酶联免疫吸附试验方法

酶联免疫吸附试验方法（精选7篇）

酶联免疫吸附试验方法 篇1

临床免疫室开展的乙肝系列、丙肝抗体、艾滋病抗体、梅毒特异性检测等日常检测工作, 最为常用的检测方法为酶联免疫吸附试验。该试验用已知抗原检测未知抗体, 或用已知抗体检测未知抗原, 虽然操作简便, 但影响因素诸多, 一个环节出现问题, 都可能会导致检测的失败。现将酶联免疫吸附试验常见影响因素及处理方法总结如下。

1 试剂因素

1.1 试剂的选择

试剂的选择是保证血液检测质量的关键因素, 要选购知名度高, 质量有保证, 具有“三证”的试剂, 最好选用配套试剂。也可以和同行交流, 其他实验室对某种试剂盒的实际使用效果, 往往具有很强的说服力, 因此应使用检测口碑好的试剂 (可通过室间质评组织获得[1]) 。不使用过期试剂, 不同批号试剂不能混用, 同批号试剂盒的组分也不可混用。

1.2 试剂的储存运输。

1.2.1 试剂的储存至关重要, 试剂一到科室, 即应立即放入冷藏冰箱, 必须注意不得靠近冰箱后壁, 以防试剂冻结, 影响检测结果。

1.2.2 试剂供应商必须保障试剂在进入科室前运输储存的质量, 试剂盒从出厂到用户手中, 均要历经运输 (如送检、检定、发货等) 及运输中的储存环节, 某一环节不当, 均影响试剂盒的临床使用质量。去年我科有一段时间所做的表面抗原项目, 今天阳性, 同一份标本明天复检有可能是弱阳性甚至阴性, 查找原因可能是这批试剂在进入科室前储存温度出现了问题, 与试剂商联系更换新的批号试剂后, 此现象消失。

1.3 试剂的准备

在临床实验室, 试剂的准备一般不太注意, 工作人员通常在试验时将试剂从冰箱中拿出来就用, 其直接后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此酶联免疫吸附试验中, 试剂准备最关键的是使试剂盒在使用前与室温平衡, 以满足检测要求, 一般检测前30 min即应将试剂盒从冰箱中取出, 检测时试剂盒可与室温平衡。

2 标本因素

标本因素包括标本溶血、被污染、标本保存时间过长和标本凝固不全等。

2.1 标本溶血

血红蛋白中含铁血红素有类过氧化物酶活性, 因此以辣根过氧化物酶为标记的酶联免疫吸附试验测定中, 如血清中血红蛋白浓度较高, 很容易在温育过程中吸附于固相, 从而与后面加入的辣根过氧化物酶反应显色, 造成假阳性。因此在采血过程中应注意, 采集血液标本时应缓慢抽动, 注射器插入生化管应让血液自动靠负压注入生化管, 不能用手推注射器栓塞, 以防标本溶血。处理方法:若轻微溶血影响还不大, 若为中度或重度溶血, 则必须与临床联系, 重新抽取标本, 并讲清楚正确采集血标本的重要性。并由有关部门定期培训临床护士怎样正确采集血液标本。

2.2 标本被污染

菌体可能含有内源性过氧化物酶, 可出现非特异性显色, 因此宜用新鲜标本, 如有特殊情况, 应冰箱保存或冰冻保存, 并应加盖保存。阳性结果应重抽血双孔复检。

2.3 标本的保存

标本在冰箱中保存时间过长, 可能造成污染或效价降低, 可引起假阴性, 因此应尽量用新鲜标本。冰冻标本应避免反复冻融, 因冰冻标本的反复冻融产生的机械力对标本中的蛋白分子有破坏作用, 可引起假阴性[2]。

2.4 标本凝固不全

标本凝固不全的血清中有部分纤维蛋白原, 影响结果。有的工作人员着急赶时间, 刚采集的标本就离心 (虽然现在都采用促凝生化管) , 结果刚离心完血清还可以, 但是在洗涤时, 此孔血清呈果冻状, 显然反应不完全。处理方法:标本采集后在37℃水浴30 min后再离心, 以3500转/min离心5 min可获得满意标本[3]。

3 操作因素

3.1 加样

孵育前加样时间过长, 漏加样本, 酶试剂加入孔外, 用滴瓶滴加试剂时加量不准等都可使试验结果不可靠。处理方法: (1) 标本过多时, 可分批操作, 标本要轻拿轻放, 防止标本溅出交叉感染; (2) 加完样品封板前要仔细观察反应板, 看是否有样品漏加, 以便及时发现; (3) 加酶试剂后可用吸水纸吸干孔外试剂; (4) 使用滴瓶加试剂时, 应垂直滴加, 匀速滴加, 以免速度过快有的孔中多加1滴试剂, 建议采用微量加样器加试验中的所有组分; (5) 加样器应定期校准, 消毒, 吸头要一次性使用, 以免交叉污染。

3.2 温育

温育是最为关键、最容易出现问题的步骤;温育的时间、温度选择一般按照试剂盒说明进行, 加完样本和试剂后微孔板放入水浴箱或温箱中, 孔内温度从室温升至摄氏37℃需一定时间, 若一放入就计时, 就容易造成孵育时间不够, 易致弱阳性标本检测不出。处理方法: (1) 可采用适当延长几分钟时间 (大约2 min) ; (2) 可把反应板封板后直接放入37℃水浴箱水中; (3) 用37℃孵育箱将是不错的选择。

