二维液相色谱（共8篇）
二维液相色谱 篇1
东北刺人参属五加科刺人参属,其分布区域十分狭窄,全世界只在中国东北与俄罗斯和朝鲜交界的地方有少量分布[1]。 东北刺人参的根有类似于人参的功效,具有抗菌消炎、调节血压、增强免疫之功效,可用于神经衰弱、心血管病、糖尿病、 风湿病、提高免疫力和肿瘤预防等,是一种很有开发前途的稀有药用植物[2]。目前从东北刺人参的根中报道分离得到化学成分为14个,主要为苯丙素和木脂素类[2,3]。传统植物化学研究时间周期长、消耗大以及环境污染等问题,寻找快速有效从植物中鉴别化学成分的方法有利于天然活性成分的发现和开发。
鉴于二维液相色谱的高分辨率和选择性[4],利用离线二维液相色谱串联高分辨质谱的方法分析检测东北刺人参根提物的成分,共检测得到31个组分,并结合UV、MS数据鉴定了其中的7个成分。本研究首次利用离线二维液相色谱串联高分辨质谱的方法分析检测东北刺人参根提物的化学成分。
1 实验部分
1. 1 材料与试剂
Agilent 1200高效液相色谱仪,Agilent Technologies; Agilent 6530高分辨质谱,Agilent Technologies; 色谱柱包括: Wates CN色谱柱 ( 150 mm × 3. 9 mm,4 μm) 和Hypersil BDS - C18色谱柱 ( 4. 6 mm × 250 mm,5 μm) ; 甲醇和乙腈( 色谱纯) ,国药集团化学试剂有限公司; 水为Milli - Q超纯水,其他试剂均为分析纯。
药材于2013年9月采自中国辽宁省本溪地区,经辽宁中医药大学中药学院窦德强教授鉴定为东北刺人参Oplopanax elatus Nakai. 的干燥根; 凭证标本 ( OER - 20130316 - 1 ) ,存放于中南大学临床药理研究所中药遗传药代动力学中药标本室。
1. 2 样品制备
东北刺人参干燥根5 kg,粉碎过20目筛,用95% 甲醇冷浸提取后减压浓缩得浸膏0. 65 kg,取适量样品溶于甲醇,过0. 45 μm滤膜,4 ℃ 下保存,备用。
1. 3 一维液相色谱分析
利用Agilent 1200液相色谱系统进行一维液相样品分析制备,采用CN柱 ( 150 mm × 3. 9 mm,4 μm) 作为第一维分析制备柱,流动相由超纯水( A) 和甲醇( B) 组成,梯度洗脱条件: 0 ~ 30 min: 10% ~ 100% B。流速1. 0 m L / min,柱温30 ℃ ,紫外检测波长为210 nm。按图1( b) 所示手动收集两个馏分,连续6次进样,合并馏分,浓缩,用100 μL甲醇复溶,4 ℃ 冷藏, 待用。
1. 4 二维液相色谱分析
利用Agilent1200液相色谱系统和Hypersil BDS - C18色谱柱 ( 4. 6 m × 250 mm,5 μm) 进行二维液相样品分析,流动相由超纯水( A) 和甲醇( B) 组成,梯度洗脱条件为: 0 ~ 5 min: 10% B; 5 ~ 15 min: 10% ~ 30% B; 15 ~ 20 min: 30% ~ 35% B; 20 ~ 30 min: 35% ~ 40% B; 30 ~ 40 min: 40% ~ 50% B; 40 ~ 45 min: 50% ~ 80% B; 45 ~ 50 min: 80% ~ 85% B; 50 ~ 55 min: 85% ~ 90% B; 55 ~ 60 min: 90% ~ 100% B。流速为1. 0 m L / min,柱温为30 ℃ ,紫外检测波长为280 nm。
1. 5 质谱条件
高分辨率质谱 ( Aglient Technologies 6530 Accurate - Mass Q - TOF LC / MS) 分析在ESI正离子模式下检测,毛细管电压: 4. 0 k V,氮气作为干燥气体,温度和流速分别为: 325 ℃ 和6 L / min; 鞘气温度和压力分别为: 350 ℃ 和12 L / min; 雾化压力: 40 PSI。喷嘴电压: 1. 0 k V,碎裂电压: 130 V,质量扫描范围为100 ~ 1000 m/z。
2 结果与讨论
2. 1 二维液相色谱的构建
2. 1. 1 色谱柱的选择
色谱柱的选择是建立一个二维液相体系关键的一步。选择二维的色谱柱需要满足正交性,即两维的色谱柱分离机理应尽量不相同,增加柱容量,提高分离效率。传统的C18柱对弱极性物质有很好的保留和分离能力,而且其对质谱具有很好的兼容性,通常用在天然产物活性成分的高效分离分析研究中。 图1( a) 为东北刺人参提取物的HPLC谱图,从图中可以看出东北刺人参提取物中极性较大的化合物含量较低,而极性较低的化合物为其主要成分,在常规的HPLC - MS中,极性较大的化合物离子流图基质干扰严重,结构难于鉴定。因此,必须对极性较大的化合物和极性较小的化合物进行有效的分离并富集, 便于系统研究东北刺人参的化学成分。CN柱对极性化合物有很好的保留和分离能力,所以CN柱为第一维液相色谱样品分析制备。如图1( b) 所示,主要分离得到两个馏分。
2. 1. 2 二维液相色谱分离
对第一维液相色谱分析制备所得的2个馏分( Fr1和Fr2) 在Hypersil BDS - C18色谱柱上进行第二维色谱分析,如图2所示, 共检测到31个组分,相对于一维分离,如图1( a) ,二维分离分辨率与峰容量有明显的提升,由于使用离线分离模式,样品得到富集,一些低丰度的组分在第一维收集后在第二维被识别出来。这说明构建的以CN柱为第一维液相色谱制备,以C18柱为第二维液相色谱分析的二维液相体系能够获得更多的物质信息,有利于东北刺人参根提物的中化学成分的分析和检测。
2. 2 结构鉴定
东北刺人参样品根提取物在离线二维液相色谱串联质谱体系下得到了较好的分离。通过UV、MS数据分析、生源关系分析以及与参考文献的对照,初步鉴定了其中的7个化学成分, 如表1所示。
化合物1的最大紫外吸收为221 nm,其质谱检测分子离子峰为[M + Na]+,m/z: 365. 1221,与文献[5]报道一致,故鉴定其为松柏苷; 化合物2在219 nm下有最大紫外吸收,其质谱检测分子离子峰为[M + Na]+,m/z: 395. 1327,与文献[5]报道一致,故鉴定为紫丁香苷; 化合物3在223 nm下有最大紫外吸收,其质谱检测分子离子峰为[M + Na]+,m/z: 545. 2007, 与文献[5]报道一致,故鉴定为异落叶松脂素 - 3 - α - O - β D - 葡萄糖苷; 化合物4的最大紫外吸收为204 nm,质谱检测分子离子峰为[M + H]+,m/z: 279. 1939,与文献[6]报道一致,故鉴定为oploxynes A。化合物5的最大紫外吸收为205 nm,质谱检测分子离子峰为[M + H]+,m/z: 291. 157,与文献 [7]报道一致,故鉴定为oplopantriol A。化合物6和7的最大紫外吸收都为205 nm,质谱检测分子离子峰分别为[M + Na]+, m / z: 283. 1669和[M + Na]+,m/z: 285. 1827,与文献[8]报道一致,初步鉴定为( 3S,8S) - falcarindiol和oplopandiol。
3 结 论
本文建立了一种离线二维液相色谱串联高分辨率质谱的方法,有效的分离鉴定了东北刺人参中的活性成分。二维液相方法与一维液相相比具有更高的峰容量以及分离度,能够获得更加丰富的样品信息,适合于复杂体系以及低含量物质的分离与检测。本文结合UV、MS以及文献数据初步鉴定出其中的7化合物,为后续的鉴定试验提供了良好的基础。
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二维液相色谱 篇2
硅胶基质高效液相色谱固定相
结合作者实验室的研究工作,并引用文献157篇,对高效液相色谱用硅胶基质色谱填料进行了综述.
