免疫分子

免疫分子（精选6篇）

免疫分子 篇1

猪繁殖与呼吸综合症 (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) , 因发病猪耳部发绀呈紫红色斑块状, 又称“蓝耳病”。它是由猪繁殖与呼吸综合症病毒 (PRRSV) 感染引起的一种传染病, 该病主要导致母猪繁殖障碍 (流产、死胎和木乃伊胎增多等) 、仔猪呼吸道症状和高死亡率以及公猪精液品质下降等[1]。PRRS自1987年首次在美国发现以来, 几年之内席卷了北美洲、欧洲和亚太地区, 至今仍在世界范围内流行, 被公认为是危害养猪业的头号传染病。特别是2006年5月以来, 由高致病性PRRSV引起的突发疫情“高热病”在我国很多省份暴发和流行, 给我国养猪业造成了巨大的经济损失[2,3]。

PRRSV属于有囊膜的正链单股RNA病毒, 存在欧洲型和美洲型两类, 我国猪群主要感染美洲型。PRRSV有严格的宿主和细胞嗜性, 猪肺泡巨噬细胞 (Porcine alveolar macrophage, PAM) 是其重要的靶细胞, PRRSV可破坏机体的免疫系统, 导致猪免疫抑制, 抗病力下降, 容易导致继发感染或混合感染。该文通过对其逃逸宿主天然免疫机制方面的研究, 进一步为其防治及免疫提供理论基础。

1 天然免疫系统

天然免疫系统是宿主抵抗病原微生物的第1道防线, 也是获得性免疫的基础, 可识别外源微生物早期感染并诱导炎症反应, 在获得性免疫发挥作用之前起到非常重要的作用。天然免疫系统主要由吞噬细胞和抗原递呈细胞介导, 通过其表面的PRRs (Pattern recognition receptors) 识别病原中的PAMPs (Pathogen associated molecular patterns) 而被活化, 从而激活一系列相关信号通路, 诱导I型干扰素 (IFN) 和炎症相关因子表达, 产生非特异性抗外源微生物反应[4]。天然免疫识别是由种系编码的受体介导的, 受体特异性是由遗传决定。

2 干扰素 (IFN)

干扰素 (IFN) 是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的细胞因子, 是抗病毒天然免疫的核心因子。IFN通过与细胞膜上特异性受体结合激发信号级联放大反应, 并最终将信号传递到胞核内, 调控一系列基因表达, 激活相应AVP表达, 发挥抗病毒效应[5]。IFN参与不同信号通路, 有多重激活机制, 然而抗病毒的核心在于IFN的激活, 以及其下游基因的表达和作用, 启动天然免疫抗病毒机制。

2.1 I型IFN

I型IFN激活可激发第二波的抗病毒反应, 它可诱导下游300多个干扰素刺激基因 (IFN-stimulated genes, ISGs) 的表达, 共同保护宿主细胞免受病毒感染, 抑制病毒复制, 诱导被感染细胞凋亡[6]。I型IFN是抗病毒天然免疫反应中的关键效应分子, 如IFN-α、IFN-β等, 它们受到多种转录因子的精细调控, 主要包括IRF家族成员、NF-κB、ATF2 (Activating transcription factor2) 等[7]。

宿主细胞的PRRs主要有Toll-like receptors (TLRs) 、RIG-I-like receptors (RLRs) 、Nodlike receptors (NLRs) 和C-type lectin receptors (CLRs) 。不同类型的PRRs通过其特定的信号级联反应促使相应的转录因子活化, 转录因子再进一步调控下游一系列靶基因的表达, 如I型IFNs、IL-8、IL-10、IL-12、IL-6、IL-1β和TNF-α等[8]。

2.2 I型IFN参与信号通路

I型IFN参与的信号通路包括JAK-STAT信号通路、RIG-Ⅰ信号通路以及TLR/NF-κB信号通路等。

2.2.1 JAK-STAT信号通路

JAK-STAT通路是目前研究最多也是最重要的IFN信号通路。IFN-α/IFN-β与相应受体结合后JAKs被激活, 活化以后的JAKs可磷酸化受体复合物的其它成分和STATs, STATs形成二聚体, 暴露出入核信号, 从而转移至核内, 结合顺式DNA元件, 这一元件存在于I型IFNs诱导的基因, 调节干扰素激活基因表达抗病毒蛋白 (Antiviral protein, AVP) [9]。在病毒感染的细胞, IFN能诱导产生多种AVP, 它们可破坏病毒RNA、抑制病毒转录或蛋白合成, 从而发挥抗病毒效应。

2.2.2 RIG-Ⅰ信号通路

RIG-Ⅰ及其同源物MDA5以及LGP2检测细胞内RNA病毒的受体。这些受体会将病毒入侵的信号通过一个共有的接头分子IPS-I传递到下游, 并最终诱导I型IFN的产生和抗病毒免疫反应[10]。孙岳平等[11]研究发现, RIG-Ⅰ在介导IFNs对细胞的抗病毒保护作用方面起十分关键的作用, 并参与了IFNs对细胞的生长抑制。RIG-Ⅰ缺失后IFNs对细胞的抗病毒保护作用明显受损, 同时细胞的生长抑制也明显减弱。且RIG-Ⅰ缺失后会导致IFNs对其下游的细胞因子和趋化因子的诱导作用较正常细胞有明显的下降。说明RIG-Ⅰ在IFNs介导的炎症反应中起重要作用。

2.2.3 TLRNF-κB信号通路

TLR通过选择性地识别PAMP的保守结构, 实现对入侵病原体的早期识别, 激活天然免疫[12]。在TLR识别其相应配体之后, TLR可招募接头蛋白MyD88, MyD88随后可募集IRAK (IL-1receptor associated kinase) 使干扰素调节因子 (Interferon regulated factor, IRF) 磷酸化, 并转移到细胞核内, 从而激活转录因子NF-κB和MAP激酶等, 诱导IFN及炎症细胞因子的表达[13]。

