酶联免疫吸附实验检测

酶联免疫吸附实验检测（精选8篇）

酶联免疫吸附实验检测 篇1

0 引言

ELISA是酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)的简称,是以免疫学反应为基础,将抗体、抗原的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种具有高特异性和高敏感性的实验技术。根据样本中待测物质的种类及性质不同,可以设计出各种不同类型的ELISA检测方法,包括抗体夹心法、抗原夹心法、竞争法、间接法及捕获包被法等。1971年瑞典斯德哥尔摩大学的Engvall和Perlmann[1]首次建立了酶联免疫吸附测定方法,短短几十年ELISA检测法的应用已渗入我们生活的许多方面,且在不断发展和完善,包括在临床诊断、医学研究、食品安全、植物资源、环境监测及生态学方面的应用。本文介绍了ELISA检测法的主要应用现状,并综合其优缺点对ELISA检测法的应用前景进行了展望。

1 ELISA的应用现状

1.1 临床诊断和医学研究中的应用

ELISA技术被广泛地用来检测与感染性疾病相关的病原因子以及相应的抗体、体液中的抗原成分、激素和药物等。用于临床医学类研究的标本通常以人的血液和尿液等为主,此外还包括粪便、组织等。在基础医学研究中ELISA检测标本则来源广泛,包括人、鼠、兔、猪、犬等多种实验用动物的血液、组织、细胞及细胞培养的上清液等[2]。

ELISA可以测定的项目包括:(1)抗原及其抗体的检测。ELISA在传染性疾病和病毒检测中具有突出的优势,如甲型H1N1流感病毒[3]、艾滋病毒、巨细胞病毒、柯萨奇病毒A组16型[4]、狂犬病毒、肝炎病毒、肠道病毒、风疹病毒、疱疹病毒和脊髓灰质炎病毒等,其敏感性都超过目前常用的检查方法。在细菌感染的检测方面包括:链球菌、金黄色葡萄球菌[5]、布氏杆菌等。ELISA在免疫性疾病方面可进行自身免疫病抗体的测定以及对过敏的诊断,如检测各种过敏原的抗体、甲状腺球蛋白抗体、红斑性痕疮抗体[6]、血清抗碳酸酐酶Ш抗体[7]等。(2)蛋白质的检测。各种免疫球蛋白;肿瘤标志物如:甲胎蛋白、胰岛素、癌胚抗原、磷酯酰肌醇蛋白聚糖3[8]、诱骗受体3(DcR3)[9]、前列腺碱性磷酸酶;其他蛋白等;(3)非肽类激素的检测。如:雌二醇、皮质醇等;(4)血液中药物浓度的检测。如:治疗心脏病类药物、抗哮喘药物、抗癫痫药物、抗生素、庆大霉素等[10]。这些利用ELISA建立起来的检测方法为保障人们的健康与安全提供了一种便捷有效的途径。

1.2 食品安全方面的应用

食品是人类赖以生存的物质基础,食品的安全问题关系到人类的健康和国计民生的重大问题。随着食品工业的发展,传统的分析方法已经不能满足食品检测的需求。ELISA在食品检测中得到了广泛的应用:(1)食品饲料中微生物的检测。用该法对沙门菌、李斯特菌、大肠杆菌、曲霉、毛霉等进行检测,反应特异性和敏感性高,检测时间短;(2)食品中毒素的检测。主要用于水产生物毒素的检测。李闽针等[11]建立了应用ELISA检测麻痹型贝类毒素的方法,检测过程仅需1h且灵敏度高;(3)食品中残留药品的检测。主要涉及动物和植物性食品的检测,包括动植物体内的抗生素,添加剂和药物残留(如水果蔬菜中的百草枯、蜂蜜中的磺胺类药物[12]);用于兽药残留尤其是动物性产品中兽药残留的检测[13](链霉素、氯霉素、青霉素、四环素、盐霉素、磺胺二甲基嘧啶等)。传统的仪器分析方法(高效液相色谱法,气相色谱法,薄层色谱法等)在兽药残留分析中虽然具有较大的优势,但其前处理过程复杂、仪器昂贵、效率低下,不能适应以筛选为目的的大量检测样本分析。ELISA由于具备灵敏度高、特异性强、方便和成本低等优点,越来越多的被应用到兽药残留检测。(4)外源性污染物残留,富集作用,寄生虫、细菌、病毒等的感染[14]以及食品中其他成分的检测。如对鲜乳中三聚氰胺的检测[15]和食品中"瘦肉精"的检测[16]。(5)转基因食品的检测。国外已开发出用于检测转基因食品的PCR-ELISA试剂盒,我国也建立了转基因食品(如大豆,水稻,鱼)的PCR-ELISA检测法。雷勃钧等[17]使用PCR-ELISA法对大豆品种进行转基因的定性检测,灵敏度高达0.1%,达到国际领先水平。

1.3 植物资源研究方面的应用

ELISA在植物资源方面的应用主要包括:(1)用于植物病毒的流行病学分析,研究不同的寄主和介主的关系。随着我国植物种质资源的引进和生态环境的改变,植物病毒株系分化和变异也不断出现。利用ELISA对植物病毒的分布情况进行追踪调查,研究变异株系的地域性,对植物流行病学的研究具有指导意义。李瑛等[18]利用ELISA对兰州百合病毒进行检测,发现兰州百合病情含量随着种植年限的增加而增加;施曼玲等[19]利用三抗体夹心ELISA对芜菁花叶病毒(TuMV)进行了检测,测定出7种农作物上有TuMV感染。(2)用于种子健康测试。秦碧霞等[20]从感染黄瓜绿斑驳花叶病毒的葫芦植株上收取种子,通过双抗体夹心酶联免疫吸附法检测种子的带毒情况,检出率为100%。(3)大规模经济作物中的植物病毒以及自然寄主中的植物病毒的检测等。目前ELISA检测已经应用到番茄、黄瓜、甜菜、甘蔗、花生等多种经济作物病毒的检测和预防。(4)中药材有效成分质量的检测。谭铭铭等[21]使用抗SSa单克隆抗体建立竞争性ELISA法测定广州市售柴胡药材中柴胡皂苷a(SSa)的含量,发现市售柴胡药材质量参差不齐,约30%不符合药典要求。

1.4 环境监测方面的应用

80年代后期,随着半自动化和自动化ELISA分析仪的问世和发展,ELISA技术在药物残留检测中的应用也越来越广泛。可以用于检测水、土壤中的异内甲草胺、苯并咪叶及多种农药等。有机磷和菊酯类农药广泛用于全球各国,为农业发展起了重要作用。但由此产生的毒物经生物圈物质循环后重新汇集到水中,对水环境产生负面影响;海藻水华产生的微囊藻毒素(MCs)是一类环状七肽毒素,具有很强的毒性,人类饮用被污染的水源后残留在体内的毒素逐渐积累富集会造成人体中毒。ELISA被用于水质检测已有多年,近年来刘延凤等[22]建立了氯菊酯农药残留的ELISA检测方法,抗血清检测线性范围为10~800μg·L-1,平均回收率大于97%,且与其他类似结构农药交叉反应率很低。此外,氯代芳烃化合物,二恶英化合物等有机物长期以来一直是环境科学研究的热点,ELISA法在如何快速检测其在水质,土壤,空气中的浓度发挥了重要作用。

1.5 生态学研究中的应用

食物关系分析可能使我们更好地理解和预测生态系统的一些基本过程,更好地了解相互作用的多物种系统的多样性格局和动态,为害虫管理提供新思路。目前,研究者们认为最有前途、应用最多的检测捕食作用的方法是以免疫学为基础的ELISA检测法[23]。最早将ELISA引入捕食作用研究的是Fichter和Stephen。此后,Ragsdale等[24]应用ELISA研究了大豆上一系列捕食者对稻绿蝽的捕食作用。刘雨芳,张古忍等[25]使用酶联免疫吸附试验双抗体夹心法对稻田节肢动物(捕食天敌、水稻害虫、和昆虫)之间的捕食关系进行了研究,为稻田捕食性节肢动物亚群落的重建和发展的研究提供了一定的参考依据。

2 ELISA在免疫检测中的优点

ELISA检测所需仪器化程度低、操作简便,对样本预处理要求简单,易于推广,具有准确、灵敏、特异、快速、经济等特点,除此之外,还有很重要的一点,即对环境没有污染。基于这一系列的优点,使得ELISA成为免疫检验中的主导技术,得到了快速的发展和广泛的应用。国际上许多权威机构将其列为优先发展的分析技术之一。