作 者：蒋生祥 刘霞 JIANG Shengxiang LIU Xia 作者单位：中国科学院兰州化学物理研究所,甘肃,兰州,730000刊 名：色谱 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY年，卷(期)：25(2)分类号：O65关键词：硅胶基质 固定相 高效液相色谱
二维液相色谱 篇3
近年来,对阿维菌素在农作物及畜产品中残留的分析方法研究众多[5,6,7,8],但国内关于阿维菌素在水中残留的分析方法未见报道。以往阿维菌素残留的提取及净化方法有机试剂使用多,不仅对分析者身体健康有害,还易造成污染,试验将分散液相微萃取净化与高效液相色谱-紫外(HPLC-UV)检测方法相结合,建立了一种测定水中阿维菌素残留的方法。此方法有机试剂使用少,快速、环保。
1 材料
1.1 仪器
高效液相色谱仪,配手动进样器和紫外检测器(型号为Agilent-1260)、Eclipse plus C18色谱柱(3.5μm,4.6 mm×100 mm),由安捷伦科技有限公司生产;微型旋涡混合仪(型号为WH-2),由上海沪西分析仪器厂生产;超纯水制作系统(型号为UL UP-URE),由四川优普超纯科技有限公司生产。
1.2 试剂
阿维菌素标准品,由美国Sigma-Alorich公司生产;甲醇(色谱纯),由天津康巢生物医药有限公司生产;丙酮(分析纯)、三氯甲烷(分析纯),由利安隆博华医药化学有限公司(天津)生产。
河水,取自天津市海河;湖水,取自天津市水上公园;自来水,取自天津农学院兽医学实验室;井水,取自天津市宝坻区郝各庄镇。所有水样在分析前先过0.22μm滤膜,除去颗粒物。
1.3 标准溶液的配制
储备液:取阿维菌素100 mg,放入10 m L容量瓶,加甲醇定容,配制成浓度为10 mg/m L的阿维菌素溶液。
工作液:用甲醇将阿维菌素储备液稀释,配制成浓度为10,50,100,200,500μg/m L的标准溶液。
2 方法
2.1 色谱条件
Eclipse plus C18色谱柱(3.5μm,4.6 mm×100 mm),流动相为甲醇∶水(80∶20),流速为1.0 m L/min,检测波长为245 nm,柱温为35℃,进样量为20μL,定量方法采用外标法。
2.2 线性试验
分别取10,50,100,200,500μg/m L浓度的标准工作液20μL,进行HPLC分析。每个浓度进样3次。以阿维菌素工作液浓度为横坐标,各浓度对应的色谱峰面积的平均值为纵坐标作标准曲线,进行线性相关性统计分析。
2.3 样品前处理
水样经0.22μm的滤膜过滤,取5.0 m L过滤水样置于15 m L带塞的锥形离心管中,将含有70.0μL三氯甲烷的1.0 m L丙酮通过微量进样器快速注入离心试管中,然后涡旋10 s,混合液从水相被萃取到氯仿溶液中,静置10 min,分散在水相中的萃取溶剂氯仿沉积到试管底部,用微量进样器吸取萃取溶剂至10 m L离心管中,再向过滤水样中加入含有70μL三氯甲烷的1 m L丙酮,涡旋10 s,静置10 min,取下层萃取溶剂,合并萃取溶液。氮气吹干,再用50μL甲醇溶解,涡旋30 s,取20μL进行色谱分析。
2.4 添加回收率试验
样品处理方法同2.3,水中阿维菌素的添加浓度分别为0.1,1.0,5.0μg/m L,同一天内重复测定5次,计算日内变异系数;连续测定3 d,计算日间变异系数。
3 结果与分析
3.1 线性试验
在10~500μg/m L浓度范围内线性良好,线性方程为y=1 667.0x+127.0,线性回归系数(r2)=0.999。标准曲线见图1。
3.2 液相微萃取条件的分析
采用分散液相微萃取法对水中阿维菌素进行前处理净化,分别采用四氯化碳、三氯甲烷、二氯甲烷作为萃取剂发现,只有采用三氯甲烷作为萃取试剂回收率最高。
以三氯甲烷作为萃取剂,分别采用丙酮、甲醇、乙醇、乙腈作为分散剂发现,三氯甲烷和甲醇、乙醇不能形成乳浊液,丙酮和乙腈作为分散剂时相比较,丙酮的萃取效果最好,回收率最高。
确定丙酮与三氯甲烷作为萃取剂和分散剂后,对丙酮和三氯甲烷的比例进行了多次试验,首先确定1 m L丙酮的萃取效果最好,分别采用含有50μL、70μL、100μL、200μL三氯甲烷的1 m L丙酮作为萃取剂对标准溶液进行萃取,试验结果表明:含有50μL三氯甲烷的1 m L丙酮对阿维菌素的萃取效果不好,回收率低;含有70μL、100μL、200μL三氯甲烷的1 m L丙酮对阿维菌素的萃取效果良好,而且用更高含量三氯甲烷的丙酮溶液进行萃取,效果也不增强,因此确定采用含有70μL三氯甲烷的1 m L丙酮作为萃取剂,效果良好,经济环保。
分别采用3 000 r/min离心5 min、3 000 r/min离心10 min,静置5 min、10 min、15 min以促进萃取过程,结果表明,静置5 min萃取效率低,3 000 r/min离心5 min、3 000 r/min离心10 min,静置10 min、15 min的萃取效率相同,本方法静置10 min。
3.3 方法的灵敏度
取6个空白水样,经2.3的方法处理后进行HPLC测定,按10倍信噪比(S/N=10)进行计算,本方法对阿维菌素在水中的检测限为0.1μg/m L,空白样品色谱见图2,0.1μg/m L阿维菌素类药物添加样品色谱见图3。在阿维菌素的保留时间位置均无杂峰干扰。
