免疫分型（精选5篇）
免疫分型 篇1
猪繁殖与呼吸系统综合征 (porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS) 俗称蓝耳病, 是由猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 引起的, 1992年被国际兽疫局 (OIE) 列为需要通报的B类传染病, 我国亦将其列为二类传染病。郭宝清等[1]首次在国内分离出PRRSV, 从而证实了本病在我国大陆的存在。在随后的几年里, 我国很多省份都有本病发生的报道[2], 本病给我国的养猪业带来了巨大的经济损失。
1 PRRSV基因分型及特点
1.1 基因分型
(1) 在同一时期不同地域PRRSV有着不同的遗传株系[3]。PRRSV两种主要的基因型是欧洲型 (基因型1) 和北美洲型 (基因型2) , 在核苷酸水平上同源性只有55~80%。两个基因型的毒力、抗原性和基因组却不相同, 导致毒株分为两个亚型:A亚型, 大多数是美洲型毒株;B亚型, 大多数是欧洲型毒株[4]。我国的PRRSV分离株属于美洲型。美洲型毒株至少有3个基因亚型, 其中PRRSV的 (ml V) 弱毒株构成一个亚型;日本和台湾毒株与美洲毒株相似[5]。 (2) 美洲型PRRSV分离株间有高度的基因变异性, 各分离株GP5编码区的核苷酸同源性只有90%甚至更少[6]。欧洲株之间也存在显著的基因异源性, 甚至还有更多的异源毒株 (同源性72.2%~90%) [3]。许多学者认为, 基因型的演变导致了不断增加的株系多样性[7]。 (3) 最初, 认为1型和2型病毒只分别局限在欧洲和北美洲出现, 但在欧洲, 1996年因为使用弱毒的PRRSV活疫苗而传入了2型PRRSV[8], 大约1999年北美洲对1型PRRSV也有了报道[9]。虽然1型和2型病毒引起的临床症状非常相似, 但遗传的高度多样性将会导致病毒重组而产生具有新的生物学特性的不同的病毒;在丹麦出现的PRRSV被证明是由于使用的2型弱毒活疫苗返祖造成的[9]。1型和2型间遗传和免疫原的多样性可以很轻易地通过RT-PCR、单克隆抗体和血清学试验加以区别。 (4) Pesch等[10]用66株1991~2001年PRRSV毒株ORF5全序列及3株改良的活疫苗毒株, 19种毒株的ORF6、ORF7, 推导ORF5的氨基酸序列可变性, 并得到可变区及保守区的客观结果;系统发育分析和核苷酸序列比对显示株系间的遗传距离随时间的增加而扩大。
1.2 基因结构
(1) PRRSV以反遗传体系发展, 全长15195个核苷酸的病毒基因以单克隆c DNA装配, 不分节, 且包裹在同质异构的衣壳结构中。病毒基因包含9个开放阅读框架 (ORF) , 由5′端开始分别为ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b及ORF3~ORF7[9], 其中ORF2b编码的蛋白被证实是一个结构蛋白。ORF1 (包括ORF1a和ORF1b) 开始于5′端211个核苷酸后, 约占整个病毒基因组的80%, 由基因组RNA直接表达, 为病毒的非结构蛋白 (NSP) 编码区, ORF1a和ORF1b编码多聚蛋白, 这些蛋白可以从引入的RNA直接翻译而来。认为多聚蛋白分成13个非结构蛋白参与基因的复制和翻译[11]。ORF2a至ORF7分别编码结构蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5 (E) 、膜蛋白 (M) 和核衣壳蛋白 (N) , 这些结构蛋白都是由一个嵌套式的3′端亚基因m RNA翻译而来[12]。PRRSV至少含有7个结构蛋白, 即糖蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5 (E) 、膜基质 (M) 蛋白、核衣壳 (N) 蛋白, 这些结构蛋白具有紧密的联系, 其中E和M以异源二聚体的形式联系[13]。 (2) ORF2至ORF7位于基因组3′端, ORF7的终止密码子之后为114个核苷酸的非编码区和约20个核苷酸的多聚腺苷酸尾 (Poly A) ;并且相邻的ORF有部分重叠。美洲型在ORF4与ORF5间存在10kb的非编码区[14]。据推测, 3′端非编码区可能是病毒复制过程中负链RNA开始合成时多聚酶结合的区域。 (3) PRRSV通过产生6个亚基因组m RNA来进行表达[15], 这些m RNA具有来自病毒基因组RNA 5′端非编码区的共同前导序列, 长度大约200个核苷酸, 并且3′末端相同, 从而形成一组3′末端嵌套结构。从ORF1到ORF7亚基因RNA呈递减顺序排列, 分别为15、3.3、2.7、2.2、1.7、1.1、0.7kb。也有报道说可产生7个亚基因组m RNA, 即在ORF3和ORF4之间有一个m RNA3.1[16]。在转录过程中, 前导序列连接到每个m RNA中去, 产生具有相同5′端前导序列的亚基因组m RNA, 然后翻译成病毒蛋白。
