酶联免疫

酶联免疫（共11篇）

酶联免疫 篇1

甲胎蛋白(AFP)是哺乳动物胚胎期肝脏卵黄囊合成的一种糖蛋白,是辅助诊断原发性肝癌的重要指标[1]。目前检测AFP的方法较多,近年来随着科技的发展,化学发光免疫分析技术日益完善,作为检测AFP的一种重要方法被广泛应用于临床,显示出了很好的应用前景[2]。我们采用化学发光免疫法和酶联免疫法(ELISA)对50例临床血清标本中AFP含量进行检测,结果如下。

1 材料和方法

1.1 标本

来源为2009年至2010年来本院住院和门诊的患者,随机抽取50例血清标本。

1.2 仪器和方法

酶联免疫法使用雷勃酶标仪(MULTISKAN MK3)试剂使用上海科华。化学发光免疫法使用西门子全自动化学发光仪(ADVIA Centaur XP)和配套试剂,采用吖啶酯为发光底物,采用双抗体夹心法[3]。

1.3 统计学处理

采用统计学软件包SPSS11.0进行分析处理,所得数据以均数±标准差(x±s)表示,以p<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 线性实验

将标准液按不同浓度稀释后做线性实验,结果显示ELISA法和化学发光法呈良好的线性关系,见表1。

2.2 对比实验

用ELISA法和化学发光免疫法同时对血清标本进行定量分析,结果表明,两法差异无统计学意义(p>0.05),相关系数r=0.996,提示两法呈良好相关性,见表2。

2.3 精密度实验

用两种方法对低、中、高质控品分别进行精密度实验,表明化学发光免疫法重复性好于ELISA法,特别是病理高值化学发光免疫法明显优于ELISA法,见表3。

3 讨论

化学发光免疫技术既具有发光检测的高度敏感性,又具有高度特异性[4],是公认快速、精确、重复性好且安全无毒的方法。ELISA法也以快速、简便实效而被广泛应用[5~7]。我们检测AFP结果指示化学发光法和ELISA法之间差异无统计学意义(p>0.05)相关性好r=0.996.通过比较显示化学发光法线性范围宽,精密度等方面明显优于ELISA法,因此我们认为化学发光法可广泛应用于临床项目的检测[8]。

摘要：目的:探讨两种方法检测AFP的优缺点。方法:采用西门子全自动发光免疫分析仪和雷勃酶标仪。结果:化学发光法和ELISA法之间差异无统计学意义(P>0.05),相关性良好(r=0.996)。结论:化学发光法的精密度和准确性均优于酶联免疫法。

关键词：化学发光免疫法,酶联免疫法,甲胎蛋白

参考文献

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[7]李金明.临床酶免疫测定技术[M].北京:人民军医出版社.2005,217

[8]陆志檬.因定量诊断技术评价及其临床应用.中国医药导刊,2003;(1):5～6

酶联免疫 篇2

污水中大肠杆菌的酶联免疫检测方法研究

以城市污水处理厂二沉池出水为检测目标,比较了夹心法和直接法2种酶联免疫反应方式,分析包被抗体和酶标抗体浓度、菌液预处理等因素对检测灵敏度的影响,确定了ELISA的最佳工作条件.结果表明,检测大肠杆菌的线性区间为10CFU/mL～6×104CFU/mL,最低检测限达到10CFU/mL.与传统检测方法相比,该技术具有操作简单,节省时间和费用,反应灵敏度高等优点.

作 者：席海燕 蔡强 何苗 施汉昌 XI Hai-yan CAI Qiang HE Miao SHI Han-chang 作者单位：清华大学环境科学与工程系环境模拟与污染控制国家重点联合实验室,北京,100084刊 名：环境科学 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF ENVIRONMENTAL SCIENCE年，卷(期)：26(5)分类号：X830.2关键词：大肠杆菌 快速检测 ELISA 污水处理厂

酶联免疫 篇3

关键词：酶联免疫吸附分析 综合性实验 教学

中图分类号：G421文献标识码：A文章编号：1674-098X（2013）05（a）-0149-02

食品分析是食品科学与工程专业重要的专业基础课程之一。食品分析实验课是食品分析教学的重要组成，是锻炼学生实验操作能力，分析解决问题能力的重要教学途径之一。酶联免疫吸附分析（ELISA）技术涉及有机化学、食品化学、生物化学和免疫学等综合知识内容，在食品分析学中开展ELISA综合性实验，不仅利于提高教学质量，而且能锻炼学生综合技能运用能力。

1 ELISA综合实验在教学中开展的意义

酶联免疫吸附分析技术是一种固相免疫分析方法，因其具有灵敏、快速、特异性强等特点，迅速发展，在食品安全检测领域应用越来越广泛，成为食品中小分子有害因子主要的快速筛查技术手段[1]。目前，对于食品中的农药、兽药残留，生物毒素，致病微生物等有害物质的分析，市面上已有商品化的ELISA试剂盒[2]。但本科教学极少开展ELISA教学，学生对其原理和操作了解较少，缺乏实验机会，相关知识的理解主要停留在理论教学水平。在食品专业开设ELISA实验课程，已成为一项非常必要的实验教学内容。有助于帮助学生学习对相关知识点的学习及掌握，提高学生对生物分析技术的认识，了解免疫分析技术在食品安全领域应用的优势及重要性，并锻炼学生动手能力，培养学生的综合素质。

2 ELISA实验的原理

ELISA技术是用酶标记的抗原或酶标记的抗体为主要试剂，通过复合物中的酶催化底物呈色反应来对被测物进行定性或定量的一种免疫分析方法[3]。其原理是把抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性，在测定时，将受检样品（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，形成抗原抗体复合物，用洗涤的方法使固相载体上的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与样品中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，通过定性或定量分析有色产物即可确定样品中待测物质的含量[4-5]。目前ELISA 的分类方法众多，主要技术类型有双抗体夹心法、间接法、捕获法、竞争法。在食品安全检测领域，竞争法为主要类型[6]。检测原理示意图见图1。

3 实施过程及具体实验步骤

根据笔者的教学经验，该综合性实验约需教学时数，10～12学时，具体操作过程如下。

（1）带教老师讲述ELISA的原理，应用及注意事项。

（2）通过观看酶联免疫吸附实验操作视频，了解整个实验流程及操作要点。

（3）将学生分组，每组3人，开展ELISA综合实验。

（4）实验操作结束，带教老师与学生共同讨论分析实验结果。

具体的实验操作步骤如下：

以测定牛奶和鱼肉中的氯霉素为例，采用酶标抗原的直接竞争法，介绍本实验具体实验步骤。

（1）包板：将抗体用包被液稀释一定的倍数，加入96孔酶标板中，100 μL/孔。37 ℃孵育，过夜。

（2）封板：洗板两次，加入封闭液120 μL/孔，37 ℃孵育，3小時。

（3）样品前处理：封板时，分别对样品牛奶和鸡肉进行前处理。

（4）烘干：将封闭好的板倒掉封闭液，37℃烘干。

（5）加样：加标准品/样本50 ?L/孔，然后加入酶标记物50 ?L/孔，再振荡混匀，用封板膜盖板，37 ℃条件下反应30 min。

（6）显色：洗板4～5次，每次浸泡30s，拍干。每孔加入底物缓冲液50 ?L，再加底物液50 ?L，轻轻振荡混匀，37 ℃或室温环境避光显色10 min。

（7）测定：每孔加入终止液50 ?L，轻轻振荡匀，设定酶标仪于450 nm处测定吸光度值。

（8）结果判定：以标准品百分吸光率为纵坐标，以氯霉素标准品浓度（ng/mL）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氯霉素实际浓度。

4 结语

ELISA实验是一个综合性实验，涉及到有机化学，食品化学，生物化学以及免疫学等方面的相关知识。因此，学生通过本实验，可以取得以下效果：（1）巩固理论知识，加强对相关知识的理解，并对该技术在食品安全检测领域的重要性有一定的认识。（2）结合视频及具体实验操作，了解整个实验的操作流程。（3）学生之间分组进行实验，加强相互协作及团队意识。

在食品科学与工程、食品营养、食品质量与安全、生物工程等专业的食品分析实验课中，我们为部分同学开设了ELISA综合实验，检测过的对象包括氯霉素、盐酸克伦特罗、三聚氰胺、和孔雀石绿等。本实验内容丰富充实，实验现象生动有趣，深受学生的欢迎。

参考文献

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[2]李明尧.酶联免疫吸附（ELISA）技术在食品检验的发展应用[J].中国医药指南，2012，10（35）：380-381.