3.4 方法的检出限、回收率和精密度
阿维菌素从低到高3个浓度的样品添加回收率和日内变异系数见表1。平均回收率范围为82.84%~95.03%,日内变异系数范围为3.78%~7.04%,日间变异系数范围为3.29%~4.29%,回收率较高,重复性较好。
3.5 方法的可行性
为验证方法的可行性,将本方法应用于4种不同水样,即河水、自来水、井水、湖水中对目标待测物进行测定,均未测出阿维菌素的残留,结果见表1。
参考文献
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液相色谱检测器原理及应用 篇4
高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上, 引用了气相色谱的理论, 在技术上, 流动相改为高压输送 (最高输送压力可达4.9′107Pa) ;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成, 从而使柱效大大高于经典液相色谱 (每米塔板数可达几万或几十万) ;同时柱后连有高灵敏度的检测器, 可对流出物进行连续检测。
高效液相色谱仪主要由色谱泵及控制器、进样器、色谱柱、检测器和数据处理及控制五大部分组成, 分离原理是一个物理过程, 流动相携带着待分析化合物和其他一些共存物质流过色谱柱, 利用不同物质在固定相上的保留时间不同, 从而出峰时间不同而达到分离, 利用保留时间定性, 峰高或者峰面积定量, 在将分离后的各个成分依次通过一紫外检测器时就可检测出各化合物的浓度来。
2 衡量检测器的指标
检测器作为高效液相色谱仪的重要组成部分, 直接决定分析的准确度和灵敏度, 所以对检测器要有一个充分的认识, 这样才能更好的使用仪器, 提高工作效率, 并且平常需要做相关的维护和保养。
衡量检测器的指标有:灵敏度S=R/Q, R是检测器响应值的增量, Q是样品量的增量;噪音, 即没有样品时检测器的最大输出信号;漂移, 即检测器在一段时间内响应值的变化;线性动态范围, 即最大线性相应与最小检出限之比;最小检测限, 即样品产生两或三倍于噪音信号时的浓度;信噪比, 即S/N。
注意最小检测限不是一个单纯的检测器指标它实际上是评价整个色谱系统的指标, 包括了色谱系统在内的综合性指标, 信噪比亦如此。
3 检测器的分类
一般常用的有固定波长紫外检测器、可调波长紫外/可见检测器、可编程紫外/可见检测器、光电二极管矩阵检测器、示差折光检测器、荧光检测器、电化学检测器、电导检测器, 其他的还有放射性检测器、质谱检测器、热能检测器、LALLS检测器、蒸发质量检测器、粘度检测器等。
3.1 紫外/可见检测器
紫外-可见光检测器是应用最广泛的检测器, 遵循的原理是Beer’s Law-BEER定律, 即光能量P0=透过溶剂的光能量, P=透过样品的光能量, 光通量 (透过率%) T=P/P0, 吸光度A=-log (T) =log (P0/P) , 吸光度=单位吸光度, 即A=abc, 也就是说样品池 (S) 中的样品对光产生吸收有信号差, 如是可变波长检测器还有分光系统 (光栅) 同紫外检测器灵敏度有关的因素有信号强度 (S) 和噪音 (N) 。
从BEER定律可看出信号强度 (S) 与样品的种类、样品浓度及进样的体积、检测池的长度、所使用的波长、检测器的时间常数有关。
噪音 (N) 与流动相、所使用的波长灯的能量、检测器的时间常数以及非检测器因素如电噪音、泵脉动等有关。
紫外检测器的灵敏度与溶剂的影响、背景吸收、示差折光效应有关, 不同种类溶剂有其截止波长, 溶剂的质量好坏对其截止波长有影响, 溶剂质量与含紫外吸收的杂质、溶解在其中的氧气、缓冲液溶质的紫外吸收等因素有关;背景吸收减少线性范围、许多溶剂会产生背景吸收, 所以应该选择应用;示差折光效应会产生假的紫外吸收变化, 定量误差导致光谱图不准确, 梯度应用时有严重的基线漂移。
3.2 光电二极管矩阵检测器 (Photodiode Array Detector)
光电二极管矩阵检测器简称PDA, 它可以兼顾紫外检测器及可见分光光度计的信息, 在收集色谱图的同时得到光谱图, 自动完成色谱峰的纯度鉴定以及色谱峰的确认, 可以对任意波长进行再处理, 可以从硬件上消除示差折光效应, 一般考察PDA的指标是色谱的灵敏度、光谱的灵敏度以及光谱的分辨率。
3.3 示差折光检测器
示差折光检测器是目前液相色谱中常用的一种检测器, 它可与输液泵, 色谱柱, 进样器等组成凝胶渗透色谱仪或高速液相色谱仪系统, 也可以配置适当的进样系统作为单独的分析仪器使用。对所有溶质都有响应, 某些不能用选择性检测器检测的组分, 如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等, 可用示差检测器检测。由于不同的液体折光不同, 因此本检测器通用性强, 可广泛地应用于化工、石油、医药、食品等领域。
示差折光检测器是基于连续测定样品流路和参比流路之间折射率的变化来测定样品含量的。光从一种介质进入另一种介质时, 由于两种物质的折射率不同就会产生折射。只要样品组分与流动相的折光指数不同, 就可被检测, 二者相差愈大, 灵敏度愈高, 在一定浓度范围内检测器的输出与溶质浓度成正比。
缺点是不能做梯度实验, 最大的池耐压是100 psi, 流速范围是0.3-10 ml/min.
