自体荧光成像（通用5篇）
自体荧光成像 篇1
摘要：目的 探讨在300 nm波长光激发下, 利用340 nm自体荧光成像技术诊断乳腺癌和结肠癌的方法。方法 在相同实验条件下对21例乳腺癌和结肠癌样本进行自体荧光成像, 比较和测量肿瘤组织、正常组织、脂肪组织、血管组织的荧光强度。结果 实验结果表明, 样本中肿瘤组织的荧光强度高于其他组织, 脂肪组织和血管组织的荧光强度要低于正常组织。结论 乳腺和结肠的自体荧光图像中各组织荧光强度有明显的差异, 可以作为诊断的辅助手段。
关键词：自体荧光成像,乳腺癌,结肠癌,荧光光谱
很早就有报道, 通过观察组织自体荧光光谱的变化, 可以发现组织的改变[1]。这种分析和诊断的方法正是利用了正常细胞和肿瘤细胞不同的自体荧光光谱特性[2]。基于自体荧光光谱技术的自体荧光成像系统让医生对肿瘤的分析和诊断变得更容易、更高效[3]。
本实验说明了乳腺和结肠组织的自体荧光图像能为肿瘤的诊断提供丰富的信息, 探讨荧光成像方法在肿瘤诊断中的意义。通过测量荧光图像中各种组织的荧光强度, 发现肿瘤组织的荧光强度高于正常组织、脂肪组织、血管组织。
1 材料和方法
1.1 实验样本
实验中的乳腺和结肠的肿瘤组织样本来自于丽水市人民医院病理科, 样本由病理科医生挑选出来, 并对样本做出病理诊断。样本共21 例, 其中乳腺样本11 例, 结肠癌样本10 例, 每组样本都包含有正常组织作为对照样本。样本的贮藏条件为4℃, 在组织样本离体6 h内完成对样本的荧光成像。荧光成像前, 样本未经过任何的化学和冰冻处理, 结肠样本中的粘液作为组织的一部分。
1.2 实验方法与装置
采集比较了多种波长条件下样本的自体荧光图像, 对比了样本的荧光光谱, 发现激发光波长为300 nm, 荧光波长为340 nm时, 乳腺癌和结肠癌的荧光图像有类似的荧光特性, 其诊断结果与病理学诊断结果最为接近。
实验装置示意图, 见图1。氙灯 (300 W) 作为光源, 光束通过300 nm的窄带滤光片 (半宽度为5 nm) 。样本与镜头平行, 以避免不规则的折射对自体荧光图像的影响。光束经多功能光学测量计 (Newport, Model 1835-e, Irvine, CA) 的测量, 到达样品表面的光束能量为35 m W/cm2。在镜头1 (105 mm UV-Nikkor镜头) 前有一个340 nm的窄带滤光片 (半宽度为5 nm) 。荧光由图像增强器放大以后, 由镜头2 成像。 最终由相机 (TM-72EX, Pulnix America Inc., Sunnyvale CA) 采集后传输给电脑。
1.3 荧光成像及荧光强度的测量
荧光成像过程中, 电脑接每秒钟收到3 个画面, 每个样本的荧光图像都是由50 个画面叠加在一起。显示器上最终显示的荧光图像是样品自体荧光强度的10 倍。 根据病理结果与荧光图像对比, 将样本中的组织分为肿瘤组织、正常组织、脂肪组织、血管组织。利用电脑上的软件V (Digital Optics Ltd. Auckland, New Zealand) 来测量样本中各组织的荧光强度。软件测得的荧光值是样本上所选的1 mm2面积的荧光强度, 样本中每个组织上分别取6 个点进行测量, 6 个测量值的均值为该样本中这一组织的荧光强度。
2 结果
在相同条件下, 对21 个样本进行自体荧光成像。通过乳腺和结肠的自体荧光图像与病理片的对照可以清楚的观察到样本中各组织有不同的自体荧光强度, 见图2~3。
由图可见, 肿瘤的自体荧光强度高于正常组织;脂肪组织和血管组织的荧光强度要低于正常组织, 其中血管组织的荧光强度最低。乳腺和结肠的肿瘤组织荧光强度与正常组织相比, 差异有显著性 (P < 0.01) 。
