免疫荧光检测

免疫荧光检测（共7篇）

免疫荧光检测 篇1

猪瘟(classical swine fever,CSF)是给养猪业造成巨大经济损失的病毒传染性疫病。1984年,猪瘟被国际动物卫生组织(OIE)列为A类动物传染病,即为必须上报OIE的传染病之一[1]。通过严格的防控措施,美国、加拿大等部分国家宣布成功地消灭了猪瘟,但世界范围内仍有猪瘟爆发流行的报道。养猪在我国是畜牧业传统支柱产业,猪瘟的危害仍旧十分严重。建立有效的检测猪瘟病毒(CSFV)的方法对于该病的防制和科学研究具有重要的意义。目前,全球性公认的猪瘟的诊断方法是从可疑的病料提取病原体——CSFV,然后在易感的猪源细胞上进行培养分离。随着分子生物学技术的迅速发展和人们对CSFV研究的深入,Real-time PCR、ELISA技术等新的诊断方法不断涌现[2,3],并已应用于CSFV的抗原检测和病原特性研究,但这些方法却不能用于CSFV感染组织器官和细胞的抗原定位与直观判断。为更好地探讨CSF的发生、发展规律及致病机理,研究以猪瘟阳性血清为一抗、荧光素FITC标记的羊抗猪IgG为二抗,建立了检测CSFV的间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)法,以期为研究CSFV在感染细胞中的抗原定位和动态分布提供有效的检测手段。

1 材料与方法

1.1 病毒和细胞

猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒(PCV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),均由西北农林科技大学动物医学院预防兽医学平台鉴定、保存;猪血管内皮细胞(EC),由西北农林科技大学动物医学院预防兽医学平台传代、保存。

1.2 主要试剂和仪器

猪瘟阳性血清和猪瘟阴性血清,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所唐青海副研究员馈赠;荧光素(FITC)标记的羊抗猪IgG,由Southern Biotech公司产品;高糖DMEM干粉, Gibco 公司产品;胎牛血清(FBS),购自杭州四季青公司;荧光倒置显微镜,日本Nikon公司产品。

1.3 细胞及病毒的培养

从液氮中取出冻存的EC管迅速放入37 ℃水浴中快速融化;将冻存管中的细胞液迅速倒入新的培养皿或培养瓶中,加入适量含有10% FBS的DMEM培养基,混合均匀,放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养;18～24 h后常规换液1次,减少DMSO对细胞的伤害,以后按生长状态和密度适时传代或换液;将病毒液经过适当稀释,加入到培养板的相应孔中,100 μL/孔,37 ℃吸附1 h;补加维持液,在37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养。

1.4 IFA试验的建立

1.4.1 抗CSFV抗体最适工作浓度的确定

用十字交叉法,选择荧光清晰、明亮且稀释度最大的抗体稀释度,即为抗CSFV的阳性血清(一抗)及FITC标记的羊抗猪IgG(二抗)的最适工作浓度。同时设阴性对照、空白对照及样本自发荧光对照。一抗设立的稀释梯度为1∶50,1∶100,1∶200,1∶500;二抗设立的稀释梯度为1∶20,1∶50,1∶100,1∶500。

1.4.2 特异性试验

制备长成单层的EC培养板,分别接种CSFV、PCV、TGEV,37 ℃ 吸附1 h;补加细胞维持液至100 μL/孔,继续在37 ℃、5%CO2 恒温箱中培养24～72 h;并设正常细胞对照,然后进行间接免疫荧光试验。一抗和FITC标记的羊抗猪IgG 均按照最适工作浓度稀释,检测是否有交叉反应发生,以确定本方法的特异性。

1.4.3 空白对照试验

以PBS 代替一抗,进行间接免疫荧光试验,观察二抗本身有无非特异性反应。同时设阳性对照。

1.4.4 样本自发荧光对照试验

向新的96孔板和接毒的96孔板分别滴加100 μL PBS后直接置于荧光显微镜下,观察是否存在自发荧光。同时设阳性对照。

1.4.5 抑制试验

在固定其他条件的基础上,先将FITC标记的羊抗猪IgG 荧光抗体与过量的CSFV 一抗作等量混合,37 ℃避光作用1 h;再加在样本上进行荧光抗体染色,然后置于荧光显微镜检查样本是否有荧光出现。同时设阴、 阳性对照及空白对照。

1.4.6 敏感性试验

用PBS将猪瘟阳性血清按1∶50,1∶100,1∶200,1∶500,1∶1 000,1∶2 000进行稀释,滴加到细胞培养板孔中进行间接免疫荧光试验,以出现明显荧光的最大抗体稀释度为其检测的灵敏度。

1.4.7 重复性试验

取相同批次的细胞培养板,相同批次的CSFV阳性血清及荧光二抗,在相同条件下,不同时间进行IFA试验,观察荧光强弱是否改变,检测本方法是否具有良好的重复性。

2 结果

2.1 抗CSFV抗体最适工作浓度

通过荧光显微镜观察,当二抗稀释度为1∶500时,无论一抗稀释度多大,均无荧光或为很弱的荧光;二抗在其他3个稀释度下,一抗稀释度为1∶50和1∶500时,荧光较一抗稀释度为1∶100和1∶200弱,而在一抗稀释度为1∶200、二抗稀释度为1∶50时,荧光最强(见193页彩图1);因此,可以确定一抗稀释度为1∶200、二抗稀释度1∶50为最适工作浓度。

2.2 特异性试验结果

2.2.1 交叉试验结果

接种PCV、TGEV的细胞无特异性荧光,正常不接毒的细胞也无特异性荧光,而接种CSFV的细胞有明显特异性荧光。说明建立的IFA法与其他病毒感染无交叉反应,具有特异性。

