免疫检测

免疫检测（共12篇）

免疫检测 篇1

1 材料与方法

1.1 血清样品

从遂宁市安居区5个乡镇的生猪散养户中随机抽取176份猪血清，用于检测猪蓝耳病免疫抗体水平。

1.2 诊断试剂

猪蓝耳病抗体检测ELISA试剂：购自深圳市某生物技术有限公司，诊断试剂在有效期内使用。试验严格按照试剂说明书的要求操作。

1.3 试验原理

利用猪蓝耳病病毒基因重组抗原包被ELISA板，然后加入适当稀释的待检猪血清与之反应结合成“包被抗原+PRRSV-IgG”，再通过酶标抗猪IgG二抗来检测与包被抗原结合的猪蓝耳病特异性抗体，形成“包被抗原+PRRSV-IgG+酶标抗猪IgG二抗”复合物，最后加入显色剂，通过酶催化反应显色，显色的深浅与所检血清样品中的PRRSV-IgG含量成正比。通过酶标仪对待检血清的OD450值进行测定，当显色超过设定的临界值时，结果判为阳性，反之则为阴性。

1.4 判定标准

本试剂盒的临界值为0.33，在酶标仪上测各孔的OD值。试验成立的条件是阳性对照孔的平均OD值≥0.70，阴性对照孔的平均OD值必须<0.10。当样品OD值≥0.33时，判为阳性;样品OD值<0.30时判为阴性;0.30

2 结果与分析

5个乡镇农村散养生猪的蓝耳病抗体效价分布情况详见表1。从表中可见，被检测的176份血清中，OD值高于或等于0.33的有124份，比例为70.45%;OD值介于0.30到0.33之间的有8份，比例为4.55%;OD值小于0.30的有44份，比例为25.00%。

3 讨论

3.1 免疫现状及原因分析

3.1.1 现状

按照要求，遂宁市安居区的猪蓝耳病免疫密度常年维持在90%以上，其中应免生猪的免疫密度要达100%。从本次检测结果看，在抽取的176份猪血清样品中，猪蓝耳病免疫抗体的合格率为70.45%，达到了农业部的基本要求(70%以上)，但是聚贤乡、马家乡的抗体合格率低于农业部要求。

3.1.2 原因分析

影响该区猪蓝耳病免疫效果的主要原因到底有哪些?安居区动物预防控制中心通过调查、了解，归纳了以下几个方面：

(1)疫苗保存不当。调查发现，一个村级动物防疫员将猪蓝耳病灭活疫苗置于温度为-20℃的冰箱中冷冻保存，而未按说明书规定将疫苗存放在温度为4℃的冰箱中，导致疫苗免疫效果变差。

(2)据对2个散养户的了解，畜主担心接种蓝耳病疫苗后反而刺激猪机体产生免疫抑制，因而未作猪蓝耳病疫苗免疫。

(3)仔猪母源抗体的存在可能中和了疫苗的免疫效果。经调查发现，有3个散养户在仔猪断奶前注射了猪蓝耳病灭活疫苗，此时接种，疫苗抗原可能会中和掉母源抗体，不仅不能产生保护力，而且大大削弱了原有保护力。

(4)根据检测结果我们发现，玉丰镇及马家乡各有1户偏远农户的猪蓝耳病免疫抗体为阴性，主要是因为村级防疫员的责任心不强，未对猪只进行免疫。

(5)饲养管理跟不上和饲料质量差。农村散养户的猪舍通风不良，卫生条件差，猪群长期处于应激状态，导致猪体免疫力下降。饲料发霉变质，产生了黄曲霉、褐曲霉等毒素，抑制了免疫应答;饲料中营养物质缺乏，也会影响免疫抗体产生的速度和数量。

3.2 应对措施

3.2.1 加强领导，健全制度。

提高猪蓝耳病的免疫密度和免疫效价是一项长期系统的工作，各级、各有关部门务必加强领导，提高认识，建立健全各项规章制度，加强村级动物防疫员队伍建设，不断提高专业人员的业务技能和工作责任心。