对于荧光数据分析运用了荧光比率探测方法[4], 正常组织的自体荧光强度作为其他组织 (肿瘤、脂肪、血管) 的自体荧光强度参照, 测量结果用平均比率和标准差来表示 (x_±SD) , 结果显示, 见表1。实验结果为:肿瘤组织1.89±0.41、脂肪组织0.77±0.11、血管组织0.30±0.11。
3 讨论
目前, 国内外已经有大量关于利用自体荧光技术分析和诊断各种不同肿瘤的研究[5], 但引起正常组织和肿瘤组织出现荧光强度改变的机理还不清楚。许多研究认为自体荧光物质主要有胶原蛋白、二络氨酸、聚糖等[6], 而肿瘤组织荧光强度的改变可能就是由于肿瘤组织的上皮组织周围这些物质发生了量和质的变化, 而且大多数肿瘤都起源于上皮细胞。
自体荧光的改变与药物荧光相比, 优势在于能直接反组织生化结构的改变[7,8], 并且不需要光敏剂, 消除了光敏剂对病人的影响。以低剂量注射 (0.35 mg/kg) 血卟啉为例, 48 h内能在皮肤中检测到, 在肿瘤等敏感区域2 天内都能检测到, 这意味着血卟啉药物在体内至少存在2 天[9,10]。
自体荧光成像技术不会损伤肿瘤组织的生理状态和正常细胞的生理功能, 是一种无侵袭诊断技术, 高分辨率的荧光成像系统还能用于诊断很小的肿瘤。自体荧光成像技术用于肿瘤诊断时, 与自体荧光光谱技术相比, 能提供的信息更为直观, 根据荧光图像中各组织不同的荧光强度, 还能对肿瘤组织进行分界[11]。
查阅了文献, 关于肿瘤和正常组织的自体荧光有两种不同的结果[12], 有些研究的结果与本实验的结果相同, 认为肿瘤的荧光强度大于正常组织。这种差别也许是由于对样本不同的处理方式和选择了不同波长的激发光与荧光。本实验结果证明了在300 nm波长光激发下, 利用340 nm自体荧光成像技术诊断乳腺癌和结肠癌的可行性, 测量出了肿瘤样本中各个组织的荧光强度, 给肿瘤的诊断提供了参考依据。也说明了乳腺和结肠组织在这种条件下, 有相同的荧光特性, 这其中包括了正常和肿瘤组织。这种自体荧光成像技术还能用于识别和诊断其他种类的肿瘤, 但还需要通过更多的实验来证明这一假设。
参考文献
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多光谱荧光成像系统 篇2
德国弗劳恩霍夫制造技术与自动化研究所推出一种多光谱荧光成像系统, 可用于诊断肿瘤诊断, 并在日前德国杜塞尔多夫国际医疗器械展览会上展出。
在手术前将特殊的荧光染色剂注入病人的血液中, 荧光分子会选择性地附着在恶性肿瘤组织上, 用特殊的光波照射相应区域, 荧光分子就会发光, 并可同步显示图像。多种荧光染色剂可使用, 不同的染色剂在不同组织中显示的颜色是不一样的, 恶性肿瘤组织会呈现绿色、蓝色、红色或其他颜色。染色的可视性在很大程度上依赖该系统的一组荧光滤镜, 即使在荧光亮度不高的条件下, 这组滤镜也能将肿瘤上的荧光与普通荧光光波区分开来, 从而区分癌变组织和周围的正常组织。荧光成像系统还可与其他染色剂结合使用。例如, 5-氨基酮戊酸就是一种能让神经胶质母细胞瘤 (一种脑肿瘤) “现形”的染色剂。5-氨基酮戊酸可将肿瘤染成红色, 荧光成像系统同样可以检测出这种染色效果。
手术过程中, 成像系统的软件可在几秒内分析和处理荧光形成的图像, 并将图像同步投射到监视器上。一些仅有几毫米大小、容易被医生肉眼忽视的肿瘤残余, 或癌细胞转移的踪迹都可以被显示出来。明年将对人体进行临床检测试验。
生物医学荧光成像系统的应用 篇3
1 荧光显微镜