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酶联免疫法检测猪尿中赛庚啶 篇4

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂盒

Model 550酶标仪, 美国Bio-Rad公司制造;MS3 Basic圆周振荡器, 德国IKA公司制造。赛庚啶检测试剂盒 (赛庚啶标准品以及其他检测用试剂) , 购自深圳容金科技有限公司。

1.2 试验设计

实验室室温控制在 (23±1) ℃, 将检测试剂盒和样品置于室内, 自然回温至室温。

取出酶标板条, 将50μL猪尿样品 (标准品、空白样品、阳性对照) 加入不同的微孔内, 每个试样做双孔平行, 记录微孔位置。向各微孔内加入100μL一抗, 轻敲微孔板边缘混匀60 s;室温避光孵育30 min;用250μL工作洗液洗酶标板3次, 每次洗板后轻轻甩出微孔内液体, 倒扣在吸水纸上, 轻轻拍打出残留在孔内的液体, 向各微孔内加入150μL二抗, 轻敲微孔板边缘混匀60 s;室温避光孵育30 min;用250μL工作洗液洗酶标板3次, 拍出微孔内残留液体, 向各微孔内加入100μL TMB底物, 轻敲微孔板边缘混匀60 s;室温避光孵育15 min;加入100μL终止液终止反应。使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。

1.3 相对吸光度的计算

相对吸光度是用猪尿样品 (标准品、空白样品、阳性对照) 的平均吸光度除以标准品阴性浓度为0质控的吸光度, 乘以100%而得。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

采用Ridasoft Win软件以标准品的相对吸光度值为纵坐标、标准品浓度为横坐标绘制标准曲线。赛庚啶标准曲线结果见表1, 标准曲线见图1。

由表1可见, 标准品吸光度离散系数小于5%, 浓度变异系数不大于0.2%。由图1可见, 在15~1 500 ng/L范围内标准曲线线性良好, 绘制的标准曲线准确、可靠。

2.2 检出限

对20份阴性猪尿样品进行测定, 利用标准曲线计算样品浓度, 以20份样品检测浓度的平均值 () 和标准偏差 (s) 来表示方法检出限 (MDL) , 即MDL=+3 s, 结果获得该方法对猪尿样品的检出限为169 ng/L。目前江苏省畜禽产品质量安全标准中, 赛庚啶的限量规定为2μg/L, 因此, 检出限可以满足检测要求。

2.3 加标回收试验

使用阴性猪尿样品作为空白样品进行加标回收试验, 向空白样品中加入适量浓度为10μg/L的标准品溶液作为阳性对照, 用涡旋混合器4 000 r/min混合60 s后按步骤进行测定。回收试验结果见表2。

对6份空白样品不同加标浓度的回收率进行了试验, 部分空白样品检测结果在15~50 ng/L之间, 计算回收率时用加标样品的测定浓度扣除空白测定浓度之后进行计算。在加标量为200~1 250 ng/L的浓度范围内, 空白样品加标回收试验均有满意的结果, 完全满足测定要求。

2.4 实际样品的测定

对21份猪阳性样品进行了测定, 其中有1个样品测定浓度在500~1 500 ng/L范围内, 3个样品测定浓度在150~500 ng/L范围内, 2个样品测定浓度在15~150 ng/L范围内, 其他样品测定浓度均低于15 ng/L, 结果均符合要求。

3 讨论

3.1 样品的背景值

阴性猪尿样品的测定值一般很低, 无法使用有效的测定手段进行确认, 原因可能是背景干扰的结果。在实际测定中, 猪尿样品很可能呈现浑浊或混有其他组织液的情况, 这种情况下背景干扰更强, 应采取有效办法降低样品的背景值, 除离心外, 还应进行适当的稀释, 以降低干扰。

3.2 样品的选择

赛庚啶主要在动物肝脏内代谢, 肾脏和胰脏等其他组织中也有残留, 最后排泄出体外[6]。由于组织样品需要进行复杂的前处理, 作为快速检测方法而言, 用酶联免疫法检测组织样品并不占优势。尿液本身为液体, 取用方便, 不需要宰杀动物, 且试验操作步骤简便。考虑到测定成本和快捷性, 选用猪尿样品适合赛庚啶的快速测定, 尤其适用于屠宰场宰前检测和规模养殖基地现场抽样检测。

3.3 方法的特异性

酶联免疫法是建立在抗原抗体反应的特异性基础上的测定方法, 拥有良好的特异性, 但对结构类似的化合物有一定的交叉反应, 因此无法排除干扰物质对测定结果产生影响[7]。在实际样品测定中, 样品测定浓度在500~1 500 ng/L之间。此种样品经液相色谱-串联质谱进一步分析, 未检出赛庚啶。原因可能是背景值的影响或是其他药物的交叉反应所致。因此在使用酶联免疫法检出赛庚啶值较高的情况下, 应及时将样品送至有资质的检测单位, 使用液相色谱-串联质谱法进行进一步确证, 而不能直接判定赛庚啶超标。

4 结论

利用酶联免疫法对猪尿中赛庚啶进行了测定, 结果表明, 该方法特异性较好、灵敏度高、准确度高, 且仪器设备投资少、检测成本低, 是畜产品中药物残留测定发展的趋势, 在现场测定和大批量样品筛选测定中有着十分广阔的应用前景。

参考文献

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酶联免疫 篇5

酶联免疫法快速检测牛乳中的三聚氰胺操作视频配音稿

准备好物品后即可进行检测操作，首先进行样品处理。取1mL纯牛奶样本，加入一根小试管，再加1mL去离子水，涡动1min混匀；取出40μL牛奶溶液，加入另一根小试管，再加入960μL样本稀释液稀释，涡动1min混匀。

接下来，吸取50μL牛奶样本到微孔中，做2孔平行，并记录所在位置。再取三聚氰胺标准品各50μL到微孔中，也做2孔平行，并记录所在位置。然后，每孔各加50μL酶标物，每孔再加入抗试剂50μL，轻轻振荡均匀，用盖板膜盖板，置25℃避光环境中反应30min。

取出微孔板，小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，每孔加入洗涤液250μL，充分洗涤4次，每次间隔10s，用吸水纸拍干。接下来各孔加入底物液A液50μL，再每孔加入底物液B液50μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，置25℃避光环境反应15～20min。取出微孔板，每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值。

测定完成后我们得到了三聚氰胺标品和样本的吸光度平均值，如表格所示。首先进行三聚氰胺的定性分析，根据样本的吸光度值1.870，可以得出它的三聚氰胺浓度范围为1ppb-3ppb，再乘以稀释倍数50得出此纯牛奶中三聚氰胺的浓度为50ppb-150ppb。

接着我们进行三聚氰胺的定量分析，先计算百分吸光率和三聚氰胺浓度的对数，如表格中所示。

酶联免疫 篇6

【关键词】酶联免疫吸附试验；ELISA;梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验；TPPA;梅毒抗体