3.2.2 制定科学合理的免疫程序，有效提高猪只的免疫率。

对于育肥猪，要坚持行之有效的首免、春秋普防、常年补针;对于种猪，每年春秋季应各做一次预防接种。

3.2.3 严格遵守预防注射操作规程。

做好器械的消毒灭菌工作，严防带菌(毒)感染;在预防工作中要做到每一头猪换一个针头，避免交叉感染。

3.2.4 按剂量免疫，做好加强免疫工作。

预防接种过程中应严格按照产品说明书规定的剂量进行免疫，并推行第二次加强免疫的措施，确保达到有效免疫率。

3.2.5 积极开展猪只抗体监测工作。

充分发挥区(县)级兽医实验室的作用，逐步加大抗体监测力度，为猪蓝耳病的综合防制提供科学依据。在春秋季两次集中防疫高峰后的1个月内，随机采取猪血清作抗体检测，计算总保护率。根据抗体的分布情况、免疫保护率高低等，具体分析防疫工作是否到位，免疫效果是否确实。

参考文献

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免疫检测 篇2

酶联免疫法检测试剂注册技术审查指导原则

一、前言

本指导原则主要针对酶联免疫类检测试剂的主要原材料、生产工艺及反应体系、产品质量控制等环节提出指导性技术要求。

本指导原则系对酶联免疫法检测试剂的一般要求，申请人应依据产品特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需详细阐述其理由及相应的科学依据。

本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。

二、适用范围

本指导原则适用于有关病原微生物检测的第三类体外诊断试剂的注册技术审查。其他酶联免疫法检测试剂（如作为二类管理的体外诊断试剂）可参考本指导原则执行。

三、基本要求

（一）基本原则

1.研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。— 2 — 2.试剂生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》；同时，应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；还应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。企业应对试剂的使用范围做出明确规定，并经国家药品监督管理部门批准。

3.诊断试剂的研制应当按照科学、规范的原则，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。

4.试剂在研制、生产过程中所用的各种材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。

5.生产和质量控制的总体目标：保证试剂使用安全、质量稳定、工艺可控、检测有效。

（二）原材料质量控制 1.主要生物原料

与产品质量最密切相关的生物原料主要包括各种天然抗原、重组抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及多肽类、激素类等生物原科。这类原料可用于包被酶标反应板、标记相关酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）、中和反应用抗原或抗体、制备校准品（标准品）等。使用前应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。

主要生物原料的常规检验项目一般包括：（1）外观

肉眼观察，大部分生物原料为澄清均一的液体，不含异物、浑浊或摇不散的沉淀或颗粒；或者为白色粉末，不含其他颜色的杂质；特殊生

— 3 — 物原料应具备相应外观标准。

（2）纯度和分子量

主要经SDS-PAGE 电泳后，利用电泳扫描仪进行分析，也可用其他适宜的方法，如高效液相法等。根据所检测生物原料的分子量选择适宜聚丙烯酰胺凝胶浓度进行电泳，一般每个电泳道加样量为5μg，电泳后的凝胶可用考马斯亮蓝染色或银染法染色。染色后的凝胶用电泳扫描仪分析原料的纯度和分子量，纯度应达到相应的质量标准，分子量大小应在正确的条带位臵。

（3）蛋白浓度

蛋白浓度可通过Lowry法、280nm 光吸收法、双缩脲法或其他适宜的方法进行检测。

（4）效价

效价的测定一般根据蛋白含量测定结果，通过倍比稀释法进行。效价应达到规定的要求。

（5）功能性实验

功能性实验是指生物原料用于试剂盒实际生产中的情况，一般考查使用该原料的试剂盒的灵敏度、特异性和稳定性等，并比较其与上批次原料的相关性。

2.生物辅料

生物辅料一般指在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。这些生物原料的质量标准应符合2000年版的《中国生物制品主要原辅材料质控标准》规定的标准要求，并且要适合于本企业的生产。建议作以下检验：