2.2.2 空白对照试验结果

用PBS代替一抗,进行IFA,结果没有发现特异性荧光或为弱荧光,而阳性对照有明显特异性荧光,说明抗原与二抗之间无非特异性反应。

2.2.3 样本自发荧光对照试验结果

将所做的样本自发荧光对照试验置于荧光显微镜下观察,均无特异性荧光,而阳性对照试验有明显特异性荧光,说明样本本身并不发荧光。

2.2.4 抑制试验结果

抑制试验组、阴性对照组、空白对照组均无荧光,而阳性对照有特异性荧光。

2.3 敏感性试验结果

结果表明,在抗体稀释度为1∶1 000时有清晰可见的荧光,而在1∶2 000时有很微弱的荧光。

2.4 重复性试验结果

对相同批次、相同方案、相同条件、不同时间、相同判定结果进行的IFA检测,结果基本一致或只有微小变化。

3 讨论

3.1 IFA法的优越性

与检测CSFV的其他常规方法相比,IFA法不仅可以特异、直观地检测抗原,而且可以用已知抗原检测抗体,具有简单、快速、特异、直观、经济等优点,因而得到了广泛的应用[4]。采用试验建立的IFA法对CSFV进行检测,结果表明,CSFV感染EC细胞后,病毒主要分布于细胞质中,这和许保疆等[5]于2010年用建立的单克隆抗体IFA法检测CSFV的结果是一致的。本试验建立的方法以猪瘟阳性血清作为一抗,试验材料来源更方便,而且成本低、易得到,因此作为一种实验室检测方法更具有实用性,为CSFV感染的实验室诊断及CSFV在感染细胞中的定位和动态分布提供了有效的试验检测手段。

3.2 IFA法的最优条件建立

研究应用抗CSFV的阳性血清为一抗,FITC标记羊抗猪IgG为二抗,通过优化最佳工作条件,建立了一种检测细胞中CSFV的IFA法, 得出了IFA法最佳工作条件:接种病毒后细胞的培养时间为72 h,一抗稀释度为1∶200、二抗稀释度为1∶50。特异性试验结果表明,所建立的方法特异性良好。通过敏感性试验测定了IFA法中抗体稀释度在1∶1 000时具有明显荧光,而在1∶2 000时荧光很弱。在此方法初步建立的基础上,在不同时间段进行了多次试验,结果表明,本方法具有很好的重复性。用本方法检测CSFV具有敏感、特异、简便、快速、经济等优点,可用于CSFV在EC上的感染和定位研究。

4 问题与展望

试验结果表明,所建立的IFA法可以直观、方便、经济、特异地检测出CSFV,并具有良好的特异性和重复性。该方法的建立也为其他不致细胞病变病毒的研究提供了很好的借鉴。但是依然存在一些不足,如对于不同来源、不同批次的猪瘟阳性血清,即一抗,可能会得出不同的结论,因此在应用不同批次的猪瘟阳性血清进行IFA检测之前应进行预试验。

参考文献

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[4]SARDY M,KOSTAKI D,VARGA R,et al.A comparative study ofdirect and indirect immunofluorescence and enzyme-liked immu-nosorbent assays in the diagnosis of bullous pemphigoid[J].J In-vest Dermatol,2012,132(2):18.

[5]许保疆,游一,郭成留,等.单克隆抗体间接免疫荧光检测猪瘟病毒方法的建立[J].中国兽医学报,2010,30(12):1566-1570.

免疫荧光检测 篇2

1 抗核抗体简介

从传统定义上看, ANA是一组专门针对细胞核内脱氧核糖核酸 (DNA) 、核糖核酸 (RNA) 、蛋白质、脂类、酶类及这些物质分子复合物的抗体, 其无器官特异性和种属特异性, 大多数属于Ig G类抗体。随着分子生物学、细胞生物学和免疫学等学科的不断发展及免疫荧光技术的日益改进, 目前对ANA的研究已不再仅仅局限于细胞核成分, 其靶抗原的分布已由传统的细胞核拓展到整个细胞, 除细胞核外, 还包括细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期蛋白等。

随着对ANA研究的不断深入, 目前已发现具有明确不同临床意义的ANA 20余种, 形成了初具体系的抗核抗体谱 (antinuclear antibodies, ANAs) , 这些抗体对风湿免疫性疾病如系统性红斑狼疮 (SLE) 、类风湿性关节炎 (RA) 、强直性脊柱炎、多发性硬化症 (MS) 、干燥综合征 (SS) 、皮肌炎及混合性结缔组织病 (MCTD) 等的诊断、鉴别诊断及衡量疗效, 判断预后都具有重要的临床价值[3,4,5]。值得注意的是, 某些非结缔组织病如慢性活动性肝炎、重症肌无力和慢性淋巴性甲状腺炎等也可见ANA阳性, 正常老年人也可出现低滴度的ANA。

2 间接免疫荧光法

IIF是公认进行ANA筛查的首选方法, 多以Hep-2细胞和灵长类动物肝脏如猴肝冰冻切片为抗原底物片。Hep-2细胞即人喉癌上皮细胞, 其核抗原丰富、特异性强、含量高, 核大、细胞结构清晰, 易于判读荧光染色核型结果, 该基质片较鼠肝 (肾) 冰冻切片检测ANA, 阳性率可提高10%~20%[6]。

2.1 荧光染色模型IIF检测ANA, 主要有以下6种常见荧光染色模型 (以Hep-2细胞为基质) :