3.4 荧光检测器 (Fluorescence Detector)
荧光检测器是高压液相色谱仪常用的一种检测器。用紫外线照射色谱馏分, 当试样组分具有荧光性能时, 即可检出。其特点是选择性高, 只对荧光物质有响应;灵敏度也高, 最低检出限可达10-12g/ml, 适合于多环芳烃及各种荧光物质的痕量分析。也可用于检测不发荧光但经化学反应后可发荧光的物质。如在酚类分析中, 多数酚类不发荧光, 为此先经处理使其变为荧光物质, 而后进行分析。
荧光检测器滤光片可以分为近通 (Short pass) -低于特定点的所有波长可以通过, 远通 (Long pass) -高于特定点的所有波长可以通过, 带通 (Band pass) -在特定范围内的所有波长可以通过。
3.5 电化学检测器 (Electrochemical Detector)
电化学检测器的原理是随着化合物被氧化或还原能产生正比于待测化合物浓度的电流, 一般在特殊情况下使用, 主要用来测定化学性质不稳定的离子, 如容易被氧化或还原的离子。
该检测器的特性是选择性非常高, 只有容易氧化或还原的电活性物质才可被检测。例如, 即便有高含量的氯化物、硫酸盐共存时, 其他离子的检测也不受干扰, 因为这两种离子不被电化学检测器所检测。
3.6 电导检测器 (Conductivity Detector)
所有的离子化合物以及可被解离的化合物的水溶液能够导电, 电导检测器就是以液相色谱流动相的导电度的变化作为定量依据的, 流动相携带样品通过流通池, 空白流动相会产生一个电导值, 流动相加样品的电导减去流动相的电导即为样品产生的电导值, 该值与待测样品浓度成正比。
电导检测器以导电溶液作为介质, 所以用缓冲溶液作为流动相是合适的, 但是不可避免的会大大提高检测器的背景基流, 因此在无抑制柱的离子色谱中多数使用浓度很小的有机酸或有机酸盐作为流动相, 以减低背景基流。
该检测器的特性是结构比较简单, 灵敏度比较低, 对于离子的检测有独特的作用。
4 应用
总之各种检测器有其不同的特点, 适用的范围也不同, 我们应该根据不同的使用环境合理选择检测器, 更好的提高工作效率。
摘要：高效液相色谱法是一种快速有效的有机化合物分析技术, 在分析测定有机化合物方面, 以其快速、灵敏、选择性好的特点, 倍受分析工作者青睐, 是环境监测、卫生防疫、石油化工、食品生产等行业作为水质分析的标准仪器。检测器是高效液相色谱仪的重要组成部分, 不同的检测器的原理, 使用的范围和对象不同, 所以针对不同的检测器, 我们应该注意的重点也不同。只有这样, 才能更好的完成日常的分析化验工作, 提高工作效率。
关键词：高效液相色谱仪,检测器,分类,应用
参考文献
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液相色谱柱基质材料的发展 篇5
在吸附色谱中, 硅胶、氧化铝、活性炭和聚酰胺应用最为广泛。其中活性炭柱色谱尤其适用于分离水溶性物质, 如氨基酸、糖类以及某些苷类, 它是分离水溶性物质的主要吸附材料之一。聚酰胺也称为锦纶或尼龙, 其吸附机理主要来自聚酰胺内的酰胺键, 可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键, 例如, 聚酰胺树脂可以吸附保健品中具有羟基、羧基或酚羟基的黄酮类化合物。
在离子交换色谱中, 离子交换树脂主要是利用高分子化学的加聚反应。一般首先合成高分子离子交换树脂的骨架, 然后在骨架上添加功能基。如果需要得到大孔树脂, 则在聚合过程中加入致孔剂, 如果不添加致孔剂, 则得到凝胶型树脂。在高分子离子交换树脂中, 骨架多数采用交联度为1%~20%范围的聚苯乙烯, 它由二乙烯苯交联制得, 结构稳定, 通过磺化反应可制备强酸性阳离子树脂;通过氯甲基化后, 再与各种胺反应, 可得到各种阴离子树脂。少数离子交换树脂的骨架可由交联聚丙烯酸类树脂构成。
在亲和色谱中, 固定相由载体、键合臂和具有特殊选择性的亲和基团组成, 该亲和基团称为配基。常见的载体有琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺和硅胶等。配基有两大类, 第一类是具有专一亲和力, 如抗原与其对应的抗体。另一类是没有专一亲和力的假亲和色谱, 这类配基典型的代表是染料配基和硼酸盐配基。其中, 免疫球蛋白IGG的检测过程中使用的蛋白柱即是一种亲和色谱柱, 免疫球蛋白IGG与蛋白柱之间的亲和作用及洗脱过程是通过流动相中的pH值、离子强度及化学组成来控制的, 该类亲和色谱柱易滋生霉菌, 因此柱子的存储十分重要, 比如蛋白柱就需要保存在20%的乙醇的水溶液中, 并冷藏于4℃环境。
纵观几大分离色谱, 大多数具有特异分离效果的色谱材料均是复合型色谱填料, 以下重点介绍的是制备型及分析型液相色谱柱色谱填料的种类、整体柱及色谱基质的表征手段。
1 基质填料种类
1.1 硅胶
无机基质材料中最重要的是硅胶, 微粒型硅胶的出现, 促进了高效液相色谱法的发生与发展。用作色谱填料基质的硅胶是通过人工合成的, 其制备方法多样, 大都拥有各自的专利。合成色谱用硅胶区别于天然晶体二氧化硅, 也区别于介于晶型和无定型之间的用于色谱、电色谱中的石英毛细管, 用作色谱填料的是无定型二氧化硅。硅胶吸附色谱是色谱中的经典, 硅胶至今仍是制备色谱中填充柱的主要材料, 250目~400目 (即40μm~63μm直径) 的硅胶颗粒的含水量直接影响活性, 其活性随着含水量的升高而降低。当其含水量接近20%的时候, 硅胶基本不具吸附活性;活性太高, 则出现不可逆吸附和拖尾, 甚至分离物分子结构的改变。以下将重点介绍其化学修饰及聚合物包覆的过程。
硅胶能用于色谱基质材料, 是因为其表面具有重要的活性基团硅羟基, 即自由硅羟基, 或称孤立硅羟基。由于游离的硅羟基是造成色谱峰尤其是碱性溶质拖尾的主要原因, 因此在合成反相色谱材料中, 针对硅羟基的封尾技术非常重要。例如C18柱, 在键合了十八烷基后, 还需通过小分子的硅烷化试剂 (例如三甲基氯硅烷) 对其进行封尾, 以尽可能地减小极性大的硅羟基对整体呈现非极性的色谱柱的影响, 如若硅羟基外露, 封尾不完全, 势必影响反相色谱的保留时间和色谱峰型。
对硅胶表面进行的改性是通过该活性基团进行的, 通过各种硅烷化试剂对硅胶表面进行修饰, 可以得到包括烷烃和芳烃在内的烷基反相填料。常用的硅烷化试剂除了氯硅烷和烷氧基硅烷外, 还有烷基硅氨烷。例如:在硅羟基上键合十八烷基, 可制得液相色谱柱中常用的C18柱 (ODS) ;以氨基、羧基、磺酸基修饰, 可得到离子交换填料;以聚乙二醇修饰, 可得到疏水作用的填料。对于化学键合相硅胶, 在孔径、粒径相当的前提下, 稳定性是其最重要的指标, 稳定性主要指柱流失。柱流失的程度取决于键合反应时的条件是否控制得当, 即是否由于水的存在, 而生成易溶于有机相中的副产物;值得指出的是, 在硅胶的预处理过程对最终硅胶基质填料的稳定性也有十分重要的影响, 在预处理过程中, 需要无机酸浸泡, 以除去硅胶表面存在的会造成峰型拖尾, 甚至不可逆吸附强极性杂质的Na+、Ca2+、Al3+、Fe3+等金属离子。