3.3 洗板

3.3.1 洗涤液的配制, 按照说明书要求1∶20稀释, 看似很简单, 但必须注意一些细节问题: (1) 注意洗涤液是否有结晶析出, 冬天洗涤液易结晶, 如不注意很容易堵塞洗板机管路。处理方法:事先将洗涤液置37℃水温箱中预温一会再行配制就可解决。 (2) 要注意去离子水的pH值。处理方法:用0.1nNaOH调节pH值至7左右。

3.3.2 洗板有两种, 即手工洗板和洗板机洗板。采取手工洗板, 孔与孔之间液体易交叉;采取洗板机洗板时, 洗液量不足导致洗板不彻底, 针孔堵塞导致抽吸不完全, 清洗效果差。处理方法: (1) 手工洗板时, 孔内洗液不能溢出, 拍板时要垂直, 但用力不能过猛, 防止抗原抗体复合物脱落; (2) 用洗板机洗板, 洗涤液要新鲜配制, 洗板机要经常检查冲洗头是否畅通, 洗涤液瓶应定期彻底清洗, 要定期检查整个管路, 疏通管路, 若针头被堵塞, 可用注射器排除; (3) 我科采用机洗5遍人工加洗1遍, 效果较好; (4) 洗板时, 吸水纸不可重复使用; (5) 洗完板时, 应充分扣干反应孔, 可用吸水纸包住反应板扣干。

3.4 显色

要严格按照说明书进行, 充分显色到预定时间后加入终止液。

3.5 测定

加入终止液后用酶标仪检测, 酶标仪需预热15 min~30 min, 因反应板加入A、B显色剂后在37℃放置30 min, 反应板底部会有水雾, 检测时可出现假阳性, 上机前一定要在吸水纸上吸干。

在以上的操作过程中, 要保持试验的连续性, 有的工作人员在洗完板时, 因故未能及时加A、B显色液, 会对测定结果造成影响, 因此要注意试验的连续性, 这一点至关重要。

综上所述, 尽管酶联免疫吸附试验测定操作简单, 但影响测定结果的因素较多, 所以工作人员要加强责任心, 在操作过程中不能有一点疏忽, 要严格按照试剂盒说明书操作, 尽量避免或减少影响因素, 保证检验质量。

参考文献

[1]马斌国.现代临床检验质量保证[M].太原:山西科学出版社, 2001:6.

[2]李会英.酶联免疫吸附试验影响因素的分析[J].检验医学与临床, 2007, 4 (10) :985-986.

[3]程玉萍.标本收集对酶联免疫吸附试验检测结果的影响因素[J].山西医药杂志, 2004, 33 (5) :412.

酶联免疫吸附试验方法 篇2

1 资料与方法

1.1 一般资料:

本组选择在2013年7月至2014年7月, 通过临床检查确诊为肿瘤的患者50例, 进行肿瘤标志物进行筛查是阴性, 其中男性28例, 女性22例, 年龄在32~66岁, 平均年龄49岁。肺癌21例, 胃癌14例, 肝癌15例。选取健康的志愿者50名, 其中男性27名, 女性23名, 年龄36~69岁, 平均年龄52.5岁, 经过检查健康状况良好, 经过其同意可以进行接下来的检测。获得的样品均当天采集后进行离心处理。

1.2 双夹心免疫吸附试验步骤

1.2.1 制备过程:

将鼠的抗肝素酶单克隆抗体包被于p H值为9.6的Na2CO3-Na HCO3的缓冲溶液中, 从中取出50μL的液体置于96孔酶标板中, 在4℃条件下放置18 h, 并用p H值为7.4的磷酸缓冲溶液反复冲洗干净, 置于有20 g/LBSA的磷酸盐缓冲液进行96孔酶标板封闭1 h, 随后反复冲洗3~5次后, 处于4℃环境下保存待用。

1.2.2 反应过程:

在96孔酶标板中分别加入200μL的血清样品, 相同血清样品重复做三个, 在室温环境下放置2 h, 随后反复冲洗5次后, 在向其中加入兔的抗肝素酶多克隆抗体100μL, 处于室温环境下放置2 h, 反复冲洗5次。将100μL稀释到20000倍的HRP标记羊抗兔Ig G置于酶标板微孔中, 在室温环境下放置1 h, 最后加入TMB显色底物50μL放置半个小时, 随后用硫酸100μL结束反应进程。在D450 nm及D603 nm条件下应用酶标仪进行检测。

1.2.3 酶联免疫吸附试验方法及其作用原理。

(1) 酶联免疫吸附试验的基本原理:酶和相应的抗体及抗抗体分子进行共价结合, 共价键的结合特点就是不影响及改变抗体的免疫学性质, 对生物学性质也不产生妨碍。被酶标记抗体可以和被吸附在相应载体上的抗原抗体进行连接。在上述溶液中加入底物, 酶可以使底物的没有颜色的还原型的供氢体转变成有颜色的氧化型的状态, 呈现出颜色的变化来反应体系的进程。为此可观察反应体系的颜色变化来判断免疫反应是否发生。在反应体系中, 呈现出的颜色深浅程度和样品中的抗体抗原的量有关, 相应的抗原抗体量多, 反应的颜色就较深。这种颜色深浅的变化可以通过酶联免疫吸附试验的检测仪器来定量测定检测[2]。 (2) 酶联免疫吸附试验, 在免疫技术中应用广泛, 其常用方法有双抗体夹心法及间接法, 双抗体夹心法主要应用于分子量大的抗原检测, 间接法多用于特异性抗体的测定。双抗体夹心法主要分为四个步骤, 首先要进行特异性的抗体和载体想结合, 反复洗涤去除杂质, 然后加入需要检测的样品, 并使之平衡一段时间, 目的是使样品中的抗原和相应的抗体结合上, 同样需要洗涤掉未结合的抗体以及杂质等。第三步需要加入酶标物, 使上述免疫结合物的抗原和酶标物进行连接, 同样进行洗涤的步骤清除杂质。酶量和样品中的要进行检测的物质量有关系。最后将底物反应变成有色的物质, 并根据颜色的深浅程度对进行定量判断[3]。