【中图分类号】R377⁺¹【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)10-0077-01

梅毒是由梅毒螺旋体感染引起的性传播疾病.目前梅毒检测常用方法^{[1]主要有:快速血浆反应素试验(RPR)、甲苯胺红快速反应素试验(TRUST)、梅毒螺旋体EUSA试验(ElSA)、梅毒螺旋体血凝试验(TPHA)和梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)等，有时也用到免疫印迹法和PCR方法。高敏感性和特异性的检验方法对于该病的确诊和治疗具有重要意义。我们采用梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验(TPPA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)对2000份血清标本进行了检测比较，现报道如下。}

1材料与方法

1.1标本来源选取我市2006年10月～2008年10月献血者和梅毒临床患者共2000份血清标本，男1236例、女764例，其中包括1700份健康献血者血清、300份梅毒患者血清。

1.2试剂TP-ELISA试剂盒购自北京万泰生物药业有限公司，IPPA试剂盒购自日本富士瑞必欧株式会社，均批检合格，在有效期内使用。

1.3方法所有标本均采用ELISA和TPPA进行血清梅毒螺旋体抗体平行检测，具体操作和结果判定均按试剂盒说明书进行。

1.4统计学处理采用统计学软件SPSS13.0对所得数据进行统计学分析，率的检验采用卡方检验，P<0.05，差异有统计学意义。

2结果

2.1酶联免疫吸附试验(ELISA)和梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验(TPPA)两种方法检测对300份梅毒患者血清检测结果比较，见表1。

2.2两种方法对1700份献血者血清检测结果见表2。

3讨论

梅毒是一种由苍白密螺旋俸所致的密螺旋体病，主要通过性接触、血液、母要垂直传播。20世纪60年代初得到较彻底的控制。1973年梅毒死灰复燃，卷土重来，20世纪80年代后期，国内各地先后均有早期梅毒的病例报道，以后呈直线上升，成为仅次于艾滋病的对人体危害最大的性传播疾病．无偿献血者血液初筛检测中，梅毒抗体阳性率也高达2.0%．其中工人、农民、流动人口的检测阳性率为3．58％^[2]。而且，早期梅毒患者作为供血者，可以通过输血传染梅毒^[3]。因此，必须选用高质量的梅毒检测试剂，加强对献血者梅毒的检测，以控制其经输血传播。

人体感染梅毒螺旋体后，可以产生特异性梅毒螺旋体抗体和非特异性抗体即反应素，前者比后者出现得早，即使通过抗梅毒治疗后，梅毒螺旋体抗体仍可终生存在^[4]。TPPA试验方法是将特异性TP抗原包被在明胶颗粒上，省略了吸收剂，不受生物因素影响，与血清中特异性TP 抗体结合后出现肉眼可见的凝集反应的检测方法。TP以是目前公认较好的梅毒抗体确认方法，敏感性高，特异性强。ELISA法是利用基因重组工程合成抗原，检测血清中梅毒特异性抗体，在梅毒各期均有较高敏感性，TP-ELISA是利用重组梅毒螺旋体的特异性抗原包被酶标板孔，并采用双抗原夹心法检测血清标本中的梅毒特异性IgM和IsG抗体，对早期和晚期梅毒都有较高的检出率^[5]，但ELISA法也存在着假阳性问题^[6]。

本文结果表明，TP-ELISA法的假阳性率为0.35％。通过本文实验，我们发现ELISA和TPPA都具有较高的敏感性和特异性，两法的检测结果无显著性差异(P>0.05)。因TPPA用肉眼判断结果，使结果可靠性下降，并且试剂昂贵，整个检验过程几乎全部依赖于手工，操作繁琐，存在操作出错的风险，检测时需将样本作系列稀释，不利于大批量样本筛查，也不便用于疗效判断。而ELISA现已利用全自动加样器和全自动酶免分析仪，实现了从标本加样、温育、洗板、加试剂到结果判断等整个检验过程的完全自动化，可同时检测大批量标本，操作简便，极大地减少了人为因素的影响;可实现室内质量控制的标准化;结果判断客观、准确;利用微机保存并管理原始检验结果，便于查询;适合血站大规模的血液筛检^[7]。因此，综合考虑方法学和实际操作等因素，ELlSA目前最适合血站大规模的血液筛检。

参考文献

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(收稿日期：2009.02.14)

酶联免疫技术在食品检测中的应用 篇7

1 基本原理

酶免疫方法和其它免疫技术一样, 都是以抗体和抗原的特异性结合为基础的, 其差别在于酶免疫方法以酶或者辅酶标记抗原或者抗体, 用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应, 使检测水平接近放射免疫测定法。酶免疫测定法可分为非均相免疫测定法和均相免疫测定法, 非均相法又有固相法和液相法之分。实践中, 常用的是非均相酶固相免疫测定法即ELISA法, 该法将抗原或抗体结合到固相载体表面, 将抗原或抗体相关物质与酶交联成酶结合物, 一方面保持了与相应抗原或抗体结合的免疫特性, 另一方面还具有酶活性。当酶结合物同相应的抗原或抗体结合后, 则形成酶标抗原抗体复合物, 复合物上的酶遇到相应底物时, 可以催化产物水解、氧化或还原, 从而产生有色物质。根据有色物质的有无及其浓度, 即可间接推断被检样品中有无相应抗原或抗体存在, 数量多少, 从而达到定性和定量测定的目的[1]。

在实际应用中ELISA技术主要有直接法、间接法、双抗体夹心法、直接竞争法、间接竞争法、捕获包被法、ABS-ELISA法、PCR-ELISA法、A蛋白酶联法、斑点免疫吸附法和组织印迹法等几种类型[2]。

2 在食品检测中的应用

2.1 食品中有毒有害物质的检测。

2.1.1 食品中微生物的检测。

目前传统的微生物学方法仍然是食品检测中常用的方法, 但存在操作繁琐、工作量大等缺点。对大部分微生物来说, 用传统方法检测至少需要4~5d的时间, 有些致病微生物甚至无法进行人工培养。而使用ELISA方法, 比常规培养法要提前3~4d出结果, 不需要特殊试验设备, 肉眼即可观察结果, 且样品易保存。沙门氏菌是引起细菌性食物中毒的主要致病菌之一, 田银芳[3]等应用直接ELISA方法对350份奶样进行沙门氏菌的检测, 与常规方法相比, 该法的敏感性和特异性分别为100%和99.7%, 所需检测时间仅为2~3d。

2.1.2 食品中毒素的检测。

目前发现能引起人中毒的霉菌代谢产物至少有150种以上, 常见的产毒性真菌有曲霉菌属、青霉菌属、镰刀菌属等, 其中最常见且研究最多的是黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等。Biancardi[4]用ELISA检测牛奶中黄曲霉毒素AFTM1的残留量, 结果表明, 当黄曲霉毒素AFTM1浓度大于30ppt时, ELISA比高效液相色谱的精确度和准确度要高。

2.1.3 食品中残留药物的检测。

药物残留是指药物使用后残存于食品原料与半成品食品及成品中的微量药物原体、有毒代谢物、降解物以及杂质的总称。食品中残留的药物、抗生素等不仅直接危害到消费者的健康, 而且也影响我国的农副产品出口。这一问题已引起人们的高度重视。传统的分析方法不仅需要昂贵的仪器设备, 且操作烦琐对药物中毒事件不能快速做出诊断。

自1983年以来, ELISA成为许多国际权威分析机构 (如AOAC) 分析残留农药的首选方法。ELISA技术已广泛用于有机磷类、有机氯类、除虫菊酯、磺胺类等农药残留的检测。董玉华等[5]采用间接竞争酶联免疫吸附分析方法, 来测定海水样品和海洋贝类中的有机氯农药滴滴涕及其主要代谢产物的含量。张婧等[6]在前期建立溴氰菊酯间接竞争ELISA检测方法的基础上, 成功研制组装出溴氰菊酯残留检测ELISA试剂盒, 基本满足了溴氰菊酯残留检测的需要。