1.2 氧化铝
用作吸附材料和色谱填料基质的氧化铝主要是γ-氧化铝, γ-氧化铝表面化学修饰比硅胶更困难, 因此氧化铝多使用于一些小分子有机化合物的分离, 用于正相、离子交换色谱和反向高效液相色谱中, 在生化分离上应用得少。氧化铝的化学修饰可通过铝羟基的反应或是涂覆技术。通过铝羟基反应可通过在氧化铝表面上的活性羟基键合C4、C8和C18等烷基, 制得在宽pH范围内稳定, 应用于反相色谱中的烷基化氧化铝。表面涂覆可以制得聚苯乙烯-二乙烯基、聚丁乙烯或十八烷基硅烷等强疏水性复合材料。
在吸附型制备色谱中, 氧化铝的吸附能力比硅胶更强, 氧化铝比硅胶的样品处理量更大, 根据含水量大小 (0%~15%) , 大多情况下, 需要控制的含水量为6%~10%, 对应的活性为第三和第四等级。根据酸碱性, 应用于吸附色谱中的氧化铝分为中性、酸性和碱性氧化铝, 中性氧化铝水提取液的pH值为7.5, 适用于醛、酮、醌、某些苷及酸碱溶液中不稳定化合物, 如酯、内酯等化合物的分离, 因此应用十分广泛。大多数情况下使用的是碱性氧化铝水提取液的pH值为9~10, 常应用于碳氢化合物的分离, 能中碳氢化合物中除去含氧化合物, 还能对某些色素, 甾族化合物、生物碱、醇以及其他中性、碱性物质的分离。酸性氧化铝水提取液的pH值为4~4.5, 适用于天然及合成酸性色素以及某些醛、酸的分离。
1.3 氧化锆
氧化锆和硅胶一样, 具有优异的机械强度, 适宜的孔结构和可用于键合其他功能基团的活性位点外, 还具有更宽的pH耐受范围和更好的耐温性。氧化锆多孔小球可耐受pH0~14的环境, 可高达900℃的温度下长时间工作不会变形且结构不遭受破坏。碳十八键合二氧化锆 (ODZ) 可在pH2~12范围内使用。聚丁二烯包覆二氧化锆复合填料在全pH值范围内稳定, 并且能耐200℃的柱温。王晖等制备强离子 (HO3S-P S-ZrO2) 和强阴离子新型固定相[ (Me) 3N+-PS-ZrO2], 并尝试性地用于糖、核苷、核苷酸和脱氧核苷酸的分离。
1.4 复合型填料
复合型填料在上文中已有提及, 一般而言, 硅胶基质化学键合相在pH2~8的范围内稳定, 难以耐受更宽的pH范围, 在碱性条件下硅胶基质会发生溶解, 于是人们将机械强度较低、在有机溶剂中易发生溶胀的高聚物引入到硅胶基质填料中, 与硅胶形成优势互补, 制备出有机-无机复合型填料, 即包覆型填料或涂覆型填料。
硅胶、氧化铝、氧化锆等都曾被用作包覆型填料的基质材料, 其中最重要的是硅胶和氧化锆。用于包覆无机基质填料的高聚物则有聚苯乙烯、聚乙基苯乙烯-二乙烯基苯、聚丁二烯、聚环氧乙烷、聚硅氧烷、琼脂糖、聚氯甲基苯乙烯-二乙氧基甲基乙烯基硅烷以及气相沉积碳等。
早期包覆型填料的制备采用物理包覆法, 制得的复合物孔径结构不甚可控, 重现性差。后期采用的是化学键合或复合型包覆法。该法首先利用无机基质表面修饰技术, 使硅胶、氧化铝或氧化锆等基质的表面带上适合数量的活性基团, 例如可发生加合反应的双键、环氧基团、氨基或羧基等, 再将制备高聚物所需的单体、交联剂等涂覆到基质表面, 然后通过加入引发剂, 控温等条件引发化学键合或共聚反应, 制得包覆层紧密牢固的复合色谱填料。但是由于聚合物包覆不完全, 裸露出来的无机基质会吸附路易斯碱性物质, 特别会吸附蛋白质而导致峰型变差, 这种吸附可以通过有机物热蒸汽化学气相沉积法使热解碳对裸露无机基质进行包覆。
在键合固定相中特别值得提及的是用于手性拆分药物、酸类、酰胺类化合物的手性分离固定相。手性固定相所使用的高分子基球通常是粒径单分散的缩水甘油甲基丙烯酸-亚乙基二异丁烯酸酯共聚物微球、一锅法制备的单分散聚甲基丙烯酰胺球、聚硅氧烷、光学活性聚氨基甲酸乙酯以及聚苯乙烯。通过共价键或涂覆方式, 发展了Pirkle型 (刷型) 、多糖类、环糊精类、冠醚类、杯芳烃等多种类型的手性固定相。Pirkle型手性固定相的起源是被称为CSA的手性溶解试剂;多糖类手性固定相主要包括纤维素类和直链淀粉类;环糊精 (CDs) 是含有以α-1, 4-连接的β-吡喃葡萄糖单元的环状非还原寡糖。目前, 常见的环糊精有三种:6个葡萄糖单元的α-CD, 7个葡萄糖单元的β-CD和8个葡萄糖单元的γ-CD。β-CD的空间结构似笼状, 可以包结许多水溶性及非水溶性化合物, 例如苯酚。同时因为β-CD的大小适中, 而且具有21个羟基活性位点, 可键合烷基、羟烷基、氨基、巯基、糖基、麦芽糖基、甲基、羟乙基、羟丙基、乙酰基等修饰基团, 灵活多变, 可塑性强, 是搭建手性分离的桥梁。
1.5 整体柱
整体柱区别于微粒型填料填装, 是由单体、交联剂、致孔剂以及引发剂在柱子内通过可控制的原位聚合反应形成连续、整体型的柱床。整体色谱柱合并填料合成、筛选与装柱过程, 得到均匀的色谱床层结构, 稳定性和重现性更好。具有利于传质的小孔 (孔径小于2nm) 和中孔 (孔径2nm~50nm) , 在较大流速下仍然具有较低的柱压, 传质速度快, 适合快速分析和梯度模式。
整体柱主要分为有机整体柱和无机整体柱, 有机整体柱主要包括聚丙烯酰胺类整体柱、聚甲基丙烯酸酯类整体柱、聚苯乙烯类整体柱和分子印记整体柱。近几年来, 整体柱备受科研机构关注的原因是因为整体柱在合成过程中本身就可以通过选择单体、交联剂的种类来合成高密度的活性位点, 例如:在GMA-EDMA整体柱上, 可引入环氧基团、双键等活性基团, 通过对环氧基团进行修饰, 可以键合环糊精等具有手性分离功能手性分离配基。
目前整体柱已经在反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱、亲和色谱、体积排阻色谱中获得了应用, 可用于分离脱氧核糖核酸、肽、蛋白质、氨基酸、低聚核苷酸、类固醇、芳烃、酚类等物质, 具有广泛的应用前景。马志玲等以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体, 乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂, 环己醇和正十二醇混合溶液为致孔剂, 偶氮二异丁腈为引发剂, 制备了毛细管整体柱基质, 使用Epoxy方法在基质表面键合牛血清白蛋白 (BSA) , 制得BSA修饰的毛细管整体柱, 将此毛细管整体柱应用于毛细管电色谱中, 成功地分离出了组氨酸对映体。但该类蛋白质手性分离色谱柱存在保存困难, 使用寿命短的缺点。
可能因为整体柱的制备及键合反应过程尚未能精确受控, 净化过程耗时长, 及使用过程中可能出现脱模, 及应用上与同类型商品化柱子相比较的优势, 距离规模商品化还有待深入探索。
2 基质填料的性能表征