(1) 核均质型 (homegeneous pattern, H) , 间期细胞核呈均匀的荧光, 分裂期细胞浓缩染色体亦呈均匀的荧光, 荧光更强, 该型的靶抗原主要有ds DNA、ss DNA、核小体和组蛋白。 (2) 核颗粒型 (spekled pattern, S) , 又称核斑点型或核斑块型, 间期细胞核呈颗粒样荧光, 分裂期细胞浓缩染色体阴性, 染色体周围区域为颗粒样荧光, 可细分为核粗颗粒型和核细颗粒型, 其靶抗原主要有n RNP、Sm、SS-A和SS-B。 (3) 核仁型 (nucleolar pattern, N) , 间期细胞核仁阳性, 分裂期细胞染色体阴性, 主要包括抗PM-Scl抗体、抗RNA多聚酶Ⅰ抗体、抗原纤维蛋白抗体和抗Scl-70抗体。 (4) 核膜型 (membranous pattern, M) , 间期细胞核呈均匀的荧光, 核周增强, 此型与抗板层素 (Lamins) 抗体相关。 (5) 着丝点型 (centromere pattern) , 间期细胞大小、数目 (40~60个) 相同的点状荧光均匀的分布于整个细胞核中, 分裂中期细胞的中间位置出现带状的浓缩点状荧光, 此模型对局限型进行性系统性硬化症具有很高的特异性和敏感性。 (6) 胞浆型 (cytoplasmic pattern, C) , 即细胞浆荧光染色阳性, 主要包括抗线粒体抗体 (胞浆粗颗粒型) 、抗核糖体P蛋白抗体 (胞浆细颗粒型, 有时可见核仁阳性) 、抗Jo-1抗体、抗高尔基抗体、抗溶酶体抗体、抗肌动蛋白抗体和抗波形蛋白抗体等。实际工作中, 同一份标本同时检出2种或2种以上荧光染色模型的混合型也比较常见, 此外, 还有一些较少见的荧光染色模型, 如中心粒型、中间体型和纺锤体型等。

2.2 抗体滴度。

应用IIF检测结果应报告抗体滴度, 以便于临床对病情程度进行判断, 其对观察疗效、判断预后也具有重要作用。有时一份血清内含有多种自身抗体, 高滴度的核均质型ANA往往会掩盖其他核型, 此时需用不同稀释度的血清进行检测, 有助于区分所含有的各种荧光染色模型。

3 报告模式

一个合乎规范、能体现所有检测信息的报告单至少应该包括以下要素:检测项目、检测结果 (包括滴度) 、参考范围和检测方法等。笔者推荐的报告模式见表1。

此外, 应用IIF检测ANA, 由于不同的抗体可能会出现相同的荧光染色模型, 也就是说抗体和荧光染色模型并不是一对一的关系, 因此仅根据荧光染色模型特点来推断抗体的特异性往往是比较片面的 (抗着丝点抗体、抗高尔基体抗体及抗中心体抗体等特殊荧光染色模型除外) , 而免疫印迹法则可以准确地鉴定部分靶抗原。因此在ANA的检测中, 强烈建议IIF和IBT联合应用, 以相互补充, 相互佐证, 避免误诊漏诊[7]。

参考文献

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免疫荧光检测 篇3

1资料与方法

1.1一般资料:选择2014年1~12月在本院的同时申请检测ANA和ANAs的门诊和住院患者6121例。其中男1020例,年龄18~75岁,女5101例,年龄14~86岁。

1.2 IIF检测ANA:采用德国欧蒙公司提供的ANA(马赛克)IIF试剂盒,商品号:FA1510-1005-1,每个反应区含2种抗原复合基质:HEP-2细胞和猴肝组织。以抗体滴度≥1∶100为阳性。

1.3 LIA检测ANAs:ANAs检测采用LIA法,检测试剂盒由深圳市亚辉龙生物科技有限公司提供,其试剂条含有17个测定项目:抗ds DNA、抗核小体抗体、抗组蛋白抗体(抗histones)、抗Sm D1、抗增殖性细胞核抗原抗体(抗PCNA)、抗核糖体P蛋白抗体(抗P0)、抗SSA/Ro52kd、抗SSA/Ro60kd、抗SSB/La、抗着丝点蛋白B抗体(Cenp B)、抗硬皮病70抗体(抗Scl-70)、抗U1-sn RNP、抗线粒体M2型抗体(抗AMA-M2)、抗J0-1、抗多发性肌炎/硬皮病抗体(抗PM-Sc1)、抗Mi-2、抗Ku。将血清1∶100稀释,严格按试剂说明书操作,肉眼判断反应结果。

1.4统计学分析:统计学分析采用SPSS19.0统计软件,率的比较采用χ2检验,以P<0.05为差别有统计学意义。

2结果

2.1对2014年6121例标本同时用IIF检测ANA和LIA检测17种自身抗体,发现有IIF检测ANA阳性1200例,占19.6%,阴性4921例,占80.4%,LIA检测ANAs阳性1659例,占21.1%,阴性4462例,占70.9%。其中IIF-ANA-/LIA-ANAs+的有1107例,不一致率为22.5%。IIF-ANA+/LIA-ANAs-的有124例,不一致率为10.3%。见表1。

2.2在1107份IIF-ANA-/LIA-ANAs+标本中,中阳性率最高的前五种自身抗体是SSA/Ro60kd、SSA/Ro52kd、抗Sm D1、抗SSB抗体、抗histones,阳性率为分别为29.62%、18.32%、10.20%、9.58%、8.61%,总占76.33%,其余的占23.67%。见表2。

3讨论

抗核抗体是以细胞成分为靶抗原的器官非特异性自身抗体的总称,以Hep-2细胞为抗原基质的间接免疫荧光法(IIF)被认为是ANA检测的“金标准”[2]。而随着靶抗原的纯化技术不断提高,不断涌现自动化程度较高、易于标准化的检测方法,其中LIA是近年来研究较多的一种检测方法。但在实际检测过程中,我们会发现IIF检测ANA与LIA检测ANAs的结果不一致,笔者通过对二者不同结果进行分析,试图阐述该类标本检测自身特异性抗体的临床意义。