近几年, “瘦肉精 (盐酸克伦特罗) ”、三聚氰胺引起的食物中毒每每见诸报端。陈继明等[7]在黄永科等的研究基础上建立了克伦特罗ELISA测定方法, 用该法检测动物尿样、脏器或饲料等样品, 检测范围为15.6μg/ml~1.90ng/ml, 表明该法灵敏度高、特异性强。王黎丽[8]等建立三聚氰胺直接和间接竞争ELISA检测方法, 线性检测范围分别为0.05~10μg/L和0.1~1000μg/L。

2.1.4 食品中过敏原的检测。

对于鱼类的过敏反应是严重的食物过敏反应之一, 严重者能引起窒息死亡。为此世界上很多国家的食品机构要求在预包装食品的标签上强制实施鱼类成分标识。2007年, Faeste等[9]提出用夹心ELISA法检测鱼类过敏源, 该方法成功地检测出了多种鱼类。检测限为每千克食物中含鱼小清蛋白0.01mg, 相当于每千克食物中5 mg鱼肉。这种结果已经足以控制食品中的鱼蛋白含量, 降低对鱼类过敏消费者发生过敏反应的风险。

2.2 食品中生理活性物质的检测。

食品中常含有一些生理活性物质, 由于食品成分十分复杂, 研究人员一直在寻找快速、准确的检测出这些活性物质的方法。乳铁蛋白是一种铁结合糖蛋白, 具有多种生理活性。张英华[10]等应用ELISA检测牛初乳中乳铁蛋白的含量, 最小检出量为0.5ng/m L, 与通常采用的电泳法和免疫扩散法相比, 具有快速、准确, 可同时检查几十个甚至几百个样品的优点。朱慧莉[11]等用ELISA检测免疫球蛋白。免疫球蛋白是一类具有抗体活性且能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白, 也是人类体液的一种免疫因子, 能杀死细菌和病毒, 增强机体的防御能力。近年来, 研究人员将1g用作食品添加剂生产保健食品, 如婴儿配方奶粉、乳珍等。常规的蛋白质分析方法无法检测1g的含量和活性, 应用ELISA可以成功的解决这个问题。

2.3 转基因食品的检测。

随着转基因食品的不断普及, 越来越多的国家要求对转基因产品实行标签制度, 这就对对转基因食品的检测提出了更高的要求。转基因食品或使用转基因原料的食品检测除了PCR技术直接检测转基因外, 还能用ELISA法检测某些特定的转基因表达蛋白, 以分析食品的原料是否来自转基因生物。

白卫滨等[12]以美国、阿根廷、巴西转基因大豆等为材料, 建立了ELISA法定量检测抗草甘膦转基因大豆CP4EP-SPS蛋白的方法, 成功检测出不同转基因大豆中CP4EP-SPS蛋白的含量, 从而为抗草甘膦转基因大豆中CP4EPSPS蛋白的定量检测提供了有效的手段。

3 发展趋势及展望

酶联免疫吸附技术具有检测快速、专一、灵敏的特点将在食品检测分析方面将得到广泛应用。食品中所研究的大小分子物质都可能直接或间接地成为抗原, 因此基本可以实现用ELISA方法对食品中的各种物质进行检测, 从而对各种病毒害物质进行控制, 保证食品安全。

参考文献

[1]蒲健, 冯晓红.ELISA酶联免疫吸附测定法简介[J].肉类研究, 2002 (2) :41-42.

[2]水小溪, 蔡乐, 赵宝华.ELISA技术在食品安全检测中的应用[J].生命科学仪器, 2008, 6 (10) :51-53.

[3]田银芳, 王翌明.ELISA方法与国标法在检测鲜奶中沙门氏菌的比较研究[J].中国乳品工业, 1998:32-33.

[4]A.Biancardi.Determination of aflatoxin M.residues in milk:a compara-tive assessment of ELISA and LAC-HPLC methods.Industrie Alimen-tari, 1997, 36 (361) :870-876.

[5]董玉华, 等.酶联免疫吸附方法分析海水和贝类中的滴滴涕及代谢物[J].水产科学, 2007 (4) :229-23.

[6]张婧, 等.溴氰菊酯残留检测ELISA试剂盒的研制[J].北京农学院学报, 2009 (4) :27-30.

酶联免疫 篇8

1 试剂因素

1.1 试剂的选择

试剂的选择是保证血液检测质量的关键因素, 要选购知名度高, 质量有保证, 具有“三证”的试剂, 最好选用配套试剂。也可以和同行交流, 其他实验室对某种试剂盒的实际使用效果, 往往具有很强的说服力, 因此应使用检测口碑好的试剂 (可通过室间质评组织获得[1]) 。不使用过期试剂, 不同批号试剂不能混用, 同批号试剂盒的组分也不可混用。

1.2 试剂的储存运输。

1.2.1 试剂的储存至关重要, 试剂一到科室, 即应立即放入冷藏冰箱, 必须注意不得靠近冰箱后壁, 以防试剂冻结, 影响检测结果。

1.2.2 试剂供应商必须保障试剂在进入科室前运输储存的质量, 试剂盒从出厂到用户手中, 均要历经运输 (如送检、检定、发货等) 及运输中的储存环节, 某一环节不当, 均影响试剂盒的临床使用质量。去年我科有一段时间所做的表面抗原项目, 今天阳性, 同一份标本明天复检有可能是弱阳性甚至阴性, 查找原因可能是这批试剂在进入科室前储存温度出现了问题, 与试剂商联系更换新的批号试剂后, 此现象消失。

1.3 试剂的准备

在临床实验室, 试剂的准备一般不太注意, 工作人员通常在试验时将试剂从冰箱中拿出来就用, 其直接后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此酶联免疫吸附试验中, 试剂准备最关键的是使试剂盒在使用前与室温平衡, 以满足检测要求, 一般检测前30 min即应将试剂盒从冰箱中取出, 检测时试剂盒可与室温平衡。

2 标本因素

标本因素包括标本溶血、被污染、标本保存时间过长和标本凝固不全等。

2.1 标本溶血

血红蛋白中含铁血红素有类过氧化物酶活性, 因此以辣根过氧化物酶为标记的酶联免疫吸附试验测定中, 如血清中血红蛋白浓度较高, 很容易在温育过程中吸附于固相, 从而与后面加入的辣根过氧化物酶反应显色, 造成假阳性。因此在采血过程中应注意, 采集血液标本时应缓慢抽动, 注射器插入生化管应让血液自动靠负压注入生化管, 不能用手推注射器栓塞, 以防标本溶血。处理方法:若轻微溶血影响还不大, 若为中度或重度溶血, 则必须与临床联系, 重新抽取标本, 并讲清楚正确采集血标本的重要性。并由有关部门定期培训临床护士怎样正确采集血液标本。

2.2 标本被污染

菌体可能含有内源性过氧化物酶, 可出现非特异性显色, 因此宜用新鲜标本, 如有特殊情况, 应冰箱保存或冰冻保存, 并应加盖保存。阳性结果应重抽血双孔复检。

2.3 标本的保存

标本在冰箱中保存时间过长, 可能造成污染或效价降低, 可引起假阴性, 因此应尽量用新鲜标本。冰冻标本应避免反复冻融, 因冰冻标本的反复冻融产生的机械力对标本中的蛋白分子有破坏作用, 可引起假阴性[2]。

2.4 标本凝固不全

标本凝固不全的血清中有部分纤维蛋白原, 影响结果。有的工作人员着急赶时间, 刚采集的标本就离心 (虽然现在都采用促凝生化管) , 结果刚离心完血清还可以, 但是在洗涤时, 此孔血清呈果冻状, 显然反应不完全。处理方法:标本采集后在37℃水浴30 min后再离心, 以3500转/min离心5 min可获得满意标本[3]。