1.4 统计学处理:

选用SAS统计软件分析处理实验数据, 对每个样品的3个重复实验计算平均值及标准偏差, 对稳定性进行评估。分析健康患者血清D值的状况, 肿瘤患者血清D值的状况, 对两组的血清肝素酶的水平进行对比, 比较其差异水平, 确定此种方法对血清肝素酶的检测对辅助肿瘤的临床价值。

2 结果

对每个样品平行测定三次进行平均值的计算, 并计算微孔间的标准差都<0.019, 且相对标准偏差也要<9.0%, 从统计结果来看检测方法稳定, 可靠。经过数据处理:50名健康志愿者的血清肝素酶的D值呈现正态分布趋势, 其平均值是0.094, 处于95%置信区间内其范围在0.067~0.106。50例肿瘤的患者, 血清肝素酶的D值也呈现正态分布趋势, 平均值是0.178, 处于95%置信区间内其范围在0.152~0.191。经两组数据进行比较, 存在显著性差异, 通过对血清肝素酶D值的检测, 肿瘤患者的D值要比健康志愿者的D值明显增高。

3 讨论

肝素酶和肿瘤的产生及变化有着密切的关系, 尤其肿瘤处于转移阶段的患者体内肝素酶的水平和肿瘤的动态变化息息相关。为此, 对肿瘤患者血清肝素酶的有效检测, 可以辅助肿瘤的诊断, 用于评价其恶化程度。但就目前的研究状况来说, 因为血清中的肝素酶的存在量很低, 而且又存在特异性的免疫性质, 反应性好的抗体价格很高, 限制了此种方法的发展。现在, 在国内及国外市场上并没有相应的检测试剂盒, 相关的研究报道也很少见。因此, 研究一个可以有效的检测血清肝素酶的办法对肝素酶的发展起到很重要的作用[4]。搭建灵敏度高, 重现性好的酶联免疫吸附试验第一个需要解决的问题就是筛选出适合的抗体, 本研究综合考虑了实验准确率及成本的因素, 最终筛选出用鼠抗肝素酶单克隆抗体及兔抗肝素酶多克隆抗体, 并采用双抗体夹心法进行先关研究, 最后得到的结果稳定好, 重现性也较好。和别的检测方法比较, 此种检测方法具有材料选择简便, 操作简单的优点, 而且定量精准, 可以影响定量的因素少, 对于免疫组化及原位PCR等方法, 会因为选取的部位不同, 选取的样品大小不一或是人为的一些因素对检测的结果影响很大, 此两种方法需要在患者的身体上得到肿瘤的样本或是一些癌症组织, 进行这样的处理给患者的身体及心理上造成很大影响, 产生较大负担。采取双抗体夹心法不仅不会给患者带来身体上的伤害及心理上的负担, 还在准确及重现性上体现出自身方法的优点。最重要的是双抗体夹心方法操作简单易学, 可以动手完成也可以用仪器机械化完成, 更有利于肿瘤的筛查。本组对50例肿瘤患者的血清肝素酶水平进行检测, 其水平值显著高于健康志愿者的血清肝素酶水平值, 这一结果和国外对血清肝素酶水平的研究结果趋势相同, 这一结果可以在一定程度上说明可以选择血清肝素酶代替组织肝素酶的检测。

酶联免疫吸附试验是到目前为止使用最广的一项技术, 特异性的将抗原抗体相结合, 并使之酶的催化底物进行有效的结合起来, 检测血清中微量的肝素酶, 在操作的过程中需要对样品进行采集、保存, 准备相应的试剂, 随后进行加样品, 显色比色等步骤, 如果其中一个步骤出现人为的操作问题都会影响结果的准确性。显色这一步骤对酶联免疫吸附的方法得到的结果影响较大。目前来讲, 常用的测定显色物质是四甲基联苯胺及过氧化氢, 在辣根过氧化物酶的作用下, 产生颜色的变化。所以, 目前把研究重点放在肿瘤患者血清肝素酶水平上的研究是十分有意义的, 可以评估患者肿瘤的变化情况, 为临床的诊断提供了很好的参考和有力的依据。

参考文献

[1]田曙光, 虞立霞.酶联免疫吸附试验定量检测血清肝素酶方法的建立及应用[J].生物技术通讯, 2009, 20 (4) :545-546.

[2]王晓秋.酶联免疫吸附试验在蛋白质/多肽类药物药代动力学研究中的应用[J].中国药理学与毒理学杂志, 2013, 27 (3) :534-535.

[3]尹利民.动力学法在酶联免疫吸附试验定量检测中的应用[J].检验医学与临床, 2012, 9 (7) :852-853.