3 PRRSV破坏宿主免疫系统的分子机制

3.1 PRRSV影响I型IFN转录水平的表达

PRRSV可以抑制I型IFN的产生, 从而破坏宿主免疫系统。许多研究表明, PRRSV可下调I型IFN的表达[14], 使宿主失去及时清除入侵病毒的能力。此外, PRRSV可以长期存在于宿主体内逃避宿主的免疫系统攻击[15], 使宿主持续反复地感染发病。于琳琳[16]研究发现PRRSV感染早期对猪体造成较明显的免疫抑制, 感染7~10d, 猪体免疫力才逐渐表现出恢复的趋势。PRRSV感染引起猪的呼吸系统障碍, 主要是因为诱导许多炎症因子 (IFN-γ、IL-10、TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-12等) 的表达造成肺组织损伤。研究发现, 用PRRSV感染MARC-145细胞后, INF-α和INF-β表达没有变化, 但是用外源性dsRNA处理细胞后, 能够产生大量的Ⅰ型IFN;当用dsRNA和PRRSV同时处理MARC-145细胞后, Ⅰ型IFN产生但很快又受到强烈抑制[17]。由此可见, PRRSV感染直接影响了I型IFN转录水平的表达, 逃逸宿主天然免疫反应。

3.2 PRRSV抑制IFNs下游信号通路

用编码猪IFN-α的质粒作为免疫佐剂可暂时性加强PRRSV疫苗免疫后的免疫应答, 但还不足以引起理想的保护性免疫[18]。Brockmeier等[19]发现与直接感染PRRSV的猪相比, 利用Ad5-pINF-α质粒人为上调猪IFN-α表达水平后, 可延迟病毒血症, 降低病毒载量。该方法可在感染早期降低病毒复制, 然而并不能有效提高感染中后期整体免疫反应。这可能一方面是外源的IFNs无法在猪体内有效持续表达, 另一方面是因为PRRSV不仅抑制IFNs激活, 也能抑制IFNs下游的信号通路基因 (ISGs) 而抑制免疫应答[20]。目前, 对于PRRSV抑制Ⅰ型IFN转录及转录后调控的分子机制还知之甚少。Wang等[21]发现, 天然免疫相关miR-125b能显著抑制PRRSV的RNA复制和病毒增殖, miR-125b并不是直接作用于PRRSV的基因组, 而是作用于宿主细胞中NF-κB的抑制因子κB-Ras2, 通过调控NF-κB信号通路抑制PRRSV的增殖。

3.3 Nsp蛋白抑制IFN表达

PRRSV还可采取多重机制作用IFN信号通路。PRRSV的多种Nsp蛋白均可抑制IFN的表达, 如Nsp11和Nsp1β均可抑制IRF3介导的Ⅰ型IFN的激活;Nsp1可通过降解核内CBP (CREB-binding protein) 抑制IFN的表达[22];Nsp1α可抑制IκBα的磷酸化, 阻断NF-κB的核转录过程, 抑制IFN-α的激活[23]。研究表明, 在PRRSV感染的早期阶段 (感染后36~48h) Nsp1、Nsp2及Nsp11可促进病毒性基因和蛋白的表达, 并同时抑制Ⅰ型IFN的产生及其相关的IFN信号通路;而到感染后期, NF-κB信号通路将被激活以协助病毒在宿主体内生存[24]。

4 不同品种猪对PRRSV的易感性差异

不同品种猪猪肺泡巨噬细胞 (PAMs) 感染PRRSV后机体产生Ⅰ型IFN的能力有差异, 抵抗PRRSV感染和抑制PRRSV增殖的能力和细胞因子的变化水平均不同[25]。这是由于不同品种猪对PRRSV易感性存在差异, 国外引进猪种较中国地方猪种易感。如肖犟[26]对比分析了PRRSV对长白、大白、杜洛克、清平、通城及梅山6个品种断奶仔猪的免疫力影响, 发现感染后5~7d开始有仔猪死亡, 3个地方品种清平、通城和梅山抵抗力显著高于3个国外品种, 其中长白猪易感性最高;于琳琳[16]对比分析了莱芜黑猪与长白猪对PRRSV的易感性, 同样发现长白猪较敏感, PRRSV感染后其组织病变明显, 而莱芜黑猪组织病变较轻微。

不同PRRSV毒株对INF-α的敏感性不同[27], PRRSV在不同细胞类型 (如MARC-145和PAMs) 中激活IFN-β的能力也存在差异。如有研究发现PRRSV能较弱激活PAMs细胞的IFN-β表达[28], 而在MARC-145细胞中却不能激活IFN-β表达[29]。不同细胞系不同猪种激活IFN表达的能力不同, 这可能与其PRRSV易感性存在密切联系。

5 结论

PRRSV能破坏宿主猪的免疫系统, 因此被比作是猪的“艾滋病”, Ⅰ型IFN信号通路介导的天然免疫反应是动物机体抵抗病毒的第1道防线, 而PRRSV可以通过多重途径抑制Ⅰ型IFN的激活及其下游信号通路, 逃逸宿主天然免疫系统。通过对PRRSV逃逸宿主天然免疫的分子机制进行总结及阐述, 进一步了解PRRSV抑制I型IFN的激活及相关的信号通路, 从而掌握其破坏宿主天然免疫系统的多种途径, 为PRRSV的防治及免疫提供理论基础。

免疫分子 篇2

应用动物模型是现代医学 (兽医学) 认识生命科学客观规律的实验方法和手段。建立遗传稳定、微生物背景清楚的实验动物封闭群, 利用基因敲除、转基因等遗传工程技术建立模式动物, 并在此基础上进行固有免疫研究已成为实验动物领域的研究热点[7]。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所培育的封闭群巴马小型猪具有体型小、易饲养、成本低和基因纯度高等优势, 是进行猪固有免疫研究的良好对象。本研究旨在为进一步完善巴马猪作为实验动物的生物学信息奠定基础。