与其他检测方法相比,ELISA检测法具有明显的优越性。在口蹄疫诊断检测中新型ELISA(单克隆抗体ELISA、生物素-亲和素ELISA及Dot-ELISA)得到了广泛的应用[26];在梅毒血清学检测中,应用ELISA、TPPA(螺旋体明胶凝集试验)、TRUST(甲苯胺红不加热血清学试验)和RPR(快速血浆反应素试验)四种方法检测梅毒和非梅毒血清,检测结果的阳性率和假阳性率表明:ELISA法敏感性、特异性强都相对较好,是目前梅毒血清学检测的首选方法[27]。应用ELISA方法对鲜奶及肉制品中沙门氏菌进行检测的研究表明:与国际法相比,直接ELISA检验更可靠,同时也可以显著消除样品的非特异性干扰,可以进行大量样品的快速检测[28]。

随着制备单克隆抗体技术的发展,将其和ELISA方法互相结合,极大地提高了分析检测的灵敏性与可靠度。PCR-ELISA技术是将PCR技术、探针技术和ELISA技术三者结合起来的一项技术,即在PCR扩增以后,在微板上借用ELISA的原理,使用酶标抗体,进行固相杂交来实现定量。近年来PCR-ELISA技术被应用于致病菌、病毒的检测,由于该方法是PCR和ELISA技术的结合,是一种两级放大系统、灵敏度高,同时这种方法避免了PCR产物分析时的电泳及染色过程,与普通PCR和荧光PCR相比具有更为快捷、简便和灵敏等优点。除此之外,在端粒酶检测,寄生虫检测,血型基因分型,菌种鉴定等领域也取得了一定的进展[29]。

3 ELISA的局限性及展望

ELISA作为一项免疫检测技术,同时也具有一定的局限性,例如:在所检测的生物学样本中有可能存在各种干扰实验的因素,此外,在实验过程中影响结果的因素也比较多[30,31]。在ELISA定性测定实验中,阳性判定值(Cut-off)的建立是在一定的统计学基础上的,对于某一特定的受检者来说,有可能并不具备适用性。如在使用ELISA方法检测HIV时,检测所得的阳性结果或许并不是真正的阳性,需要利用其他方法如蛋白印迹、重组免疫印迹或中和试验来确认,才能报告阳性。

ELISA测定的基础是抗原与抗体的特异性反应。因此,如果检测抗原,则要求抗体特异性。此外,待测抗原还必须有能与抗体相结合的抗原决定簇,若因某些原因(突变导致某些位点不表达,结合位点因某些原因被封闭或阻断)影响了抗原和抗体的结合,就会造成假阴性结果。如检测抗体,除要求所用包被抗原尽可能包含所有的特异抗原决定簇,还要尽可能不含非特异成分,但是,这一点往往由于受到技术水平的限制难以完全做到。因此,假阳性和假阴性的结果是不能完全避免的。相信随着技术水平的提高,检测所需的抗体和包被抗原的特异性也会得到进一步的提高,从而最大限度的避免假阴性结果的出现,提高检测的准确性。

由于ELISA操作过程中干扰因素的存在,试剂半衰期长应用范围仅限于小的实验室诊断等缺点,给ELISA的应用带来了很大的局限性[6]。此外,我国与国外在ELISA试剂盒的研发方面还有一定差距,我国自主研发的试剂盒种类少、不稳定、重复性不良、灵敏度不高的问题还没有完全解决,很大程度上依赖于进口。因此,在实际研究工作中应克服这些缺点,为ELISA方法学提供更为广阔的应用与发展空间。

酶联免疫吸附实验检测 篇2

【关键词】酶联免疫吸附试验；ELISA;梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验；TPPA;梅毒抗体

【中图分类号】R377⁺¹【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)10-0077-01

梅毒是由梅毒螺旋体感染引起的性传播疾病.目前梅毒检测常用方法^{[1]主要有:快速血浆反应素试验(RPR)、甲苯胺红快速反应素试验(TRUST)、梅毒螺旋体EUSA试验(ElSA)、梅毒螺旋体血凝试验(TPHA)和梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)等，有时也用到免疫印迹法和PCR方法。高敏感性和特异性的检验方法对于该病的确诊和治疗具有重要意义。我们采用梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验(TPPA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)对2000份血清标本进行了检测比较，现报道如下。}

1材料与方法

1.1标本来源选取我市2006年10月～2008年10月献血者和梅毒临床患者共2000份血清标本，男1236例、女764例，其中包括1700份健康献血者血清、300份梅毒患者血清。

1.2试剂TP-ELISA试剂盒购自北京万泰生物药业有限公司，IPPA试剂盒购自日本富士瑞必欧株式会社，均批检合格，在有效期内使用。

1.3方法所有标本均采用ELISA和TPPA进行血清梅毒螺旋体抗体平行检测，具体操作和结果判定均按试剂盒说明书进行。

1.4统计学处理采用统计学软件SPSS13.0对所得数据进行统计学分析，率的检验采用卡方检验，P<0.05，差异有统计学意义。

2结果

2.1酶联免疫吸附试验(ELISA)和梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验(TPPA)两种方法检测对300份梅毒患者血清检测结果比较，见表1。

2.2两种方法对1700份献血者血清检测结果见表2。

3讨论

梅毒是一种由苍白密螺旋俸所致的密螺旋体病，主要通过性接触、血液、母要垂直传播。20世纪60年代初得到较彻底的控制。1973年梅毒死灰复燃，卷土重来，20世纪80年代后期，国内各地先后均有早期梅毒的病例报道，以后呈直线上升，成为仅次于艾滋病的对人体危害最大的性传播疾病．无偿献血者血液初筛检测中，梅毒抗体阳性率也高达2.0%．其中工人、农民、流动人口的检测阳性率为3．58％^[2]。而且，早期梅毒患者作为供血者，可以通过输血传染梅毒^[3]。因此，必须选用高质量的梅毒检测试剂，加强对献血者梅毒的检测，以控制其经输血传播。

人体感染梅毒螺旋体后，可以产生特异性梅毒螺旋体抗体和非特异性抗体即反应素，前者比后者出现得早，即使通过抗梅毒治疗后，梅毒螺旋体抗体仍可终生存在^[4]。TPPA试验方法是将特异性TP抗原包被在明胶颗粒上，省略了吸收剂，不受生物因素影响，与血清中特异性TP 抗体结合后出现肉眼可见的凝集反应的检测方法。TP以是目前公认较好的梅毒抗体确认方法，敏感性高，特异性强。ELISA法是利用基因重组工程合成抗原，检测血清中梅毒特异性抗体，在梅毒各期均有较高敏感性，TP-ELISA是利用重组梅毒螺旋体的特异性抗原包被酶标板孔，并采用双抗原夹心法检测血清标本中的梅毒特异性IgM和IsG抗体，对早期和晚期梅毒都有较高的检出率^[5]，但ELISA法也存在着假阳性问题^[6]。

本文结果表明，TP-ELISA法的假阳性率为0.35％。通过本文实验，我们发现ELISA和TPPA都具有较高的敏感性和特异性，两法的检测结果无显著性差异(P>0.05)。因TPPA用肉眼判断结果，使结果可靠性下降，并且试剂昂贵，整个检验过程几乎全部依赖于手工，操作繁琐，存在操作出错的风险，检测时需将样本作系列稀释，不利于大批量样本筛查，也不便用于疗效判断。而ELISA现已利用全自动加样器和全自动酶免分析仪，实现了从标本加样、温育、洗板、加试剂到结果判断等整个检验过程的完全自动化，可同时检测大批量标本，操作简便，极大地减少了人为因素的影响;可实现室内质量控制的标准化;结果判断客观、准确;利用微机保存并管理原始检验结果，便于查询;适合血站大规模的血液筛检^[7]。因此，综合考虑方法学和实际操作等因素，ELlSA目前最适合血站大规模的血液筛检。

参考文献

[1]王培华.输血技术学[M]，第2版.北京:人民卫生出版社，2002:113-116.