酶联免疫吸附试验方法 篇3

为达成我校以学生的发展为本,提高学生的就业竞争能力、升学竞争能力和可持续发展能力的办学目标,免疫检验课程通过制订专业课教学与临床岗位零距离对接的教学目标,实施学生自主学习—教师点拨辅导的实验教学模式。按照免疫检验临床实际的工作流程和质量管理,我们对ELISA检测乙肝两对半进行相应教学设计,将理论知识和技术应用能力的训练渗透到实验教学过程中,便于学生牢固地掌握理论知识,让学生学有所得、学有所思、学有所用,以下谈谈笔者的教学体会。

1采用的教法、学法

以往的理论授课采用传统的讲授法,由于受到课堂规则、心理环境、激励机制等因素的影响,教师在课堂讲授过程中存在许多不尽如人意的地方。如ELISA检测乙肝两对半涉及双抗体夹心法、双抗原夹心法、竞争法原理,内容上有严谨的系统性和组织性,授课中若只是简单地将知识点堆积,没有讲清知识之间的内在联系,会在一定程度上影响课堂教学的实际效果。在实验教学中,实验材料的准备、仪器的准备及调试、标本及试剂的处理等工作基本上是由指导教师包办,实验的许多中间环节学生没有亲自参与,因而在教学任务完成后,部分学生对实验的原理、操作还是一知半解,更谈不上能力的锻炼和培养。我们根据学生的学习特点和认知规律,通过优化教学内容,注重理论联系实际,在教法上采用任务驱动法、直观教学法、讨论教学法及实验教学法等,激发学生进一步探究问题、积极参与教学活动的欲望。

实验过程中注重培养学生的职业能力,提高学生分析问题、解决问题的能力,因而采用自主学习法、合作探究法、分析讨论法等。如在教学准备环节,将学生分组(5人/组),指定各组组长,布置以下学习任务:(1)乙肝两对半包括哪些项目?(2)常见的乙肝两对半检测结果是哪些?有何临床意义?(3)应用了ELISA的什么原理?(4)接触血液、分离血清标本需实施哪些安全保护措施?(5)实验用品的准备和注意事项有哪些?

2使用多媒体信息技术手段辅助教学

2.1登录网站搜集资料,建立QQ、微信讨论组

乙肝两对半检测与实际生活联系较为密切,学生对于乙肝病毒的传染性、病毒携带者、“大三阳”等知识有所了解,但学生对乙肝病毒采用的检测方法及原理、临床意义缺乏认识。教学设计中,我们注重理论联系实际,让学生感到所思考的问题是熟悉的、常见的,同时又是新奇的、富有挑战性的,激发学生探究问题、寻找答案的欲望。教师布置学习任务后,学生通过查阅书籍、登录网站搜集资料,并结合自己或家人曾经到医院检验科化验检查的结果来获取乙肝两对半检测的相关知识。通过QQ、微信的形式建立讨论组,针对ELISA检测乙肝两对半的相关知识进行讨论,分享学习经验,教师及时跟进、指导,在讨论组实现师生、生生讨论。

2.2 Flash动画及图片的应用

ELISA检测乙肝两对半涉及双抗体夹心法、双抗原夹心法、竞争法原理,抽象难懂,通过Flash动画、图片演示,把实验原理直观形象地展示出来,可以增强教学内容的可读性和可接受性,解决内容单调乏味、难以接受的问题。教师针对重要知识点提问,由此突破教学重点、难点,可达到预期的教学效果。

2.3教学录像、视频的应用

教学过程中,以学生的学为中心,以符合学生的认知规律为前提,为使学生对操作步骤有感性认识,我们设计、制作适合于教学对象的教学录像、视频,使得操作更为直观[2],促使学生对原有知识进行回顾和巩固,培养学生的思维能力、记忆力、主动学习能力。如通过视频导入教学,视频内容为某患者出现了肝炎的临床症状,血清乙肝两对半检测结果为HBs Ag(+);HBe Ag(-);抗-HBs(-);抗-HBe(-);抗-HBc(-),提出问题:(1)乙肝两对半常用何种方法检测;(2)患者的检测结果如何分析?有何意义?从一开始上课就牢牢地吸引学生的注意力,加深学生对乙肝两对半检测意义的理解。

此外,我们自制了乙肝两对半检测的教学录像、洗板机及酶标仪的编程录像。教师针对性地对实验环节如操作步骤、结果观察、注意事项进行重点讲解,激发学生参与实验活动的热情,增强学生做好实验的自信心。

2.4计算机交互平台的应用

为了检验学生对ELISA检测乙肝两对半的理论掌握程度、提高学生的实验技能、完善学生免疫检验课程成绩评价体系,我们对学生进行实验考核,采取以考促学的手段,加大ELISA检测乙肝两对半的训练力度,包括理论考核(30分)和操作考核(70分)。

理论考核采用本教研室的计算机交互平台进行,根据教学内容的特点,理论考核我们进行这样的设计:首先收集乙肝两对半检测相关试题共25题,内容涉及实验原理、操作、材料、结果观察及临床意义。如:(1)乙肝两对半检测涉及ELISA的哪些原理?分别检测什么项目?(2)通过各反应孔显色,如何判断疫苗接种者、病毒携带者、“大三阳”、“小三阳”?(3)手工洗涤有何要求?(4)加终止液的目的是什么?(5)ELISA常用的酶是哪种?其底物是什么?考虑到学生对理论考核容易产生畏难情绪,在题型上设有填充题、标示题、连线题及填空题等,内容直观、清晰,以PPT形式组卷,使学生“寓考于乐”,轻松愉快地完成理论考核。从试题库集中抽题组卷,考核内容及题型见表1,共组10套试卷。学生抽签后通过计算机交互平台进行考试,本教研室的计算机交互平台可实现全班学生同时测试及无纸化考试。

2.5开放式微生物教学系统的应用

ELISA检测乙肝两对半在内容上与医学微生物学、生物化学密切相关。开放式微生物教学系统操作简单、直观,同时具有良好的交互界面、动态效果,能够从视觉上、听觉上吸引学生的注意力,为学生提供自主学习的平台,扩充相关学习内容。学生在课后可进入开放式微生物教学系统,通过观看视频,针对乙肝病毒的内容进行学习。该教学系统能帮助学生复习、巩固相关知识,并能重复学习。