1 材料

1.1 试验动物

封闭群广西巴马小型猪的外周血, 由哈尔滨兽医研究所实验动物研究室保存。

1.2 主要试剂

猪淋巴细胞分离液, 购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司;M-MLV反转录酶、d NTP Mixture、RNase抑制剂、Oligod T、LA Taq酶, 均购自宝生物工程 (大连) 有限公司;DNA纯化试剂盒、质粒小提取试剂盒、总RNA小量制备试剂盒, 均购自AXYGEN爱思进生物技术 (杭州) 有限公司。

1.3 登录号

本试验扩增的TLR7、TLR8、TLR9、VISA、STING和IRF3序列登录号分别为KC860783、KC860784、KC860785、KC860782、KC860780、KC860781。序列比对选择的猪序列登录号为NM_001097434、GU013761、GU138029、EU082069、FJ455509和NM_213770;牛序列登录号为GU903503.1、GQ499855.1、HQ242779.1、NM_001046620、NM_001046357和DQ103889;犬序列登录号NM_001048124和AY859723;马序列登录号为NM_001081771、NM_001111301和NM_001081790;猫序列登录号为NM_001080133、EF484949和AY859724;人序列登录号为NM_016562、NM_138636、NM_017442、DQ174270、HQ448605和HM357932。

2 方法

2.1 引物的设计与合成

根据Gen Bank中猪TLR7、TLR8、TLR9、VISA、IRF3和STING基因设计引物 (由博仕生物技术有限公司合成) , 序列见表1。

2.2 淋巴细胞总RNA的提取及反转录

参照参考文献[8]进行。

2.3 固有免疫分子的RT-PCR扩增

注:下画线部分表示酶切位点。

取反转录产物5μL, 上、下游引物 (10 pmol/L) 各1μL, 10×Buffer 2.5μL, d NTP 2.5μL, LA Taq0.5μL, 用dd H2O补足50μL。反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s, 55~60℃退火30 s, 72℃延伸4 min, 共35个循环;72℃延伸10 min。PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳观察结果。

2.4 固有免疫分子的克隆

RT-PCR产物的回收提纯按照Axygen DNA纯化试剂盒说明书提供的方法。纯化后经过限制性双酶切连接至pc DNA3.1中16℃过夜, 转化至E.coli DH5α中, Ampicillin抗性LB固体培养基筛选阳性菌落, 挑取单克隆37℃培养。

2.5 重组质粒的提取及酶切鉴定

重组质粒的提取按照Axygen说明书进行, 酶切体系见参考文献[8]。

2.6 测序及序列分析

将酶切鉴定正确的阳性质粒送于北京六合华大科技有限公司测序, 测序结果采用DNASTAR软件进行分析。

2.7 同源性分析

从Gen Bank中下载不同种属 (人、犬、牛、马、小鼠) 的TLR7、TLR8、TLR9、VISA、IRF3和STING这6种固有免疫分子的序列, 通过MEGA4.0进行进化树分析。

3 结果与分析

3.1 巴马猪固有免疫分子的RT-PCR扩增

以巴马猪外周血淋巴细胞总RNA为模板, 按照特异引物进行RT-PCR, 与预期值3 075, 3 087, 3 097, 1 575, 1 260, 1 137 bp一致, 见图1。

3.2 固有免疫分子重组质粒的酶切鉴定

提取重组质粒后, 分别用Bam HⅠ/NotⅠ, Bam HⅠ/NotⅠ, HindⅢ/EcoRⅠ, HindⅢ/XhoⅠ, HindⅢ/EcoRⅠ和EcoRⅠ/NotⅠ进行双酶切鉴定, 酶切产物电泳出现预期大小的目的片段, 见图2。

M.DL-10 000 Marker;1.Toll样受体7;2.Toll样受体8;3.Toll样受体9;4.VISA;5.IRF3;6.STING;7.无模板对照。

M.DL-10 000 Marker;1~6.分别为pc DNA-TLR7、pc DNA-TLR8、pc DNA-TLR9、pc DNA-VISA、pc DNA-IRF3、pc DNA-STING重组质粒。

3.3 巴马猪固有免疫分子的同源性分析

3.3.1 TLR7同源性分析

将得到的固有免疫分子序列与猪、牛、犬、马、猫和人TLR7核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析, 结果见表2。

%

注:核苷酸同源性/氨基酸同源性;-表示未提交序列。

采用Meg Align软件对序列进行分析, 结果表明:TLR7与猪的核苷酸和氨基酸同源性较高, 高达99.8%;与人同源性较低, 为87.4%。在氨基酸水平上, 与猪同源性较高, 高达99.7%;与人同源性较低, 为85.2%。进化树分析结果表明, 猪TLR7与牛TLR7在同一进化分支上, 见图3。

3.3.2 TLR8同源性分析

将得到的固有免疫分子的序列与猪、牛、马、猫、人TLR8核苷酸序列、氨基酸序列进行同源性分析, 结果见表2。采用Meg Align软件对序列进行分析, 结果表明:TLR8与猪同源性高达99.2%, 其次与牛同源性较高;在氨基酸水平上, 与猪同源性最高达到98.3%;与牛、马、猫、人同源性较低, 均低于80%。进化树分析结果表明, 猪TLR8与牛TLR8处于同一分支上, 见图4。

3.3.3 TLR9同源性分析

将得到的固有免疫分子的序列与猪、牛、犬、马、猫和人TLR9核苷酸序列、氨基酸序列进行同源性分析, 结果见表2。根据软件Meg Align对序列分析可知, TLR9与猪TLR9同源性高达99.5%, 其次与牛同源性较高;氨基酸水平上, 与猪同源性最高达98.9%, 与其他种属同源性较低。进化树分析结果表明, 猪TLR9与牛TLR9进化处于同一分支, 见图5。

3.3.4 VISA同源性分析

将得到的固有免疫分子的序列与猪、牛、人VISA核苷酸序列、氨基酸序列进行同源性分析, 结果见表2。采用Meg Align软件对序列进行分析, 结果表明:VISA与猪、牛、人VISA同源性分别为98.8%、83.4%、76.2%;在氨基酸水平上, 同源性分别为98.3%、73.2%、60.3%。进化树分析结果表明, 猪VISA与牛VISA处于同一分支上, 见图6。