荧光显微镜是生物医学研究的重要工具, 几乎所有的有机分子都能够直接或经适当的化学处理后发出荧光而被观测分析。荧光显微镜根据照明系统和载物台的相对位置, 可分为正置荧光显微镜和倒置荧光显微镜。倒置荧光显微镜应用于直接观察细胞转化效率。汞灯是荧光显微镜的核心照明部件, 同时也是主要耗材。正确使用显微镜, 对延长汞灯寿命, 节约仪器运行费用, 具有重要的作用。汞灯的寿命:每次连续使用2 h, 寿命200小时;使用1 h, 寿命167小时;使用30 min, 寿命125小时;使用1 min, 寿命8 h。因此打开汞灯电源后未使用15 min, 应在15 min后关闭电源;关电源后15 min, 才可重新开启。
2 激光共聚焦显微镜
激光共聚焦显微镜 (Confocal) 结合荧光探针技术, 已成为形态学、分子生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域强有力的研究工具。激光共聚焦显微镜利用扫描点与探测点共轭这一特性, 可有效抑制样品中非扫描点处的荧光对图像的贡献, 从而获得普通光镜无法达到的分辨率。通过微动步进马达控制显微镜载物台的升降, 可以逐层对样品进行扫描, 从而对活组织实施无损伤的系列“光学切片”。该类设备的维护需安装在防震台上, 保证电源电压稳定、室内光线暗淡;工作环境应保持清洁、干燥、远离辐射源。
3 荧光化学发光系统
荧光化学发光系统整体可实现荧光及快速和慢动力学化学发光反应的检测, 可应用于细胞内Ca2+检测、细胞毒性、多药物耐药性、报告基因分析、免疫分析、酶活性分析等领域。该类系统包括酶标仪、微孔板光度计、化学发光分析仪等。多功能激光扫描成像系统, 不仅可实现自动检测四色荧光信号和直接化学发光检测, 而且能进行无底片的放射自显影成像, 可有效地处理PCR产物、2-D蛋白质电泳凝胶、膜阵列、杂交、组织切片等各种样品。我所的FLA-5100型富士荧光/化学发光及同位素影像扫描分析系统 (图1) 尤其适用于大尺寸的二维蛋白质电泳凝胶分析;可在10 μm分辨率下进行同位素、荧光、化学发光的数字化成像。该仪器的维护主要是在使用磷屏时, 应带手套抓住磷屏的两个边角, 以防止磷屏受损;在IP (Image Plate) 磷屏实验时, 把样品用保险膜包住样品进行压片, 将压好的磷屏放入机内扫描;压片和机器应置于不同房间内, 以保证在一台仪器上同时进行同位素和化学发光检测, 而实验的环境不受同位素污染。
4 活体动物体内光学成像
活体动物体内光学成像 (Optical in vivo Imaging) 主要采用生物发光 (bioluminescence) 与荧光 (fluorescence) 两种技术。生物发光是用荧光素酶 (Luciferase) 基因标记细胞或DNA, 而荧光技术则采用荧光报告基团 (GFP、RFP, Cyt及dyes等) 进行标记。活体GFP荧光成像系统采用高灵敏度CCD成像, 通过长时间积分功能, 实现动物活体单个细胞内绿色荧光蛋白的实时观察与成像等一系列的荧光检测, 可应用于观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。
荧光分子成像技术概述及研究进展 篇4
1.1 分子影像学概念
分子影像学是近几年在已有的医学影像技术基础上发展起来的一门新学科,广义上是指在细胞和分子水平对生物体进行在体成像[1]。传统的医学影像技术是以生物体本身的物理特性或者生理特性作为成像源进行的诊断显像,这些物理量或者生理量对与疾病或生理功能相关的分子或细胞没有特异性;而分子影像技术则是以这些特定的分子或细胞作为成像源,对生物体内分子水平的变化进行在体成像,获得它们生物体内部实际的分布图像。因此,分子影像技术有助于早期的诊断疾病、促进药物研制和分析生命机理[2,3]。