3 操作因素

3.1 加样

孵育前加样时间过长, 漏加样本, 酶试剂加入孔外, 用滴瓶滴加试剂时加量不准等都可使试验结果不可靠。处理方法: (1) 标本过多时, 可分批操作, 标本要轻拿轻放, 防止标本溅出交叉感染; (2) 加完样品封板前要仔细观察反应板, 看是否有样品漏加, 以便及时发现; (3) 加酶试剂后可用吸水纸吸干孔外试剂; (4) 使用滴瓶加试剂时, 应垂直滴加, 匀速滴加, 以免速度过快有的孔中多加1滴试剂, 建议采用微量加样器加试验中的所有组分; (5) 加样器应定期校准, 消毒, 吸头要一次性使用, 以免交叉污染。

3.2 温育

温育是最为关键、最容易出现问题的步骤;温育的时间、温度选择一般按照试剂盒说明进行, 加完样本和试剂后微孔板放入水浴箱或温箱中, 孔内温度从室温升至摄氏37℃需一定时间, 若一放入就计时, 就容易造成孵育时间不够, 易致弱阳性标本检测不出。处理方法: (1) 可采用适当延长几分钟时间 (大约2 min) ; (2) 可把反应板封板后直接放入37℃水浴箱水中; (3) 用37℃孵育箱将是不错的选择。

3.3 洗板

3.3.1 洗涤液的配制, 按照说明书要求1∶20稀释, 看似很简单, 但必须注意一些细节问题: (1) 注意洗涤液是否有结晶析出, 冬天洗涤液易结晶, 如不注意很容易堵塞洗板机管路。处理方法:事先将洗涤液置37℃水温箱中预温一会再行配制就可解决。 (2) 要注意去离子水的pH值。处理方法:用0.1nNaOH调节pH值至7左右。

3.3.2 洗板有两种, 即手工洗板和洗板机洗板。采取手工洗板, 孔与孔之间液体易交叉;采取洗板机洗板时, 洗液量不足导致洗板不彻底, 针孔堵塞导致抽吸不完全, 清洗效果差。处理方法: (1) 手工洗板时, 孔内洗液不能溢出, 拍板时要垂直, 但用力不能过猛, 防止抗原抗体复合物脱落; (2) 用洗板机洗板, 洗涤液要新鲜配制, 洗板机要经常检查冲洗头是否畅通, 洗涤液瓶应定期彻底清洗, 要定期检查整个管路, 疏通管路, 若针头被堵塞, 可用注射器排除; (3) 我科采用机洗5遍人工加洗1遍, 效果较好; (4) 洗板时, 吸水纸不可重复使用; (5) 洗完板时, 应充分扣干反应孔, 可用吸水纸包住反应板扣干。

3.4 显色

要严格按照说明书进行, 充分显色到预定时间后加入终止液。

3.5 测定

加入终止液后用酶标仪检测, 酶标仪需预热15 min~30 min, 因反应板加入A、B显色剂后在37℃放置30 min, 反应板底部会有水雾, 检测时可出现假阳性, 上机前一定要在吸水纸上吸干。

在以上的操作过程中, 要保持试验的连续性, 有的工作人员在洗完板时, 因故未能及时加A、B显色液, 会对测定结果造成影响, 因此要注意试验的连续性, 这一点至关重要。

综上所述, 尽管酶联免疫吸附试验测定操作简单, 但影响测定结果的因素较多, 所以工作人员要加强责任心, 在操作过程中不能有一点疏忽, 要严格按照试剂盒说明书操作, 尽量避免或减少影响因素, 保证检验质量。

参考文献

[1]马斌国.现代临床检验质量保证[M].太原:山西科学出版社, 2001:6.

[2]李会英.酶联免疫吸附试验影响因素的分析[J].检验医学与临床, 2007, 4 (10) :985-986.

酶联免疫 篇9

酶联免疫法定量检测黄曲霉毒素B1采用固相直接竞争性酶联免疫原理, 相比较国家标准而言具有简单、快速、重复性好的特点。微孔中包被有对黄曲霉毒素B1具有高亲和力的抗体。黄曲霉毒素B1酶标物与标准品或样品中的黄曲霉毒素B1竞争结合微孔中包被的抗体。孵育一定时间后, 倾倒微孔中的内容物, 洗涤非特异反应物。随后加入底物试剂, 溶液变为蓝色。颜色强度与黄曲霉毒素B1酶标物的量成正比, 与样品或标准品中黄曲霉毒素B1的浓度成反比。最后加入酸性终止液, 终止反应并将微孔中溶液颜色变为黄色。使用酶标仪在450nm下检测微孔中溶液的OD值。比较样品OD值与试剂盒提供的标准品的OD值, 即可获得检测结果。

2 样品制备

2.1制备提取溶液 (70%甲醇) (以单个待测样品为单位) :向70ml分析纯级甲醇中加入30ml蒸馏水或去离子水。

2.2使用粉碎机将样品粉碎, 使颗粒大小与速溶性良好的咖啡颗粒相同 (50%可通过20目筛) 。

2.3称取20克粉碎后的样品, 加入100ml提取溶液 (70%甲醇) , 用震荡器震荡混合10分钟。注:样品与提取试剂的比值为1:5 (w/v) 。

2.4待颗粒物质沉淀后, 用Whatman1#滤纸 (或等效的) 过滤5-10ml提取物, 收集滤液待测。

3 检测步骤

3.1使用前将所有试剂恢复至室温。

3.2取出相应数量的稀释孔置于微孔架上 (每个标准品或待测品对应一个稀释孔) , 再取出等量包被抗体的微孔置于另一个微孔架上, 向每个稀释孔加入200ul黄曲霉毒素B1酶标物。

3.3向每个稀释孔加入100ul标准品或样品 (每次移取均使用新枪头) , 吸打混匀, 至少吸打3次。

3.4从每个稀释孔中移取100ul混合液, 转移至相应的抗体包被微孔中 (每次均使用新枪头) , 室温孵育15分钟。

3.5孵育完成后, 将微孔中内容物倒入废液缸, 采用蒸馏水或去离子水洗涤微孔, 共洗涤4次。然后拍打微孔板, 去除残留的洗涤液。

根据样品和标准品个数, 向每个微孔中添加100ul底物 (显色剂) , 室温孵育5分钟。

按照与底物相同的添加顺序和速度向每个微孔中添加100ul终止液。

3.8使用酶标仪在450nm下读取并记录每个微孔中的OD值。

4 标准曲线的建立

根据标准品浓度及吸光值建立一个半对数坐标系统, 在标准曲线上一段范围内呈线性。

5 样品的测定

6 结果分析

将样品吸光值袋代入酶标仪特定程序, 可以得出样品1、样品3、样品4、样品5的吸光值大于于标准品浓度4.0 (ng/ml) 的吸光值, 黄曲霉毒素B1含量都小于20ppb, 合格;而样品2、样品6因吸光值小于标准品浓度4.0 (ng/ml) 的吸光值, 黄曲霉毒素B1含量都高于20ppb, 不合格。

样品2、样品6样品制备后的滤液, 分别用70%甲醇水稀释2倍、稀释4倍、稀释8倍后, 重新进行检测, 检测结果如下:

由于样品先经过70%甲醇水5:1稀释, 产品中的黄曲霉毒素B1的浓度应将读取的数据乘以5 (ppb) 。标准品中黄曲霉毒素B1的最高浓度为4.0ng/ml (ppb) , 对应样品中的黄曲霉毒素B1的最高浓度为20ppb, 因此, 如果样品黄曲霉毒素B1浓度高于20ppb, 应用70%甲醇水适当稀释再检测。所得霉变玉米的实际黄曲霉毒素B1的浓度为:19.74×8=157.92ppb;DDGS的实际黄曲霉毒素B1的浓度为:19.16×8=153.28 ppb。两种样品中黄曲霉毒素B1的含量远大于20ppb, 当牛食用这种饲料后, 所产的牛奶黄曲霉毒素M1势必超标。由此可见, 防控好牛奶中黄曲霉毒素M1的关键是把好饲料关, 严格控制好其中的黄曲霉毒素B1含量, 显而易见黄曲霉毒素B1检测的至关重要, 它能从源头杜绝牛奶中黄曲霉毒素M1超标, 保证牛奶质量安全。

参考文献

酶联免疫 篇10

ELISA是酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)的简称,是以免疫学反应为基础,将抗体、抗原的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种具有高特异性和高敏感性的实验技术。根据样本中待测物质的种类及性质不同,可以设计出各种不同类型的ELISA检测方法,包括抗体夹心法、抗原夹心法、竞争法、间接法及捕获包被法等。1971年瑞典斯德哥尔摩大学的Engvall和Perlmann[1]首次建立了酶联免疫吸附测定方法,短短几十年ELISA检测法的应用已渗入我们生活的许多方面,且在不断发展和完善,包括在临床诊断、医学研究、食品安全、植物资源、环境监测及生态学方面的应用。本文介绍了ELISA检测法的主要应用现状,并综合其优缺点对ELISA检测法的应用前景进行了展望。

1 ELISA的应用现状

1.1 临床诊断和医学研究中的应用

ELISA技术被广泛地用来检测与感染性疾病相关的病原因子以及相应的抗体、体液中的抗原成分、激素和药物等。用于临床医学类研究的标本通常以人的血液和尿液等为主,此外还包括粪便、组织等。在基础医学研究中ELISA检测标本则来源广泛,包括人、鼠、兔、猪、犬等多种实验用动物的血液、组织、细胞及细胞培养的上清液等[2]。

ELISA可以测定的项目包括:(1)抗原及其抗体的检测。ELISA在传染性疾病和病毒检测中具有突出的优势,如甲型H1N1流感病毒[3]、艾滋病毒、巨细胞病毒、柯萨奇病毒A组16型[4]、狂犬病毒、肝炎病毒、肠道病毒、风疹病毒、疱疹病毒和脊髓灰质炎病毒等,其敏感性都超过目前常用的检查方法。在细菌感染的检测方面包括:链球菌、金黄色葡萄球菌[5]、布氏杆菌等。ELISA在免疫性疾病方面可进行自身免疫病抗体的测定以及对过敏的诊断,如检测各种过敏原的抗体、甲状腺球蛋白抗体、红斑性痕疮抗体[6]、血清抗碳酸酐酶Ш抗体[7]等。(2)蛋白质的检测。各种免疫球蛋白;肿瘤标志物如:甲胎蛋白、胰岛素、癌胚抗原、磷酯酰肌醇蛋白聚糖3[8]、诱骗受体3(DcR3)[9]、前列腺碱性磷酸酶;其他蛋白等;(3)非肽类激素的检测。如:雌二醇、皮质醇等;(4)血液中药物浓度的检测。如:治疗心脏病类药物、抗哮喘药物、抗癫痫药物、抗生素、庆大霉素等[10]。这些利用ELISA建立起来的检测方法为保障人们的健康与安全提供了一种便捷有效的途径。

1.2 食品安全方面的应用

食品是人类赖以生存的物质基础,食品的安全问题关系到人类的健康和国计民生的重大问题。随着食品工业的发展,传统的分析方法已经不能满足食品检测的需求。ELISA在食品检测中得到了广泛的应用:(1)食品饲料中微生物的检测。用该法对沙门菌、李斯特菌、大肠杆菌、曲霉、毛霉等进行检测,反应特异性和敏感性高,检测时间短;(2)食品中毒素的检测。主要用于水产生物毒素的检测。李闽针等[11]建立了应用ELISA检测麻痹型贝类毒素的方法,检测过程仅需1h且灵敏度高;(3)食品中残留药品的检测。主要涉及动物和植物性食品的检测,包括动植物体内的抗生素,添加剂和药物残留(如水果蔬菜中的百草枯、蜂蜜中的磺胺类药物[12]);用于兽药残留尤其是动物性产品中兽药残留的检测[13](链霉素、氯霉素、青霉素、四环素、盐霉素、磺胺二甲基嘧啶等)。传统的仪器分析方法(高效液相色谱法,气相色谱法,薄层色谱法等)在兽药残留分析中虽然具有较大的优势,但其前处理过程复杂、仪器昂贵、效率低下,不能适应以筛选为目的的大量检测样本分析。ELISA由于具备灵敏度高、特异性强、方便和成本低等优点,越来越多的被应用到兽药残留检测。(4)外源性污染物残留,富集作用,寄生虫、细菌、病毒等的感染[14]以及食品中其他成分的检测。如对鲜乳中三聚氰胺的检测[15]和食品中"瘦肉精"的检测[16]。(5)转基因食品的检测。国外已开发出用于检测转基因食品的PCR-ELISA试剂盒,我国也建立了转基因食品(如大豆,水稻,鱼)的PCR-ELISA检测法。雷勃钧等[17]使用PCR-ELISA法对大豆品种进行转基因的定性检测,灵敏度高达0.1%,达到国际领先水平。

1.3 植物资源研究方面的应用

ELISA在植物资源方面的应用主要包括:(1)用于植物病毒的流行病学分析,研究不同的寄主和介主的关系。随着我国植物种质资源的引进和生态环境的改变,植物病毒株系分化和变异也不断出现。利用ELISA对植物病毒的分布情况进行追踪调查,研究变异株系的地域性,对植物流行病学的研究具有指导意义。李瑛等[18]利用ELISA对兰州百合病毒进行检测,发现兰州百合病情含量随着种植年限的增加而增加;施曼玲等[19]利用三抗体夹心ELISA对芜菁花叶病毒(TuMV)进行了检测,测定出7种农作物上有TuMV感染。(2)用于种子健康测试。秦碧霞等[20]从感染黄瓜绿斑驳花叶病毒的葫芦植株上收取种子,通过双抗体夹心酶联免疫吸附法检测种子的带毒情况,检出率为100%。(3)大规模经济作物中的植物病毒以及自然寄主中的植物病毒的检测等。目前ELISA检测已经应用到番茄、黄瓜、甜菜、甘蔗、花生等多种经济作物病毒的检测和预防。(4)中药材有效成分质量的检测。谭铭铭等[21]使用抗SSa单克隆抗体建立竞争性ELISA法测定广州市售柴胡药材中柴胡皂苷a(SSa)的含量,发现市售柴胡药材质量参差不齐,约30%不符合药典要求。

1.4 环境监测方面的应用

80年代后期,随着半自动化和自动化ELISA分析仪的问世和发展,ELISA技术在药物残留检测中的应用也越来越广泛。可以用于检测水、土壤中的异内甲草胺、苯并咪叶及多种农药等。有机磷和菊酯类农药广泛用于全球各国,为农业发展起了重要作用。但由此产生的毒物经生物圈物质循环后重新汇集到水中,对水环境产生负面影响;海藻水华产生的微囊藻毒素(MCs)是一类环状七肽毒素,具有很强的毒性,人类饮用被污染的水源后残留在体内的毒素逐渐积累富集会造成人体中毒。ELISA被用于水质检测已有多年,近年来刘延凤等[22]建立了氯菊酯农药残留的ELISA检测方法,抗血清检测线性范围为10~800μg·L-1,平均回收率大于97%,且与其他类似结构农药交叉反应率很低。此外,氯代芳烃化合物,二恶英化合物等有机物长期以来一直是环境科学研究的热点,ELISA法在如何快速检测其在水质,土壤,空气中的浓度发挥了重要作用。