3督导实验,及时进行总结

乙肝两对半共有5个检测项目,目前多采用商品化的ELISA试剂盒,需用到5种试剂盒,各个项目的操作步骤不同,实验中若不细心就容易出错。在学生操作过程中,教师巡视指导,督导每位学生的操作。此外,每个小组由小组长协助监督,及时发现错误并纠正,以免影响结果。

由于学生用的是自体标本,实验态度与参与积极性明显提高,且操作认真。实验结束后,学生很急切地想要知道自己的检测方法对不对,结果与预计的是否符合。在教师的组织下,学生对整个实验进行分析及总结,可加深对乙肝和ELISA检测法的认知。如本次课学会了什么?有何体会?总结成功的经验、失败的经验、容易出错的环节等。每组学生对实验过程和实验结果进行整理和综合分析,每名学生完成一份实验报告。通过总结,进一步加深学生对乙肝两对半检测相关知识的理解,加深对免疫学检验专业技能的认知。

4重视人文关怀,拓展知识,做好防治

我国人群中乙肝病毒感染率为10%,医学生是未来的医务人员,是高危人群,医院内污染的器械、血标本及各种不规范操作均可引起感染。ELISA检测乙肝两对半所用的标本为学生自体血清标本,实验结果显示,绝大多数学生为健康人,乙肝两对半5项全阴性的学生要求在实习前完成乙肝疫苗的全程接种,通过接种疫苗关爱自己,保护他人[3]。对乙肝病毒感染的可疑标本,由指导教师复查,以确定是否具有传染性,以便让学生及时到专科诊治,对感染了乙肝病毒的学生,教师要保护学生的隐私,指导学生以正确的态度去面对,不要产生心理负担,同时要重视乙肝的防治。

通过观看乙肝宣传片,完成乙肝手抄报作业,加深学生对乙肝流行情况、临床表现、临床类型、检测方法及防治原则的认知,积累自我保护经验。在集体生活环境中注意个人卫生,不用他人的生活用品,养成良好的卫生习惯[4]。在实际工作中,树立防范意识,在微生物检验、生物化学检验、临床检验等专业课程开设的实验中正确处理血标本、血污染物品,规范操作,避免意外感染的发生。

5制订切实可行的评价标准

结合本课题的教学目标、教学内容和学生的学习环境以及学生个体差异等制订切实可行的评价标准。设计了教师评价、小组评价及个人评价,从各个角度对本课题的实施情况进行评价。以2014级86位学生为例,评价结果见表2。通过评价,有助于学生反思和调控自己的学习过程,让每名学生都能体验到成功的乐趣,非常有利于学生更好地认识自我,树立自信。

免疫学检验课程实践性强,理论内容抽象不易学习。实验前,学生对ELISA夹心法、竞争法等概念及原理存在模糊、混淆的情况。教师应在ELISA检测乙肝两对半的理论和实验教学过程中强调理论联系实际,对教学内容、教学环节进行精心设计,使学生很快掌握该实验的原理、操作、结果判断及分析,对乙肝的传播途径、致病性、防治方法及免疫有一定的认知,使专业技能得到进一步提高,为实习及将来的工作打好基础。

摘要：为达成我校以学生的发展为本,提高学生的就业竞争能力、升学竞争能力和可持续发展能力的办学目标,免疫学检验课程制订专业课教学与临床岗位零距离对接的教学目标。结合酶联免疫吸附试验检测乙肝两对半的理论及实验教学谈谈教学体会。

关键词：酶联免疫吸附试验,乙肝两对半,免疫学检验

参考文献

[1]田兆菊.综合性实验在临床免疫学检验实验教学中的应用及体会[J].国际检验医学杂志,2014,35(2):250-251.

[2]石云.多媒体教学在临床免疫学及检验实验教学中的应用[J].中国实验诊断学,2011,15(2):1379-1380.

[3]邓青.乙肝疫苗免疫效果评价[J].中国卫生统计,2010,27(4):388-389.

酶联免疫吸附试验方法 篇4

1 材料与方法

1.1 样本与试剂

北京康彻思坦生物技术有限公司HbsAg标准品 (标准值:2ng/ml) , 批号GBW (E) 090072;珠海丽珠试剂股份有限公司生产的ELISA试剂盒。

1.2 仪器

MR-96A酶标仪, 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司;移液器 (50μl) , 大龙医疗设备 (上海) 有限公司。

1.3 方法

以试剂盒说明书为参照, 基本流程为, 移液器加入血清和酶标抗体, 37℃孵育30min后洗涤, 然后加入显色剂A、B液, 37℃孵育15min, 然后加终止液, 最后酶标仪比色。HbsAg的不确定度包含测量重复性、操作过程以及酶标仪比色的不确定度。