对于应用于色谱柱中的基质填料, 必须通过一系列的表征手段来考察其性能。对于液相色谱而言, 色谱柱最重要的参数主要有粒径及粒径分布、孔径及孔径分布、比表面积以及比孔容、表面形貌、柱效、渗透性及柱压耐受性等物理及表面性质。而化学性质则主要包括基质填料功能基团的结构解析及键合量。
2.1 物理及表面性质的表征
填料的表面形貌、粒径形状大小及粒径分布主要通过高倍数的扫描电镜进行观测, 扫描电镜图是优化填料合成条件强大的直观评价依据;孔径分布和比表面积一般可通过氮吸附法测定, 了解基质材料在微孔、中孔及大孔范围内的孔径分布。
2.2 化学性质的表征
对于大多数液相色谱填料的功能基团, 在中红外、远红外及近红外的指纹区都有相应的特征吸收, 因此, 可通过红外光谱对其进行结构解析。傅里叶红外光谱在合成填料过程中, 通过比较键合前后基质的红外光谱, 判别键合试验是否成功。
以反相色谱柱为例, 填料通常通过其含碳量来表征表面化学修饰的程度。高效液相色谱柱填料的含碳量在百分之几到百分之二十几之间, 现代元素分析仪可测定化学键合硅胶中碳、氢和氧的含量, 其测定极限约为0.2%~0.3%, 完全可满足测定需要。对于表面由单分子层修饰的基球, 可通过含碳量及填料的比表面积计算修饰基的密度, 进而对不同填料进行比较。近年来, 固体核磁共振波谱技术也应用于高效液相色谱固定相中, 例如在无机基质表面键合C18制备反相色谱柱中, 用13C标记C18修饰基团, 从固定相的NMR谱中的δ16~40判别十八烷基是否键合到无机基质表面。而δ115属于sp2杂化不饱和碳的核磁共振信号, 可判别13C标记苯环修饰基团是否交联到无机基质表面。
3 结语
色谱作为一种分离技术与方法, 发展历经百年, 特别是液相色谱, 无论是从用途 (制备型或分析型) 、分离原理、基质材料, 或是从发展史、分析应用、维护上细述, 都是一门丰富的学问。了解色谱材料的分类和分离原理, 才可以理解色谱过程中一脉相承之处, 例如固相萃取柱、固相微萃取探头涂层和液相色谱柱。在食品问题、环境问题备受关注的今天, 只有从事该行业的科研人员充分掌握了色谱的核心, 才能使食品监管、环境监控及科研中的工作进行得更加迅速顺利。
摘要：色谱柱是色谱分离的核心, 色谱基质填料是色谱界研究的热点。与气相色谱相比较, 液相色谱可分析检测的有机物范围广泛, 可以满足80%有机物的检测, 为了方便迅速地选择适合的色谱柱, 综合了解液相色谱分离基质材料 (填料及整体柱) 的分类及表征手段是十分必要的。
二维液相色谱 篇6
关键词：高效液相色谱法,利福霉素钠,含量测定
利福霉素钠属安莎类抗生素,是半合成的利福霉素中的广谱抗生素,也是国内惟一供注射用的利福霉素类药物,对金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌有较强的杀菌作用。是临床九大抗结核药物的首选药物。由于利福霉素钠结构复杂、不稳定、容易产生降解杂质,主要杂质为利福霉素S与利福霉素B,使用高效液相色谱法测定利福霉素钠的含量。该方法简便、快速、精密、准确。
1 仪器与色谱条件
采用岛津LC-6A型高效液相色谱仪;岛津SPD-6AV紫外检测器;Kromasil-C8色谱柱(250×4.6mm,5um)(瑞典NobelLEka生产),甲醇(0.075mol/L):磷酸二氢钾溶液(1.0mol/L):枸橼酸溶液(60:26:4)为流动相,检测波长为254nm,流速1.0ml/min,柱温35℃,进样量10μl。
2 方法与结果[1,2,3,4]
2.1 标准溶液的制备
利福霉素标准品(批号0333—200606,832μg/mg)、利福霉素S (130539?200601)和利福霉素B(130540?200601)均由中国药品生物制品检定所提供;利福霉素钠原料由四川制药股份有限公司提供,批号分别为2005-10-21,2005-10-22,2005-10-23,2005-10-25,2005-10-28与200605001、200605002、200605003;注射用利福霉素钠(批号为051128,规格0.25g)由海南三元阳普医药有限公司提供;培养基为I号6.0～6.5,批号:051112(北京三药科技开发公司生产,中国药品生物制品检定所监制);菌种为藤黄微球菌[CMCC(B)2800 1](中国药品生物制品检定所);甲醇与乙腈为Merck公司生产(色谱纯),其余试剂均为分析纯。精密称取对照品0.2g,加入5ml甲醇使溶解并稀释到100ml,精密量取0.6ml,0.8ml,1.0ml,1.2ml,1.5ml,2.0ml分别加流动相稀释到25 ml摇匀备用。
2.2 标准曲线的绘制
按1项下的色谱条件,取2.1项下的标准溶液分别进样测得的结果见表1。
回归方程:Y=1578749-64917,r=1.0001。说明利福霉素浓度和色谱峰面积的线性关系良好
2.3 溶液稳定性试验
取2.1项下的标准溶液于不同时间进样,每样20?l,在室温下放置12h分别在(0、2、4、8、12)h取样测定,其平均峰面积为1473250,表明本品在甲醇:乙腈:0075mol/L磷酸二氢钾溶液:1.0 mol/L枸橼酸溶液中稳定。结果表明利福昔明溶液在12小时内是稳定的。
2.4 精密度试验
精密称取利福霉素对照品0.2g,精密称定6份,分别加5ml甲醇使溶解并稀释到100ml,精密量取1.0ml,分别加流动相稀释到25 ml摇匀,分别进样,每样20?l,结果见表2。
RSD=1.56%结果表明:本法精密度较好
2.5 样品含量测定
精密称取细粉取利福霉素1.623g,置100ml量瓶中,加入甲醇溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,弃去初滤液,精密吸取续滤液5ml置50ml量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,照高效液相色谱法中(中华人民共和国药典2005年版二部)方法测定,取20μl注入液相色谱仪中,记录色谱。另精密称取于105℃干燥至恒重的利福霉素对照品0.8g,置100ml量瓶中,加入甲醇溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,精密吸取5ml置50ml量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,同法测定。按外标法以峰面积计算,结果见表3。
依据试验结果,规定含量限度为90.0%～105.0%
3 讨论
采用高效液相色谱法测定利福霉素的含量,我们用高效液相色谱法,色谱柱为KromasilC8,(甲醇:乙腈:0075 mol/L磷酸二氢钾溶液:1.0 mol/L枸橼酸溶液)=50:22.5:22.5:5为流动相,流速为1.0 ml/min,检测波长为240nm,利福霉素在(41.02～164.08)μg/mL范围内线性关系良好(r=0.99997),平均回收率为99.79%,RSD为0.2%,该方法准确、灵敏、可靠,能有效地控制该制剂的质量,可作为该制剂含量测定的检测方法。