1.5 生态学研究中的应用

食物关系分析可能使我们更好地理解和预测生态系统的一些基本过程,更好地了解相互作用的多物种系统的多样性格局和动态,为害虫管理提供新思路。目前,研究者们认为最有前途、应用最多的检测捕食作用的方法是以免疫学为基础的ELISA检测法[23]。最早将ELISA引入捕食作用研究的是Fichter和Stephen。此后,Ragsdale等[24]应用ELISA研究了大豆上一系列捕食者对稻绿蝽的捕食作用。刘雨芳,张古忍等[25]使用酶联免疫吸附试验双抗体夹心法对稻田节肢动物(捕食天敌、水稻害虫、和昆虫)之间的捕食关系进行了研究,为稻田捕食性节肢动物亚群落的重建和发展的研究提供了一定的参考依据。

2 ELISA在免疫检测中的优点

ELISA检测所需仪器化程度低、操作简便,对样本预处理要求简单,易于推广,具有准确、灵敏、特异、快速、经济等特点,除此之外,还有很重要的一点,即对环境没有污染。基于这一系列的优点,使得ELISA成为免疫检验中的主导技术,得到了快速的发展和广泛的应用。国际上许多权威机构将其列为优先发展的分析技术之一。

与其他检测方法相比,ELISA检测法具有明显的优越性。在口蹄疫诊断检测中新型ELISA(单克隆抗体ELISA、生物素-亲和素ELISA及Dot-ELISA)得到了广泛的应用[26];在梅毒血清学检测中,应用ELISA、TPPA(螺旋体明胶凝集试验)、TRUST(甲苯胺红不加热血清学试验)和RPR(快速血浆反应素试验)四种方法检测梅毒和非梅毒血清,检测结果的阳性率和假阳性率表明:ELISA法敏感性、特异性强都相对较好,是目前梅毒血清学检测的首选方法[27]。应用ELISA方法对鲜奶及肉制品中沙门氏菌进行检测的研究表明:与国际法相比,直接ELISA检验更可靠,同时也可以显著消除样品的非特异性干扰,可以进行大量样品的快速检测[28]。

随着制备单克隆抗体技术的发展,将其和ELISA方法互相结合,极大地提高了分析检测的灵敏性与可靠度。PCR-ELISA技术是将PCR技术、探针技术和ELISA技术三者结合起来的一项技术,即在PCR扩增以后,在微板上借用ELISA的原理,使用酶标抗体,进行固相杂交来实现定量。近年来PCR-ELISA技术被应用于致病菌、病毒的检测,由于该方法是PCR和ELISA技术的结合,是一种两级放大系统、灵敏度高,同时这种方法避免了PCR产物分析时的电泳及染色过程,与普通PCR和荧光PCR相比具有更为快捷、简便和灵敏等优点。除此之外,在端粒酶检测,寄生虫检测,血型基因分型,菌种鉴定等领域也取得了一定的进展[29]。

3 ELISA的局限性及展望

ELISA作为一项免疫检测技术,同时也具有一定的局限性,例如:在所检测的生物学样本中有可能存在各种干扰实验的因素,此外,在实验过程中影响结果的因素也比较多[30,31]。在ELISA定性测定实验中,阳性判定值(Cut-off)的建立是在一定的统计学基础上的,对于某一特定的受检者来说,有可能并不具备适用性。如在使用ELISA方法检测HIV时,检测所得的阳性结果或许并不是真正的阳性,需要利用其他方法如蛋白印迹、重组免疫印迹或中和试验来确认,才能报告阳性。

ELISA测定的基础是抗原与抗体的特异性反应。因此,如果检测抗原,则要求抗体特异性。此外,待测抗原还必须有能与抗体相结合的抗原决定簇,若因某些原因(突变导致某些位点不表达,结合位点因某些原因被封闭或阻断)影响了抗原和抗体的结合,就会造成假阴性结果。如检测抗体,除要求所用包被抗原尽可能包含所有的特异抗原决定簇,还要尽可能不含非特异成分,但是,这一点往往由于受到技术水平的限制难以完全做到。因此,假阳性和假阴性的结果是不能完全避免的。相信随着技术水平的提高,检测所需的抗体和包被抗原的特异性也会得到进一步的提高,从而最大限度的避免假阴性结果的出现,提高检测的准确性。

酶联免疫 篇11

1 资料与方法

1.1 对象

收集郑州大学第一附属医院2013年3月1日-2013年9月30日门诊和住院患者818例, 男182例, 女636例, 年龄在8~80岁, 平均 (42.4±17.3) 岁。按照临床诊断将病例分为SLE组与非SLE组, SLE组360例, 非SLE组458例, 包括类风湿关节炎 (RA) 128例、干燥综合征42例、皮肌炎55例, 显微镜下多血管病41例, 混合结缔组织病27例, 抗磷脂抗体综合征17例, 硬皮病10例, 风湿性多肌病9例, 其他疾病129例。SLE的诊断依据1997年美国风湿病学学会修订的SLE分类标准[2], 非SLE的各类疾病均符合相应的国际分类诊断标准。采集受试者肘静脉血, 离心分离血清, 当日完成检测。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 试剂

抗核小体抗体Ig G试剂盒 (酶联免疫吸附法) 和抗核抗体谱 (Ig G) 试剂盒 (欧盟印迹法) 均为德国EUROIMMUN公司产品。

1.2.2 仪器

芬兰雷勃Multiskan MK3型号酶标仪, XD236自动蛋白印迹仪为上海迅达医疗仪器公司产品。

1.3 方法

1.3.1 ELISA法

采用德国EUROIMMUN公司生产的抗核小体抗体Ig G试剂盒 (酶联免疫吸附法) , 方法及步骤如下:已包被核小体的微孔板中加入1∶201稀释的血清100μL, 室温孵育30 min, 冲洗3次后加入100μL酶结合物, 室温孵育30 min, 冲洗3次后加入100μL底物显色剂, 室温避光孵育10 min后每孔加入100μL终止液, 在30 min内应用酶标仪450 nm比色, 检测A值。结果判定:以20RU/m L作为Cut-off值, 结果<20 RU/m L为阴性, 结果≥20 RU/m L为阳性。

1.3.2 Western blot法

采用德国EUROIMMUN公司生产的抗核抗体谱 (Ig G) 试剂盒 (欧盟印迹法) , 方法及步骤如下:患者样本用样本缓冲液1∶101稀释, 取所需膜条用1.5 m L样本缓冲液预处理5 min, 吸去孵育槽中的液体, 加入1.5 m L已稀释的血清样本, 在摇床上室温孵育30 min, 清洗3次, 每次5 min, 加入1.5 m L稀释的酶结合物室温孵育30 min, 再清洗3次, 每次5 min, 加入1.5 m L底物液室温孵育10min, 用蒸馏水清洗膜条3次, 每次1 min, 取出膜条风干后按照膜条上条带标记位置判读结果, 与非抗原包被区比较, 阳性反应将在相应的抗原处呈现深色条带, 抗原位置出现白色条带判读为阴性。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行分析。ELISA与WB检测Anu A的阳性率比较采用χ2检验, 两种方法诊断SLE的准确度比较采用χ2检验, 敏感性和特异性比较采用ROC曲线分析, 曲线下面积比较采用Z检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ELISA和Western blot两种方法检测结果