3.3.5 STING同源性分析

将得到的固有免疫分子的序列与猪、牛、人STING核苷酸序列、氨基酸序列进行同源性分析, 结果见表2。采用Meg Align软件对序列进行分析, 结果表明:STING与猪、牛、人STING同源性分别为99.2%、88.4%、84.4%;在氨基酸水平上, 同源性分别为99.2%、87.1%、77.8%。进化树分析结果表明, 猪STING与牛STING处于同一分支上, 见图7。

3.3.6 IRF3同源性分析

将得到的固有免疫分子的序列与猪、牛、人IRF3核苷酸序列、氨基酸序列进行同源性分析, 结果见表2。采用Meg Align软件对序列进行分析, 结果表明:IRF3与猪、牛、人IRF3同源性分别为99.8%、87.0%、83.3%;在氨基酸水平上, 同源性分别为99.8%、82.8%、78.3%。进化树分析结果表明, 猪IRF3与牛IRF3处于同一分支上, 见图8。

4 讨论

本试验参考Gen Bank中猪TLR7、TLR8、TLR9、VISA、STING、IRF3序列设计引物, 以广西巴马小型猪外周血淋巴细胞mRNA为模板, 成功克隆上述分子, 序列分析结果表明, 其同源性与猪较高。TLR7、TLR8、TLR9与病毒的应答相关, 定位在内吞溶酶体中。TLR7、TLR8、TLR9在人的浆样树突状细胞 (plasmacytoid dentric cells) 中大量表达, 在静息状态下, 主要定位于内质网;在受到病原体刺激后, 可与内质网跨膜蛋白UNC93B1相互作用, 并转移至胞内体膜上以识别相应的PAMPs[8,9]。TLR7和TLR8可识别RNA病毒的ssRNA, 包括人类免疫缺陷病毒、水泡性口炎病毒和甲型流感病毒, 诱导IFN-α的产生[10,11]。TLR9主要识别未甲基化的Cp G-DNA, 如小鼠巨细胞病毒、Ⅰ型单纯疱疹病毒和腺病毒[12]。VISA定位于线粒体, 对于激活下游信号转导非常重要, 超表达的VISA能有效激活NF-κB、IRF3以及Ⅰ型干扰素的表达[13,14]。IRF3在大多数细胞中呈高水平组成性表达, 病毒感染时使得IRF3磷酸化导致其转录活性明显增加[15]。STING的N端与VISA的C端存在持续的相互作用, 并以病毒依赖的方式招募TBK1至VISA从而激活IRF3。利用RNA干扰技术沉默这个基因, 能够抑制IRF3的激活, 从而加剧病毒的感染[16,17]。

巴马小型猪凭借体型小、便于应用和与人更接近的生物学特性的优势在医学及药学研究中被广泛应用, 并被用于建立糖尿病等人类重大疾病的动物模型, 是极具潜力的实验动物。本课题组以巴马小型猪作为试验动物成功建立了猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟的感染模型[18,19]。本试验通过核苷酸和氨基酸序列同源性分析发现, 巴马小型猪的固有免疫分子与猪属高度同源, 表明巴马猪和家猪有相似的固有免疫激活途径, 这与上述巴马猪感染性疾病的研究结果相一致, 提示巴马猪可以作为试验动物代替家猪进行感染试验。本试验对巴马猪的固有免疫分子的克隆及序列分析进行了研究, 为进一步开展固有免疫的研究奠定了基础。

摘要：为了开展巴马猪的固有免疫相关研究, 试验采用巴马小型猪的外周血分离淋巴细胞, 提取总RNA, 利用特异性引物进行RT-PCR, 将克隆片段与pc DNA3.1载体相连接, 转化到大肠杆菌DH5α中, 筛选阳性克隆并进行测序, 并将测序结果提交NCBI, 比较克隆序列与已知序列的同源性。结果表明:克隆的巴马猪TLR7、TLR8、TLR9、VISA、STING和IRF3序列长度分别为3 075, 3 087, 3 097, 1 575, 1 260, 1 137 bp, 测序结果与预期相符, 各序列与猪的同源性较高。

免疫分子 篇3

大枣又称红枣，甘温归脾胃经，具有补中益气、养血安神、缓和药性的作用，用于治疗中气不足血虚等症。大枣中主要含有糖类、维生素类、氨基酸、矿质元素、环核苷酸、芦丁多糖等。动物实验研究发现大枣多糖对机体非特异免疫、细胞免疫和体液免疫均有显著的兴奋作用，可以提高免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，促进溶血素溶血空斑的形成，提高淋巴细胞转化率和外周T淋巴细胞的百分率[3]。大枣多糖能促进免疫低下小鼠腹腔巨噬细胞分泌产生IL-1、提高IL-1的活性，促进体外ConA及LPS诱导的脾细胞增殖，促进机体的免疫功能[4]。张庆等[5]实验证明大枣粗多糖亦具有促进小鼠淋巴细胞增殖作用，但作用方式略有不同，一般多糖的作用在体外均随浓度增大而增强，而大枣多糖为10μg/mL时便可观察到明显促增殖作用，在100μg/mL达最高水平，之后随浓度增大而作用减弱。大枣还具有抗炎、抗癌、抗过敏等作用。因此本研究选用大枣作为研究对象。

1 材料与方法

1.1 材料

(1) 实验动物：昆明种小鼠（SPF级），雌雄各半，体质量：18～22g。 (2) 药液制备：大枣购自本院中药房，且为《中国药典》所载品种，由中药鉴定教研室鉴定其品种和质量，采用水煎法进行煎煮并灭菌，冷却后将所得药液密封放入4℃冰箱保存。 (3) 试剂及仪器：0.9%生理盐水、泛福舒、ELISA小鼠用sIgA定量试剂盒、SpectraMax340PC型酶标仪、离心小管、微量移液器、眼科剪、眼科镊、穿刺针或4号半头等。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组