1.4 数学模型

通过标准系列的OD值测定, 建立标准线性曲线, 数学模型为:y=x, (x—被测样本的浓度, 单位为ng/ml;y—被测样本的浓度, 单位为ng/ml) 。

2 结果

2.1 不确定度的计算

2.1.1 输入量的标准不确定度的分析与计算

由于工作曲线非线性引起的输入量x的标准不确定度分项u1。分别对质控血清中的HBsAg标准系列进行5次重复测定, 其吸光度/值测量数据见表1。

根据测量数据用线性回归法得标准工作曲线:Y=0.012+0.244x, 相关系数为r=0.999 6。

对于拟合的标准工作曲线非线性引起的不确定度u1=Sy/[∑ (xi-x) ]1/2=4.73×10-3v1=4。

测定未知样本浓度时重复性引起输入量X的标准不确定度分项u2, 测定5次结果分别为0.672、0.668、0.675、0.670、0.675。

实验标准差s通常可采用贝塞尔法计算:u2=S/n1/2=1.38×10-3v2=4。

2.1.2

由酶标仪测定OD值引起的不确定度为u3。u3由市质量技术监督局检定酶标仪并提供不确定度0.005, 自由度v3=47。

2.1.3

移液器实验过程中造成的不确定度u4, 移液器检定证书提供的数据, 加样量为50ul的误差为0.004。u4=0.004/31/2=2.31×10-3v4→∞。

2.2 合成标准不确定度

由于u1、u2、u3、u4各自独立, 因此u= (u12+u22+u32+u42) 1/2=7.39×10-3

有效自由度veff=21.40≈21。

2.3 扩展不确定度

Up=kp×up=95%kp=t95 (21) =2.080U95=2.080×0.007 39=0.015。

3 结论

综上所述, 实验中的HBsAg不确定度由直线回归曲线的标准差、酶标仪的不确定度、测量值的标准偏差、移液器的不确定度组成, 其它的因素可忽略不计。

结果得出该未知血清的HBsAg浓度为0.672ng/ml, 扩展不确定度U95=0.015ng/ml (自由度为21) 。

参考文献

酶联免疫吸附试验方法 篇5

猪由于吞食生活泔水、吃死老鼠、吃人的粪便、吃某些昆虫等引起感染囊虫、旋毛虫病。猪患囊虫病时表现为营养不良, 生长发育受阻, 贫血, 水肿等, 如囊尾蚴侵害肺及喉时则出现呼吸困难, 声音嘶哑, 吞咽困难, 寄生在眼内可使视觉障碍甚至失明;寄生在大脑时, 出现癫痫, 急性脑炎, 甚至突然死亡, 影响了养猪业生产的健康发展。

近年来我国也经常发生人感染旋毛虫病。人感染主要是摄食了生的或未熟透的含有虫体包囊的猪肉, 或是食入被幼虫污染的食品, 可引起多种病症, 严重的导致死亡, 对人体健康带来了威胁。如1986年12月河南平顶山发生人体旋毛虫病流行, 仅1987年3月就发病103例。1995年1月6日广西德保县一村庄发生一起旋毛虫病流行, 发病53人, 死亡4人, 给人体健康造成危害。因此猪囊虫、旋毛虫的检验被列入肉品卫生检验的重要检验项目之一。

猪囊虫主要寄生部位为咬肌、腰肌、肩胛外侧肌等。旋毛虫主要寄生部位为膈肌。传统检验方法是宰后剖检猪胴体的咬肌、腰肌、肩胛外侧肌检验猪囊虫;采膈肌角压片镜检旋毛虫, 对检出病猪胴体进行无害化处理 (高温炼油) , 造成了很大的经济损失, 同时检验费时费事, 准确率低, 容易造成误检、漏检。我们与兰州兽医研究所寄生虫病防治专家联系提出采用酶联免疫吸附试验活体检验猪囊虫、旋毛虫。

1 试验方法

宰前采用酶联免疫吸附试验, 宰后采用剖检、压片镜检。

2 酶联免疫吸附试验原理

酶联吸附试验是根据被本病感染的血清中的抗体能特异性地吸附到经抗原致敏的聚苯乙烯板上, 再与酶标抗体结合, 加入底物后, 呈现颜色反应, 根据颜色的深浅作出判定。该试验操作简便、敏感性高, 是目前国内较先进的检验方法, 属农业部推广的检测方法。

3 试验数量

根据《动物疫病检测方法》检测范围, 对猪囊虫散发区2%屠宰猪进行病原学调查, 检测猪囊虫生猪560头份, 旋毛虫560头份, 共计1120头份。

4 试验器械、试剂准备

4.1 器械

聚苯乙烯板 (20孔或40孔) 定量加样器 (0.1mL) 及其吸嘴、酶标检测仪、普通滤纸条、微量注射器、电冰箱

4.2 试剂

抗原, 阴、阳性血清, 酶标抗体 (均有兰州兽医研究所提供) 。

包被液:碳酸钠缓冲液pH9.5~9.6

稀释液:磷酸盐缓冲液pH7.4

底物液:磷酸柠檬酸缓冲液pH5.0

终止液:2MH2SO4液

5 试验方法、步骤

5.1 采血对待宰生猪进行编号, 静脉采血2mL, 静止, 血凝后取出血清, 待检。血清样与生猪编号一致。

5.2 包被

取40孔聚苯乙烯反应板, 每次每孔注0.1mL包被液, 静置2min, 重复3次, 甩干后加诊断抗原0.1mL, 50℃恒温水浴1h, 置4℃冰箱过夜。

5.3 加被检血样

每孔加0.1mL被检血样, 每头份只加1孔, 按照血清样本编号依次加入, 每块反应板留下1孔加阳性对照血清, 1孔加阴性对照血清, 1孔空白, 室温下放置4~8min。

5.4 加酶标抗体, 弃去被样血样及阳性和阴性对照血样,

加稀释液洗涤3次, 甩干后加酶标抗体, 每孔0.1mL, 室温置4min。

5.5 加终止液, 底物显色时, 每孔加1滴终止液。

6 结果判定

6.1 眼观判定有色, 阳性;无色, 阴性。

6.2 酶标仪读数

将反应板放置在酶标仪中先对空白孔和阴性对照孔进行读数, 然后逐孔依次进行读数, 凡试验样本血清OD值高于阴性血清OD值2倍以上者, 判为阳性。

7 试验分析

按照国家农业部《动物疫病监测方法》对本地待宰生猪按10%抽样, 共对560头生猪进行宰前采血, 应用酶联免疫吸附试验检测猪囊虫, 宰后剖检咬肌、腰肌、肩胛外侧肌与酶标检测结果进行对照。560头生猪宰前采血应用酶联免疫吸附试验检测旋毛虫, 宰后采集隔肌角压片检验, 宰前与宰后检验结果进行对照。通过试验宰前采血应用酶标检测猪囊虫、旋毛虫结果与宰后检验结果完全一致。检出猪囊虫阳性生猪3头, 占检验总数的0.6%。旋毛虫全部为阴性。酶联免疫吸附试验主要是在宰前活体采血检测, 能够作到及早发现病猪, 及早治疗, 减少发病率, 同时一方面避免了宰后检出患病生猪销毁造成的经济损失。一方面避免了宰后误检, 漏检, 杜绝了病害肉上市。