2 PRRSV的免疫反应
(1) 猪肺血管内巨噬细胞在清除血液内的细菌和其它有害粒子方面具有十分重要的作用。PRRSV最显著的生物学特性是对巨噬细胞 (PAM) 的亲嗜性, PAM是主要的靶胞, PRRSV主要通过鼻黏膜和呼吸道黏膜上皮进入猪体内, 病毒在鼻腔黏膜、呼吸系统的巨噬细胞和淋巴细胞中完成最初的复制, 然后通过血液循环到达继发复制部位[17];在妊娠中后期, 还可通过胎盘进入胎儿体内, PRRSV感染后由于在巨噬细胞、单核细胞和小胶质细胞中的某些亚群中复制, 主要引起猪的免疫损伤和免疫抑制。体外试验证明, PAM在PRRSV感染48h后死亡[18], 发生细胞病变, 易发生混合感染。 (2) PRRSV感染后7~9d, 血清中一类高水平的抗体应答反应即能被ELISA检测到, 这种抗体同样也能被间接免疫荧光 (IFA) 和免疫过氧化物酶单层细胞染色 (IPMA) 检测到。然而, 这种感染早期产生的抗体在体外试验中不能中和PRRSV。感染早期抗体, 一般在感染21d后采集, 用于动物免疫保护试验, 证明这些感染早期抗体不能介导被动免疫保护。感染PRRSV的猪迅速产生抗体, 但抗体主要是针对N蛋白, 没有中和反应, M蛋白只诱导产生低水平的抗体。感染后4周才能产生中和抗体, 且产生的浓度也比较低, 但抗E蛋白的中和抗体在感染猪体内维持时间比抗N蛋白的抗体要长得多[19]。 (3) 许多研究都评价了PRRSV感染猪后产生的免疫反应, 虽然PRRSV能诱导产生体液和细胞免疫, 但病毒在首度感染猪几个月后仍然能够复制[20]。猪不能抵抗PRRSV感染也许跟只表达低水平的IFN-γ有关[21]。IFN-γ属Ⅱ型干扰素, 主要由活性的NK细胞和T细胞产生, NK细胞和T细胞分泌的IFN-γ能增强MHCⅠ和MHCⅡ的表达, 氮氧化物的产生和APC次氧化物的基本构成。由于它对APC的作用, IFN-γ在增强Th1、产生特异性记忆T细胞抗原和在未感染的细胞和组织产生抗病毒作用方面起着非常重要的作用。体内试验揭示PRRSV感染的猪能产生少量的IFN-γ, 有人认为PRRSV能够抑制IFN-γ的合成;并且证明以重组的猪IFN-γ处理的PAM能抑制PRRSV的复制。PRRSV的持续感染与感染猪对病原产生的免疫反应失效有关。感染PRRSV后, 通过对T、B免疫细胞的检测发现CD8+T细胞数量增多, CD4+T减少;有抗体依赖性增强现象[22], 增加感染;心脏巨噬细胞、肺上皮细胞、扁桃体、淋巴细胞、胸腺和脾的树突状细胞等也受到一定程度的影响。 (4) Chang等[23]观察猪普通病原体PCV2和PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞感染效果, 结果PCV2感染组含抗原率高但没有细胞死亡, 有高水平的IFN-α产生;PRRSV感染组有明显的细胞死亡;阴性对照组和PRRSV感染组没有IFN-α产生。
免疫分型 篇2
1 资料与方法
1.1 病例资料
收集2010年8月—2015年12月我院住院急性粒-单核细胞白血病患者25例, 均符合法美英合作组 (FAB) 诊断标准[1], 其中男19例, 女6例, 平均年龄52岁。
1.2仪器与材料
流式细胞仪采用Coulter EPICS XL, 单克隆抗体购自Beckman-Coulter公司。
1.3检测方法
白血病免疫分型: (1) 乙二胺四乙酸二钾 (EDTA-K2) 抗凝骨髓液2 m L, 常规分离骨髓单核细胞 (MNC) 。 (2) 调节每管MNC密度 (1~9) ×106/m L, 与20μL单抗混匀, 常温避光孵育15 min。 (3) 用Q-Prep样品制备仪/Immumo Prep系统制备MNC悬液。上机检测:上机前以标准荧光微球对仪器校准, 控制半峰变异系数值在2%之内。每个标本用同种型抗体作为自身阴性对照。
1.4 治疗方案