（1）牛血清或羊血清

外 观：为浅黄色澄清稍粘稠的液体，无溶血或异物。无菌试验：将血清直接37℃放臵7天，明亮处观察，不得出现混浊或— 4 — 沉淀。

总蛋白含量：用双缩脲法测定，蛋白含量≥32mg/ml。

球蛋白含量：取待测血清1ml，采用饱和硫酸铵法进行沉淀，沉淀溶于0.85%氯化钠溶液，至1ml，用Lowry方法测定，蛋白含量应≤2mg/ml。

（2）牛血清白蛋白：

外 观：应为浅黄色、黄色或乳白色的冻干粉末，无吸潮，无结块，无肉眼可见的其它杂质颗粒。

溶解性：将牛血清白蛋白配成10%溶液，在1826℃时，溶解时间应≤15分钟，pH值应为6.57.1。

总蛋白含量：用双缩脲法，其标准为≥95％。

总蛋白中的牛血清白蛋白（BSA）含量：采用硝酸纤维素膜电泳法，其标准为≥95%。

BSA的净含量：总蛋白含量乘总蛋白中的BSA含量，其标准为≥90%。（3）酪蛋白：

应符合生产所需的质量标准。（4）标记用酶

应在产品的质量标准中明示所使用的标记用酶的名称（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等），同时应根据不同生产厂家的检验方法和质量标准进行检验，酶的纯度RZ值（OD403nm/OD280nm）应大于3.0。

对于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，还应进行功能性实验，即以其为原料配制一定浓度的稀释液作为样品，进行酶联免疫测定，均不能出现非特异性反应。

生物辅料的供应商同样要求相对固定，不得随意变更供应商。3.化学原材料

化学原材料的质量标准，包括外观、一般盐类检测、溶液pH值、溶解情况、干燥失重、炽灼残渣等，均应符合《中国生物制品主要原辅材

— 5 — 料质控标准（2000年版）》分析纯级别的要求，并且要适合于本企业的生产。

主要化学原材料的供应商要求相对固定，不得随意发生变更。化学原材料在购入时，原材料的生产商必须提供该批次化学原材料的质量保证材料和质量检验报告。

4.其他物料（1）酶标板 ①外观

明亮处用肉眼观察板条的外观质量，如有欠注、飞边、肮脏、表面光洁度差，底部有波纹及划伤等应剔除。②吸附能力和精密性 采用合适的方法进行检验。

一般用一定浓度的正常人免疫球蛋白G(IgG)包被板条，再用一定浓度的抗人IgG酶结合物吸附，通过显色反应，使用酶标仪读数，计算CV值。CV值结果应符合相关产品的功能性质量标准，一般批内CV≤5％，批间CV≤10％。

（2）液体试剂装量瓶

包括阴阳性对照、样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液等液体组分，均应有相应的装量瓶，并建立相应的质量控制标准，如不同的液体试剂所用的装量瓶规格、装量瓶的颜色、瓶盖的颜色等。

（3）其他材料

包括试剂瓶标签、粘胶纸、铝箔袋、衬垫、可密封塑料袋、说明书、干燥剂和包装外盒等，应参照国家食品药品监督管理局发布的《体外诊断试剂说明书编写指导原则》和《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定》建立相应质量控制标准。— 6 — 5.企业质控品

企业质控品一般包括阴/阳性参考品的符合率、灵敏度（最低检出量）、精密性、钩状效应（hook效应）等质控样品，对于定量检测试剂，还包括线性质控品样品。如该产品具有国家标准品或参考品，应使用国家标准品（参考品）进行标化；若该诊断试剂没有国家标准品（参考品），则企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