8 试验结论

通过此方法对活体猪快速、准确的监测, 即时发现、即时治愈, 可以降低本地区猪囊虫、旋毛虫的发病率, 减少感染, 保护人体健康, 促进畜牧业健康发展。

9 猪囊虫病的治疗推荐用药

⑴吡喹酮100mg/kg.bw加适量面粉和水调成丸剂口服;间隔7d重复给药1次。⑵丙硫咪唑80mg/kg.bw, 分3~4次拌入饲料中喂服。

摘要：猪囊虫、旋毛虫病严重威胁着人体健康, 传统的检验方法是屠宰后剖检、压片镜检, 检出病猪销毁处理, 造成了很大积极损失。应用酶联免疫吸附试验活体检验猪囊虫、旋毛虫病, 对病猪进行有效治疗, 减少经济损失。

酶联免疫吸附试验方法 篇6

1 材料和方法

1.1 标本来源

采集2005年10月～2008年10月本市中心血站无偿献血者血液标本48463例，使用肝素钠抗凝，经3000r/min离心15min，取血浆作为检测标本。

1.2 仪器和试剂

LABSYSTEN DENLEY DRAGON型酶标仪，BIO-CELLAW洗板机，新刨公司提供的HIV抗体检测试剂盒，GENELAB提供的WB试剂盒。

1.3 检测方法

一步法检测严格按试剂盒说明书进行。瓶步法检测是用一步法试剂分两步进行，第一步加标本血清后，37℃温浴30min，洗板后加酶标抗原，再37℃温浴30 min洗板，然后加底物显色。检测阳性者复查后仍然阳性即为抗-HIV抗体初筛阳性；初筛阳性标本送省艾滋病检测确证中心实验室，用免疫印迹法 (WB) 进行确证。

2 结果

共计检测48463份标本，一步法初筛阳性87例，二步法初筛阳性24例；一步法和二步法初筛阳性标本用WB法确证各有4例HIV-1抗体阳性。一步法和二步法两者假阳性率比较有显著性差异 (P<0.01) ，结果见表1。

3 讨论

随着无偿献血队伍中抗一HIV的检出率逐年递增，给HIV筛查工作增加了很大的工作量。目前ELISA法是初筛检测HIV感染状况的常用方法[2,3]。酶联免疫吸附测定（ELISA）是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原），在加相应酶标记抗体（抗原），生成抗原（抗体）-待测抗体（抗原）-酶标记抗体的复合物，用与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定。由于ELISA法一方面是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因而，具有特异性。而另一方面又由于酶标记抗原或抗体是酶分子与抗原或抗体分子的结合物，它可以催化底物分子发生反应，产生放大作用，正因为此种放大作用而使本法具有很高的敏感性。

ELISA双抗原夹心一步法是在经典二步法的基础上，将受检标本和酶标抗原同时孵育反应，将二步操作简化为一步，操作更加简便、快速，更受临床欢迎，尤其适用于大批量标本的检测和中小型HIV初筛实验室使用。一步法与二步法的主要区别在于一步法测定体系中同时加入待测标本 (含抗体) 和酶标抗原进行竞争反应，当待测标本抗体浓度很高时，会形成竞争抑制作用，结果是要测定的目标结合物减少，导致显色反应降低，严重时甚至不显色，出现假阴性。因此，"钩状效应"是一步法固有的特性，虽然可以通过采用高亲和力的单克隆抗原，包被抗原、酶标记抗原的结合点尽可能的远，最大限度地减少"钩状效应"的问题"J，但仍无法避免强阳性标本因"钩状效应"而发生漏检的可能[4]。二步法先加入标本 (待测抗体) 与包被固相抗原反应后洗涤，未被结合的待测抗体被洗掉后再加入酶标记抗原，可以避免"钩状效应"的发生。

在本研究中，一步法和二步法的敏感性均达到100%，但存在不同程度的假阳性，一步法和二步法的假阳性率分别是0.17%和0.05%，一步法假阳性率明显高于二步法 (P<0.01) 。假阳性率高既增加检测工作量，又加重受检者的心理负担。然而国家规定了筛查试剂是双抗原夹心法，但未明确规定是一步法还是两步法。理论和实践都说明双抗原夹心双位点一步法检测HIV抗体确实存在因浓度过高而出现假阴性的漏检问题。这是一个值得关注的问题，应当引起高度重视。总之，两步法与一步法比较，仅仅是检验操作过程多了简单的一步，耗时稍长些，成本不会有较大的变化，然而检测的效果却不一样。因此，为了提高检测质量，有效预防艾滋病传播，我们建议HIV抗体初筛试验应取消一步法而强调必须改用两步法。

摘要：目的探讨酶联免疫吸咐试验 (ELISA) 双抗原夹心一步法和二步法检测人类免疫缺陷病毒 (HIV) 抗体的不同效果。方法采集2005年10月～2008年10月本市中心血站无偿献血者血液标本48463例, 用双抗原夹心ELISA一步法和二步法试剂检测, 初筛阳性标本, 采用免疫印迹法进行确证。结果检测48463份标本, 一步法初筛阳性87例, 确证阳性4例, 假阳性率0.17%;二步法初筛阳性24例, 确证阳性4例, 假阳性率0.05%, 两法的假阳性率比较有显著性差异 (P<0.01) 。结论酶联免疫吸咐试验二步法检测人类免疫缺陷病毒抗体的效果优于一步法, 更适合于人类免疫缺陷病毒检测的初筛试验。

关键词：酶联免疫吸咐试验,HIV初筛,一步法,二步法

参考文献

[1]胡京辉, 王瑞, 孙莉.抗-HIV不同检测方法的结果比较[J].检验医学与临床, 2008, 5 (1) :656-657.