将50只昆明种小鼠随机分组，阳性对照组10只，阴性对照组10只，大枣低、中、高组每组10只，均雌雄各半。

1.2.2 给药方法

(1) 阳性对照组：实验选取临床常用于防治呼吸道感染的生物制剂细菌溶解产物为阳性对照药物，给予临床给药剂量的细菌溶解产物水溶液灌胃，连续10d。 (2) 阴性对照组：给予0.9%生理盐水灌胃，连续10d。 (3) 大枣低、中、高剂量组：分别给予各组小鼠低、中、高浓度的大枣水煎剂灌胃，连续10d（甘草中组为临床等效剂量，三组给药浓度的比例为1∶5∶25）。

1.2.3 测定sIgA的含量

给药10d后，处死小鼠，行颈部解剖，用穿刺针插入气管上端，0.8mL生理盐水反复冲洗3遍，回收灌洗液，应用酶联免疫法（双抗体夹心法）检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中sIgA的含量。

1.3 统计学处理

正态分布的计量资料进行levene方差齐性检验，满足方差齐性的用单因素的方差分析，两两比较采用最小显著差异t检验（leas significant difference, LSD）。所有实验数据均采用SPSS16.0统计软件和2003 Excel进行统计分析处理。

2 结果

大枣不同剂量组对小鼠呼吸道黏膜免疫分子sIgA的分泌均有一定的促进作用，低、中、高剂量组sIgA的含量明显高于与阴性对照组，且P<0.05差异均有统计学意义；与阳性对照组比较，大枣对sIgA的调节作用低于阳性对照组（P<0.05）；大枣低中高剂量组比较，低剂量组sIgA的含量高于中、高剂量组，表明大枣低剂量组对呼吸道黏膜免疫分子sIgA的调节作用优于中高剂量组。见表1。

注：与阳性对照组比较*P<0.05，与阴性对照组比较注:与阳性对照组比较*P<0.05, 与阴性对照组比较△P<0.05, 与大枣低剂量组比较▲P<0.05每组n=10只

3 讨论

目前临床用于防治反复发作的呼吸道感染已从单纯的抑菌、杀菌，转换为换到促进人体黏膜免疫系统功能，通过激活或刺激各种免疫活性细胞的功能，产生免疫分子，达到局部防治感染的目的。临床常用的有瑞士欧姆制药厂生产的泛福舒（bacterial lysates，细菌溶解产物）、白葡奈氏菌片等。泛福舒是由8种常见细菌溶解物（流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、卡他奈瑟氏菌、草绿色链球菌、化脓性链球菌、肺炎克雷白菌、臭鼻克雷白菌）组成，白葡奈氏菌片是由白色葡萄球菌、奈瑟卡他球菌、枯草芽孢杆菌以20:20:1的比例构成。它们以抗原的形式经口服进入肠道，刺激肠道黏膜免疫系统发生免疫反应，肠道黏膜免疫系统前体IgA B细胞和Th细胞传播到远端效应部位上呼吸道，产生免疫分子，达到局部防治感染的目的。国外学者对泛福舒治疗呼吸道感染性疾病进行了研究，Lusuardi等[6]的双盲对照实验显示，支气管肺泡灌洗液中IgA的水平较治疗前明显升高，Zielnik-Jurkiewicz等[7]的研究也提示，泛福舒可以使血清内细胞活素向有益于机体的方向发生变化，从而预防反复呼吸道感染。SteurerStey等[8]的研究提示，使用泛福舒治疗反复呼吸道感染可以减少感染发作次数，减轻再次发作程度，同时减少抗菌素的反复使用。综上研究表明泛福舒作为抗原刺激黏膜免疫系统，激活免疫细胞的活性，促进sIgA的分泌，达到防治上呼吸道感染的目的。

泛福舒虽由八种灭活的细菌溶解产物构成，但在临床使用的过程中仍有不良反应的报道[9]，且对于免疫系统发育不完善的6个月以内婴儿禁用。大枣为临床中常用的中药，本实验研究表明大枣能够促进黏膜免疫分子sIgA的分泌，增强黏膜免疫的功能。中药作为我国特有的资源，对免疫功能具有双向调节的作用，与生物免疫制剂比较具有安全性较高、生产、来源容易的优势。因此从中药中选取增强黏膜免疫功能、促进黏膜免疫效应分子sIgA的分泌，是今后研发防治感染性疾病免疫制剂的一个方向。

摘要：目的 观察大枣对呼吸道黏膜免疫分子sIgA的调节作用, 进一步探讨大枣补气的机理, 为研发增强呼吸道黏膜免疫功能, 防治呼吸道感染的中药制剂提供依据。方法 通过灌胃给予小鼠不同剂量的大枣10d后, 检测小鼠支气管肺泡灌洗液 (BALF) 中免疫分子sIgA的含量。结果 大枣对小鼠呼吸道黏膜免疫分子sIgA的分泌有一定促进作用, 大枣低剂量组对sIgA的调节作用优于中、高剂量组。结论 大枣补气的机制之一是促进呼吸道黏膜免疫分子sIgA分泌, 可作为临床对易感人群防治呼吸道感染的中药免疫增强剂。

关键词：大枣,呼吸道,黏膜免疫分子sIgA,实验研究

参考文献

[1]Evans P, Der G, Ford G, et al.Social class, sex, and age differencesin mucosal immunity in a large community sample[J].BrainBehav Immun, 2000, 14 (4) :41-48.

[2]李舍花, 武延隽, 孟莉.反复呼吸道感染患儿细胞免疫功能的观察[J].中国儿童保健杂志, 1999, 7 (1) :28-29.

[3]徐军发, 侯敢, 黄连南, 等.酵母多糖对小鼠腹腔巨噬细胞产生一氧化氮和细胞介素-1的影响[J].中国生物药物杂志, 2002, 23 (2) :67.

[4]苗明三.多糖对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1α及脾细胞体外增殖的影响[J].中药药理与临床, 2004, 20 (4) :21-22.

[5]张庆, 雷林生, 林勤保, 等.大枣多糖体外抗补体活性及促进小鼠脾细胞的增殖作用[J].中药药理与临床, 1998, 14 (5) :19-21.