[2]利忠，黄宏科，何伟胜．崇左市无偿献血者梅毒感染情况的初步调查[J]．广西医学，2005，27：141

[3]周林，武峰．输血医疗纠纷与事故的防范[M]．北京：中国科技出版社。2006:204

[4]王培华．输血技术学[M]．2版．北京：人民卫生出版社，2002：113-116

[5]胡小兵，李俊杰，赵艳杰．TRUST与TP—ELISA法对无偿献血者血清梅毒检测对比分析[J]．中国误诊学杂志，2005，5(5)：885～886

[6]林常青．RPR和TP-PA法梅毒检测方法的比较[J]．中国误诊学杂志，2004，4(9)：1448

[7]刘明，张小华．ELISA法与TRUST法检测梅毒结果的分析[J]．中国输血杂志，2002，15(2)：122-123

(收稿日期：2009.02.14)

酶联免疫吸附实验检测 篇3

为达成我校以学生的发展为本,提高学生的就业竞争能力、升学竞争能力和可持续发展能力的办学目标,免疫检验课程通过制订专业课教学与临床岗位零距离对接的教学目标,实施学生自主学习—教师点拨辅导的实验教学模式。按照免疫检验临床实际的工作流程和质量管理,我们对ELISA检测乙肝两对半进行相应教学设计,将理论知识和技术应用能力的训练渗透到实验教学过程中,便于学生牢固地掌握理论知识,让学生学有所得、学有所思、学有所用,以下谈谈笔者的教学体会。

1采用的教法、学法

以往的理论授课采用传统的讲授法,由于受到课堂规则、心理环境、激励机制等因素的影响,教师在课堂讲授过程中存在许多不尽如人意的地方。如ELISA检测乙肝两对半涉及双抗体夹心法、双抗原夹心法、竞争法原理,内容上有严谨的系统性和组织性,授课中若只是简单地将知识点堆积,没有讲清知识之间的内在联系,会在一定程度上影响课堂教学的实际效果。在实验教学中,实验材料的准备、仪器的准备及调试、标本及试剂的处理等工作基本上是由指导教师包办,实验的许多中间环节学生没有亲自参与,因而在教学任务完成后,部分学生对实验的原理、操作还是一知半解,更谈不上能力的锻炼和培养。我们根据学生的学习特点和认知规律,通过优化教学内容,注重理论联系实际,在教法上采用任务驱动法、直观教学法、讨论教学法及实验教学法等,激发学生进一步探究问题、积极参与教学活动的欲望。

实验过程中注重培养学生的职业能力,提高学生分析问题、解决问题的能力,因而采用自主学习法、合作探究法、分析讨论法等。如在教学准备环节,将学生分组(5人/组),指定各组组长,布置以下学习任务:(1)乙肝两对半包括哪些项目?(2)常见的乙肝两对半检测结果是哪些?有何临床意义?(3)应用了ELISA的什么原理?(4)接触血液、分离血清标本需实施哪些安全保护措施?(5)实验用品的准备和注意事项有哪些?

2使用多媒体信息技术手段辅助教学

2.1登录网站搜集资料,建立QQ、微信讨论组

乙肝两对半检测与实际生活联系较为密切,学生对于乙肝病毒的传染性、病毒携带者、“大三阳”等知识有所了解,但学生对乙肝病毒采用的检测方法及原理、临床意义缺乏认识。教学设计中,我们注重理论联系实际,让学生感到所思考的问题是熟悉的、常见的,同时又是新奇的、富有挑战性的,激发学生探究问题、寻找答案的欲望。教师布置学习任务后,学生通过查阅书籍、登录网站搜集资料,并结合自己或家人曾经到医院检验科化验检查的结果来获取乙肝两对半检测的相关知识。通过QQ、微信的形式建立讨论组,针对ELISA检测乙肝两对半的相关知识进行讨论,分享学习经验,教师及时跟进、指导,在讨论组实现师生、生生讨论。

2.2 Flash动画及图片的应用

ELISA检测乙肝两对半涉及双抗体夹心法、双抗原夹心法、竞争法原理,抽象难懂,通过Flash动画、图片演示,把实验原理直观形象地展示出来,可以增强教学内容的可读性和可接受性,解决内容单调乏味、难以接受的问题。教师针对重要知识点提问,由此突破教学重点、难点,可达到预期的教学效果。

2.3教学录像、视频的应用

教学过程中,以学生的学为中心,以符合学生的认知规律为前提,为使学生对操作步骤有感性认识,我们设计、制作适合于教学对象的教学录像、视频,使得操作更为直观[2],促使学生对原有知识进行回顾和巩固,培养学生的思维能力、记忆力、主动学习能力。如通过视频导入教学,视频内容为某患者出现了肝炎的临床症状,血清乙肝两对半检测结果为HBs Ag(+);HBe Ag(-);抗-HBs(-);抗-HBe(-);抗-HBc(-),提出问题:(1)乙肝两对半常用何种方法检测;(2)患者的检测结果如何分析?有何意义?从一开始上课就牢牢地吸引学生的注意力,加深学生对乙肝两对半检测意义的理解。

此外,我们自制了乙肝两对半检测的教学录像、洗板机及酶标仪的编程录像。教师针对性地对实验环节如操作步骤、结果观察、注意事项进行重点讲解,激发学生参与实验活动的热情,增强学生做好实验的自信心。

2.4计算机交互平台的应用

为了检验学生对ELISA检测乙肝两对半的理论掌握程度、提高学生的实验技能、完善学生免疫检验课程成绩评价体系,我们对学生进行实验考核,采取以考促学的手段,加大ELISA检测乙肝两对半的训练力度,包括理论考核(30分)和操作考核(70分)。

理论考核采用本教研室的计算机交互平台进行,根据教学内容的特点,理论考核我们进行这样的设计:首先收集乙肝两对半检测相关试题共25题,内容涉及实验原理、操作、材料、结果观察及临床意义。如:(1)乙肝两对半检测涉及ELISA的哪些原理?分别检测什么项目?(2)通过各反应孔显色,如何判断疫苗接种者、病毒携带者、“大三阳”、“小三阳”?(3)手工洗涤有何要求?(4)加终止液的目的是什么?(5)ELISA常用的酶是哪种?其底物是什么?考虑到学生对理论考核容易产生畏难情绪,在题型上设有填充题、标示题、连线题及填空题等,内容直观、清晰,以PPT形式组卷,使学生“寓考于乐”,轻松愉快地完成理论考核。从试题库集中抽题组卷,考核内容及题型见表1,共组10套试卷。学生抽签后通过计算机交互平台进行考试,本教研室的计算机交互平台可实现全班学生同时测试及无纸化考试。

2.5开放式微生物教学系统的应用

ELISA检测乙肝两对半在内容上与医学微生物学、生物化学密切相关。开放式微生物教学系统操作简单、直观,同时具有良好的交互界面、动态效果,能够从视觉上、听觉上吸引学生的注意力,为学生提供自主学习的平台,扩充相关学习内容。学生在课后可进入开放式微生物教学系统,通过观看视频,针对乙肝病毒的内容进行学习。该教学系统能帮助学生复习、巩固相关知识,并能重复学习。

3督导实验,及时进行总结

乙肝两对半共有5个检测项目,目前多采用商品化的ELISA试剂盒,需用到5种试剂盒,各个项目的操作步骤不同,实验中若不细心就容易出错。在学生操作过程中,教师巡视指导,督导每位学生的操作。此外,每个小组由小组长协助监督,及时发现错误并纠正,以免影响结果。

由于学生用的是自体标本,实验态度与参与积极性明显提高,且操作认真。实验结束后,学生很急切地想要知道自己的检测方法对不对,结果与预计的是否符合。在教师的组织下,学生对整个实验进行分析及总结,可加深对乙肝和ELISA检测法的认知。如本次课学会了什么?有何体会?总结成功的经验、失败的经验、容易出错的环节等。每组学生对实验过程和实验结果进行整理和综合分析,每名学生完成一份实验报告。通过总结,进一步加深学生对乙肝两对半检测相关知识的理解,加深对免疫学检验专业技能的认知。

4重视人文关怀,拓展知识,做好防治

我国人群中乙肝病毒感染率为10%,医学生是未来的医务人员,是高危人群,医院内污染的器械、血标本及各种不规范操作均可引起感染。ELISA检测乙肝两对半所用的标本为学生自体血清标本,实验结果显示,绝大多数学生为健康人,乙肝两对半5项全阴性的学生要求在实习前完成乙肝疫苗的全程接种,通过接种疫苗关爱自己,保护他人[3]。对乙肝病毒感染的可疑标本,由指导教师复查,以确定是否具有传染性,以便让学生及时到专科诊治,对感染了乙肝病毒的学生,教师要保护学生的隐私,指导学生以正确的态度去面对,不要产生心理负担,同时要重视乙肝的防治。

通过观看乙肝宣传片,完成乙肝手抄报作业,加深学生对乙肝流行情况、临床表现、临床类型、检测方法及防治原则的认知,积累自我保护经验。在集体生活环境中注意个人卫生,不用他人的生活用品,养成良好的卫生习惯[4]。在实际工作中,树立防范意识,在微生物检验、生物化学检验、临床检验等专业课程开设的实验中正确处理血标本、血污染物品,规范操作,避免意外感染的发生。

5制订切实可行的评价标准

结合本课题的教学目标、教学内容和学生的学习环境以及学生个体差异等制订切实可行的评价标准。设计了教师评价、小组评价及个人评价,从各个角度对本课题的实施情况进行评价。以2014级86位学生为例,评价结果见表2。通过评价,有助于学生反思和调控自己的学习过程,让每名学生都能体验到成功的乐趣,非常有利于学生更好地认识自我,树立自信。

免疫学检验课程实践性强,理论内容抽象不易学习。实验前,学生对ELISA夹心法、竞争法等概念及原理存在模糊、混淆的情况。教师应在ELISA检测乙肝两对半的理论和实验教学过程中强调理论联系实际,对教学内容、教学环节进行精心设计,使学生很快掌握该实验的原理、操作、结果判断及分析,对乙肝的传播途径、致病性、防治方法及免疫有一定的认知,使专业技能得到进一步提高,为实习及将来的工作打好基础。

摘要：为达成我校以学生的发展为本,提高学生的就业竞争能力、升学竞争能力和可持续发展能力的办学目标,免疫学检验课程制订专业课教学与临床岗位零距离对接的教学目标。结合酶联免疫吸附试验检测乙肝两对半的理论及实验教学谈谈教学体会。

关键词：酶联免疫吸附试验,乙肝两对半,免疫学检验

参考文献

[1]田兆菊.综合性实验在临床免疫学检验实验教学中的应用及体会[J].国际检验医学杂志,2014,35(2):250-251.