企业质控品的基质应与诊断试剂的待测样品的基质基本一致，如待测样品为血清/血浆，质控品基质也应为血清/血浆。

（三）试剂盒各组分的生产

酶联免疫法检测试剂主要组分的生产包括酶标记物的制备及滴配过程（酶工作液浓度确定）、各种工作溶液的配制、包被酶标反应板、分装及包装等步骤；并通过产品的半成品检验和成品检验两个质控过程来保证其质量符合规定。

1.各种工作液的配制

酶联免疫诊断试剂研制生产过程中所用的工作液一般包括：包被液、封闭液、阴性阳性对照、样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液、终止液等，对定量检测试剂，还包括标准品（或校准品）溶液。若阴性、阳性对照或其他液体组分涉及生物安全性问题，制备时应在相应的生物安全实验室完成。

各种工作液在配制过程中应严格按质量标准中的配方进行配制，充分混匀确保液体中的各种成分均匀，同时进行相应的质量检验并达到质量标准后，方可使用或分装。对于定量检测试剂，其标准品（或校准品）溶液应具有量值溯源性。

应对配制过程及配制的液体进行的质量控制，主要包括酶结合物的

— 7 — 功能性实验及稳定性；各种溶液的外观、pH值等；酶作用底物应测定在无相应酶的情况下自身显色的情况，并制定合理的限定指标；终止液应对其终止酶促反应的能力进行测定。

2.包被酶标反应板

包被前应对酶标反应板进行质量检验，如尺寸、外观、包装、吸附性能、精密性等，并记录酶标反应板的批号、数量、标识。酶标反应板经检验合格后方能用于包被。不同批号的板条不能混用。

选择经检验合格的包被原料（如抗原、抗体等），经一定的方法确定最佳包被浓度和酶结合物工作浓度，按照诊断试剂的生产规程，配制包被缓冲液、封闭液，经检验合格后，包被酶标反应板，经干燥后，已包被的酶标反应板用铝箔纸封闭（内臵干燥剂），保存于28℃。

应对包被过程进行相应的质量控制，如包被用原料（抗原或者抗体等生物活性原料）的质量检验、包被液和封闭液的质控（如配方、外观、pH值）、包被过程的监控（包括包被和封闭的体积、温度、时间等）、包被均一性检验、干燥过程的监控等。

3.分装和包装

样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液等溶液应严格按照质量标准中的量进行过滤后再分装，分装量的误差应小于5%。

分装及包装均应按照相应的标准操作规程要求进行。包装前，应严格检查试剂盒的品名、批号等，核对各试剂盒各组分的数量，并在关盒前进行复核。

（四）质量控制 1.半成品质量控制（1）半成品抽样

检验人员按试剂的批号，根据抽样申请单抽取规定数量的半成品各— 8 — 组分，作号标记、待检。

（2）半成品检验

根据试剂盒的企业标准或者制检规程进行半成品的检验。半成品检验，一般使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参考品）标化后的企业参考品。若某类试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

检验指标一般包括阴/阳性参考品的符合率、灵敏度（最低检出量）、精密性等，均应达到相应的质量标准要求。对于精密性，一般情况下CV不得高于15％（采用竞争抑制法的诊断试剂CV不得高于20％）。对定量检测试剂，同时应分析其线性相关系数和定量质控品检测结果的准确性。

企业应该对每一批试剂的半成品进行稳定性研究。试剂盒各组分应留样，28℃定期作稳定性考核，同时作37℃热稳定性试验，试验结果应符合产品的质量标准。

2.成品质量控制

产品包装完成后，质检人员根据试剂的批号、实际包装量、抽样申请单的要求进行抽样，同时填写抽样数量和抽样日期，并且由抽样人签名。抽样数量应包括检验用数量和留样数量。质检人员同时应检查相关原始记录。

每一批酶联免疫类检测试剂的试生产量应满足工艺研究、分析性能验证、稳定性研究、临床试验、自测及注册检验等各阶段所需样品量的要求。

（1）成品检验

成品检验时，一般使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参考品）标化后的企业参考品，并达到相应质量要求。若该诊断试剂没有国家