[6]Lusuardi M, Capelli A, Donner CF.Lung immune defences afterstimulation of gut-associated lymphoid tissue with OM-85 BV:adouble-blind study in patients with chronic bronchitis[J].Eur Re-spir Rev, 1996, 6 (3) :182-185.

[7]Zielnik-Jurkiewicz B, Jurkiewicz D, Stankiewicz W.Effectiveness of Broncho-Vaxom in prevention of recurrent upper respiratory tract infection in children[J].Pol Merkur Lekarski, 2005, 19 (113) :625-662.

[8]Steuer-Stey C, Lagler L, Straub DA, et al.Oral purified bacterialextracts in acute respiratory tract infections in childhood:a system-atic quantitative review[J].Eur J Pediatr, 2007, 166 (4) :365-376.

免疫分子 篇4

分子对接 (molecular docking) 方法是基于受体结构的药物设计 (Structure-based drug design, SBDD) 中的重要方法之一[1], 就是将小分子配体放置于受体的活性位点, 寻找其合理的取向和构象, 使得配体与受体结合形状和相互作用匹配最佳。20世纪80年代, Kuntz[2]等发展了模拟小分子与生物大分子结合三维结构及其强度的计算方法——分子对接方法, 并开发了第一个分子对接程序DOCK。之后一些比较成功的、表性的软件有DOCK, AutoDock, FlexiDock和F1exX[3]。

目前, 已经有许多优化算法用来解决分子对接问题, 典型的模拟退火算法、遗传算法、禁忌搜索算法、蒙特卡罗方法以及这些算法的各种修正变种[4]。也出现了一些随机算法, 如随机聚点搜索算法[5]、随机近似平滑算法和势能平滑搜索算法[6]等。另外, 分子动力学方法也常被用来进行构象搜索。最近, 粒子群算法和蚁群算法[7]也被引入药物分子对接构象搜索中。

在AutoDock[8]中采用的是拉马克遗传算法, 算法在性能上比传统的遗传算法有所改进, 但是算法不能有效地使用先验知识, 影响了算法的搜索效率和质量。本文提出一种基于人工免疫原理的自适应免疫遗传算法。将免疫遗传算法进行了改进, 通过接种疫苗和免疫选择引入疫苗接种;在浓度适应机制下, 繁殖优秀抗体, 抑制浓度过高的抗体, 防止种群的退化。提高种群的多样性和改善种群的质量, 提高了算法搜索性能。

一、分子对接问题的数学优化模型

分子对接是寻找配体分子和受体分子间最稳定的结合状态, 在数学规划意义上, 就是求解目标函数最优化问题。在溶剂环境下, 分子间存在静电相互作用、范德华力、溶剂效应、氢键的作用及配体分子柔性键作用等, 本文采用Auto Dock3.05提供的半经验自由能函数[9], 计算函数如式 (1) :

式 (1) 中的五项分别表示:范德华力作用, 氢键的作用, 静电的相互作用, 柔性键作用和疏水作用对结合自由能的贡献。

二、自适应免疫遗传算法

结合人工免疫原理, 本文将免疫算法和遗传算法进行了一系列的改进, 首先按照文献[10-11]的方法, 选用适应度的选择机制, 有效的促进优秀抗体的繁殖, 同时参考文献[12]的方法, 利用抗体浓度的选择概率, 抑制浓度过高的抗体, 然后在合理提取疫苗的基础上, 通过接种疫苗和免疫选择两个操作步骤引入疫苗接种。

基于距离的抗体浓度的免疫选择概率公式表示为:

由式 (2) 可知, 集合X中与抗体i基因相似的抗体越多, 抗体i被选中的概率就越少;反之, 与抗体i基因相似的抗体越少, 抗体i被选中的概率就越大。这样低适应度的个体也可获得选中的机会, 从而保证抗体的多样性。

三、自适应免疫遗传算法设计

3.1个体编码方式和适应度函数

分子对接算法中的一个解与每个配体摆放的位置和转动的方向以及配体柔性键旋转的方向相对应, 个体的编码方式采用实数进制进行编码, 每个抗体由6+n个实数来表示, 用于分别表示配体分子的取向和构象。

适应度函数前面式 (3) 表示:

其中为配体与受体之间结合自由能相互作用, 函数关系式见式 (1) 。

3.2交叉和变异算子

交叉概率Pc和变异概率Pm这两个参数是决定遗传算法性能的关键, 交叉和变异概率随着遗传操作而变化, 有组织地进化。本文采用文献[13]提出的自适应算子Pc, Pm进行交叉和变异操作。

(a) 自适应交叉率为:

(b) 自适应变异率为:

其中, i=1, 2, …, n, , 表示第i代变异率和交叉率, fmax是当前种群中最大的适应度函数值, favg是每代群体的平均适应度函数值, 表示交叉的两个个体中较大的适应度, 交叉和变异概率Pc和Pm可以自适应地进行调节, 增加种群的多样性, 减少陷入局部最优的可能性。

3.3算法描述

步骤1:初始化种群和染色体编码, 随机生成抗体数目为N的初始种群, 记为种群X0。

步骤2:计算抗体的适应度, 从当前种群Xt中选择n个最好的抗体得到子种群A。

步骤3:根据经验知识提取疫苗, 种群中最佳个体的全部基因位作为有效信息提取疫苗。

步骤4:判断是否终止, 若符合则取最优个体为问题的解, 结束算法;否则执行下面步骤。

步骤5:对选中的n个最优个体进行交叉操作Pc, 新的抗体群为B, 对种群B进行变异操作Pm, 得到的新的抗体群C。

步骤6:从种群C中选择M个适应度值高的抗体替代当前抗体群进行接种疫苗和免疫选择, 新种群记为D, 将种群C和D混合为种群X (t+1) 。

步骤7:种群替换, 群体更新, 返回步骤2, 进入下一次迭代。

终止条件:若达到最大进化代数或统计个体最佳适应度连续不变的次数达到规定次数, 则算法停止运行的最佳个体即为问题的解。

四、实验及结果分析

4.1实验环境

AutoDockAIGA是基于分子对接软件AutoDock3.05进行改进的, 使用C++编写, 用Eclips进行了程序调试, 并嵌入AutoDock3.05中, 使用AutoDock3.05提供的打分函数评价分子对接结果。处理器为Intel Core2.0GHZ, 主存1G, 运行环境为Redhat Linux 9。

