了HPLC方法进行肉制品中喹乙醇的准确测定。该检测方法具有回收率较高，且灵敏度好等优点。除此之外，与国标检测方法的复杂、操作不方便相比，该检测方法很好地实现了快速检测。但是该检测方法仍然有待进一步的优化，在后续的实验中，需要继续摸索，使之形成一个严谨的、易操作的检测方法。

参考文献

[1]胡新岗，方希修，黄银云，等.喹乙醇饲料添加剂应用研究进展[J].动物科学与动物医学，2001，19（5）：64-65.

[2]邱楚武.喹乙醇在水产饲料中的作用及应用[J].兽药与饲料添加剂，2002，7（2）：31-32.

高效液相色谱荧光检测 篇12

高效液相色谱技术能够有效保证食品安全,对食品中的营养素、添加剂和有毒有害物质的残留进行检测,为人们的食品安全和身体健康提供有效的保障。并且随着我国科学技术的不断进步,各种检测技术也会不断发展,日后的高效液相色谱技术也会更加先进,有利于提高食品检测的质量。

高效液相色谱技术简介

高效液相色谱技术又被称为高压液相色谱法,自20世纪初俄国科学家提出经典色谱法后,液相色谱分析法得到了迅速发展,这种检测技术的原理是以传统的液相色谱技术为基础,然后在这个基础之上引进其他比较先进的技术和方法而形成的一种新的检测方法。在运用这种高效液相色谱技术对食品进行检测时,具有非常广泛的适用范围,而且检测的速度非常快,进行分离的效率较高。同时这种技术还具有流动相选择空间的广阔性和灵敏度高等优势,所以在食品的检测中得到了广泛的应用。

高效液相色谱技术在食品营养检测上的应用

对糖分进行检测

糖分是食品中的三大营养成分之一,是比较重要的一项营养指标。对糖分进行细分,又可以将它分为葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉。因为糖分具有还原性和易溶于水的特点,所以在对食品中的糖分进行检测的时候,有一些参数可能无法科学提出。不过高效液相色谱技术具有很高的灵敏度,它在对食品中的碳水化合物进行检验的时候,能对碳水化合物的参数进行有效测定,且还可以对食品中糖分的质量进行准确评价。

对氨基酸进行检测

氨基酸也是人体发展的一种非常重要的营养指标,是生物体赖以生存和发展的必备物质之一。作为人体发展的一种基础性物质,主要的构成成分就是蛋白质和酶。因为蛋白质和酶本身具有很强的变化性,性质极不稳定,为了确保检测的准确性,就有必要采用比较先进的检测方法来进行检测。因高效液相色谱技术流动相的范围非常广泛,而且具有高度的灵敏性,所以能将蛋白质和酶的参数准确地提取出来。因为高效液相色谱技术高度的灵活性和安全性,所以在各个食品检测的部门得到了广泛的使用,逐渐取代了传统的检测技术。经过大量的实践证明,高效液相色谱技术具有操作简单、参数精确度高等优点,而且具有很好的重现性和飞快的分辨速度。

对维生素进行检测

维生素也是人体必需的一种营养元素,它的主要功能是为人体的正常活动提供能量,同时在保证人体健康的过程中也扮演着非常重要的角色。如果人体中的维生素长期得不到补充,就很容易导致机体别的正常功能受到影响,严重情况下,还会引发器质性的病变。以往对食品中的维生素进行检验只能利用一些相关的食品先将维生素提取出来,然后再对维生素进行检验。这种方法的检验效率非常低,而且在这个过程中,食物的质量随时都可能发生变化,从而对检测结果的准确性产生巨大的影响。使用高效液相色谱技术对食品中的维生素进行检验,不仅可以简化检测的过程,提高检测的效率和准确性,还具有抗干扰的优势,省时又省力。

高效液相色谱技术在食品添加剂检测上的应用

对食品中的人工甜味剂进行检测

食品中的甜味剂包含的种类非常多,例如糖精钠、甜味素、甜蜜素、安赛蜜、甘草苷和甜菊苷等。这些甜味剂都可以运用高效液相色谱技术来进行检测,检测的方法还可以进行细分,即R高效液相色谱-UVD(紫外吸收检测器)法、阴离子交换色谱法、离子对色谱法。这3种检测方法对应的设备就是UVD、CD(电导检测器)、C18柱、阴离子交换柱和NH2柱。