在对2014年6121例标本同时用IIF检测ANA和LIA检测17种自身抗体中发现,IF-ANA-/LIA-ANAs+的有1107例,不一致率为22.5%。其中阳性率最高的前五种自身抗体是SSA/Ro60kd、SSA/Ro52kd、抗Sm D1、抗SSB抗体、抗histones,阳性率为分别为29.62%、18.32%、10.20%、9.58%、8.61%,总占76.33%,其余的占23.67%,结果与周仁芳等人的报道的以SSA为主要抗体一致[3]。分析原因可能是HEP-2细胞SSA的表达丰度低以及固定过程中抗核抗原出现弥散丢失。有文献报道,如选择转染Ro60c DNA的HEp-2000细胞基质可提高检测的灵敏度[4],另外其他抗体也有不同程度的漏检,笔者认为可能是:(1)IIF中HEp-2细胞为人源的细胞,部分表达的靶抗原含量低,且不均一,不同固定方法对特定抗原可能会丢失,故容易漏检,而LIA所包被的是来源于牛的胸腺和脾脏纯化抗原,含量高且固定,当标本抗体浓度低时,也可被检测(灵敏度高)。(2)方法学上IIF一般手工操作,且操作繁琐,滴度判断需系列稀释,荧光染色不稳定,荧光类型需肉眼判断,少见的特殊类型还需经验丰富专业技术人员鉴定等;而IIF可自动化,判读方便,重复性较好。

而IIF-ANA+/LIA-ANAs-的有124例,不一致率只为10.3%,表明以Hep-2细胞作为抗原基质的IIF法能检测出绝大多数自身抗体,是目前筛选ANA的理想实验。

综上所述,IIF-ANA与LIA-ANAs的检测有其互补性,二者不相互替代。IIF-ANA具有覆盖ANA抗体面广,同时即是筛查试验又是ANA检测金标准的特点,而LIA-ANAs有较高的检测敏感性和疾病特异性,故两种方法学间存在检测敏感性和特异性的差异。如果单用任何一种方法检测都有可能造成ANA阳性结果的漏检、漏报或AID的漏诊。因此,临床应用时,尤其对AID的早期诊断、鉴别和治疗,需联合进行IIF-ANA筛查和LIA-ANAs检测,减少漏诊或误诊。

参考文献

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免疫荧光检测 篇4

关键词：直接免疫荧光法,呼吸道病毒,快速检测

呼吸道感染为常见疾病, 主要病原体为病毒。呼吸道病毒可以侵犯呼吸道导致呼吸道局部发生病变或者通过呼吸道入侵导致呼吸道的组织器官发生病变[1]。目前呼吸道病毒感染不断上升, 而传统病毒分离及鉴定的操作比较复杂, 无法满足临床对其进行快速检测的需要。而直接免疫荧光法可为诊断和治疗提供及时的临床依据, 逐渐应用到临床中[2]。为研究分析直接免疫荧光法用于多种呼吸道病毒抗原的快速检测, 该研究对该院2013年1—5月间共接诊呼吸道感染患者230例的多种呼吸道病毒采取直接免疫荧光法进行快速检测, 报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取该院共接诊呼吸道感染230例患者, 由患者的病史、X线以及辅助检查等结果以及《中华人民共和国传染病防治法》中规定的呼吸道感染诊断标准得到确诊。年龄0～55岁, 平均 (31±2.8) 岁。将其按照年龄分为成人组和儿童组, 成人组105例, 男67例、女38例, 年龄23～55岁, 平均 (41±2.8) 岁;儿童组125例, 男80例、女45例, 年龄0～12岁, 平均 (4.2±0.8) 岁。

1.2 方法

样本的采集及处理:由专业的临床医生或者护士采取鼻咽拭子从患者的鼻咽部取的鼻咽分泌物, 或者选取鼻腔的灌洗液, 将样本置于无菌收集管中 (含有缓冲液) 以便送检。将样本置于离心管中, 震荡均匀, 在400～600 r/min转速下离心5～10 min后弃上清, 在沉淀中加入1～2 mL的1∶20PBS缓冲液, 再次震荡均匀离心, 除去上清液及粘液层, 直到粘液层被全部除去。在沉淀中加入0.5 mL左右的1∶20PBS缓冲液, 用移液器反复吹吸来重悬细胞沉淀, 形成一个略混浊的悬液。

直接样本制备及测试:在8孔板上的每个孔内滴加25μL的细胞悬液, 风干, 室温下用预冷的丙酮固定10 mL。然后将细胞涂片和病原体的对照玻片通过直接免疫荧光进行检测。

1.3 统计方法

采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析, 计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 呼吸道病毒检出情况

230例呼吸道感染的病毒检出呈阳性85例, 检出率为37.0%, 其中最高为呼吸道合胞病毒50例 (21.7%) , 其次为流感病毒A (16例, 6.9%) 、流感病毒B (14例、6.0%) , 见表1。

2.2 不同年龄呼吸道病毒检出情况

呼吸道病毒的阳性检出率随着年龄增长而下降, 其中儿童组检出阳性55例, 阳性率为44.0%, 明显高于成人组 (30例, 28.6%) , 差异有统计学意义 (P<0.05) , 且两者的最高检出率均为合胞病毒, 分别为27.2%和15.2%, 见表2。