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[3]邓青.乙肝疫苗免疫效果评价[J].中国卫生统计,2010,27(4):388-389.

酶联免疫吸附实验检测 篇4

目前,关于检测饲料原料、饲料、牛奶、鸡蛋和肉产品中MA的方法国内外有很多报道,包括HPLC[2,3,4,5,6,7,8,9,10]、LC-MS/MS[10,11,12,13,14]、GC/MS[15,16]。这些方法虽可定性定量,但需要昂贵的仪器设备,操作复杂,耗费大量时间和人力物力。而酶联免疫吸附检测法(ELISA)快速、简单、灵敏,一次可同时检测几十份样品,对于国内需要检测样品量巨大的实际情况来说,不失为一种最佳的选择。到目前为止,只有Kim[10]和Garber[17]分别以美国Beacon公司和美国Abraxis公司的商品化试剂盒对宠物饲料中的MA进行了检测,检测限分别为0.02 mg/kg和0.009 mg/kg。而至今国内外均未见有建立ELISA方法对MA进行检测的研究报道。因此,该研究旨在合成MA的人工抗原,制备特异性抗体,建立一种简单、快速、灵敏地检测MA的间接竞争ELISA方法,以对鸡蛋中可能残留的MA进行检测。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试药品。

三聚氰胺标准品由中国兽医药品监察所提供;牛血清白蛋白、卵清蛋白和弗氏佐剂均购自美国Sigma公司;吡啶、琥珀酸酐、四氯化碳及其他试剂均为分析纯,购自北京化学试剂公司;三聚氰胺标准储备液和系列浓度的工作液均由甲醇/水(2∶8,v/v)配制。

1.1.2 供试仪器。

美国550型Bio2Rad酶标仪;JJ-2B型组织捣碎匀浆机。

1.1.3 试验动物。

4周龄(1.5 kg)新西兰白兔8只,雌雄各半。

1.2 MA人工抗原的合成

MA人工抗原的合成过程见图2。将0.248 g(1.96 mmol)MA、0.156 g(1.96 mmol)吡啶和5 m L CCl4置于一圆底烧瓶中加热回流。在回流过程中于25~30 min内逐滴加入10 m L含有0.197 g琥珀酸酐的CCl4,然后回执回流4 h。待冷却后,得到白色沉淀。沉淀物先后用少量水和无水乙醇淋洗,干燥后得MA半抗原(熔点360℃;红外扫描结果:(KBr)Vmax3 342、3 212、1 668、1 627、1 587、1 560、1 498、1 405、1 348 cm-1)。

称取10 mg半抗原溶于2 m L的1 mol/L的碳酸钠溶液中,加入1.6 m L二氧六烷和100μL三乙胺,混合均匀后再加入15μL氯甲酸异丁酯,此混合液于4℃搅拌反应30 min。然后将此溶液逐滴加入到含有60 mg BSA或20 mg OA的碳酸钠溶液中,4℃搅拌反应过夜。最后,将反应液用生理盐水透析3 d,每12 h换液1次,分装后于-20℃保存备用。

分别将偶联物、载体蛋白和半抗原配制成一定浓度的溶液后,在200~300 nm范围内用紫外分光光度计进行全波长扫描,以鉴定是否成功偶联,并计算偶联比。

1.3 MA抗血清的制备

首次免疫,取MA-BSA与等量弗氏完全佐剂充分乳化后,在新西兰白兔背部皮下多点注射,加强免疫以抗原与弗氏不完全佐剂乳化后皮下注射。免疫剂量每只兔子0.5mg(以载体蛋白计算),每隔4周加强免疫1次,共免疫8次。最后心脏采血,分离血清,-20℃保存备用。

1.4 间接竞争ELISA方法的建立

1.4.1采用方阵滴定法确定包被抗原与抗体的最佳工作浓度。每孔加入100μL最佳工作浓度的包被原包被酶标板,4℃过夜。封闭,洗涤后,将50μL工作浓度的抗体与等体积倍比稀释的MA标准液或样品提取液加到酶标板上,以抗体与同体积磷酸盐缓冲液(PBS,0.01 mol/L,p H值7.2)的混合物为零标准,37℃反应1 h。然后加入100μL HRP-羊抗兔Ig G溶液,37℃反应30 min。再加入100μL TMB系统底物显色液,37℃显色15 min,最后加入50μL终止液(2mol/L H2SO4),在酶标仪上测定450 nm处各孔的OD值。

1.4.2以1.4.1中所测MA各浓度的OD值(B)与零标准孔OD值(B0)的比值(B/B0)为纵坐标,以各标准浓度的对数值(Log C)为横坐标,绘制标准抑制曲线。

1.4.3检测抗体与其他同系物的交叉反应率。方法同1.4.1,抑制物分别为环丙氨嗪、三聚氰胺一酰胺、三聚氰胺二酰胺和三聚氰酸。根据抑制曲线计算抑制抗原抗体结合50%时的各竞争物浓度,以抑制率为50%时的MA浓度与各竞争物浓度之比计算交叉反应率。

1.5 样品提取方法

将鸡蛋去壳后充分搅拌均匀,取5 g置于100 m L离心管中(空白样品按20、50、100 ng/g的浓度添加MA标准品),然后加入50 m L含20%氨水的乙腈,剧烈振荡10 min后在4 000 r/min下离心15 min。取10 m L上清液转移至干净分液漏斗中,加入10 m L正己烷,剧烈振荡1 min,静置分层。收集下层乙腈相,在50℃水浴中旋转蒸干后复溶于1m L的甲醇/水(2∶8,v/v)中,用0.45μm的滤膜过滤后供ELISA检测。

1.6 未知样品ELISA检测

从不同超市、农贸市场和养鸡场购得未知的鸡蛋50枚,按上述方法提取后进行ELISA检测。

2 结果与分析

2.1 抗原合成

MA具有环状对称的特殊结构,有3个氨基可供偶联载体。如果采用氨基的反应直接与蛋白连接,则3个氨基都可以同载体蛋白偶合,导致MA完全被大分子蛋白包围,这样的抗原不能刺激产生高效价抗体。因此,该研究采用控制MA和琥珀酸酐等量反应摩尔比的方法,只将其中1个氨基连接上带有羧基的4碳间隔臂以合成半抗原。所得半抗原的熔点高于MA的熔点说明产生了一种新物质,红外扫描的数据可证明半抗原上连接了羧基和羰基。另外,半抗原的全波长紫外扫描曲线和最大波长均与MA相似,说明MA分子中的三嗪环没有被破坏。这些均证明半抗原合成成功。

在用混合酸酐法将半抗原与载体蛋白连接后,将半抗原、载体蛋白和偶联物进行紫外全波长扫描,从图3可以看出,偶联物的曲线是半抗原和载体曲线的叠加,从而证明免疫原和包被抗原均偶联成功。

2.2 抗体灵敏度与特异性

要建立一种ELISA方法,必须要获得针对被测物的特异性抗体。该研究用自制的抗原免疫动物获得了针对MA的特异性抗体,以该抗体为基础首次建立了检测MA的间接竞争ELISA方法。该法对MA的半数抑制浓度(IC50)为42ng/m L,在3、6、12、25、50、100、200、400 ng/m L的浓度范围内,MA对该抗体的竞争抑制曲线见图4。以抑制率为10%计算,该ELISA方法对MA的检测限为8.5 ng/m L,完全可以满足对MA的残留检测要求。因此,该方法的灵敏度等同或优于文献报道的ELISA试剂盒的灵敏度,明显高于报道的仪器方法的灵敏度。由于合成的半抗原中还有2个游离的氨基,与其结构有相似性的物质可对该抗体产生抑制作用。因此,该抗体对环丙氨嗪有70%的交叉反应率,对三聚氰胺二酰胺有5%的交叉反应率,对其他代谢物没有交叉反应。