参考文献
[1] 张兵.Rp-HPLC测定利福昔明的含量及有关物质[J].华西药学杂 志,2003,18(4) :281．
[2] 吴小英,童成亮,钟淮滨.利福昔明中有机溶剂残留量的测定[J].安 徽医药,2004;02:45-46
[3]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典(第二部附录Ⅳ) [s].2005版.北京:化学工业出版社.2005,65
二维液相色谱 篇7
1.1 组成
高效液相色谱仪它是在经典液相色谱的基础上, 引入气相色谱的理论和技术而发展起来的。其主要由储液器、高压泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。
1.2 工作原理
储液器中的流动相被高压泵打入系统, 样品溶液经进样器进入流动相, 被流动相载入色谱柱 (固定相) 内, 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数, 在两相中作相对运动时, 经过反复多次的吸附, 解吸的分配过程, 各组分在移动速度上产生较大的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出, 通过检测器时, 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪, 数据以图谱形式打印出来。
2 高效液相色谱仪的使用及维护
2.1 色谱柱
色谱柱是整个色谱系统的心脏, 它的质量优劣直接影响到分离的效果, 一般情况下色谱柱通常采用优质不锈钢管制成, 并且柱内壁必须光洁平滑, 否则内壁的纵向沟痕和表面多孔性也会引起谱带的展宽, 柱接头的体积应尽可能小, 柱长一般10 cm～25 cm, 内径4 mm～5 mm。为了保护分析柱不被污染, 有时需在分析柱前加一短柱, 约数厘米长, 此柱称为保护柱, 为了防止保护柱过分增加柱阻力, 在保护柱中使用的颗粒大小约为10 μm～30 μm。在使用中我们应尽量做到以下几点:
(1) 加装保护柱, 保护柱的作用是过滤掉来自流动相和样品的化学“垃圾”同时也可以有效除去流动相和样品中的不溶物。保护柱填料应与分析柱一致, 粒径可较分析柱大。保护柱属消耗品, 经过一定次数的样品分析 (50～100次) 后, 出现柱压显著升高或峰形变坏或基线漂移时, 应考虑更换保护柱。
(2) 净化样品, 当样品中含有对色谱柱有损害的化学成分, 如产生永久性吸附的蛋白质、糖等有机分子和强吸附性物质, 以及可能对柱填料产生破坏作用的基团离子。在进样前应尽可能对样品进行分离提纯以除去多余杂质组分。
(3) 避免高压冲击分离柱。一般色谱柱都能承受得起高压, 但经不住突然变化的高压冲击, 这将改变柱床体积, 影响柱效。引起高压冲击的原因主要有:进样器的样品阀的缓慢转动、泵启动太快、柱切换等操作。用手动进样阀时的压力变化不大, 自动进样阀由于切换较慢, 可能会造成压力冲击[1]。
(4) 注意分离柱的使用条件, 一般以硅胶为基质的色谱柱最高使用温度不超过60℃, 以低于40℃为宜, 特别是在流动相pH接近使用限度时, 更应降低使用温度。温度过高会加快键合相的水解和硅胶的溶解, 从而使填料性质改变, 柱床塌陷, 降低柱效, 改变峰形。目前的键合硅胶色谱柱标示的pH适用范围可达2～10, 但在实际使用时应避免极端的pH条件, 特别是在偏碱性的条件 (pH≥8) 下使用[2]。
(5) 及时冲洗, 试验结束后, 要及时用适当的溶剂冲洗系统并最终过渡到纯甲醇冲洗, 对于含有缓冲盐的流动相, 最好的办法是先用与分析用流动相组成完全相同但不含缓冲盐的溶液进行冲洗, 再逐步过渡到纯甲醇冲洗。
2.2 高压泵
高压泵主要用于输送流动相, 其压力一般为几兆帕至数十兆帕。这时液体的黏度比气体大100倍, 同时由于固定相的颗粒极细, 柱内压降大, 为保证一定的流速, 必须借助高压迫使流动相通过柱子。高压泵应无脉动或脉动极小, 以保证输出的流动相具有恒定的流速, 同时采用脉动阻尼装置可将产生的脉动除去, 使流动相的流量变动范围不宜超过2%～3%, 同时还应具有耐压、耐腐蚀、密封性好等特点。使用过程中应注意:使用流动相尽量要清洁, 进液处的沙芯过滤头要经常清洗, 流动相交换时要防止沉淀, 避免泵内堵塞或有气泡。
2.3 检测器
通常情况下检测器分为通用型和选择型两种种, 通用型检测器是指可连续测量色谱柱流出物 (包括流动相和样品组分) 的全部特性变化;而选择型检测器是用以测量被分离样品组分某种特性的变化, 这类检测器对样品中组分的某种物理或化学性质敏感, 而这一性质是流动相所不具备的, 或至少在操作条件下不显示。如紫外检测器、荧光检测器等属于选择型检测器;示差折光检测器属于通用型检测器。
(1) 紫外检测器
紫外吸收检测器是一种选择性浓度型检测器, 它不仅对那些在紫外波长下有吸收的物质有响应, 并且还具有灵敏度高、噪声低等优点。在高效液相色谱中应用最广, 约占70%。使用紫外检测器时要注意环境因素带来的干扰。由于静电的作用, 检测器在使用时易于从周围环境中吸附尘埃, 覆盖在光学元件上的尘埃能降低光的传播效率, 加大了光的散射, 对检测不利。故紫外检测器周围的环境要清洁, 经常打扫, 保持干净。强紫外照射还会使一些光学材料涂层降解, 慢慢增加噪声, 故检测器应避免阳光直射。同时, 要远离热源、暖气管道等。
(2) 荧光检测器
凡具有荧光的物质, 在一定条件下, 其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此, 这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物 (如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等) 的测定。荧光检测器是一种最灵敏的高效液相色谱检测器, 它的灵敏度比紫外吸收检测器高100倍, 特别适合于痕量分析。但在使用中我们应注意: (a) 测定时不要使用可熄灭、抑制或吸收荧光的溶剂作流动相[3]。 (b) 荧光强度易受溶剂极性和温度的影响, 提高溶剂极性可导致荧光增强, 提高温度, 可使荧光物质溶液的荧光效率和荧光强度降低。 (c) 样品浓度过高时, 荧光物质分子易与溶剂分子或其他溶质分子相互作用, 引起溶液的荧光强度降低, 因此, 在进行荧光检测时, 样品要配成低于1 μg/mL浓度的样品。
(3) 示差折光检测器