根据成像的原理不同,可将分子影像学的成像技术分为核医学、光学和磁共振(MRI)等分子成像[4]技术。核医学分子成像主要包括PET和SPECT,它们对体内的放射性核素产生的γ射线进行成像,穿透度深,灵敏度高,但放射性源可引起电离辐射,长期对人体有害。在光学分子成像中,荧光分子成像利用了具有特异性的荧光分子探针标记特定分子或细胞,空间分辨率能达到mm级,其探针是生物学和医学研究中已大量使用的荧光标记物,为生命科学工作者所熟知,在体外成像中已大量应用,很受科学研究人员的欢迎,且具有灵敏度较高、时间分辨率高、快捷简便、费用低、相对高通量等诸多优点[5],因而近几年发展迅猛。荧光分子成像由于穿透距离短,目前主要用于小动物成像。
1.2 荧光产生机理
分子荧光的产生与某些具有特殊光学特性的荧光物质吸收和释放能量有关。当一个分子或者原子吸收了给予的能量后,从一种电子态向另一种能量较低的电子态弛豫引起发光,停止能量供给时发光亦瞬间停止(持续10-8s 10-7s),这样的发光叫做荧光[2]。具体而言,荧光的产生过程是指荧光分子或者原子吸收能量后跃迁到激发态,通过非辐射内转化等方式转移到激发态的最低能级,短暂停留后发出荧光并回到基态。
2 荧光分子探针
在荧光分子成像中,为了对感兴趣的生物分子过程进行辨别,需要借助于荧光分子探针进行观察和定量分析。荧光分子探针按照其成像过程的不同可以分为直接成像型荧光分子探针和间接成像型荧光分子探针[6]。直接成像型荧光分子探针分为活性分子探针和激活型分子探针,都是经过工程处理后可以直接作用于受体或某种特定的酶。其中活性分子探针在没到达靶向目标时也会发出荧光,在检测的过程中背景噪声比较大,扫描器很难将源示踪剂从边界及代谢示踪剂中区分出来,源示踪剂的消失也需要一段时间。为了克服这个缺点,一种被称之为“智能探针”的具有特异性分子成像的激活型分子探针应运而生,不仅可以用于光学成像设备,也可用于核磁共振成像设备中。此类探针只有在靶向目标时才“打开”,因而提高了信噪比。如近红外荧光探针,能被基质金属蛋白酶激活,荧光团在一定的条件下可从载体中释放出来并发出明亮的荧光[7]。间接成像型荧光分子探针是指在间接成像中某些转基因表达的荧光蛋白,它在阐明基因的表达和调控中发挥着很重要的作用。用光学成像法能检测到转基因转录后的产物荧光蛋白,通过对荧光蛋白的可视化和量化就间接地实现了对基因表达的成像[8]。
3 荧光分子成像系统
荧光分子成像系统按照成像方式分为平面成像和断层成像两种。
3.1 平面成像系统
平面成像为直接用照相机采集某一个投影方向的光信号[6],具有开发及操作简单、高通率等优点,因而获得了广泛的应用,在荧光分子成像领域中也取得了较多的进展[9,10,11,12,13,14]。然而由于其检测是来自多个深度的信号的叠加,因而造成图像模糊、分辨率低,只能应用于薄物体的成像。另外平面成像中得到的信号强度与深度及生物组织光学特性之间是非线性关系,定量化相对困难[15]。
3.2 断层成像系统
荧光断层成像系统则可以较好地解决平面成像存在的问题,如FMT(荧光分子断层成像,fluorescence molecular tomography)。FMT又称为诱发荧光断层成像,它采用特定波长的激发光激发荧光分子产生荧光,通过图像重建能够提供目标的深度信息和对目标物进行立体成像,克服了平面成像的局限性[16]。此外,FMT还具有使用低能量的激发光、染料稳定、成本低、无电离辐射、能进行长期定量监测等诸多优点,因而在近几年发展迅速。