所有病例确诊后经标准IDA (伊达比星+阿糖胞苷) 、DA (柔红霉素+阿糖胞苷) 或其他方案诱导缓解治疗达完全缓解, 再应用标准DA、MA (米托蒽醌+阿糖胞苷) 、HA (高三尖杉酯碱+阿糖胞苷) 、EA (依托泊苷) 或HD-Ara C (大剂量阿糖胞苷) 为主的方案巩固强化治疗, 所有患者均常规鞘内注射甲氨蝶呤 (MTX) 和 (或) 阿糖胞苷 (Ara C) 以预防中枢神经系统白血病。对于常规采用急性髓系白血病方案治疗2个疗程无效者, 采用标准CAG (阿柔比星+阿糖胞苷+重组人粒细胞集落刺激因子) 、标准FLAG (氟达拉滨+阿糖胞苷+重组人粒细胞集落刺激因子) 或者其他方案。复发病例治疗同初发病例。
1.5 疗效判断标准
按张之南和沈悌编写的《血液病诊断及疗效标准》 (第二版) 进行疗效评价, 完全缓解 (CR) :原粒细胞Ⅰ、Ⅱ型+原始及幼稚单核细胞≤5%;部分缓解 (PR) :原粒细胞Ⅰ、Ⅱ型+原始及幼稚单核细胞>5%, ≤20%;未缓解 (NR) :原粒细胞Ⅰ、Ⅱ型+原始及幼稚单核细胞>20%[1]。
1.6 随访
所有病例均在化疗结束后14 d完善骨髓细胞学检查, 巩固期间每月复查1次骨髓。期间定期复查血常规及外周血涂片, 随访至今。
2 结果
2.1 25例AML-M4患者初发时阳性免疫表型检查结果 见表1。
2.2患者治疗方案与治疗效果 见表2。
注1:a.化疗后感染性休克死亡;b.发病时脑血管意外死亡, 未化疗;c.化疗后脑血管意外死亡;d.要求转院治疗。注2:23例患者初次化疗CR率30.4% (去除2例未化疗患者) ;最终CR率65.2%。
2.3 患者免疫表型与缓解率 见表3。
2.4 随访信息
随访方式包括入院巩固化疗、门诊复查、电话等, 随诊时间为1年~5年。25例患者中失访3例, 11例预后良好 (50%) , 目前仍在存活中, 其中3例诱导缓解后行异基因造血干细胞移植, 预后良好;原发病初次诱导治疗NR后死亡4例 (18.1%) ;初次治疗中死亡4例 (18.1%) , 其中死于脑血管意外2例 (9.1%) , 感染性休克死亡2例 (9.1%) ;复发3例 (13.6%) , 复发时间为3个月~24个月, 其中男2例, 1例复发后再次化疗后无效死亡, 1例反复复发3次, 每次复发均予化疗后缓解, 女1例, 初次化疗后未巩固化疗。见表4。
3 讨论
研究结果表明, 属于单个系列的单个抗原在本组间AML-M4的表达率之间存在差别, 如CD13表达率高达92%, 而CD14表达率则为16%, 这反映了AML-M4细胞的抗原表达的特异性, 表明AML-M4细胞处于不同分化阶段。髓系抗原中, 总表达率为100%, 其中CD13、CD33表达比例高达80%以上, 认为这两个抗原可能是AML-M4特异性抗原。其次CD117、CD64表达比例在50%~80%之间, 亦可认为可能是AML-M4相关抗原。而CD14表达为16%, 在该组病例中特异性较低。淋系抗原中, 总表达率为55.6%, 单个抗原表达率均小于20%, 其中CD7表达率最高, 为16%, 提示在该组病例中特异性较低。HLA-DR、CD34及CD38在本组AML-M4细胞中表达率为64%~88%, 也具有较高的特异性。特别是HLA-DR, 表达率超过80%, 其作为MCI二类分子, 在细胞之间相互接触以及信号传导通路中都具有相对重要的作用。在AML-M4细胞中, 此抗原的消失能否影响细胞信号传导以至于影响细胞生长, 有待于进一步探讨。
在本研究中, AML-M4以单一系列表达者最多, 且其中CR率及预后良好率均较高, 复发率为15.4%。AML-M4免疫表型伴有杂合表达的, CR率及预后均低于单一表达组, 并且考虑杂合表达组中有3例患者在首次治疗缓解后进行了异基因造血干细胞移植, 其实际预后良好率可能更低。杂合表达组的复发率为11.1%, 低于单一表达组, 但考虑到单一表达组中1例复发患者初次缓解后未常规巩固化疗, 所以实际比例可能并不低于单一表达组。
在本组25例患者中, 杂合表达未达到诊断急性杂合性白血病的标准, 但是当本研究中AML-M4免疫表型杂合表达时, 其预后可能较差, 这对制定白血病治疗方向及预后判断可能都具有指导意义。
摘要：目的 分析急性粒-单核细胞白血病 (AML-M4) 患者的免疫分型及与预后的关系。方法 使用流式细胞仪检测白血病细胞的免疫分型通过免疫分型评价患者预后。结果25例患者中, 髓系抗原总表达率为100%。其中CD13、CD33表达比例80%以上, CD117、CD64表达比例在50%80%之间, CD14表达为16%。淋系抗原总表达率为55.6%, 单个抗原表达率均小于20%, HLA-DR、CD34及CD38表达率为64%88%。采取化疗的23例患者中, 单一表达的病例占60.8%, 缓解率为71.4%;杂合表达的病例占39.2%, 缓解率为55.6%。结论 杂合表达的AML-M4患者的预后比单一表达的AML-M4患者差, 其对制定治疗方案具有一定的指导意义。