3 讨论

研究表明大约80%呼吸道感染由病毒感染引发, 并且可通过空气进行传播, 传染较快并且传染性极强, 很容易导致局部流行或者大流行[3]。研究显示导致病毒性呼吸道感染病原, 比较常见的包括流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒等[4]。尤其是儿童, 为呼吸道病毒感染高发人群, 再加上儿童的抵抗力低于成人, 病毒感染对其身体健康及生活质量造成严重的伤害, 因此早期的诊断和治疗是最有效的控制方法[5]。目前对病毒诊断的方法主要包括病毒分离培养检测、组织培养法、分子生物学检测、免疫法等[6]。其中病毒分离检测是传统方法, 主要是采用电镜对病毒颗粒进行直接检测, 但是该法的检出率较低, 而且比较难以普及应用。随着分子生物学的发展, 分子检测逐步取代了10年前病毒检测的“金标准”—组织培养法, 其灵敏度和特异性较高, 但在对病毒种群遗传学及抗原性变化等方面, 组织培养法仍具有重要的作用[7]。目前免疫技术得到快速的发展, 尤其免疫标记技术得到了广泛的应用, 如直接免疫荧光技术、间接免疫荧光技术等, 特别是直接免疫荧光法已成为一种检测病毒抗原的稳定、敏感及高特异性的方法。而标本是否合格关系到阳性符合率, 因此应尽量采取鼻咽部较深处的分泌物, 在制备标本时一定要将黏液去除干净, 否则会造成非特异荧光从而影响实验结果[8]。

该研究显示, 230例呼吸道感染患者通过直接免疫荧光法进行病毒抗原检测, 呈阳性85例, 检出率为37.0%, 其中最高为呼吸道合胞病毒50例 (21.7%) , 其次为流感病毒A (16例, 6.9%) 、流感病毒B (14例, 6.0%) 。并且呼吸道病毒的感染阳性率随着年龄增长而下降, 儿童组阳性检出率明显高于成人组差异有统计学意义 (P<0.05) , 由此说明呼吸道感染与流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒、腺病毒等7种病毒密切相关, 直接免疫荧光法可对其进行快速检测, 并且灵敏度及特异性均较高, 易于标准化, 能满足实验室对病毒检测要求, 应在临床中推广应用。

参考文献

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免疫荧光检测 篇5

1 大肠杆菌

大肠杆菌0157:H7的暴发常常与肉制品、乳制品、新鲜蔬菜和发酵香肠、酸奶、蛋黄酱和果汁等有关。传统检测方法根据是否产酸产气, 通过乳糖发酵来进行鉴别, 这个方法涉及两个问题:一是通过增温 (44℃~45.5℃) 检测大肠杆菌, 这种方法费力费时, 全部诊断时间需4~6d;二是不适合受损菌体 (如冷冻食物) , 这些菌体对高温培养和选择培养基很敏感。而采用葡萄糖苷酶荧光法可以在24h内检测大肠杆菌。

在肠杆菌科中, 除少数志贺氏菌、沙门氏菌等细菌外, 94%~97%大肠杆菌产生β-D-葡萄糖苷酸酶 (β-D-glu-curonidase, 简称GUD) 。据此, 以荧光物MUG (4-甲基伞形基-β-D葡萄苷酸) 作为酶底物检测GUD活性从而检测大肠杆菌就具有高度的特异性。潘新南[7]采用了在乳糖胆盐发酵管中加入MUG, 36℃培养24h。在366nm长波紫外灯下观察, 产生淡蓝色荧光为GUD阳性反应, 表明该试验管可能含有大肠杆菌。再将GUD阳性管培养物进行细菌分离培养, 并进行生化试验, 可判定是否符合大肠杆菌生化特征。

总大肠菌群产生的酶能分解4-甲基伞形基, β-D吡喃半乳糖苷酸 (MUGal) 的物质 (366nm长波紫外灯下发荧光的化合物) , 而大肠杆菌 (E.coli) 的β-谷氨酸脱羧酶能分解吲哚β-D葡萄苷酸 (IBDG) 产生蓝色色素。根据这一原理在滤网培养琼脂中同时加入MUGal和IBDG能同步检测样品中的大肠菌群和大肠杆菌。顾鸣等[8]根据此原理应用纸片荧光法可快速、易检测冷冻食品中大肠菌群、大肠杆菌, 不仅缩短了检测时间, 而且不需要经过论证步骤, 只需24 h即可获检测结果。

2 沙门氏菌

反应及血清学试验, 费时较长, 操作复杂。Ollson (1991) 首先报告了检查沙门氏菌的辛酸酯酶法。原理是沙门氏菌属能产生特异性较强的辛酸酯酶, 应用生物荧光法即可快速检测。测定时加入荧光素如4-甲基伞形酮 (4-MU) 与样品一起反应, 若样品含病原菌, 则病原菌具有的酶活性可催化伞形化合物生成伞形酮, 在365nm紫外灯下可观察到强蓝色荧光, 从而判定沙门氏菌的存在, 在国内已有应用[5]。该方法测定沙门氏菌只需6~8 h。

生物发光法具有简便、快速、灵敏、重复性好等优点, 但应用4-MU-辛酸酯为底物需避免其它荧光物的干扰, 并需在暗室中用紫外灯观察。洪伟等[6]采用β-萘酚辛酯酶为底物, 经沙门菌酶解, 释出的β-萘酚与固蓝作用呈现紫褐色。反应在纸片上进行, 只需5 min即可完成鉴定。该法优点是不受荧光物干扰, 不需紫外光, 反应迅速。缺点是沙门氏菌以外的少数菌株可能会由于其产生的色素而导致假阳性。

3 金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌易在肉类、鱼类、乳类和罐头等食品中生长繁殖产生肠毒素。我国传统的检测金黄色葡萄球菌的方法获得最终结果需5d左右, 造成的经济损失较大。很多食品微生物实验室多年来都在探索和寻找一些准确性高、快速的检测方法, 并已取得一定进展。