[2]马亚非.艾滋病病毒抗体检测结果分析[J].检验医学与临床, 2007, 4 (6) :545-546.

酶联免疫吸附试验方法 篇7

关键词：酶联免疫吸附法,金免疫层析试验,明胶凝集试验

梅毒主要是由苍白密螺旋体 (TP) 感染而引起的一种慢性全身性传播疾病, 严重地危害人们的生命健康。TP一旦进入人体, 血清中会产生非特异性抗体及梅毒特异性抗体[1]。因此, 应加强对梅毒的诊断, 而血清型检测是诊断机体是否为TP感染的唯一途径。临床上检测TP抗体的血清检验学方法有多种, 其检测敏感度与特异度也具有一定的差异性[2]。酶联免疫吸附法 (ELISA) 与金免疫层析试验 (GICA) 常用于TP抗体的临床检测之中。本研究以“金标准”TPPA作为参照, 对比ELISA与GICA法对TP抗体的检测情况, 现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择6250例产前和术前标本, 其中男2350例, 女3900例;年龄19~68 (45.09±5.92) 岁;共检测出梅毒阳性患者50例, 检出率为0.8% (50/6250) , 均符合梅毒临床诊断标准, 其中一期梅毒患者14例, 二期梅毒患者17例, 三期梅毒患者6例, 不明期梅毒患者13例。

1.2 仪器与试剂

ELISA试剂为上海科华公司生产, 生产批号为201003011;TPPA试剂为日本富士康必欧株式会社公司生产, 生产批号为VN00303;GICA试剂为英科新创公司生产, 生产批号为2010020907。主要仪器为:郑州anthos2010酶标仪, 郑州anthos fluido型全自动酶标洗板机。

1.3 检测方法

首先抽取5ml空腹条件下静脉血, 于4000rpm转速下离心5min之后将血清加以分离, 若血清标本不能及时地送检, 则需将其置于温度为4℃的冰箱中保存, 备用, 以避免反复地冻融, 分别采用ELISA法、GICA法及TPPA法进行检测, 检测方法严格按各自试剂盒上的说明进行规范操作。前两种检测方法的结果与TPPA法检测结果进行对比。

1.4统计学方法

采用SPSS 16.0进行数据处理。计数资料以率 (%) 表示, 组间比较采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

GICA法对一期梅毒、三期梅毒、不明期梅毒的检出率及总检出率低于ELISA法和TPPA法, 差异均有统计学意义 (P<0.05或P<0.01) 。ELISA法与TPPA法各时期TP的检出率及总检出率差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表1。

3 讨论

当梅毒进入人体之后, 机体会产生2种类型的抗体, 即:抗心磷脂的非特异性抗体 (“反应素”) 与抗菌体的特异性抗体。非特异性抗体不是机体针对菌体自身所发生的反应, 而是针对菌体破坏患者组织之后释放的内脂所产生的反应[3]。因此, 检出时间一般比检出机体对菌体产生的特异性抗体晚2周, 且在一期梅毒早期、晚期梅毒、潜伏期梅毒及梅毒治疗之后起检出率显著降低甚至呈阴性[4]。因此, 若使用检测非特异性TP抗体的检测方法对特异性抗体进行诊断, 会出现更多的假阴性。笔者认为特异性抗体是诊断TP感染的重要依据。

注:与GICA法比较, *P<0.01, #P<0.05

目前, 临床上常使用非特异性抗体试验, 如TRUST与RPR2种检测方法, 2种方法所使用的抗原均为心磷脂类。此类试验虽具有操作简单、结果易读、试剂成本低、设备要求低及检测快速等方面的特点[5], 然而因该试验方法的局限性以及结果极易受到主观因素的影响, 且灵敏度及特异度较低, 常出现生物学假阴性。因此, 上述检测方法不适合TP特异性抗体的临床检测。目前, 使用较多的ELISA法与GICA法, 通过对这2种方法检测结果的对比分析, 结果显示:50例确诊梅毒病例中, ELISA法与TPPA法对各时期TP的检出率具有较高的一致性, 除二期梅毒外, GICA法对各期TP检出率显著低于ELISA法与TPPA法 (P<0.01) 。由此可见, 与GICA法相比, ELISA法检测梅毒特异性抗体检出率更高, 漏检率更低, 且与“金标准”TPPA检测法检测结果基本一致, 可用于临床梅毒感染患者的诊断之中。

参考文献

[1] 肖春梅, 朴桂花, 李富荣, 等.梅毒血清学实验室检查及临床应用[J].实用医学杂志, 2011, 27 (8) :1485-1486.

[2] 王碧玉.曾自如.胶体金法、酶联免疫吸附试验和明胶颗粒凝集试验检测血清梅毒抗体的结果比较[J].右江民族学院学报, 2011, 33 (2) :209-211.

[3] 张胜兰, 陈翔, 林炳亮.酶联免疫吸附试验与金免疫层析试验检测梅毒特异性抗体的结果评价[J].浙江医学, 2013, 35 (11) :1094-1096.

[4] 徐正红.金标法与滴度法应用于临床检测梅毒的效果观察[J].西南军医, 2011, 13 (1) :51-52.