关键词：急性粒-单核细胞白血病,白血病免疫分型,预后,分析
参考文献
免疫分型 篇3
1 材料与方法
1.1 材料
乙肝病毒标记物试剂盒(艾康生物技术(杭州)有限公司);高速冷冻离心机(Eppenndorf Centeifuge,德国);PCR扩增仪(PTC-220MJ Reaearch,USA);DYY-2型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂);紫外分析仪(UV-1700(E)230CE,日本岛津公司);FACSCalibur流式细胞仪(美国Becton-Kickin-son公司);血清病毒DNA提取试剂盒(大连宝生物工程有限公司);PCR Mix缓冲液及超纯水(大连宝生物有限公司);东胜Marker(上海东胜生物公司);琼脂糖(日本Ta Ka Ra公司);FACSCount Reagent Kit(美国BD公司)引物设计参照文献[6]报道,分别为两条外引物P1、P1R;公用上游引物P2,A、B、C三型特异下游引物;公用下游引物P3R,D、E、F三型特异上游引物,共10条引物,由生工生物(上海)有限公司生产。血液样本来源于2008-2011年广西医科大学第一附属医院传染科门诊及住院部、肝胆外科住院部,广西医科大学肿瘤医院住院部患者,诊断符合2005年修订《慢性乙型肝炎防治指南》[7],入选患者排除甲肝、丙肝、戊肝、HIV、酒精性肝病、自身免疫性肝炎等疾病。
1.2 方法
1.2.1 HBV marker(HBs Ag、HBs Ab、HBe Ag、HBe Ab、HBcAb)检测
严格按照酶联免疫吸附法试剂盒操作。对乙肝病毒表面抗原(HBsAg)阳性者,送广西医科大学第一附属医院做荧光定量PCR检测HBVDNA拷贝数。
1.2.2 血清病毒基因型检测
血清病毒DNA提取按照试剂盒说明书。取2μl乙肝病毒DNA提取液,巢式PCR方法参照文献,条件稍作改动[6]。在0.5ml离心管中加入上下游外引物(50pmol/L)各1μl,25μl PCR Mix,2μl病毒DNA提取液,加21μl超纯水至50μl,轻微震荡混匀后,进行第1轮PCR扩增。取2μl每一个样本的第一轮PCR产物加上A、B、C引物和对应的公用引物(50 pmol/L)各1μl,PCR Mix、超纯水按照第一轮加入。在另一离心管D、E、F基因型的检测同前所述。将两组巢式PCR产物进行凝胶电泳,参照Marker得到产物的相对分子质量判断基因型,A型为68 bp,B型为281bp,C型为122bp,D型为119bp,E型为167bp,F型为97bp。对不能用巢式PCR成功分型的样本送生工生物工程(上海)有限公司测序。并随机选择10个成功分型的样本测序以鉴别本实验分型的可靠性。
1.2.3 T淋巴细胞亚群检测
对慢乙肝组患者进行流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8:每个12×75 mm样品测定管加入50μl抗凝血(EDTA-K2抗凝),各管加入10μl三色单抗,轻微振荡混匀,室温避光放置20 min;加1 ml溶血素裂解红细胞,轻微振荡,避光10 min,接着离心弃上清2次,加PBS后上机检测。取50μl全血加10μl Ig G1-FITC/Ig G1-PE/Ig Gl-PE-Cy5(小鼠),作为阴性对照,其他步骤同上。每份标本测定5000个细胞,全部数据用流式细胞仪和软件SYSTEM II获取和分析。
1.3 统计学处理
HBVDNA先进行对数转换后再进行比较。统计学分析采用SPSS 17.0软件,计量资料以表示,均数的比较采用t检验或F分析,率的比较采用检验,双侧P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 研究病例纳入情况
共收集病例ASC46例,CHB103例,LC58例,HCC46,所有病例乙肝表面抗原(HBs Ag)均为阳性,排除病毒DNA拷贝数<1×103后,得到最后研究病例ASC 31例,CHB 85例(轻度17例,中度36例,重度32例),LC 30例,HCC 35例。男性144例,女性37例,年龄13~84岁。每个病例组的平均年龄、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乙肝病毒DNA拷贝数及乙肝病毒e抗原(HBeAg)的情况见表1。
2.2 HBV基因分型