吴仲梁等人[12]采用了一种快速检测致病性金黄色葡萄球菌的培养基Petrifilm RSA.Count Plate, 是一种薄膜型快速检测金黄色葡萄球菌的计数平板, 由二部分组成。第一部分是由黄金色葡萄球菌培养基片。第二部分是一种耐热核酸酶 (TNase) 反应片, 含有DNA及甲苯胺兰 (Toluidine Blue-O) 及四哩指示剂 (Tetraeolium) 。此指示剂有助于菌落的计数及确定葡萄球菌耐热核酸酶的存在。耐热去氧核糖核酸酶 (deoxyribonulcas Dnase) 为产毒金黄色葡萄球菌之典型特征。此酶非常耐热, 在100℃加热30min, 不易失活, 是一种鉴定金黄色葡萄球菌的方法。在Petrifilm.RSA检测片上, 耐热DNA酶反应呈粉红色环带包围着一个红色或蓝色的菌落。此方法和目前常规检测方法相比, 可缩短一半时间, 并可以节省大量人力。

斯国静等[13]采用小型VIDAS全自动荧光酶标免疫测试系统测定金黄色葡萄球菌肠毒素的有无及强弱程度。检测原理是应用ELFA技术 (酶联荧光免疫分析) , 抗原 (细菌、蛋白) 的检测是应用夹心技术、包被针上有抗体包被, 测得荧光与标本抗原的含量成正比。底物与荧光物质结合可产生蓝色荧光物4-甲基-7羟刀豆素, 荧光强弱与标本中被测物浓度相关。操作时以标本作对照, 系统可自动消除由标本产生的非特异荧光。此方法检测可解决日常工作中检测金黄色葡萄球菌肠毒素提取肠毒素难、试剂来源难、保存时间短、操作繁锁等问题, 并可减少用金黄色葡萄球菌计数来确定是否为此菌引起食物中毒过程中由于标本量太少及一些特殊性状标本而无法进行计数的缺陷。但目前所用的小型VIDAS检测金黄色葡萄球菌肠毒素尚不能分型。

4 李斯特氏菌

消毒牛奶、苔菜、海洋贝壳类和肉食品以及干酪、馅饼、剩饭、即食食品是产生李斯特氏杆菌的危险食品。传统的分离培养和鉴定技术检测李斯特氏菌, 需要数周时间, 且人力物力花费很大, 不能满足现实需要。为了有效控制该病, 国内外均开展了对本菌检验方法的研究。Mclanchin等于1989年将与异硫氰酸荧光素 (FITC) 结合的2株单克隆抗体应用到直接免疫荧光试验, 2 h即可检出软干酪食品中的李斯特氏菌。国内于90年代开始了相关研究工作, 焦新安等[9]于1994年在首次报道研制出3株针对本菌属特异表位的单克隆抗体, 分别命名为C11、B18、B5, 以此单克隆抗体为检测试剂, 用异硫氰酸荧光素进行标记, 建立了快速检测李斯特氏菌的间接免疫荧光方法。结果显示单抗C11、B18、B5能与所试全部李斯特氏菌反应, 呈现分布于菌体表面黄绿色的特异荧光。但由于荧光抗体技术应用较多的是多克隆血清, 因与其他细菌也可出现类似的交叉反应, 所以应用时须慎重。

实时荧光PCR是近几年广泛采用的分子生物学检测技术, 在传统意义上的PCR反应体系中加入了一条与扩增模板能特异性结合的、标记了2个荧光基团的探针, 并在传统的PCR仪上增加了荧光信号检测系统[10]。金大智等[11]采用实时荧光PCR技术对单核细胞增生李斯特氏菌进行了快速检测。采用Taq Man探针法, 其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性, 切断探针, 产生荧光信号。2个荧光基团的探针为:5′端标记报告基团 (Reporter, R) 为6-Carboxyfluorescein (FAM) , 3′端标记荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 为Tetra methycarboxyrhodamine (TAMRA) 。结果显示, 对单增李氏菌株各种血清型均能检测出, 灵敏性较高;而对非单增李氏菌株无论近源株还是远源株都不能检出。因此, 实时荧光PCR法检验具有周期短、灵敏度高, 同时通过光学系统检测荧光信号而省去了凝胶电泳的繁琐操作, 避免了实验过程中EB等致癌物质的污染, 既减少了假阳性的发生率和对人、环境的潜在危害, 又缩短了检测时间。对污染较重的样品, 从样品准备到检出只需约4~5 h。但此检测法只能对总病原菌进行检测却无法鉴别污染食品中死活菌体, 给食品病原菌定量检验带来一定的困难。

5 禽流感病毒

高致病力禽流感病毒主要是H5和H7亚型。1997年香港禽流感是由H5N1病毒引起, 而2004年的亚洲禽流感则主要由H7N1亚型造成。传统的禽流感病毒的检测主要靠病毒细胞培养和血清法进行, 通常需要1~2周才能确诊。荧光RT-PCR (逆转录多聚酶链式反应) 是20世纪90年代末才发展起来的新技术, 将荧光素标记的探针与引物一起, 在荧光PCR仪中反应, 电脑对整个反应进行实时监测[14]。该法检验周期短、灵敏度高, 从经典培养法鉴定需要5~15 d减少至4~5 h, 大大提高了检验检疫机构的检测能力, 也适应了口岸检验检疫把关工作需要。