2003年开发的平板成像系统,能达到亚毫米级的分辨率[17]。早期的FMT系统一般采用圆柱成像腔,实验时将动物泡在匹配液中,通过光纤接触成像腔导出边界光强分布[18,19]。采用圆柱成像腔的FMT系统的优点为实现简单,重建快速,缺点为采样数目有限,重建质量和分辨率都不高。为此,哈佛大学医学院Nikolaos Deliolanis等人最近建立了360°几何投影自由空间荧光分子断层成像系统[20]。将成像动物放在旋转台上,用一束激光在其横断面上进行扫描,在成像动物的正面放置CCD照相机。小动物旋转一周,可采集360°全视角的信号。清华大学医学院分子影像研究组在解决小动物三维轮廓获取、非接触式光传播模型等关键技术后建立了一种连续动态采集式的360°全景小动物诱发荧光分子成像方法及系统,与静态采集方法相比,避免了器官移位,节约了时间,提高了实验的便利性[21]。由于此系统没有使用匹配液和与组织接触的光纤,因而大大简化了实验装置,可以高质量地采集任何一个投影的数据并可充分利用散射荧光断层的计算方法。此系统还能与其他成像模式无缝融合,因而最有可能为FMT带来最佳的成像性能,并将成为下一代小动物的成像系统。
3.3 商业化成像设备
目前,这类商品化的成像系统层出不穷,如Xenogen公司的IVIS 2000成像系统。系统所使用的CCD具有很高的量子效率,光谱范围可以达到400至900nm(生物组织的光谱窗为600至950nm)。将摄像头冷却到零下90℃以下后暗电流可以减小到100(electron/s/cm2)以下而使相关噪声近于可忽略级别[22]。另外,Kodak公司生产的多模态成像设备具有较高的分辨率,GE Healthcare公司生产的成像设备能精确地恢复荧光浓度,可以进行荧光寿命成像[23]。
4 荧光分子成像中图像重建技术
4.1 基于有限元分析的重建技术
由于有限元分析对区域的形状具有较大的适应性并可以编制通用的计算机程序[24],近几年在荧光分子成像中有很多研究人员利用此方法进行图像的重建。如清华大学医学院分子影像研究组建立了几种基于有限元分析方法的荧光断层成像算法[25,26,27,28]。如在非均匀介质中同时重建组织吸收系数和荧光产额分布的方法[26],另外,将二阶预迭代的方法应用于荧光团浓度空间分布的重建中,则可提高了重建速度,适用于数据量较大的荧光成像[27]。同时提出了一种线性与非线性结合的共轭梯度法[29]。
在当前成像系统数据量不断增加的情况下,自适应有限元法和自适应网格技术可有效利用计算资源,它在目标物存在的位置生成细网格,而在其它地方生成粗网格,即降低了数据量,又能达到较高的分辨率。基于有限元方法,清华大学医学院分子影像研究组提出了一个共厄梯度法和landweber结合的自适应重建方法,并应用于考虑了组织非均匀特性的实际小鼠腹部模型[30]。利用在非接触式成像模式下产生的模拟数据,证明了所提算法的计算效率、抗噪性能和分辨率。部分重建结果见图1。在BLT(bioluminescence tomography)的重建中,中国科学院自动化研究所提出了多级自适应有限元算法[31],提高了图像重建的效率和鲁棒性。
为了对较大模型中小目标进行频域法成像(如乳腺癌检测中要求能对0.5cm大小的目标进行成像),Ranadhir Roy等人在正向问题中采用了有限元方法预测边界荧光数据来求解关于模型光学特性的散射方程,在反演问题上用PMBF(penalty-modified barrier function)和CONTN(constrained truncated Newton)方法来更新模型的光学参数值,以使边界测量值与正向计算得出的数据之间的误差最小化[32]。由于采用了Breitfeld和Shanno方法对拉格朗日乘子进行初始化因而不再需要先验信息,只要保证初始值处于上下边界之间,荧光吸收系数的初始猜测就不会对算法的性能产生影响。实验结果表明此算法对图像重建的效果较好,深度达到了2.8cm以上,最小体积单元为0.5cm3。
4.2 基于辐射传输方程的重建技术