4.2对接准备

本文使用的受体和配体原始样本由Autodock官方网站 (http://autodock.scripps.edu) 提供的测试用例, 根据PDB编号从Protein Data Bank (http://www.rcsb.org pdb/) 下载文件, 原始文件均为PDB格式。受体PDB文件先去除水分子, 金属离子和配体原子, 加入极性氢和点原子, 文件保存为PDBQS格式。配体小分子的X-射线晶体结构为: (a) b-Trypsin/benzamidine; (b) McPC-603/Phosphocholine; (c) Streptavidin/biotin; (d) HIV-1protease/XK263; (e) Reductase Methotrexate。

算法中的实验参数 (种群、迭代次数、交叉概率、变异概率、免疫概率) 分别取 (150, 250000, 0.8, 0.02, 0.06, 子种群规模为60) , 其他参数均使用AutoDock3.05默认设置实验中每种复合物进行10次分子对接, 通过分析这10次分子对接结果, 选取其中寻优能力最优秀的一组对接结果, 表1为对接运算得出的数据:

4.3实验效果对比

以上数据是通过改进的构象搜索算法得出的实验结果, 通过测试与不经过改进的原有的AUTODOCK分子对接软件计算得出的实验结果, 以下是效果对比:

4.4实验数据分析

分子对接计算的复杂度随着小分子配体柔性键的增加而变得复杂, 通过观察复合物晶体结构可以评价小配体柔性键。通过实验对比效果, 可以看出通过改进的构象搜索算法, 总体上效果比没有改进的时候要好, 得出的最优最低能量AIGA比AUTODOCK3.05低, 均方根偏差RMSD实验中比Autodock3.05要低, 由于最直接评价分子对接精确性的方法, 就是配体构象和原始构象间的RMSD, 这表明在对接的精确性上AIGA方法优于Autodock3.05。

五、结论

本文提出的算法是免疫算法和遗传算法相结合的一种优化搜索方法, 用于优化柔性分子对接的问题, AIGA与AutoDock3.05相比, 实验结果的能量值更低, 表明模拟分子的结合更为紧密, 说明AIGA方法寻优效果更好, 并且本文方法所计算出的RMSD相对较低, 表明分子对接更准确更可靠, 在对接最低结合能的时间消耗上也低于模拟退火和拉马克遗传算法。实验结果表明新方法具有更高的寻优能力。

免疫分子 篇5

1 资料与方法

2013年5月~2014年1月本院治疗流产者45例, 年龄24~45岁, 平均年龄33.57岁, 均具备以下条件: (1) 连续2次以上复发性流产者, 过去没有死胎、死产及活产史; (2) 抗心磷脂抗体 (ACA) 间隔6周以上2次阳性; (3) 排除女性子宫颈机能不全、生殖道畸形或感染; (4) 内分泌激素和病毒四项筛查阴性; (5) 夫妻双方染色体正常; (6) 无其他内科合并症; (7) 男方精液检查正常及抗精子抗体、支原体、衣原体均为阴性, 无传染性疾病。

1.2 方法

1.2.1 用药方法

拜阿司匹林:孕前3个月至孕后12周口服100 mg, 1次/d。地屈孕酮片:排卵后口服10 mg/次, 3次/d;12~33周2次/d。强的松片:口服5 mg/d, 12周后停用。低分子肝素钙:排卵后0.4 ml皮下注射, 1~2次/d, 直至妊娠12周。病情需要可延至妊娠33周。注射方法:患者取卧位, 注射部位为前外侧或后外侧腹壁的皮下组织内, 左右交替。该药出厂时在注射器内留有与注射器乳头及针梗容积相同的气体, 在注射前不要按常规将气体排出, 注射针垂直, 完全插入注射者用拇指和食指捏起的皮肤皱褶内, 不要水平注入。丙种免疫球蛋白:从确定宫内妊娠后开始静脉滴注丙种球蛋白一个疗程 (5.0 g/d, 连续使用3 d) , 4周1个疗程, 连续3个疗程。

1.2.2 护理

1.2.2. 1 心理护理

习惯性流产的患者, 容易产生不同程度的恐惧、焦虑、失落、抑郁的心理[1], 严重影响患者的生活质量[2]。此时患者的心理问题甚至重于身体疾病。护士要和患者进行沟通交流, 了解患者对于药物治疗、治疗后效果和方法选择的认知程度, 通过交流, 分散她们注意力[3]。护士用友善同情的态度对待孕妇, 让孕妇产生信任感, 积极配合治疗。

1.2.2. 2 产科护理

观察有无腹痛, 阴道流血的量及颜色, 嘱保留会阴垫, 以便准确记录出血量。保持外阴清洁, 防止逆行感染的发生。指导孕妇学会自我监测, 能正确识别腹痛等异常症状, 及时向医生反映病情变化。

1.2.2. 3 健康指导

患者要保持愉悦的心情, 多听音乐缓解紧张情绪。饮食做到营养均衡, 多食用富含膳食纤维的食物预防便秘。对于需要卧床休息的患者可在适当做抬举上肢、屈伸膝关节等运动。定期做产前检查, 如出现腹痛及阴道流血及时就诊。妊娠3个月内和7个月以后避免性生活。

2 结果

2.1 疗效 以妊娠维持至28周获得有生机儿为治疗成功。45例中41例取得成功, 成功率为91.1%, 其余4例流产。

2.2 患者不良反应 45例中, 5例出现过敏性皮疹, 停药1d自行缓解。

2.3 患者能正确评估自身病情变化, 积极配合治疗, 心理状态稳定。

3 讨论

现在常规保胎治疗、或中药安胎治疗仍是我国治疗复发性流产的的常用方法, 但疗效不一[4]。丙种球蛋白联合低分子肝素钙等药物治疗复发性流产是近几年来应用的新方法, 我院应用其治疗患免疫性复发性流产的患者取得明显的效果。医生对患者治疗侧重于病情的治疗用药, 缺乏更多的时间来关心患者的心理感受。护士配合医生对患者开展有效的护理干预, 通过教育使其学会照顾自己的方法, 能正确观察病情变化。

作者认为丙种球蛋白联合低分子肝素钙等治疗复发性流产成功率高、安全、有效。同时做好患者的护理是保证妊娠成功的关键。

参考文献

[1]康威.浅谈先兆流产患者心理分析与心里护理对策.中医药导报, 2007, 4 (4) :74.