示差折光检测器是一种浓度型通用检测器, 对所有溶质都有响应, 其主要缺点是它对温度变化特别敏感, 且不适于梯度淋洗色谱。示差检测器是基于连续测定样品流路和参比流路之间折射率的变化 (或液体折光指数差值) 来测定样品含量的。只要样品组分与流动相的折光指数不同, 就可被检测, 二者相差愈大, 灵敏度愈高, 在一定浓度范围内检测器的输出与溶质浓度成正比。示差折光检测器主要受温度、流速以及流动相的种类等因素的影响, 示差折光检测器是较难稳定, 但是和仪器本身的硬件条件有问题, 使用中我们应注意以下几点: (a) 流动相一定要混匀, 而且要充分脱气, 最好用单元泵。 (b) 有条件的话将溶剂瓶、柱温箱、检测器的光学单元温度控制在同一个温度, 且最好高于室温5～10℃。不要将检测器放置在通风橱或是空调出风口处。 (c) 环境温度不要变化太大, 实验室最好门窗关闭, 如果没有柱温箱那就把检测器温度调低一点。
3 高效液相的日常维护
3.1 建立仪器档案。主要记录仪器的型号、制造厂家、购入日期、启用日期和放置地点, 保护好开箱资料、验收文件、仪器手册及使用记录和维修记录。
3.2 液相色谱仪要有专业技术人员负责管理和使用。分析前要检查仪器是否处于正常状态, 如输液泵是否工作正常、流路中是否有漏液现象、反压是否过高等。分析时严格按使用说明进行操作。用完仪器后要做好使用记录, 特别是发现异常和故障, 一定要及时登记, 为以后的维修提供参考依据。
3.3仪器不用时, 定期冲洗系统 (用平衡溶液) , 一是为赶走流路中的气泡, 二是用新鲜流动相置换柱中的旧液, 防止柱内填料因长期静止不流动形成的沉淀物堵塞色谱柱。
3.4做好仪器的日常维护和保养, 及时更换已老化、损坏了的仪器部件, 确保仪器始终处于正常运转状态。
4结语
液相色谱仪以独特的特点及其技术的发展, 已被广泛地应用到化工、食品分析、环境分析、天然产物分析以及医药、生化、临床检验, 它对于疾病的诊断和疗效监测起到了非常重要的作用。如医药方面, 高效液相色谱仪可以分析药物的含量, 药物在体内的残留量, 测定药物在体内的代谢情况等。在生化方面高效液相色谱仪可以分离分析与生命密切相关的多种物质, 如氨基酸、肽、蛋白质、核酸、维生素、酶、糖等。临床检验方面可以对疾病的变化通过对人体组织或体液中的异性物质进行含量改变的分析, 对于疾病的诊断和疗效监测将会起到重要的作用。
摘要：高效液相色谱 (HPLC) 作为一种具有高灵敏度、高选择性的高效快速分离分析技术, 随着科学技术的不断发展, 液相色谱 (HPLC) 仪器方法也得到了长足的发展, 目前已成为影响最大、发展最快、应用广泛的现代分析仪器之一。它既能用于微量组分的分析测定, 又能用于大量的制备分离, 灵活多样, 其应用范围已超过其他各种分离方法, 尤其在生化医药样品的分析分离方面更充分发挥它的特长, 为推动该领域的进步和发展作出了巨大贡献。然而, 在日常的工作中, 经常会遇到这样或者那样的问题, 影响到正常的工作, 本文将通过加强管理和维护来降低故障的发生率谈几点看法。
关键词：色谱系统,检测器,管理
参考文献
[1]张燕婉, 汪劭婷.高效液相色谱仪的管理与维护[J].现代科学仪器, 2007.
[2]刘国诠.余兆楼.色谱柱技术[M].北京:化学工业出版, 2006.
[3]于世林.高效液.相色谱方法及应用[M].北京:化学工业出版社, 2005.
植物甾醇酯的高效液相色谱分析 篇8
一仪器与试药
Agilent 1100型液相色谱仪, Agilent 1100型紫外检测器;电子天平;梅特勒托利多。
植物甾醇酯对照品购于cognis生物制品有限公司, 经HPLC测定纯度为95.31%, 所用试剂均为色谱纯。
二实验方法
1. 对照品溶液的制备
称取Cognis甾醇酯 (95%) 对照品50mg溶于50m L流动相, 配制成质量浓度为1mg/m L的对照品溶液, 摇匀, 经0.45µm微孔滤膜过滤, 即得对照品储备液, 备用。
2. 样品溶液的制备
向装有温度计的250m L四口烧瓶中加入一定量的植物甾醇和脂肪酸甲酯, 油浴加热, 机械搅拌, 温度达到90℃后继续反应1h, 再加入一定量的甲醇钠, 而后恒温反应4h, 最后将热的反应液转入漏斗中, 经水洗、乙醇洗涤, 脱溶剂后得到样品。
称取合成样品50mg溶于50m L流动相, 配制成质量浓度为1mg/m L的样品溶液, 摇匀, 经0.45µm微孔滤膜过滤, 即得样品储备液, 备用。
3. 色谱条件
色谱柱:硅胶正相柱 (250mm×4.6mm, 5μm) ;流动相:正己烷∶异丙醇∶甲醇=98∶2∶1.5%;流速:1m L/min;检测波长:210nm;进样量:20μL。
4. 线性关系考察
吸取对照品储备液1、2、4、6、8m L, 分别置于10m L容量瓶中, 使用流动相定容, 摇匀, 得到5个不同浓度的对照品溶液。分别吸取20µL, 按上述色谱条件进样分析。以浓度X (µg/m L) 为横坐标, 峰面积Y为纵坐标, 绘制标准曲线并计算回归方程。回归方程为:Y=187269X+29637, r=0.9987。结果表明:甾醇酯在0.1~0.8mg/m L的浓度范围内与峰面积有良好的线性关系。
5. 精密度试验
吸取上述标准对照品溶液中的0.6mg/m L 20µL, 按上述色谱条件, 重复进样5次, 测得甾醇酯峰面积的RSD为1.29%。
6. 稳定性试验
取0.4mg/m L对照品溶液, 分别于0、2、6、12、24h, 吸取20µL进样, 测得甾醇酯峰面积的RSD为1.76%。结果表明, 供试品溶液在24h内稳定性较好。
7. 重现性试验
取同一批原料5份, 按供试品溶液制备方法分别制备5份, 测定, 计算甾醇酯的百分含量的RSD为1.94%。
8. 回收率试验
称取已知甾醇酯含量样品5份, 各取5mg分别加入甾醇酯对照品适量, 按供试品溶液的制备方法进行处理, 按上述色谱条件测定, 结果甾醇酯的平均回收率为98.72%, RSD为1.87%。
9. 样品测定
吸取经微孔滤膜 (0.45µm) 滤过后的样品溶液20µL, 在上述色谱条件下进样分析。
三讨论
经实验最后确定流动相为:正己烷∶异丙醇∶甲醇=98∶2∶1.5%。加入少量异丙醇能使甾醇快速出峰, 峰型较理想, 加入量过多也会使甾醇与其他峰无法分开。正己烷∶异丙醇=98∶2时峰型较理想;加入甲醇能使甾醇酯与甲酯很好分离。实验还考查了反相液相色谱法对样品测定, 发现甾醇组份能分别出峰, 但甾醇酯不能得到理想峰型。
四结论
本实验对高效液相色谱法进行了系统性分析, 考查了不同色谱柱和流动相, 最后确定了分析三种物质较理想的分析条件:紫外检测器;硅胶正相柱Hypersil CN (250mm×4.6mm, 5μm) ;流动相:正己烷∶异丙醇∶甲醇=98∶2∶1.5%;流速:1m L/min;检测波长:210nm;进样量:20μL。本方法简便、易行, 而且稳定、重现性好。
摘要：本文研究了植物甾醇酯、植物甾醇和脂肪酸酯的定性、定量分析方法。采用正相高效液相色谱法, 紫外检测器, 结果表明:三种物质10min内出峰, 分离效果好, 此方法快速、准确、简便。
关键词：植物甾醇,植物甾醇酯,高效液相色谱
参考文献
[1]盛漪、华伟、谷文英.植物甾醇降胆固醇生理功能及其研究进展[J].粮食与油脂, 2002 (12) :25～26