— 9 — 标准品（参考品），则使用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

（2）稳定性试验

在批放行前，每一批试剂应完成37℃热稳定性试验，试验结果应符合产品的质量标准。

四、名词解释

酶联免疫法：是指在酶标板上包被特定的抗原（和/或抗体）后，利用直接或间接的方法与待测样品中的相关抗体（和/或抗原）反应，形成的抗原抗体复合物再与相应的酶标记的抗体和/或抗原进一步反应，经过酶催化底物发生显色反应，由形成的颜色的强弱来判断样本中相应的抗体和/或抗原的存在。

五、参考文献：

1.《中国生物制品规程》（2000年版），化学工业出版社

免疫检测 篇3

表1 82名健康人的二种方法检测结果

在82名健康对照组蛋白芯片和斑点免疫金检测的阳性率分别为18.3%和24.6%。两组结果配对比较差异无统计学意义（X2=3.852 P=0.068 X2=3.58 P=0.062） 2．不同方法对结核病患者检测的比较：164名患者组结果见下表2。

表2 164名结核病患者两种方法检测结果 在164名结核病患者对照组蛋白芯片和斑点免疫金检测的阳性率分别为90.8%和89.6%。两组结果配对比较差异无统计学意义（X2=2.552 P=0.038 X2=2.518 P=0.032） 3．不同方法在结核病诊断中的价值：为评价二种方法在结核中的诊断价值，统计二种方法在健康人群和结核病患者中的反应情况（表3）。蛋白芯片阳性预测值为90.8%，阴性预测值为81.7%。斑点免疫金阳性预测值为87.2%，阴性预测值为71.3%。两种方法的阳性预测值和阴性预测值均差异无统计学意义。（X2=2.552 P=0.038 X2=2.982 P=0.038） 三、 讨 论

混合免疫异常检测 篇4

研究入侵检测技术, 保护网络和系统的安全具有重要的意义。目前, 已提出许多入侵检测方法, 如统计方法、专家系统、人工神经网络、数据挖掘等[1,2,3]。随着对生物免疫系统的研究, 人们发现免疫系统所解决的问题与计算机安全系统或入侵检测系统所面临的问题具有相似性;免疫系统保护生物体免受细菌的侵害, 而一个计算机安全保护系统保护计算机抵抗入侵。

近几年, 人工免疫系统吸收了免疫系统新的灵感, 成为一个活跃的研究领域[4]。否定选择算法是最早的人工免疫方法之一, 在可供选择的方法中具有明显的作用并且能够以更高的质量提供独特的效果。

2 混合免疫学习方法的提出。

NSA算法主要利用否定检测, 也就是由算法产生的检测器来直接鉴别在异常 (非自体) 空间的元素。这种方法被应用在一些特殊的应用中[5,6] (分布式异常检测和不太小的正常子空间) 。

提出了另一种NSA算法在异常检测中的应用。这种方法既不运用否定算法, 也不运用肯定算法。而是在异常和正常类之间试图寻找一个边界。这种方法可以利用在不执行分布式异常检测或者正常集比较小的情况下。

主要思想是利用实值否定选择算法 (RNSA算法) 来产生非自体样本。然后, 应用分类算法来寻找自体的特征功能。这种特征功能应用于异常检测功能。

在训练部分, 输入对应于正常样本 (特征向量) , 它利用由RNSA算法产生的异常样本。接着, 正常和异常样本被用来作为监督算法的输入产生一个分类。这个分类对应于异常检测功能并且在检测段将新的样本分为正常或异常的样本。