在荧光分子成像中,典型的图像重建方法是基于辐射传输方程的重建技术,相关的研究开展较早,近期也有一些新的研究动态。如用于生物自发荧光三维重建的新技术DLIT(diffuse luminescence imaging tomography),它可以对复杂物体的内部光源分布进行三维成像[22]。光子传播模型的正演问题是建立在对均匀组织中散射逼近基础之上,对每个网格单元局部平面分别进行边界的逼近计算,并根据先验知识将组织的吸收和散射特性参数输入到算法中。实验证明此算法能够较好表征复杂物体的表面形状,且因为采用单视角图像进行重建,运算速度非常快,在3.4GHz的计算机上只需一分钟就可以完成800个数据的迭代运算。由于在媒质几何形体很小、吸收系数很大,以及光源与检测器对在分隔单元很小等情况下用漫射方程逼近的方法可能导致重建算法的失败,所以Alexander D.Klose等人直接采用基于辐射传输方程的算法进行图像重建,因而不依赖于漫射近似,可以得到更精确的解[33]。算法中用一个目标函数来描述组织表面实际测得的荧光光与理论预测数据的偏差,对目标函数进行优化迭代找出最小值,从而得出反演问题的解。在每一步迭代中,利用基于辐射传输的光线传播正演模型进行数据预测,算法很好地恢复了在高度散射的生物组织中荧光光源的空间分布。
4.3 其他重建技术
对于平板成像系统,清华大学医学院分子影像研究组首次结合了解析解和自适应网格技术,发展了新的FMT快速重建算法[27]。对于平板系统,解析法求解前向模型比有限元法更为快速准确。而在重建中,自适应网格技术能有效划分网格,二者的结合进一步提高重建的速度,改善重建图像的质量(图2)。
随着计算机计算速度的不断加快,Monte Carlo方法(亦称为随机模拟法)在求解数学、物理、工程技术等方面的问题中的应用越来越广泛。如Mathieu Allard等人利用Monte Carlo方法,根据活体测量中取得的一组光学特性数据来解决光子传播的正向问题[34]。在光学模拟过程中采用POLMC软件中标准Monte Carlo算法产生光子从光源处到老鼠皮肤层的传播路径。在每一次模拟中都产生107条路径,足以有效地消除了统计噪声。
5 应用前景与展望
如何在早期发现癌症和在分子水平对肿瘤进行观察是临床上长期困扰人们的难题。各种新近红外荧光染料和单色近红外激光器的研制及高灵敏度检测系统的发展,开创了人类对深层次组织进行非侵入式荧光定量和成像的新历史。荧光分子成像结合其他成像技术,如fp VCT(flat panel volumetric computed tomography),将使如何在分子和亚细胞层次上观察肿瘤体积的大小、生长情况等问题迎刃而解[35]。最近,全球关于此类问题的研究依然非常活跃,如Deane NG等人用一种叫NIR-con PK11195的能与PBR(peripheral benzodiazepine receptor)特异结合的荧光分子探针研究老鼠的结肠肿瘤,指出此法是观察结肠肿瘤和区分炎症和癌的有效手段[36]。另外,Hama Y等人用单克隆抗体与另一种叫neutravidin BODIPY-FL的荧光分子探针结合,对肿瘤进行研究,分两步靶向目标,从而产生原先荧光十倍大小的信号。
荧光分子成像技术在神经、心血管和外科疾病等研究领域也具有十分广阔的应用前景,最近也取得了不少的进展。阿尔茨海默病(AD,Alzheimer's disease)是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病,以前利用PET和SPECT对AD的研究较多,但是目前也成功地运用NIRF(近红外荧光分子成像)方法检测活体中的斑块[37]。再如在对AIA(急性抗原诱导关节炎,antigen-induced arthritis)的研究中发现了巨噬细胞将会在表面集中发炎部位表达出抗原F4/80。在静脉注射荧光染料(如Cy5.5)标记的单克隆抗体后,荧光分子探针即在老鼠的关节发炎部位不断聚集[38]。