对食品中的防腐剂进行检测

食品中的防腐剂是用于保持食品原有品质和营养价值为目的,它能抑制微生物的生长繁殖,防止食品腐败变质而延长保质期。种类非常繁多,有丙酸钙、苯甲酸钠、山梨酸钾、乳酸链球菌素、脱氢乙酸钠、双乙酸钠、乳酸钠、对羟基苯甲酸丙酯和过氧化氢等,利用高效液相色谱技术对食品中的防腐剂进行检测非常方便和快捷,而且检测的准确性非常高。其中的R高效液相色谱技术能对食品中的BA(苯甲酸)、CA(丙酸)、羟基苯甲酸乙酯(丙酯)、脱氢乙酸进行检测。另外,运用UVD-RID(紫外吸收检测器与折光示差检测器)串联的方法,还能够对食品中的甜蜜素、BA和CA进行检测。

对食品中的抗氧化剂进行检测

食品中的抗氧化剂是能延缓或阻止食品氧化变质、提高食品稳定性和延长贮存期的食品添加剂。氧化不仅会使食品中的油脂变质,而且还会使食品褪色、变色和破坏维生素等,从而降低食品的感官质量和营养价值,甚至产生有害物质,引起食物中毒。常用的食品抗氧化剂有叔丁基对羟基苯甲醚、二叔丁基对甲酚、叔丁基对苯二酚、抗坏血酸、三羟基苯丁酮、4-羟甲基-2,6-二叔丁基酚和3,3-巯基二丙酸等。运用反向柱,用乙腈乙酸(95∶5)为流动相,用UVD进行检测即可。

对食品中的色素进行检测

在食品生产过程中常加入色素来提增强颜色效果,常用的天然色素有焦糖色、红花黄、红曲红、姜黄、虫胶、辣椒红色素、酱色及β-胡萝卜素等。天然色素一般来源于天然成分,比如辣椒、葡萄和甜菜红,这些食品已经得到了广大消费者的认可与接受。因此,采用这些食物来源的天然色素更能得到消费者的青睐,使用起来也更安全些。人工色素有苋菜红、胭脂红、赤藓红、诱惑红、新红、日落黄、柠檬黄、亮蓝、靛蓝和它们各自的色淀以及酸性红、β-胡萝卜素、氧化铁黒(红)以及叶绿素铜钠等。食品中的人工色素和天然色素都可以通过高效液相色谱技术检测出来,而且检测的方法非常简单,例如食品中的新红、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、赤藓红及亮蓝等色素既可以利用高效液相色谱-UVD的方法检测出来,也能利用C18柱分离的方法检测出来。

高效液相色谱技术在食品有毒有害物质检测上的应用

对食品的农药残留进行检测

人们为了能够提高农作物的产量,会在它们的生长期使用各种有机的化学物质和农药。虽然这些化学物质和农药在很大程度上能促进农作物的生长质量和产量,但是也很容易在农作物身上造成农药的残留。因为这些农药本身就是一种具有极强性的有机化合物,具有分子量大和极不稳定的热性,各种农药使用后残留存在于植物体中,水中,土壤中,对不易降解的农药,经食物链会在人体中聚集,很容易对人体的健康造成极大的影响。同时,也是因为农药的这些特性,使得它们很不容易被人们发现。采用高效液相色谱技术能够弥补气相色谱法的不足,对食品中残留的农药进行定性和定量的分析。如氨基甲酸酯类农药,其中的灭多威、涕灭威、异索威、杀灭威、克百威、百亩威、甲萘威、混杀威、灭虫威、白克威、苏达灭和野麦畏等用C18柱,流动相为20%乙腈水,检测器为UVD,可实现20余种农药组分的分离。

对食品中的兽药残留进行检测

这种兽药残留检测主要是针对动物类食品而言,因为动物在使用兽药之后,它们身体部位的任何一个食用部位都会有药物的残留或者药物产生的代谢物。采用高效液相色谱技术,将水中的诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星等抗生素药物经过萃取,然后通过外标法就可以对其中的药物残留进行定量的分析。

对食品中的黄曲霉毒素进行检测

黄曲霉毒素是由黄曲霉、寄生曲霉等产生的代谢产物。是化学结构类似的化合物,当粮食未能及时晒干及储藏不当时,往往容易被黄曲霉或寄生曲霉污染而产生此类毒素,有致癌作用,目前存在的主要有M1、M2、B1、B2、M1、M2等几种形式,可使用反相键相柱,用水、乙腈、甲醇(60∶30∶10)为流动相,用FD(荧光检测器)检测器进行分析。

除了能够对食品中的农药残留和兽药残留等进行检测,还能够对食物中的微生物和相关的代谢物进行定量检测。

结语