[2]邵丽丽.不孕不育患者的心理护理及健康教育.中国实用医药, 2008, 3 (4) :120-121.

[3]胡秀芬.心理干预对习惯性流产的心理研究.临床和实验医学杂志, 2010, 5 (9) :763.

免疫分子 篇6

1资料与方法

1.1一般资料:选取我院2010年1月至2015年3月收治的80例基底细胞样型乳腺癌患者作为观察对象。所有患者均为女性,年龄22~76岁,平均年龄(45.3±4.2)岁。经手术取病理标本,用10%中性福尔马林将标本固定,采用石蜡封闭,检测80例标本的ER、PR、HER-2三阴者,以及其CK5/6以及EGFR表达。

1.2方法:采用免疫组化SP法检测80例基底细胞样型乳腺癌标本的ER、PR以及HER-2、CK14、CK5/6,均按照试剂盒说明书进行染色。采用pbs作阴性对照,阳性对照为已知阳性组织,其中CK14是细胞质阳性,ER和PR是细胞核阳性,CK5/6以及EGFR是细胞膜阳性。将随机选择的7例病理标本进行荧光原位杂交法进行检测,其EGFR基因检测试剂盒按照使用说明书使用,其中EGFR呈桔红色,CEP7为绿色,两种比值>2∶1,则表明EGFR出现扩增。

1.3观察指标:观察基底细胞样型乳腺癌的结构特征、生长方式以及淋巴结转移情况。

1.4统计学分析:本研究数据以SPSS20.0软件进行分析,计量资料以(±s)表示,比较以t检验;计数资料的比较经χ2检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1基底细胞样型乳腺癌病理特征主要表现为肿瘤细胞呈实性巢状以及缎带状形状,其中,有21例浸润性生长、59例肿瘤周边推挤式生长。肿瘤细胞膜不清晰、呈椭圆或圆形、具有较少的细胞质、核浆比例高、异型性较大、常见核分裂象以及细胞凋亡。

2.2 80例患者中,EGFR阳性表达率为76.3%(61/80)、CK5/6阳性表达率为78.8%(63/80)。EGFR阳性表达可见图1。

2.3 80例患者中出现淋巴结转移的有34例,转移率占42.5%;出现EGFR基因扩增的患者有5例,占71.4%,且出现EGFR基因扩增的患者,其淋巴结转移率更高。选择的7例患者中进行EGFR的荧光原位杂交法检测,有5例EGFR基因扩增,有6例出现EGFR蛋白过表达,5例基因扩增者均存在EGFR蛋白过表达,另外1例EGFR蛋白未过表达的也没有出现基因扩增。也就是说,出现EGFR基因扩增的患者其淋巴结转移率相对于没有出现基因扩增的患者要高(P<0.05),且EGFR蛋白表达与EGFR基因扩增之间没有直接的相关性(P>0.05)。具体情况见表1。

3讨论

基底细胞样型乳腺癌是一种具有独特的生物学、病理学特征的新型乳腺癌[2]。根据相关研究表明,认为乳腺癌的起因源于腺上皮细胞,该疾病具有较难的预后性[3]。在医学研究中,相关研究人员根据癌基因与受体的蛋白表型进行预后治疗。随着医学技术的不断进步和完善,对其基因进行分型,主要研究出基底细胞样型、腔A型、腔B型、HER2过表达型以及正常乳腺样型。其中基底细胞样型的诊断是最为复杂的,在一些乳腺癌患者中可以发现EGFR基因扩增[4]。在本研究中,我们在80例患者中选择了7例进行荧光原位杂交法检测,发现有5例存在EGFR基因扩增,且出现EGFR基因扩增的患者其淋巴结转移率也相对较高,也就是说乳腺癌早期转移中,EGFR受体为其提供了有利条件。总之,底细胞样型乳腺癌在临床上,具有较为特殊的组织形态特点以及免疫组化特征,是一种新型的乳腺癌亚型,具有EGFR基因扩增的患者,其淋巴结转移率更高。

摘要：目的 探讨分析基底细胞样型乳腺癌病理形态特征以及免疫表型与分子病理检测的相关性。方法 选取我院收治的基底细胞样型乳腺癌患者80例作为观察对象,对其进行免疫组化CK5/6以及EGFR检测,并从中选择7例为进行荧光原位杂交检测。观察患者的病理特征以及免疫表型与分子病理检测的关系。结果 80例患者中,EGFR阳性表达率为76.3%(61/80)、CK5/6阳性表达率为78.8%(63/80)。出现EGFR基因扩增的患者其淋巴结转移率相对于没有出现基因扩增的患者要高(P<0.05),且EGFR蛋白表达与EGFR基因扩增之间没有直接的相关性。结论 底细胞样型乳腺癌在临床上,具有较为特殊的组织形态特点以及免疫组化特征,是一种新型的乳腺癌亚型,具有EGFR基因扩增的患者,其淋巴结转移率更高。

关键词：基底细胞样型乳腺癌,免疫表型,分子病理

参考文献

[1]瞿伟.基底细胞样型乳腺癌病理形态特征、免疫表型与分子病理检测的相关性[J].中国现代医生,2012,50(36):112-114.

[2]武秀秀,张帆.基底细胞样乳腺癌的研究进展[J].医学信息,2015,28(11):354-355.

[3]周恬,毛大华.基底细胞样型乳腺癌的生物学标记及临床意义[J].贵州医药,2015,39(2):184-186.