2.3 样品提取

对于从生物样品中提取MA的溶剂,国内外有许多文献报道。中国农业部发布的标准方法是采用三氯乙酸作为提取液,国家质检总局发布的公告中采用三氯乙酸和乙腈作提取液。另外,还有采用乙腈∶水(1∶1)[2]、柠檬酸和己烷磺酸钠的缓冲液[3]、盐酸[4]或乙酸[5]、甲醇∶水(1∶1)[10]、酸性乙腈[13]等溶液来提取MA。因为MA属于强极性碱性化合物,它应该在碱性溶液中溶解度更大。因此,有多篇文献报道采用碱性乙腈来提取肌肉、鸡蛋、牛奶[6,7,18]和饲料[19]中的MA,均达到了理想的提取效果。该研究采用含20%氨水的乙腈对鸡蛋中的MA进行提取,然后过滤膜后ELISA检测。从图4可以看出,空白样品提取液中添加MA标准液的抑制曲线与MA标准品的曲线相似,说明该提取方法可基本除去样品基质中的干扰。由于本提取方法未对提取液进行稀释或浓缩,因此,该ELISA方法对MA标准品的检测限也被认定为对鸡蛋中MA的检测限,即8.5 ng/g。在空白鸡蛋中按20、50、100ng/g的浓度添加MA标准液后,按该方法提取,ELISA检测,添加回收率结果见表1。可以看出,在3个添加浓度下,MA的日间和日内回收率范围均在88.9%~96.1%之间,变异系数均小于11.6%。

2.4 未知样品检测

ELISA方法是目前兽药残留检测中常用的筛选方法,但到目前为止,国内外均未见有建立ELISA方法对MA进行检测的研究报道。该研究利用建立的ELISA方法用于对市场购得的50枚鸡蛋进行检测。结果发现,有2枚鸡蛋中检测出含有MA残留,浓度分别为36、84 ng/g。这可能是由于给鸡饲喂了高浓度的环丙氨嗪代谢而来,或是使用了MA非法添加的饲料。但残留浓度较低,远低于国家规定的在奶制品中的含量限值,应该不会对消费者身体健康造成危害。

3 结论与讨论

酶联免疫吸附实验检测 篇5

1 有关酶联免疫吸附技术的概述

1.1 酶联免疫吸附技术的基础原理

酶联免疫吸附技术是指利用酶的高效催化作用和抗原抗体反应的高度特异性相结合发展而建立的一种食品检测免疫分析技术。酶联免疫吸附法的英文简称是ELISA, 多运用于食物中生物毒素、重金属、病原微生物等食品的检测。[1]酶联免疫吸附技术的原理是指将某种固相载体和具有免疫活性的抗原体相结合, 加入特异性酶标记的抗原体和受检样品进行化学反应形成复合物, 在终止化学反应时对比被结合的酶标和待测样品中抗原体的量, 再对其他相关物质进行洗涤, 加入酶所催化反应的底物, 形成有色产物, 最后对有色产物进行定量分析, 从而达到检测食物中某种物质的目的。[2]然而, 对于不具有免疫性的且相对分子质量都较低的物质, 需要先将其与大分子蛋白质相结合, 形成具有免疫原性的完整抗原体, 再运用酶联免疫吸附技术进行食品检测。

1.2 酶联免疫吸附的技术分类

根据酶联免疫吸附技术的反应途径, 将其分为间接法测抗体技术、竞争法测抗原技术和双抗体夹心法测抗原技术。如果采用第一种检测技术的待测样品中缺少抗体, 就会导致这种酶标记的抗体复合物被洗涤液冲走, 在化学反应结束后就不会显色。如果采用第二种检测技术的待测抗原的含量很高, 会使加入底物的显色很浅。如果采用第三种检测技术相应抗原的待测样品中的酶会因催化而显色。临床诊断多适用于双抗体夹心法测抗原, 测定小分子抗原主要是采用竞争法测抗原。因而, 需要根据不同食品的检测物质, 采用不同的食品检测技术, 进而发挥酶联免疫吸附技术在食品检测中的作用。

2 食品检测技术的未来发展方向及重要性探究

2.1 食品检测技术的未来发展趋势

酶联免疫吸附技术在食品安全检测中的应用十分广泛, 随着科学技术水平的不断提高, 酶联免疫吸附检测技术在未来食品检测的发展道路上会出现新的发展趋势。具体表现在检测食品中农药残留、检测食品中的生物毒素、检测动物性食品中的药物残留和检测转基因食品等方面, 创新发展酶联免疫吸附技术, 使其检测范围由ng发展到pg的水平上, 提高检测技术的灵敏度, 扩大酶联免疫吸附技术在更多类别食品检测上的适用范围, 采用定性试验对检测技术进行筛选, 降低食品的检测费用, 节约食品检测的时间和成本, 进而保证社会成员的生活质量。

2.2 改进食品检测技术的必要性

酶联免疫吸附技术与传统的食品检测技术多采用的高效液相色谱法相比, 此种方法具有灵敏度高、检测结果准确、成本少、样品处理量大、操作简便等优点。而后种检测方法虽然较为精确, 但由于操作程序相对复杂, 加上需要昂贵的检测仪器设备和较长的实验周期, 使得其在社会上运用面十分狭窄。随着人们生活水平的不断提高, “苏丹红事件”“瘦肉精事件”“三鹿奶粉”等食品安全事件的发生, 使得食品安全问题日益受到关注。因而改进和提高酶联免疫吸附检测技术对解决关系到人们身体健康、经济发展及社会发展的食品安全问题十分重要。作者认为对酶联免疫吸附技术在食品安全检测方面的应用情况进行分析探究和总结, 不仅有利于保障食品安全, 推动食品安全检测技术的知识普及, 还有利于促进社会的健康发展和人们身体素质的提高。

3 酶联免疫吸附技术在食品检测中的运用

3.1 植物性食物中有关农药残留物的检测运用

近年来, 为了提高农产品的产量, 农业种植人员长期超量使用化肥、农药成为一种普遍现象。农作物对病害的耐药性能逐渐增强, 进而造成植物源性食品的农药含量超标, 这对社会成员的健康产生严重威胁, 更严重的会发生食物中毒甚至死亡的现象。采用酶联免疫吸附技术检测柑橘、桃子、香蕉、樱桃和西红柿等新鲜农产品中的胺甲萘和虫螨等农药残留物, 在我国的食品检测技术中已经成熟建立。技术人员通过直接竞争的酶联免疫吸附技术检测杀虫剂克百威, 其应用的普遍性不断增强, 最低检测可以达到0.1毫克每升, 足以说明此技术在国际上处于领先水平。

3.2 食物中有关生物霉素的检测运用

众所周知, 黄曲霉毒素是食品中众多生物毒素中的一种最为常见的生物霉素, 由于其在近几年内对人类身体产生了许多潜在威胁, 危害性极大, 因而各国都在运用酶联免疫吸附技术严格限制该生物霉素的含量。该食品检测技术主要是利用蛋白质和小分子的黄曲霉毒素结合而成的抗原体, 获得与抗黄曲霉毒素的抗体B1合成的酶标物, 再对食品进行最终的检测。目前我国酶联免疫吸附食品检测技术中的直接竞争ELISA法和间接ELISA法在检测食物中的生物霉素方面被广泛地推广应用。

3.3 食物中有关重金属残留的检测技术运用

随着经济的飞速发展和社会的进步, 生态环境问题日益严重。土壤中的重金属污染问题和工业废水的排放问题成为威胁食品安全的重要因素, 最终导致植物源性食品和动物源性食品中出现重金属含量超标的现象。比如市场猪肉中铜元素含量严重超标, 酶联免疫吸附技术主要是采用纯化的金属硫蛋白进行抗原免疫使其产生氧化酶抗体, 通过将采集猪肉的抗血清纯化后, 再标记辣根的过氧化酶, 该巯基团能够与大多数的重金属离子结合产生金属硫蛋白, 最终实现对食品中重金属的检测, 进而实现食物细胞免受重金属危害的作用。

4 结束语

综上所述, 随着人们对食品安全问题的关注, 快速简便、准确灵敏、重现性好、全自动的酶联免疫吸附技术在食品安全检测的运用也十分广泛。然而在食品检测中的农药残留物、生物霉素的检测运用和重金属残留的检测技术等实践中也存在着无法进行对多残留进行检测分析、交叉反应化合物等缺点和不足, 因而完善和改进酶联免疫吸附技术, 不仅有利于提高食品检测效率和精准度, 而且对未来食品安全的快速检测和精准度检测发挥着十分重要的作用。

参考文献

[1]王兰兰.临床免疫学和免疫检验[J].食品安全与检测, 2012 (19) :79-83.