将PCR产物在1.5%浓度琼脂糖凝胶电泳,基因分型为B型或C型,未检测到B、C混合型,未发现其他基因型。将测序结果与NCBIGene数据库病毒序列比对得到测序的基因分型为B型或C型。所有病例中B型61例(33.7%),C型120例(66.3%),发病者主要集中在大于30岁的人群,C基因型的>30岁患者比重较大。各疾病谱基因分型及对应的指标值见表2。
*HBVDNA载量取对数转换值
*HBVDNA载量取对数转换值;#数值代表该细胞亚群占T细胞比例
2.3 各疾病谱基因型分布
HCC组C型的比例(91.4%)均高于ASC(67.7%)、CHB(56.5%)、LC(63.3%),差异均有统计学意义(P<0.05)。ASC组、CHB组、LC组组内的C型比例较B型高,但组间分布差异无统计学意义。
2.4 乙肝病毒e抗原与基因型
B型组HBeAg(+)为36.1%,低于C型组的HBeAg(+)的60%,差异有统计学意义(P=0.002)。
2.5 乙肝病毒基因型与病毒DNA拷贝数
B型HBVDNA平均拷贝数为2.21×107,C型的为1.31×107,两者比较差异无统计学意义(P=0.333)。
2.6 乙肝病毒基因型与ALT、AST的关系
B基因型组与C基因型组ALT、AST差异均无统计学意义(PALT=0.486,PAST=0.673)。ASC、CHB、LC、HCC组内比较也发现ALT、AST与基因型无关。
3 讨论
据文献报道,我国流行的HBV基因型主要为B型和C型,但各地区基因型分布情况不尽相同。本研究发现,广西地区原籍人口中感染的HBV基因型主要为C型,其次为B型。据文献报道,北京、黑龙江及广东、河南、山西等多地区的主要流行基因型也是C型[8,9,10,11],提示我国的主导基因型为C型,广西HBV基因型分布与全国一致。
本研究结果表明,广西地区原籍人口C基因型的乙肝病毒相关性肝病的发病主要是在25岁之后,这与Yin等[12]先前在国内做的社区调查的报道相似。广西是HCC高发区之一,本研究显示,HCC组C基因型的比例均明显高于ASC、CHB、LC组,表明C基因型与肝癌的进展密切相关[13]。对30岁以上的乙肝病毒携带者检测病毒基因分型有助于预测肝癌发病风险[14]。有研究报道,C基因型引起的肝脏疾病临床表现的严重程度较B型高,包括较高的肝癌术后复发率、延迟的血清转换、较高的DNA拷贝数、较高的ALT水平[14,15];也有研究报道B基因型引起的临床表现较为严重[12,16];Zeng等[17]报道B、C基因型的肝病严重程度包括肝功能、肝脏炎症、纤维化差异并无统计学意义。本研究中广西地区原籍人口C型HBe Ag血清转换率显著低于B型的,提示HBV C基因型感染患者病毒的复制与感染性较B基因型高,但两种HBV基因型的ALT、AST及HBVDNA水平无显性差别。报道的不一致可能与地区分布的乙肝病毒流行特点、病毒亚型及患者的环境因素、生活习惯有关[18]。
一般认为,HBV致肝脏损害主要由机体对HBV免疫应答介导,肝细胞感染HBV后在细胞表面表达的病毒可引起细胞毒性T细胞反应,多种因素可影响这种免疫应答的强度,其中包括病毒遗传物质多态性[19,20]。为了解HBV基因型是否与机体T细胞免疫有关,本研究比较了慢性HBV感染相关性肝病患者B、C基因型外周血的T细胞亚群CD3(+)、CD4(+)、CD8(+)的数量,结果表明,C基因型的CD3(+)、CD4(+)、CD8(+)T细胞与B型均无显著性差别,此结果可能与研究样本相对较小有关。综上所述,广西地区流行的HBV以B型、和C型为主,未见其他基因型,或B、C重叠情况。C基因型与较严重的HBV感染相关性肝病病情有关,HBV基因型与机体细胞免疫状态的关系仍需进一步加大样本量进行研究。
摘要：目的:研究广西地区乙肝病毒基因型分布及与临床表现及机体免疫功能的关系。方法:收集广西地区原籍人口不同病情的慢性乙肝病毒相关性疾病包括无症状携带者(ASC)、慢性乙型病毒性肝炎(CHB)、乙肝后肝硬化(LC)、原发性肝癌(HCC)血液标本,检测乙肝病毒血清学标志物(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc和抗-HBcIgM),HBVDNA拷贝数,肝功能,T淋巴细胞亚群,型特异性引物巢式PCR及测序鉴定病毒基因型,利用统计软件SPSS17.0进行资料分析。结果:本研究检测纳入的研究对象感染乙肝病毒为B、C两种基因型,未检测到其他基因型,以C型(66.3%)为主,B型(33.7%)次之。C基因型的HBeAg血清转换率低于B型(P<0.05)。C型在肝癌组的比例显著高于其他疾病组(P<0.05),不同基因型间年龄、HBVDNA拷贝数、AST、ALT、T细胞亚群CD3(+)、CD4(+)、CD8(+)的差异无统计学意义。结论:广西地区乙肝病毒感染相关性肝病患者HBV基因型为B型、C型,以C型为主,C型与较严重病情有关,感染不同HBV基因型与机体的免疫状况无明显相关。