荧光分子成像技术推动了药物的研究。借助荧光分子成像技术开发药物与传统的方法相比具有很多优势。首先,它省去了费时的解剖和组织分析过程,加速了药物的筛选进程;其次,它可以在同一只动物上进行重复实验,减少了实验动物数,也便于纵向研究,提高了统计相关性;最后,借助荧光分子成像技术开发药物可以在实验过程中提供重要的药物剂量及时间等信息。新荧光染料的研制和成像技术的改进将会对药学研究领域带来突破性进展[39]。
荧光分子成像与其他成像模式的融合是未来的一个发展趋势。各种不同的分子成像中没有“all-in-one”的成像模式,相互之间有一定的互补性。在这方面国内外已经开展了较多工作,如清华大学医学院分子影像研究组正建立一个光学CT双模态成像系统,提供解剖和分子影像两种信息,并利用CT提供先验知识,进一步提高成像性能,也更便于定位目标(如肿瘤等)。目前已完成了Micro CT分系统的搭建和初步的仿体、动物实验。荧光分子成像模式与MRI活体分子成像模式的信息融合,也能为荧光分子成像提供高空间分辨率的解剖学信息。在与核医学结合方面,Jorg Peter等人提出了在小动物中同时检测正电子和荧光分子探针的双模断层成像理念,他们在扫描探头小孔内放置一对大视场激发光源光学检测器进行同步成像研究,对双模PET-OT检测系统的断层成像原理进行Monte Carlo模拟。为了处理不断提高的生物医学信息的复杂性,多模态成像信息在将来有可能强制性地与其他包括无图像数据在内的生物信息平台进行整合。另外,未来几年内很多成像算法将很可能会得到进一步的改进,如成像算法的鲁棒性和效率的统一、提高计算速度、各种不同机制的成像方法(时域、频域和连续波)各自将会结合特定的物理化学方法提供新的计算方案等。
自体荧光成像 篇5
1 激光共聚焦显微镜
荧光显微镜[5]是荧光成像技术中最早的成像系统, 是观察细胞形态、结构和生命状态的重要工具。激光共聚焦显微镜[6,7]是在荧光显微镜的基础上组装激光扫描装置, 是当今世界上最先进的分子生物学分析仪器之一, 已成为研究形态学、药理学、分子生物学等学科的重要工具。
激光共聚焦显微镜在传统光学显微镜的基础上作了改进, 具有除目镜与物镜之外的图片放大功能, 可以随时采集和记录检测信号, 观察活细胞的结构及特定分子、离子的生物学变化。其选择单色性较好的激光作为光源, 从根本上消除了色差。物镜的焦平面上加了一个带孔挡板, 阻挡了焦平面外的杂散光, 进一步消除色差。样品被分解成二维或三维空间上的无数个点, 激光束逐个扫描成像, 进而组成整体的平面或立体图像, 计算机代替肉眼或照相机进行观察或摄像, 数字化的图像在电脑中进一步处理, 提高了图像的清晰度。该仪器还使用了光电倍增管, 将微弱的信号放大, 大大提高了灵敏度。由于以上优点, 激光共聚焦显微镜可以应用到几乎所有有关细胞研究的领域。如原位鉴定细胞或组织内的生物大分子, 观察细胞或亚细胞的形态结构;无损伤实时检测分析活细胞, 并研究其形态和功能;在一个样品上同时进行多重标记, 实时观察等。
2 荧光探针
荧光探针在荧光成像技术中占据举足轻重的地位[8]。一般荧光探针需具备优良的光物理性质, 以便于激发和检测, 且不与生物基质同时被激发, 还要有较高的荧光量子产率和摩尔消光系数。荧光探针的溶解度要大, 便于溶于缓冲液或细胞培养液中, 且热、光性质比较稳定, 有特异性标记位点。荧光探针需要具有良好的生物相容性[9], 易于进入细胞内。
荧光探针大致分为两类, 包括化学类和生物类。化学类包括有机染料[10,11]、纳米材料[12,13] (金纳米粒子、半导体量子点等) 及金属配合物等。生物类包括藻胆蛋白、分子灯标及基因编码荧光蛋白等。荧光探针在化学、光学、生物学等领域应用广泛, 但是, 目前仍缺少有效的分子探针识别疾病分子水平上的独特位点, 故从分子水平上进行病理研究比较困难。