酶联免疫吸附实验检测 篇6

1 明确ELISA检测“乙肝二对半”的重要性

ELISA是目前临床上最常用的免疫标记技术, 是免疫检验技术课程的重要内容之一, 而ELISA检测“乙肝二对半”是ELISA在临床上应用的代表, 其灵敏度高、特异性强、操作简单, 同时运用到ELISA的3种方法, 即双抗体夹心法、双抗原夹心法、竞争抑制法, 是在学习了抗原抗体反应等基础上进一步学习的内容, 起到承前启后的作用。掌握这项技术可为以后的临床工作打下牢固的基础。

2 确立ELISA检测“乙肝二对半”的重点、难点

由于授课对象是检验专业的学生, 对其而言, 掌握操作过程和判断实验结果最重要, 因此, 应把操作方法及结果判断列为重点内容;而掌握实验原理对于中职生来说有一定难度, 所以列为难点内容。在教学过程中, 一方面, 安排的任务要符合学生实际, 注意任务的层次性;另一方面, 要根据实际情况灵活调整教学进度和深度。

3 合理运用各种教学方法

3.1 PBL教学法

PBL是以问题为基础的教学法, 它最大的优势, 就是要求学生主动学习。在学习过程中, 学生可以自主地探索某些问题, 虽然有时可能是失败的探索, 但是他们从失败中获得了智慧, 从成功中得到了快乐, 从学习中获得了经验。研究表明[1,2], 采用PBL教学法可以激发学生的学习热情、培养学生创新思维及自学能力、提高人际交往及协作能力、形成终身学习意识, 在以后的工作中更具开拓精神。

本次实验设计了以下问题: (1) 什么是乙型肝炎?它的病原体是什么? (2) 什么是“乙肝二对半”?想知道是否感染了乙肝病毒可以做什么检查? (3) 什么是酶联免疫吸附试验?ELISA检测“乙肝二对半”的原理是什么?如何进行操作及判断结果?如何解释得出的实验结果?什么是“大三阳”?激发学生的求知欲和探究欲, 促使学生主动学习实验所涉及的相关知识, 为实验打好理论基础。

3.2 实验操作多媒体演示法

很多中职生接受能力较差, 对做好ELISA没有信心。实验课可通过播放高年级学生的实验操作录像, 把操作内容直观、形象地展示给学生, 便于学生理解和掌握, 达到增强学生信心的目的:学长能做到的, 我们也能做到。

3.3 情境角色扮演法

本次课给学生创设情境, 让学生扮演检验科的“医生”和“病人”角色, 在角色扮演中学习, 在解决问题中达到理论和实践的有机结合, 即“做中学, 学中做”, 强调工作过程的整体性, 注重职业情境中实践能力的培养, 锻炼了学生的动手能力、分析和解决问题的能力。

3.4 启发、归纳教学法

从临床检验实际出发, 启发学生对ELISA的认识, 培养和提高学生团队协作精神及学习的积极性、主动性;引导学生以探讨、研究的方式, 认识思考和解决问题。

通过本次实验课, 引导学生归纳出5个检测项目操作步骤的异同, 举一反三, 更好地进行ELISA的相关检测。

4 加强对学生学习方法的指导, 培养学生的自学能力

最有价值的知识是关于方法的知识, 掌握了正确的学习方法就像有了能打开知识大门的金钥匙, 因此, 教师应当加强对学生学习方法的指导, 把金钥匙交给学生。本次课主要让学生学会以下学习方法。

4.1 问题讨论学习法

通过问题的导入, 让学生讨论, 并在操作过程中发现问题、分析问题、解决问题。让学生学会分析、归纳, 提高解决问题的能力。

4.2“一读、二联、三写、四练、五创”的学习方法

“一读”, 指教师指导学生阅读教材, 对学习好的学生指导其阅读课外资料和相关参考书。要求学生遇到问题, 学会查阅相关资料, 如实验操作说明书、微生物检验技术中乙肝病毒相关知识等。

“二联”, 指教师指导、启发学生进行联想, 把与问题相关联的知识串联起来, 理成线, 织成网, 总结出规律, 同时学生间相互讨论。学生学会将知识前后联系, 融会贯通;本次实验要求学生归纳出乙肝病毒5项检测指标操作、结果判断的异同, 以锻炼学生概括能力。

“三写”, 指学生在学完一章后, 写出知识要点和小结, 以培养学生的文字概括、写作和书面表达能力。在本次实验后要求学生概括出“乙肝二对半”所需试剂种类、操作步骤、结果判断, 加深对实验的印象。

“四练”, 指让学生自己动手做实验, 培养和提高其实验操作能力。

“五创”, 指教师尽量开拓学生的视野, 培养学生举一反三的知识迁移能力和创新精神, 把所学操作知识运用于临床检验工作。

通过学习方法指导, 既要学生学会, 又要学生会学, 在教知识的同时教方法。

5 合理安排实验各环节

(1) 做好实验前准备工作。实验课前一周进行实验分组, 布置学习任务, 让学生通过各种途径, 如利用网络查阅相关资料, 获取ELISA检测“乙肝二对半”的相关知识, 为实验打下良好的理论基础。

(2) 在实验过程中严格小组操作, 发挥“小老师”的监督作用。每个小组选出一位能力较强的组长进行培训, 做“小老师”, 全程负责监督, 从而保证实验顺利进行, 事实证明, 这个方法行之有效。同时, 教师负责巡回, 给予必要的指导和纠正;注意实验原理的分析, 及时了解学生对实验的掌握情况。

(3) 实验结果的判断。让学生自己思考判断, 记住自己的实验结果, 教师检查, 给予必要的指导和纠正, 激发学生的求知欲, 锻炼他们独立分析、解决问题的能力。在实验时要注意学生个人隐私的保密, 注意乙肝防治知识的拓展。

(4) 实验小结。实验结束后, 要及时进行总结, 由一位学生总结本次实验心得, 其他学生补充, 最后教师加以点评, 以加深对本次实验的印象, 锻炼学生的概括、总结能力。

(5) 课后布置作业, 加深印象, 进一步巩固所学知识;同时开放实验室, 让学生到实验室进行操作练习, 巩固操作技能。

6 实验反馈和评价

本实验的目标是让学生学会正确操作、结果判断和分析, 同时训练及提高学生的操作能力, 培养团体合作精神。只要学生得出正确的实验结果, 书写检验报告, 并且课后能独立完成布置的作业, 就达到了本次实验的目的。当然, 要熟练掌握一项实验技能不是一次实验课就能够实现的, 需要不断地巩固和练习。

总之, 在ELISA检测“乙肝二对半”的实验教学中, 学生充分认识到本次实验的重要性, 采用恰当的教学方法, 加强对学生学习方法的指导, 充分发挥学生学习的主动性, 合理安排实验各环节, 使学生更好地掌握操作技能。

参考文献

[1]魏红蕾, 方芳, 刘慧珠, 等.PBL教学法在临床护理教学中的应用[J].解放军护理杂志, 2005, 22 (7) :81~82.

酶联免疫吸附实验检测 篇7

1 资料与方法

1.1 一般资料:

本组选择在2013年7月至2014年7月, 通过临床检查确诊为肿瘤的患者50例, 进行肿瘤标志物进行筛查是阴性, 其中男性28例, 女性22例, 年龄在32~66岁, 平均年龄49岁。肺癌21例, 胃癌14例, 肝癌15例。选取健康的志愿者50名, 其中男性27名, 女性23名, 年龄36~69岁, 平均年龄52.5岁, 经过检查健康状况良好, 经过其同意可以进行接下来的检测。获得的样品均当天采集后进行离心处理。

1.2 双夹心免疫吸附试验步骤

1.2.1 制备过程:

将鼠的抗肝素酶单克隆抗体包被于p H值为9.6的Na2CO3-Na HCO3的缓冲溶液中, 从中取出50μL的液体置于96孔酶标板中, 在4℃条件下放置18 h, 并用p H值为7.4的磷酸缓冲溶液反复冲洗干净, 置于有20 g/LBSA的磷酸盐缓冲液进行96孔酶标板封闭1 h, 随后反复冲洗3~5次后, 处于4℃环境下保存待用。

1.2.2 反应过程:

在96孔酶标板中分别加入200μL的血清样品, 相同血清样品重复做三个, 在室温环境下放置2 h, 随后反复冲洗5次后, 在向其中加入兔的抗肝素酶多克隆抗体100μL, 处于室温环境下放置2 h, 反复冲洗5次。将100μL稀释到20000倍的HRP标记羊抗兔Ig G置于酶标板微孔中, 在室温环境下放置1 h, 最后加入TMB显色底物50μL放置半个小时, 随后用硫酸100μL结束反应进程。在D450 nm及D603 nm条件下应用酶标仪进行检测。