ELISA与WB检测818例患者Anu A阳性率分别为35.1% (287/818) 和31.1% (254/818) , 两者差异有统计学意义 (χ2=14.4, P<0.05, 见表1) 。两种方法检测Anu A结果的总一致率为91.3%, 其不一致情况以WB阴性而ELISA阳性多见 (6.4%) 。以SLE的临床诊断为金标准, 360例SLE患者中, ELISA与WB检测Anu A阳性率分别为72.5% (261/360) 和66.1% (238/360) , 两者差异有统计学意义 (χ2=9.13, P<0.05) ;两种方法检测SLE的准确度分别为84.7%和83.1%, 差异无统计学意义 (χ2=0.766, P>0.05) ;ELISA检测Anu A诊断SLE的敏感度为72.5%, 特异度为93.2%, WB检测敏感度为66.1%, 特异度为96.5% (见表2) , 两者ROC曲线下面积分别为0.840和0.813, 差异无统计学意义 (Z=1.23, P>0.05, 见附图) 。

2.3 ELISA和Western blot检测Anu A结果分析

818例患者中, ELISA共检测出287例Anu A阳性, 其中261例为SLE患者, 19例为非SLE自身免疫病患者, 7例为其他疾病患者;WB共检测出254例Anu A阳性, 其中238例为SLE患者, 7例为非SLE自身免疫病患者, 9例为其他疾病患者。

SLE组中, ELISA检测结果<20 RU/m L的99例患者中, 84例 (84.8%) WB检测结果为阴性, 15例 (15.2%) WB检测为弱阳性;ELISA检测结果为 (20~99) RU/m L的83例患者中, 38例 (45.8%) WB检测结果为阴性, 29例 (34.9%) WB检测结果为弱阳性, 16例 (19.3%) WB检测结果为阳性;ELISA检测结果>100 RU/m L的患者中, WB检测结果均为弱阳性和阳性, 以阳性者居多 (148/178, 83.1%) (见表3) 。非SLE组中, ELISA检测结果<20 RU/m L的432例患者中, 仅4例 (0.9%) WB检测结果为弱阳性, 其余428例 (99.1%) 患者WB检测结果均为阴性;ELISA检测结果为20~99 RU/m L的19例患者中, 13例 (68.4%) WB检测结果为阴性, 其余6例 (31.6%) 检测结果为弱阳性;ELISA检测结果>100 RU/m L的7例患者中, 6例 (85.7%) WB检测结果为阳性, 仅有1例 (14.3%) 患者ELISA检测值>200 RU/m L而WB检测结果为阴性。见表4。

3 讨论

系统性红斑狼疮是一种累及多系统、多脏器的自身免疫性疾病, 其特征是患者体内可产生多种针对细胞核结构和组分的自身抗体。Anu A是以核小体为靶抗原而产生的自身抗体, 属于自身抗体的一种。近年来研究显示, Anu A比抗ds DNA抗体和抗组蛋白抗体更早出现于系统性红斑狼疮的早期[3], 特异度较高, 并且Anu A与SLE疾病活动性及狼疮性肾炎 (LN) 的发生明显相关[4,5]。

目前检测Anu A的方法较多, 有化学发光免疫分析 (CLIA) 、WB、ELISA、间接免疫荧光法 (IIF) 、胶体金免疫层析法 (CGCIA) 和酶联免疫斑点法 (ELISPOT) 等。本研究针对以上检测方法, 选择了在临床工作中应用较多的ELISA法和WB法进行比较, 并结合临床诊断对两种方法进行对比分析, 客观评价二者的试验性能。WB用于体外定性检测血清或血浆中的人抗核小体的Ig G类抗体, 操作简便, 适合基层实验室开展。张国庆等[6]人应用免疫印迹法检测Anu A, 显示在SLE中阳性率达72.4%, 敏感度72.4%, 特异度达97.7%。ELISA用于在体外定量或半定量检测人血清或血浆中抗核小体Ig G类抗体。DOSTAL等[7]应用ELISA检测Anu A在SLE中的阳性率为73%, Anu A在SLE患者、狼疮性肾炎患者及神经精神性狼疮患者体内的浓度分别为为76 IU/m L, 139 IU/m L和117 IU/m L, 远高于其他自身免疫病患者及健康对照。SULEIMAN等[8]对90位SLE患者应用ELISA法进行检测, Anu A阳性率 (52.2%) 高于抗ds-DNA抗体阳性率 (36.7%) 。秦莉[9]等对ELISA法检测Anu A进行系统评价, 结果显示Anu A对SLE的诊断平均敏感度为64.9%, 平均特异度为92.6%, 提示其漏诊率高 (34.1%) , 误诊率较低 (7.4%) ;并推荐ELISA法检测Anu A用于SLE诊断, 但也表明该方法不适合用于SLE筛查。胡学芳等[10]人应用ELISA法检测122例SLE患者, 结果显示Anu A阳性率为68.85%, 敏感性为68.85%, 特异性为90.91%, 并且Anu A在SLE合并LN的患者中阳性率为84.48%, 提示Anu A与SLE的肾损害有明显关系。

本研究结果显示, ELISA检测Anu A阳性率 (35.1%) 高于WB (阳性率31.1%) , 两者差异有统计学意义 (P<0.05) , ELISA检测值较高时WB的灰度也较深, ELISA检测值较低时WB的灰度也较浅, 多为弱阳性。ELISA检测结果阳性而WB检测结果阴性时, ELISA检测值多在20~99 RU/m L之间, ELISA检测结果阴性而WB检测结果阳性时, WB检测结果均为弱阳性, 说明两种方法检测Anu A结果的总一致率较高, 符合性较好。

在SLE的诊断方面, 两种方法对SLE诊断的敏感性和特异性比较采用ROC曲线分析。ROC曲线即受试者工作特征曲线, 是反应敏感度和特异度连续变量的综合指标, 其曲线下面积越大, 诊断准确性越高, 可用于两种诊断方法的统计学比较。ELISA与WB诊断SLE的ROC曲线下面积分别为0.840和0.813, 提示两者对SLE的诊断准确性均较高, ELISA略高于WB, 但是两者差异无统计学意义 (P>0.05) 。ELISA检测SLE的敏感度为72.5%, 特异度为93.2%, WB检测SLE的敏感度为66.1%, 特异度为96.5%, 与国内外文献基本相符[6,7,8,9,10]。

因此, ELISA与WB检测Anu A的总一致率高, 对SLE诊断的准确度较高, 敏感度和特异度均较好。目前, 在我国风湿病实验室普遍采用WB进行抗核提取物抗体谱 (ENA) 的检测, 虽然WB与ELISA检测Anu A在SLE诊断中的准确度及ROC曲线下面积差异无统计学意义, 但是ELISA可以定量检测Anu A的浓度, 可以观察血清抗体的变化与临床和实验室指标的相关性, 对疾病的监测和指导更优于WB检测方法, 不过ELISA检测试剂价格高于WB, 在基层实验室的开展也有很大的局限性。因此, 应用WB进行Anu A检测的初筛, 需要时应用ELISA进行复检, 可以提高6.4%的Anu A检测阳性率, 为临床提供更好的SLE诊断及疾病活动度的信息。

摘要：目的 比较酶联免疫吸附法 (ELISA) 和免疫印迹法 (WB) 检测抗核小体抗体 (Anu A) 的差异, 为临床工作寻找合适的检测方法。方法 收集818例临床血标本, 其中系统性红斑狼疮 (SLE) 360例, 其他自身免疫性疾病458例, 同时采用ELISA和WB两种方法检测样本血清中Anu A, 计算每种方法的敏感度、特异度、ROC曲线, 并运用SPSS 17.0进行统计学分析。结果 ELISA与WB检测Anu A的阳性率分别为35.1%和31.1%, 两者差异有统计学意义 (P<0.05) 。准确度、敏感度和特异度无差异。结论 ELISA与WB检测Anu A的总一致率高, 对SLE诊断的准确度较高, 敏感度和特异度均较好。提示临床监测时, 可应用WB进行Anu A检测的初筛, 需要时应用ELISA进行复检, 可以提高6.4%的Anu A检测阳性率, 为临床提供更好的SLE诊断及疾病活动度的信息。

关键词：酶联免疫吸附法,免疫印迹法,抗核小体抗体

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