张鹤晓等[15]根据A型禽流感病毒的共有NP基因序列设计引物、探针, 建立的通用型荧光RT-PCR (逆转录多聚酶链式反应) 检测方法不仅能够用来检测禽流感病毒H 5、H 7、H 9亚型, 而且对其他禽流感病毒亚型也能检出。因为荧光RT-PCR检测AIV, 检测的是病毒核酸, 不管病毒是否有感染性, 只要存在完整的AIV核酸, 并达到检出的下限就能检出, 不易漏检。该通用型探针、引物检测H 5、H7、H 9亚型的敏感性和只针对H 5或H 7或H 9亚型的探针、引物检测相应禽流感病毒的敏感性相同。而且用通用型探针、引物检测常见其它禽类病毒, 未发现交叉反应, 说明该方法敏感性高、特异性强。丹麦学者为了提高检测AIV的敏感性, 建立了RT-PCR-ELISA方法, 该方法比常规RT-PCR敏感10~100倍。而通用型荧光RT-PCR方法检测尿囊液的最高极限同样能达到10-7, 其敏感性远远高于普通RT-PCR (最高极限为10-2) 。因此, 通用型荧光RT-PCR同具他亚型荧光RT-PCR一样, 在检测禽流感病毒感染尿囊液时, 能检测出禽流感病毒的最高稀释度可达10-7, 具有快速、灵敏、特异、操作简单等特点。

6 结语

荧光分析结合免疫技术和PCR等技术对食源性病原菌进行快速检测具有快速简单、专一性强、灵敏度高、无放射性污染等优点。但其敏感性和特异性易受荧光素量、球蛋白的含量、结合时间等因素的影响, 以及外来细菌及其产生物质的干扰, 使检测结果出现假阳性或假阴性。并且目前只能对总病原菌进行检测却无法做污染食品中死活菌体或类型的鉴定。因此还需做大量基础研究工作。另普通的荧光标志物荧光寿命非常短, 开发光学性质稳定、且能保存较长时间的新型荧光标记物 (如荧光藻蛋白) 将有十分重要的意义。

摘要：快速检测食源性微生物的方法很多, 其中荧光分析结合免疫技术和PCR技术具有快速、简单、灵敏等特点。本文对在常见食源性病原菌:大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特氏菌、葡萄球菌、禽流感病毒等快速检测中的应用进行了综述。

免疫荧光检测 篇6

1 对象和方法

1.1 对象

本组选择呼吸道疾病患者569例, 包括慢性支气管炎88例, 阻塞性肺气肿56例, 慢性阻塞性肺疾病145例, 社区获得性肺炎106例, 支气管哮喘58例, 支气管扩张64例, 肺源性心脏病52例。其中男355例, 女214例;年龄19~87岁, 中位数65岁。

1.2 仪器和试剂

使用上海光学仪器六厂生产的XSP-BM-63X荧光显微镜。九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测试剂由郑州安图科技发展有限公司提供, 西班牙Vircell公司生产, 可检测9种非典型病原体:LP、MP、QFR、CP、ADV、RSV、INF A、INF B、PIVs。

1.3 方法

采用IFA。严格按照说明书操作, 步骤如下:无菌采集静脉血3ml, 收缩后离心分离血清;用磷酸盐缓冲液1∶1稀释血清, 加入吸附剂, 离心分离IgG;取上清液加入含相应抗原的玻片各孔, 湿盒孵育90min;洗涤风干玻片后, 每孔加入含荧光素 (异硫氰酸荧光素, FITC) 二抗, 湿盒孵育30min;洗涤风干, 滴加封闭介质, 盖上盖玻片, 暗视野荧光显微镜观察结果。

1.4 评判标准

LP、QFR、CP、IgM在黑色背景下可见典型的杆状、球杆装和球状黄绿色荧光。MP、ADV、RSV、INF A、INF B、PIVs、IgM在红色细胞的胞膜、胞质和胞核上可见黄绿色荧光。每次检测, 均需加入阴性和阳性对照, 只有阴性对照片和质控孔无荧光出现, 阳性对照片出现荧光, 实验才算成功有效。

2 结果

2.1 各种呼吸道疾病非典型病原体检出例数见表1。

2.2 9种非典型病原体检出结果见表2。

3 讨论

呼吸道疾病所伴非典型病原体感染逐渐增多, 应充分重视, 及时诊治, 可以有效治愈疾病, 降低危害[5,6]。及时准确检出病原体, 具有重要意义。非典型病原体中, CP、QFR、ADV、RSV、INF A、INF B、PIVs等很难通过分离培养确立, 其他常规方法在灵敏度和特异性方面又难如人意。IFA检测非典型病原体, 只需在一张玻片上包被相应抗原, 加入样本和荧光素二抗, 通过温育和洗涤, 最后在荧光显微镜下就可同时检测多种病原体。笔者利用IFA检测569例各种常见呼吸道疾病非典型病原体, 无论病因是感染性, 还是非感染性, 都有阳性检出, 检出率为16.7%。并且LP、MP、QFR、CP、ADV、RSV、INF A、INF B、PIVs等9种病原体皆检出, 前5位构成比分别为:INF B 28.2%、MP 24.3%、INF A12.5%、PIVs 10.4%、LP 9.6%。

所以, 运用IFA检测呼吸道非典型病原体, 简便准确, 能及时提供实验依据, 满足临床诊治疾病需要。

参考文献

[1]Dfaz A, Barria P, Niederman M, et al.Etiology of communityacquired pneumonia in hospitalized patients in child:the increasing prevalence of respiratory viruses among classic pathogens[J].Chest, 2007, 131 (3) :779-787.

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[3]单咏梅, 周宏, 杨凡, 等.呼吸道非典型病原体抗体实验室检测及病原分析[J].国际检验医学杂志, 2013, 34 (17) :2297-2299.

[4]印洁, 施毅.非典型病原体混合感染的诊断和治疗[J].中国实用内科杂志, 2011, 31 (3) :236-238.

[5]黄春光.佛山地区呼吸道非典型病原体感染流行病学研究[J].当代医学, 2013, 19 (8) :154.