1.2.3 酶联免疫吸附试验方法及其作用原理。

(1) 酶联免疫吸附试验的基本原理:酶和相应的抗体及抗抗体分子进行共价结合, 共价键的结合特点就是不影响及改变抗体的免疫学性质, 对生物学性质也不产生妨碍。被酶标记抗体可以和被吸附在相应载体上的抗原抗体进行连接。在上述溶液中加入底物, 酶可以使底物的没有颜色的还原型的供氢体转变成有颜色的氧化型的状态, 呈现出颜色的变化来反应体系的进程。为此可观察反应体系的颜色变化来判断免疫反应是否发生。在反应体系中, 呈现出的颜色深浅程度和样品中的抗体抗原的量有关, 相应的抗原抗体量多, 反应的颜色就较深。这种颜色深浅的变化可以通过酶联免疫吸附试验的检测仪器来定量测定检测[2]。 (2) 酶联免疫吸附试验, 在免疫技术中应用广泛, 其常用方法有双抗体夹心法及间接法, 双抗体夹心法主要应用于分子量大的抗原检测, 间接法多用于特异性抗体的测定。双抗体夹心法主要分为四个步骤, 首先要进行特异性的抗体和载体想结合, 反复洗涤去除杂质, 然后加入需要检测的样品, 并使之平衡一段时间, 目的是使样品中的抗原和相应的抗体结合上, 同样需要洗涤掉未结合的抗体以及杂质等。第三步需要加入酶标物, 使上述免疫结合物的抗原和酶标物进行连接, 同样进行洗涤的步骤清除杂质。酶量和样品中的要进行检测的物质量有关系。最后将底物反应变成有色的物质, 并根据颜色的深浅程度对进行定量判断[3]。

1.4 统计学处理:

选用SAS统计软件分析处理实验数据, 对每个样品的3个重复实验计算平均值及标准偏差, 对稳定性进行评估。分析健康患者血清D值的状况, 肿瘤患者血清D值的状况, 对两组的血清肝素酶的水平进行对比, 比较其差异水平, 确定此种方法对血清肝素酶的检测对辅助肿瘤的临床价值。

2 结果

对每个样品平行测定三次进行平均值的计算, 并计算微孔间的标准差都<0.019, 且相对标准偏差也要<9.0%, 从统计结果来看检测方法稳定, 可靠。经过数据处理:50名健康志愿者的血清肝素酶的D值呈现正态分布趋势, 其平均值是0.094, 处于95%置信区间内其范围在0.067~0.106。50例肿瘤的患者, 血清肝素酶的D值也呈现正态分布趋势, 平均值是0.178, 处于95%置信区间内其范围在0.152~0.191。经两组数据进行比较, 存在显著性差异, 通过对血清肝素酶D值的检测, 肿瘤患者的D值要比健康志愿者的D值明显增高。

3 讨论

肝素酶和肿瘤的产生及变化有着密切的关系, 尤其肿瘤处于转移阶段的患者体内肝素酶的水平和肿瘤的动态变化息息相关。为此, 对肿瘤患者血清肝素酶的有效检测, 可以辅助肿瘤的诊断, 用于评价其恶化程度。但就目前的研究状况来说, 因为血清中的肝素酶的存在量很低, 而且又存在特异性的免疫性质, 反应性好的抗体价格很高, 限制了此种方法的发展。现在, 在国内及国外市场上并没有相应的检测试剂盒, 相关的研究报道也很少见。因此, 研究一个可以有效的检测血清肝素酶的办法对肝素酶的发展起到很重要的作用[4]。搭建灵敏度高, 重现性好的酶联免疫吸附试验第一个需要解决的问题就是筛选出适合的抗体, 本研究综合考虑了实验准确率及成本的因素, 最终筛选出用鼠抗肝素酶单克隆抗体及兔抗肝素酶多克隆抗体, 并采用双抗体夹心法进行先关研究, 最后得到的结果稳定好, 重现性也较好。和别的检测方法比较, 此种检测方法具有材料选择简便, 操作简单的优点, 而且定量精准, 可以影响定量的因素少, 对于免疫组化及原位PCR等方法, 会因为选取的部位不同, 选取的样品大小不一或是人为的一些因素对检测的结果影响很大, 此两种方法需要在患者的身体上得到肿瘤的样本或是一些癌症组织, 进行这样的处理给患者的身体及心理上造成很大影响, 产生较大负担。采取双抗体夹心法不仅不会给患者带来身体上的伤害及心理上的负担, 还在准确及重现性上体现出自身方法的优点。最重要的是双抗体夹心方法操作简单易学, 可以动手完成也可以用仪器机械化完成, 更有利于肿瘤的筛查。本组对50例肿瘤患者的血清肝素酶水平进行检测, 其水平值显著高于健康志愿者的血清肝素酶水平值, 这一结果和国外对血清肝素酶水平的研究结果趋势相同, 这一结果可以在一定程度上说明可以选择血清肝素酶代替组织肝素酶的检测。

酶联免疫吸附试验是到目前为止使用最广的一项技术, 特异性的将抗原抗体相结合, 并使之酶的催化底物进行有效的结合起来, 检测血清中微量的肝素酶, 在操作的过程中需要对样品进行采集、保存, 准备相应的试剂, 随后进行加样品, 显色比色等步骤, 如果其中一个步骤出现人为的操作问题都会影响结果的准确性。显色这一步骤对酶联免疫吸附的方法得到的结果影响较大。目前来讲, 常用的测定显色物质是四甲基联苯胺及过氧化氢, 在辣根过氧化物酶的作用下, 产生颜色的变化。所以, 目前把研究重点放在肿瘤患者血清肝素酶水平上的研究是十分有意义的, 可以评估患者肿瘤的变化情况, 为临床的诊断提供了很好的参考和有力的依据。

参考文献

[1]田曙光, 虞立霞.酶联免疫吸附试验定量检测血清肝素酶方法的建立及应用[J].生物技术通讯, 2009, 20 (4) :545-546.

[2]王晓秋.酶联免疫吸附试验在蛋白质/多肽类药物药代动力学研究中的应用[J].中国药理学与毒理学杂志, 2013, 27 (3) :534-535.

[3]尹利民.动力学法在酶联免疫吸附试验定量检测中的应用[J].检验医学与临床, 2012, 9 (7) :852-853.

酶联免疫吸附实验检测 篇8

1 资料与方法

1.1 对象

收集郑州大学第一附属医院2013年3月1日-2013年9月30日门诊和住院患者818例, 男182例, 女636例, 年龄在8~80岁, 平均 (42.4±17.3) 岁。按照临床诊断将病例分为SLE组与非SLE组, SLE组360例, 非SLE组458例, 包括类风湿关节炎 (RA) 128例、干燥综合征42例、皮肌炎55例, 显微镜下多血管病41例, 混合结缔组织病27例, 抗磷脂抗体综合征17例, 硬皮病10例, 风湿性多肌病9例, 其他疾病129例。SLE的诊断依据1997年美国风湿病学学会修订的SLE分类标准[2], 非SLE的各类疾病均符合相应的国际分类诊断标准。采集受试者肘静脉血, 离心分离血清, 当日完成检测。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 试剂

抗核小体抗体Ig G试剂盒 (酶联免疫吸附法) 和抗核抗体谱 (Ig G) 试剂盒 (欧盟印迹法) 均为德国EUROIMMUN公司产品。

1.2.2 仪器

芬兰雷勃Multiskan MK3型号酶标仪, XD236自动蛋白印迹仪为上海迅达医疗仪器公司产品。

1.3 方法

1.3.1 ELISA法

采用德国EUROIMMUN公司生产的抗核小体抗体Ig G试剂盒 (酶联免疫吸附法) , 方法及步骤如下:已包被核小体的微孔板中加入1∶201稀释的血清100μL, 室温孵育30 min, 冲洗3次后加入100μL酶结合物, 室温孵育30 min, 冲洗3次后加入100μL底物显色剂, 室温避光孵育10 min后每孔加入100μL终止液, 在30 min内应用酶标仪450 nm比色, 检测A值。结果判定:以20RU/m L作为Cut-off值, 结果<20 RU/m L为阴性, 结果≥20 RU/m L为阳性。

1.3.2 Western blot法

采用德国EUROIMMUN公司生产的抗核抗体谱 (Ig G) 试剂盒 (欧盟印迹法) , 方法及步骤如下:患者样本用样本缓冲液1∶101稀释, 取所需膜条用1.5 m L样本缓冲液预处理5 min, 吸去孵育槽中的液体, 加入1.5 m L已稀释的血清样本, 在摇床上室温孵育30 min, 清洗3次, 每次5 min, 加入1.5 m L稀释的酶结合物室温孵育30 min, 再清洗3次, 每次5 min, 加入1.5 m L底物液室温孵育10min, 用蒸馏水清洗膜条3次, 每次1 min, 取出膜条风干后按照膜条上条带标记位置判读结果, 与非抗原包被区比较, 阳性反应将在相应的抗原处呈现深色条带, 抗原位置出现白色条带判读为阴性。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行分析。ELISA与WB检测Anu A的阳性率比较采用χ2检验, 两种方法诊断SLE的准确度比较采用χ2检验, 敏感性和特异性比较采用ROC曲线分析, 曲线下面积比较采用Z检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ELISA和Western blot两种方法检测结果