免疫分型 篇4
为更加完善地诊断血液病, 笔者分析了200例血液病患者的诊断资料, 现报道如下。
1临床资料
笔者收集了2010年7-8月血液病患者200例, 其诊断情况见表1。
2结果
通过表1可以看出, 血液病诊断单独依据形态学占43%, 依据形态学、免疫分型、细胞遗传学检查诊断占26%, 依据形态学、骨髓活检诊断占21%。联合应用形态学、免疫分型、骨髓活检、细胞遗传学检查诊断及准确率可达95%以上。
3讨论
3.1 血液形态学检查
血液形态学检验包括骨髓细胞形态学和外周血细胞形态学检查, 是诊断血液病最基础、最直接、最快速和最重要的手段之一。骨髓细胞形态学检查包括骨髓组织化学染色如过氧化物酶 (POX) 染色、特异性酯酶染色、非特异性酯酶染色及氟化钠抑制试验、糖原染色、铁染色等, 对血液系统疾病的诊断具有十分重要的作用, 对各种贫血、髓系及淋巴系白血病、骨髓增生异常综合征 (MDS) 、恶性组织细胞病、多发性骨髓瘤 (MM) 、骨髓转移瘤等的诊断均具有不可替代的作用。虽然血液形态学检查在血液病诊断中不可或缺, 但其仍存在一些缺陷, 如抽吸骨髓液受众多因素的影响, 容易对一些疾病给出假阳性和假阴性的判断。此外, 血液形态学检查不能观察组织结构, 不易觉察肿瘤早期浸润, 对以组织错位、纤维组织增生和异常细胞簇为病变特征的血液肿瘤也不能提供证据, 因此必须结合其他的相关检查才能全面、科学、正确的诊断血液疾病[1]。
3.2 骨髓活检
骨髓活检对血液病诊断也具有特别重要的意义, 对一些血液病具有独立的诊断价值, 能够准确地反映骨髓增生程度, 尤其对于骨髓穿刺干抽更是必不可少。另外对MDS的鉴别诊断及白血病化疗效果分析具有十分重要、不可替代的临床意义。在再生障碍性贫血、MM患者骨髓浆细胞浸润程度、淋巴瘤诊断和临床分期以及骨髓纤维化 (MF) 的判断中, 活检切片更具有重要意义。骨髓活检与形态学结合, 能有效提高血液疾病的诊断率, 对一些疾病的治疗方案选择和预后评估也具有十分重要的指导作用[2]。
3.3 免疫分型 (FCM-IM)
近几年来, 流式细胞仪FCM-IM对血液病的辅助诊断已被国际所公认。借助FCM-IM使血液病分型越来越细, 因而国际白血病免疫分型机构要求对每例白血病患者都做FCM-IM, 目的在于: (1) 区分形态学和细胞遗传性方法无法鉴别的T、B系或髓系白血病及其亚型; (2) 确定缺乏特异谱系抗原标记的急性未分化和双表型白血病; (3) 确定细胞成熟阶段及其克隆性; (4) 了解与亚型有关的生物学特性和预后, 建立临床适用的标准化诊断模式; (5) 发现和确定细胞恶变相关因子, 探讨发病机制; (6) 识别微小残留白血病 (MRD) [3]。FCM-IM主要通过一线抗体和二线抗体的结合检测来诊断血液病, 由于急性白血病 (AL) 、慢性淋巴性白血病 (CLL) 一线抗体特别强, 所以能对大多数AL、CLL作出诊断并归入相应类型和亚型。二线抗体用以验证一线抗体的检测结果, 并确诊一些少见的髓系白血病如M7、M6等。
3.4 细胞遗传医学检查
细胞遗传学检查包括常规核型和荧光原位杂交 (FISH) 分型, 在恶性血液病诊治中发挥着越来越重要的作用, 特别是一些骨髓形态学检查并不典型的血液疾病, 通过对其特征性染色体改变的检出而确诊, 提高了疾病的诊断率[4]。此外细胞遗传学检查还有助于血液病的鉴别诊断和分型, 2001年WHO发表关于淋巴和造血系统肿瘤的新分型, 将t (8;21) 、t (15;17) 、inv (16) 和del (11q23) 作为4种髓系白血病亚型诊断标志, 以上4种亚型均伴有不同的再现性遗传学异常。
综上所述, 现今血液病的诊断首先建立在血液形态学的基础之上, 再结合骨髓活检、免疫分型和细胞染色体检查, 四者密切配合, 外加其他临床资料进行综合分析, 才能更加完善血液病的诊断。
参考文献
[1]卢兴国.完善血液形态学诊断的模式[J].实用医技杂志, 2003, 10 (9) :1079-1080.
[2]董昌虎.骨髓活检在血液病诊断治疗中的应用[J].陕西医学杂志, 2001, 30 (10) :589-590.
[3]钟国梁.血液形态学与免疫学分型在血液病诊断中的互补性[J].检验医学与临床, 2009, 6 (4) :291-292.