免疫荧光检测 篇7

1 资料和方法

1.1 研究对象

40例病例来自2011年3月28日-2011年4月5日至本院的门诊体检者或住院的乙型病毒性肝炎患者。其中, 男, 29例;女, 28例;年龄14~68岁, 平均年龄38岁。

1.2 主要试剂、仪器及方法

1.2.1 CLIA法:试剂由郑州安图绿科生物工程有限公司提供;仪器为郑州安图实验仪器有限公司生产的lu Mo化学发光分析仪 (X) ;

1.2.2 TRFIA法:试剂由上海新波生物技术有限公司提供;仪器为上海新波生物技术有限公司生产的ANYTES1_2000时间分辨荧光测定仪及其配套仪器 (Y) 。

1.2.3 每天选取8份临床病人样本, 分别用两种方法按顺序1→8进行样本测定, 再按相反顺序8→1重复测定, 连续测定5天。记录测定结果 (Xij和Yij) , 计算每个样本测定结果的均值 (Xi和Yi) 、样本重复测定值间差值的绝对值 (Dxi和Dyi) 及两种方法测定结果均值间的差值 (Yi-Xi) 。以Yi对Xi作散点图。以 (Yi-Xi) 对Xi作偏差图。目测离群点:计算样本重复测定值间差值 (Dxi和Dyi) 的平均数。计算两种方法测定结果均值间差值 (Yi-Xi) 的平均数。判断:超出上述平均数4倍时, 检验结果视为无效。

2 结果

2.1 时间分辨免疫荧光法与化学发光免疫分析法对40份血清标本分别检测。其定性结果见表l。

血清标本定性检测结果比较:时间分辨免疫荧光法检测结果阳性判定值为>0.2ng/m1。化学发光免疫分析法检测结果阳性判定值S/Co>I。

2.2 两种试验方法检测40例血清标本Hbs Ag的相关性分析

以化学发光免疫分析法两次测定HBs Ag结果 (S/Co>I) 的均值为横坐标。时间分辨免疫荧光法测定HBs Ag结果均值为纵坐进行相关性分析, 结果见附图。两种方法测定病人HBs Ag浓度结果的线性回归方程为:Y=0.9846x-0.2469, 相关系数r为0.9962。

3 讨论

我国是乙型肝炎病毒 (HBV) 感染高发区, 有效地预防和治疗HBV感染是临床一项艰巨的任务[2]。乙肝肝炎血清学标志物是检测HBV感染的最主要病原标志和直接证据之一, 它的准确与否, 直接关系到该病的诊断、治疗与康复。随着科学技术的不断发展, 我国的标记免疫学经历了上世纪60年代的放射免疫技术 (RIA) 、70年代的酶标技术 (ELISA) 、80年代的化学发光技术 (CLIA) 、90年代的时间分辨技术 (TRFIA) 以及现在正在科研中的生物芯片技术。而化学发光技术和时间分辨技术是现今使用较多的标记免疫学。

化学发光免疫分析 (Chemiluminescence Immunoassay, CLIA) 是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合, 用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。其检测原理与放射免疫 (RIA) 和酶免疫 (EIA) 相似, 不同之处是藉助发光底物自身的发光强度直接进行测定。利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额, 该光量子产额与待测物的浓度成正比。由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。化学发光免疫分析具有高灵敏度和宽线性范围, 广泛适用于做免疫学抗原和抗体的定量检测[3,4]。化学发光技术自动化程度高, 单个样本检测速度快, 适合做急诊。

时间分辨免疫分析技术 (TRFIA) 是目前最先进的体外免疫检测技术之一, 它以镧系元素为标志物, 具有灵敏度高、试剂有效期长、标准曲线稳定性好及易于自动化等优点, 适用于生物学及医学的超微量分析度 (酶联免疫为10-9mol/L、放射免疫为10-12mol/L、化学发光为10-15mol/L、电化学发光10-17mol/L、时间分辨荧光为10-18mol L) 。

两种方法在定量测定乙肝表面抗原浓度比较中发现:检测的阳性标本在定量关系上呈高度相关 (=0.9641, P<0.001) , 在灵敏性、特异性、准确性等都基本相当。时间分辨免疫荧光法试剂具试剂有效期长、标准曲线稳定性好、经济性等优点。而化学发光技术灵敏性虽略低于时间分辨免疫法, 但具有检测时间短、自动化程度高和国产有自主产权等优点。二种方法可互为补充, 为我国乙肝定量检测、疗效观察以及血液筛选中尤其是在低水平血清乙肝病毒表面抗原检测中起到重要作用。

摘要：目的 探讨化学发光免疫分析法 (CLIA) 和时间分辨荧光免疫分析技术 (TRFIA) 在测定乙肝病毒表面抗原 (HbsAg) 浓度上的差异性。方法 依据美国国家临床实验室标准协会EP9-A文件, 在5天内分别用CLIA和TRFIA两种方法测定临床40份标本各2次, 并对结果进行分析。结果 对临床标本的检测结果阴阳符合率为100%;两种试验方法的直线回归方程为Y=0.9846x-0.2469, 相关系数r为0.9962。结论 时间分辨免疫荧光法与化学发光法在乙肝表面抗原的定量检测上的灵敏性、准确性基本相当, 再临床上可互为补充。

关键词：时间分辨荧光免疫技术,化学发光法:乙肝病毒表面抗原

参考文献

[1]欧翠华, 熊符, 陈健文.时间分辨免疫荧光法和电化学发光法检测HBsAg的对比分析[J].江西医学检验, 2007, 25 (4) :99-101.

[2]林江, 温先勇, 向成玉.ELISA与TR-FIA测定乙肝标志物的结果分析[J].中国医学理论与实践, 2006, 16 (2) :214-215.

[3]Campbell AK.Chemiluminescence principles andapplication in biology andmedicine[M].Chichester (England) :EllisHorwood Ltd, 1988.Chapter11.