ELISA与WB检测818例患者Anu A阳性率分别为35.1% (287/818) 和31.1% (254/818) , 两者差异有统计学意义 (χ2=14.4, P<0.05, 见表1) 。两种方法检测Anu A结果的总一致率为91.3%, 其不一致情况以WB阴性而ELISA阳性多见 (6.4%) 。以SLE的临床诊断为金标准, 360例SLE患者中, ELISA与WB检测Anu A阳性率分别为72.5% (261/360) 和66.1% (238/360) , 两者差异有统计学意义 (χ2=9.13, P<0.05) ;两种方法检测SLE的准确度分别为84.7%和83.1%, 差异无统计学意义 (χ2=0.766, P>0.05) ;ELISA检测Anu A诊断SLE的敏感度为72.5%, 特异度为93.2%, WB检测敏感度为66.1%, 特异度为96.5% (见表2) , 两者ROC曲线下面积分别为0.840和0.813, 差异无统计学意义 (Z=1.23, P>0.05, 见附图) 。

2.3 ELISA和Western blot检测Anu A结果分析

818例患者中, ELISA共检测出287例Anu A阳性, 其中261例为SLE患者, 19例为非SLE自身免疫病患者, 7例为其他疾病患者;WB共检测出254例Anu A阳性, 其中238例为SLE患者, 7例为非SLE自身免疫病患者, 9例为其他疾病患者。

SLE组中, ELISA检测结果<20 RU/m L的99例患者中, 84例 (84.8%) WB检测结果为阴性, 15例 (15.2%) WB检测为弱阳性;ELISA检测结果为 (20~99) RU/m L的83例患者中, 38例 (45.8%) WB检测结果为阴性, 29例 (34.9%) WB检测结果为弱阳性, 16例 (19.3%) WB检测结果为阳性;ELISA检测结果>100 RU/m L的患者中, WB检测结果均为弱阳性和阳性, 以阳性者居多 (148/178, 83.1%) (见表3) 。非SLE组中, ELISA检测结果<20 RU/m L的432例患者中, 仅4例 (0.9%) WB检测结果为弱阳性, 其余428例 (99.1%) 患者WB检测结果均为阴性;ELISA检测结果为20~99 RU/m L的19例患者中, 13例 (68.4%) WB检测结果为阴性, 其余6例 (31.6%) 检测结果为弱阳性;ELISA检测结果>100 RU/m L的7例患者中, 6例 (85.7%) WB检测结果为阳性, 仅有1例 (14.3%) 患者ELISA检测值>200 RU/m L而WB检测结果为阴性。见表4。

3 讨论

系统性红斑狼疮是一种累及多系统、多脏器的自身免疫性疾病, 其特征是患者体内可产生多种针对细胞核结构和组分的自身抗体。Anu A是以核小体为靶抗原而产生的自身抗体, 属于自身抗体的一种。近年来研究显示, Anu A比抗ds DNA抗体和抗组蛋白抗体更早出现于系统性红斑狼疮的早期[3], 特异度较高, 并且Anu A与SLE疾病活动性及狼疮性肾炎 (LN) 的发生明显相关[4,5]。

目前检测Anu A的方法较多, 有化学发光免疫分析 (CLIA) 、WB、ELISA、间接免疫荧光法 (IIF) 、胶体金免疫层析法 (CGCIA) 和酶联免疫斑点法 (ELISPOT) 等。本研究针对以上检测方法, 选择了在临床工作中应用较多的ELISA法和WB法进行比较, 并结合临床诊断对两种方法进行对比分析, 客观评价二者的试验性能。WB用于体外定性检测血清或血浆中的人抗核小体的Ig G类抗体, 操作简便, 适合基层实验室开展。张国庆等[6]人应用免疫印迹法检测Anu A, 显示在SLE中阳性率达72.4%, 敏感度72.4%, 特异度达97.7%。ELISA用于在体外定量或半定量检测人血清或血浆中抗核小体Ig G类抗体。DOSTAL等[7]应用ELISA检测Anu A在SLE中的阳性率为73%, Anu A在SLE患者、狼疮性肾炎患者及神经精神性狼疮患者体内的浓度分别为为76 IU/m L, 139 IU/m L和117 IU/m L, 远高于其他自身免疫病患者及健康对照。SULEIMAN等[8]对90位SLE患者应用ELISA法进行检测, Anu A阳性率 (52.2%) 高于抗ds-DNA抗体阳性率 (36.7%) 。秦莉[9]等对ELISA法检测Anu A进行系统评价, 结果显示Anu A对SLE的诊断平均敏感度为64.9%, 平均特异度为92.6%, 提示其漏诊率高 (34.1%) , 误诊率较低 (7.4%) ;并推荐ELISA法检测Anu A用于SLE诊断, 但也表明该方法不适合用于SLE筛查。胡学芳等[10]人应用ELISA法检测122例SLE患者, 结果显示Anu A阳性率为68.85%, 敏感性为68.85%, 特异性为90.91%, 并且Anu A在SLE合并LN的患者中阳性率为84.48%, 提示Anu A与SLE的肾损害有明显关系。

本研究结果显示, ELISA检测Anu A阳性率 (35.1%) 高于WB (阳性率31.1%) , 两者差异有统计学意义 (P<0.05) , ELISA检测值较高时WB的灰度也较深, ELISA检测值较低时WB的灰度也较浅, 多为弱阳性。ELISA检测结果阳性而WB检测结果阴性时, ELISA检测值多在20~99 RU/m L之间, ELISA检测结果阴性而WB检测结果阳性时, WB检测结果均为弱阳性, 说明两种方法检测Anu A结果的总一致率较高, 符合性较好。

在SLE的诊断方面, 两种方法对SLE诊断的敏感性和特异性比较采用ROC曲线分析。ROC曲线即受试者工作特征曲线, 是反应敏感度和特异度连续变量的综合指标, 其曲线下面积越大, 诊断准确性越高, 可用于两种诊断方法的统计学比较。ELISA与WB诊断SLE的ROC曲线下面积分别为0.840和0.813, 提示两者对SLE的诊断准确性均较高, ELISA略高于WB, 但是两者差异无统计学意义 (P>0.05) 。ELISA检测SLE的敏感度为72.5%, 特异度为93.2%, WB检测SLE的敏感度为66.1%, 特异度为96.5%, 与国内外文献基本相符[6,7,8,9,10]。

因此, ELISA与WB检测Anu A的总一致率高, 对SLE诊断的准确度较高, 敏感度和特异度均较好。目前, 在我国风湿病实验室普遍采用WB进行抗核提取物抗体谱 (ENA) 的检测, 虽然WB与ELISA检测Anu A在SLE诊断中的准确度及ROC曲线下面积差异无统计学意义, 但是ELISA可以定量检测Anu A的浓度, 可以观察血清抗体的变化与临床和实验室指标的相关性, 对疾病的监测和指导更优于WB检测方法, 不过ELISA检测试剂价格高于WB, 在基层实验室的开展也有很大的局限性。因此, 应用WB进行Anu A检测的初筛, 需要时应用ELISA进行复检, 可以提高6.4%的Anu A检测阳性率, 为临床提供更好的SLE诊断及疾病活动度的信息。

摘要：目的 比较酶联免疫吸附法 (ELISA) 和免疫印迹法 (WB) 检测抗核小体抗体 (Anu A) 的差异, 为临床工作寻找合适的检测方法。方法 收集818例临床血标本, 其中系统性红斑狼疮 (SLE) 360例, 其他自身免疫性疾病458例, 同时采用ELISA和WB两种方法检测样本血清中Anu A, 计算每种方法的敏感度、特异度、ROC曲线, 并运用SPSS 17.0进行统计学分析。结果 ELISA与WB检测Anu A的阳性率分别为35.1%和31.1%, 两者差异有统计学意义 (P<0.05) 。准确度、敏感度和特异度无差异。结论 ELISA与WB检测Anu A的总一致率高, 对SLE诊断的准确度较高, 敏感度和特异度均较好。提示临床监测时, 可应用WB进行Anu A检测的初筛, 需要时应用ELISA进行复检, 可以提高6.4%的Anu A检测阳性率, 为临床提供更好的SLE诊断及疾病活动度的信息。

关键词：酶联免疫吸附法,免疫印迹法,抗核小体抗体

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