免疫分型 篇5
1资料与方法
1.1一般资料:选择2014年1月至2015年5月本院ICU的住院患者100例,其中男62例,女38例;年龄21~88岁,平均年龄(62.5±10.5)岁。所有病例均排除自身免疫性疾病和免疫缺陷性疾病,并且近期也未使用过影响免疫系统功能的药物。选择同期本院健康体检者50例为健康对照组,其中男29例,女21例;年龄23~79岁,平均年龄(60.3±11.6)岁。两组在年龄及性别构成比差异上无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
1.2仪器与试剂:流式细胞仪为美国BD公司的FACSCalibur三色单平台仪器,检测试剂
CD4-FITC/CD8-PE/CD3-Per CP抗体、Trucount TM计数管、FACS(10X)溶血素、四色荧光标准微球也来自于BD公司,并严格按照使用说明书使用。所有检测项目均严格执行室内质量控制,质控品来自于BECKMAN COULTER(贝克曼)公司。
1.3方法:两组均采用相同的样本处理及检测方法,采集清晨空腹肘静脉血2.0 m L,加入含有EDTA-K2抗凝的专用真空采集管中,充分混匀抗凝。分别在Trucount TM计数管中加入CD3-FITC/CD4-APC/CD8-PE抗体20μL,用反向加样法准确加入抗凝全血50μL,充分混匀,室温避光放置15~20 min后再加入450μL专用FACS(10X)溶血剂,混匀,室温放置15 min后上机运行Multiset程序检测获取数据,处理好的样本在2 h内检测完毕。
注:*与健康对照组比较,差异具有极显著意义(P<0.01)
注:*与重症组比较,差异具有极显著意义P<0.01
1.4统计学处理:采用SPSS20.0软件对数据进行统计学分析,计量资料采用均数±标准差(±s)表示,组间统计比较采用方差分析和t检验,以P<0.05为差别有统计学意义。
2结果
2.1观察组与健康对照组比较,观察组外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞数量、CD4+%、CD4+/CD8+明显低于健康对照组,差异均具有极显著意义(P<0.01);而外周血CD8+%明显高于健康对照组,差异具有极显著意义(P<0.01)。见表1。
2.2将观察组按序贯器官衰竭评估(S O FA)标准,分为重症组(SOFA<3分)和危重症组(SOFA评分≥3分)。两组比较,危重症组外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞数量、CD4+%、CD4+/CD8+明显低于重症组,差异具有统计学意义(P<0.01);CD8+T淋巴细胞变化不明显(P>0.05);而CD8+%明显高于重症组,差异均有统计学意义(P<0.01)。见表2。
3讨论
重症加强医疗病房(ICU)的住院患者,常常由于重大的创(烧)伤、手术操作、恶性肿瘤、出血、缺血缺氧、休克、急性中毒等非感染因素和多种病原微生物感染引发的脓毒血症所引起。患者病因错综复杂,病情危重且变化较快,患者机体往往处于一个急性应激状态,主要表现为蓝斑-交感-肾上腺髓质系统和下丘脑-垂体-肾上腺皮质系统兴奋,肾上腺糖皮质激素分泌旺盛。如果这种应激状态过于强烈而且持续时间较长,就会引起机体代谢和器官功能的变化以及组织器官的损伤。甚至会引发多器官功能障碍综合征(MODS)和多器官功能衰竭(MOF)。此时,患者机体就会发生一系列的病理生理变化,包括心血管系统、消化系统、凝血系统、免疫系统等方面的变化,而免疫系统功能的状况和ICU患者疾病的发生、发展与转归密切相关[3]。MODS/MOF是重症患者死亡的主要原因之一,因此,研究ICU患者的免疫功能状况,对于患者的病情判断以及指导治疗就显得尤为重要。
外周血中T淋巴细胞来源于骨髓,在胸腺中发育成熟。T细胞(抗原)受体与CD3分子复合物(TCR-CD3)是T淋巴细胞的特有标志。T淋巴细胞具有高度的异质性,根据其表面标志和功能特性,可以分为CD3+CD4+的辅助性T淋巴细胞(CD4+Th)和CD3+CD8+的抑制性T淋巴细胞(CTL)。CD4+T淋巴细胞在调节免疫系统中对免疫反应的启动、最终表现形式和强弱起着关键作用。CD4+Th细胞在初始阶段接受抗原刺激后,继续分化为分泌型的Th细胞亚群:Th1细胞、Th2细胞、Th3细胞和Th17细胞。Th1细胞能分泌γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-2(IF-2)。Th1细胞的主要功能是增强吞噬细胞介导的抗感染、抗肿瘤免疫,在细胞免疫应答中发挥重要作用,在病理情况下,Th1细胞还参与迟发型的超敏反应和器官特异性自身免疫性疾病。Th2细胞分泌一些细胞因子(IF-4、IF-5、IF-6、IF-10及IF-13),Th2细胞的主要功能是辅助体液免疫应答,并在过敏性疾病和感染性疾病中发挥重要作用。CTL细胞通过分泌穿孔素、颗粒酶、淋巴毒素以及通过Fas L途径导致靶细胞的裂解和凋亡。T淋巴细胞是细胞免疫中最主要的免疫细胞,几乎参与了所有的特异性免疫反应。既是直接抵御抗原和肿瘤细胞的效应细胞,又是体液免疫与细胞免疫反应之间的调节者[4]。其各亚群之间的动态平衡,对于维持与调节机体的免疫系统功能状态尤为重要。