3 荧光成像技术的应用
3.1 蛋白质、金属离子的检测
生物体的生理状态可以通过蛋白质表现出来, 生命活动离不开各种酶的作用, 而酶大多是由蛋白质构成的, 故研究蛋白质的结构和功能在认识生命活动过程中至关重要。刘亭延等[14]采用荧光成像技术构建了一种检测人血清蛋白质的新方法。该方法以碳量子点为标记染料, 以聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出人血清蛋白, 优化实验条件, 最终得到清晰的电泳图。段相国等[15]建立了一种HCV NS3/4A蛋白酶在小鼠体内瞬间表达的模型。金属离子在生物学中起重要作用, 金属离子与荧光探针结合, 在荧光显微镜下可观察细胞内金属离子的变化[16]。Michael等[17]选用Indo-1为模板, 合成了一系列检测Ca2+的荧光探针, 可用于确定活细胞中特定位置的Ca2+浓度。Sare等[18]合成了Zn2+的荧光探针, 并应用到细胞中Zn2+的检测识别中。人们还建立了Mg[19,20]、Cu[21,22]、Hg[23,24]、Cd[25,26]等离子的检测模型。荧光成像技术应用于蛋白质及细胞内金属离子检测还存在一些问题, 如有的荧光探针不能通过细胞膜、成像过程对细胞造成损害、检测方法不统一等, 因此, 建立统一、低损害的荧光成像检测技术仍是极具挑战性的研究课题。
3.2 肿瘤疾病的检测和诊断
目前, 肿瘤的临床诊断主要依赖于显微形态学观察, 从而在细胞层面上了解肿瘤细胞的类型与个体差异, 这就要求检测手段不断进步。荧光成像技术以其操作方便、标记靶点多、灵敏度高等优点, 广泛应用于肿瘤跟踪成像研究中, 具有广阔的临床应用价值。高苒等[27]建立了一种小鼠肿瘤模型, 利用荧光显微镜和活体荧光成像仪可直接从整体和细胞水平上观察肿瘤, 了解宿主与肿瘤间的作用。至今为止, 人们对此进行了深入的探讨和研究[28], 但该技术应用于体内时需要考虑复杂的体内环境, 动物组织会产生背景噪音, 影响该技术的发展应用。
3.3 药物新剂型研究
为了提高药物疗效, 降低毒副作用, 发展药物新剂型尤为重要。荧光探针的不断发展使荧光成像技术在这一领域的应用范围不断扩大, 可用于对药物运输过程、细胞屏障跨越方式、药物释放过程等的观测研究, 它的迅速发展也大大促进了药物新剂型研究的迅速发展。陈刚等[29]研究了荧光探针经内耳给药后的转运通路, 在荧光成像系统下追踪了整个运输过程。钟华等[30]构建了一种装载抗癌药物阿霉素的新型纳米胶囊, 采用激光共聚焦显微镜实时跟踪观察药物投递释放过程, 为新剂型的研究提供了理论平台。目前, 类似的研究虽然较多, 但仍处于理论研究阶段, 诸如荧光探针毒性、生物体内相容性等问题还没有解决, 没有合理的规范, 难以规模化生产。
4 结论与展望
荧光成像技术的迅速发展加深了人们在分子水平对生命科学的了解, 生命科学的研究也进一步推进了荧光成像技术的发展。激光共聚焦显微镜操作简单, 应用广泛, 荧光探针易于制备, 荧光信号强, 荧光成像技术可用于蛋白质、金属离子的检测, 在肿瘤等疾病的检测中也起着重要作用, 还可以实时跟踪检测给药过程, 为药物新剂型的研究提供新的平台。目前, 荧光成像技术仍存在许多不足, 主要为:细胞在可见光区有自发荧光, 掩盖了标记分子信号;难以实现对分子的长期标记检测。荧光成像技术是基础研究和实际应用间的重要纽带, 三者将相互促进, 不断进步。
摘要：近年来, 荧光成像技术发展迅速, 其成像系统通常为目前最先进的分析检测仪器之一的激光共聚焦显微镜, 荧光探针是荧光成像技术的核心之一。作为新兴光学成像技术, 荧光成像技术在生命科学领域中应用广泛, 可用于蛋白质及金属离子检测, 肿瘤疾病的诊断, 并为药物新剂型的研究提供了新思路。