正常情况下,CD3+细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量处于一个动态平衡并且相互调节的状态。CD4+/CD8+的值反映了机体的免疫平衡状态,CD4+/CD8+明显降低、说明机体处于免疫抑制状态[5,6]。本文研究显示,ICU患者外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞数量、CD4+%、CD4+/CD8+明显低于健康对照组,CD8+%明显高于健康对照组,说明患者的免疫功能明显低下,细胞免疫功能处于明显抑制状态。其机制可能为:当机体遭受严重创(烧)伤、恶性肿瘤、急性中毒、休克、感染后所致脓毒症等,T淋巴细胞对特异性抗原刺激无增殖性反应,大量的T淋巴细胞发生凋亡。凋亡清除了大量活化的T淋巴细胞,使诱导T淋巴细胞克隆无反应,患者淋巴细胞数量明显减少,患者机体的特异性免疫功能处于抑制状态,而非特异性免疫功能则呈高度活跃状态;另一方面,一些严重的病因使得CD4+T淋巴细胞分化异常,CD4+/CD8+比值失衡,Th1细胞/Th2细胞平衡状态发生漂移,其分泌的细胞因子也随即发生改变,结果导致了机体免疫功能的障碍[7]。这样一来,ICU的患者就很容易丧失对迟发型过敏反应的能力、清除病原体无力、容易引起医源性感染和罹患恶性肿瘤以及病情迁延不愈,甚至恶化。本研究中,观察组CD8+T淋巴细胞绝对数量较对照组明显降低,而CD8+的百分比明显升高,是因为观察组中总T淋巴细胞绝对数量明显降低所致,并无矛盾之处。另外,本研究还显示,危重症组较重症组患者外周血CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞数量、CD4+百分比、CD4+/CD8+明显降低,CD8+的百分比明显升高,说明危重症组比重症组免疫功能障碍更严重,从而说明患者病情越严重,机体的免疫功能抑制越严重[8],患者的预后更差。当然,由于条件所限,未能同时进行如淋巴细胞亚群中B细胞、NK细胞以及免疫球蛋白,补体等的检测是本研究的不足之处,如能进行,将会对ICU患者的免疫功能监测更客观和全面。
综上所述,ICU患者存在免疫功能障碍,尽早和动态对其外周血T淋巴细胞亚群进行检测,对于ICU患者病情的判断、指导综合治疗具有重要的临床意义。
摘要：目的 探讨外周血T淋巴细胞亚群免疫分型在重症患者中的变化及临床意义。方法 收集2014年1月至2015年5月我院重症加强医疗病房(ICU)的住院患者100例为观察组,并选择同期健康体检人员50例为健康对照组,采用流式细胞仪分别检测两组人员的外周血T淋巴细胞亚群数量(绝对计数)和百分数。另将观察组按序贯器官衰竭评估(SOFA)标准,分为重症组(SOFA<3分)和危重症组(SOFA≥3分)进行比较,并进行统计分析。结果 观察组外周血CD3+淋巴细胞(简称CD3+)、CD3+CD4+T淋巴细胞数量(简称CD4+)、CD3+CD8~+T淋巴细胞数量(简称CD8+)、CD4+%、CD4~+/CD8+比值明显低于健康对照组,差异均具有统计学意义(P<0.01);而外周血CD8+%明显高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。重症组和危重症组比较,危重症组CD3+、CD4+细胞数量、CD4+%、CD4+/CD8+比值明显低于重症组,差异均具有统计学意义(P<0.01);而CD4+%明显高于重症组,差异有统计学意义(P<0.01);CD8+变化不明显(P>0.05)。结论 重症加强医疗病房(ICU)患者存在外周血T淋巴细胞水平异常,表明患者机体免疫功能存在障碍,且免疫功能状态与病情危重程度有关。尽早检测ICU患者外周血T淋巴细胞数量,对于ICU患者病情的早期诊断、评估及指导临床治疗具有较好的临床意义。
关键词：T淋巴细胞亚群,绝对计数,重症患者,免疫功能
参考文献
[1]邱海波,周韶霞.多器官功能障碍综合征现代治疗[M].北京:人民军医出版社,2001:8-11.
[2]陈永斌,张敏珍,杨国辉.细胞免疫功能测定在危重症患者中的临床意义[J/CD].中国危重症医学杂志:电子版,2010,3(6):384-388.
[3]曹相原.重症医学教程[M].北京:人民卫生出版社,2014:55-83.
[4]金伯泉.医学免疫学[M].5版.北京:人民卫生出版社,2008:101-107.
[5]陈红芳,王香梅,罗建勤,等.脑出血体液免疫变化及其临床意义[J].中国危重病急救医学,2005,17(3):177-179.
[6]路静.外周血T细胞亚群检测在恶性肿瘤中的价值[J].中国现代药物应用,2014,8(20):35-36.
[7]张庆红,姚咏明.进一步重视创(烧)伤脓毒症的免疫监控[J].中华急诊医学杂志,2014,23(2):125-128.