重要的是这种技术允许把监督算法的利用作为一个任务, 它通常需要一个非监控的方法。这种方法的主要优点是:

a.这种分类方法已经研究了很长时间。有另一种高效算法, 已被广泛测试并且被应用于其它领域。b.这种方法不需要对分类算法初始化。它允许模块组合使它能被更广泛的利用, 并且对于监督算法存在很好的执行效果。c.分类方法比非检测学习问题更接近异常检测问题。例如, 类聚。类聚方法基于最大化内部分类和最小化外部分类原则聚合输入数据。另一方面, 分类算法的主要目的是增加分类的准确性, 也就是说增加区分两类的能力。它接近于异常检测的目的, 最大化检测率和最小化误报率。d.可能利用真实的异常样本, 如果可行的话, 通过把它们与RNSA算法所产生的样本相结合, 并且把它们一起送给分类算法。

最想达到的目的与最近邻方法相似。一个元素接近于正常样本就可能是正常。如果距离选择好的话, 这个设想对很多应用程序都是合理的。

3 实值否定选择算法。

实值表示法其搜索空间通常是连续的并且难以用计数组合学的方式分析, 但却适合一些无法有效采用二进制表示法的应用。在实值否定选择算法中, 通常以超球体或超立方的形式表示检测器。这些检测器既可以用原始的随机生成方法生成也可以用其他方法, 例如遗传算法生成。

与二进制表示相比, 实值表示最主要特点是把与Rn子集对应的自体/非自体检测空间, 归一化到超矩形空间[0, 1]n。其中, n表示维数空间大小。实值否定选择算法就是在这个归一化的超立方中操作。

定义1.实值表示自体定义

S= (X, rs) 。其中X= (x1, x2……xm) 是m维的点, S表示以X为中心, rs为半径的超球体。

定义2.实值表示检测器定义

d= (X, rd) 。和自体数据类似, 检测器是一个以m维的点为中心, rd为半径的超球体。

算法的输入是由n维点 (向量) 表示的自体样本集。算法进化覆盖非自体空间的其他点集 (检测器) 。它由一个反复的过程完成, 这个过程是由两个目标驱动的检测器位置的修正:

3.1 移动检测器远离自体点。

3.2 保持检测器分离以最大化覆盖非自体空间。

算法1产生有效实值检测器

输入:检测半径r, 更新率η, 当检测器成熟时达到的代数t, 被考虑到临近的数量k, 候选检测器集合R0, 迭代次数num_iter

输出:有效实值检测器集合R

方法:

Near Cells=使用k-邻近法计算出的Self集中的邻居

并按照与d的距离排序

参数r代表每一个检测器半径。为了决定检测器d与自体样本点是否匹配, 算法计算出d在自体集中的k最近邻。计算出这些k最近邻的中值距离。如果距离小于r, 则检测器d被认为与自体相匹配。这个策略使得算法对噪音和外界干扰更健壮。

函数是检测器d的隶属匹配函数。它现实了自体/非自体空间中x和检测器之间的匹配程度。它定义为:

参数η代表一处检测器的步伐的大小。为了保证算法将收敛到一个稳定的状态, 这就有必要在每次迭代后以的方式减少这个参数。更新规则如下:

4 结论。

试验表明, 混合免疫学习算法效果很好, 同时, 它能够利用正常样本的子集来学习自体集的结构。在一些应用中, 主要在改变检测中, 假定自体集已完成, 然而, 在许多真实的异常检测应用中, 情况并不是这样。因此, 一个异常检测算法必须能够产生自体和非自体空间结构的好的近似值。即使训练集中自体集的部分是可用的。

摘要：传统的基于免疫的入侵检测系统采用低级别的二进制检测器, 妨碍了有意义的知识提取, 对Nonself空间的覆盖也不完备。研究了实值否定选择算法, 使用实值否定选择算法来产生非自体样本。应用分类算法来寻找自体的特征功能。

关键词：人工免疫,实值否定选择算法,混合免疫

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免疫检测 篇5

专业文献综述

题目:

姓名:

学院:

专业:

班级:

学号:

指导教师: 免疫标记技术及其在食品安全检测中的应用陈泽食品科学与药学学院食品质量与安全食品质量与安全112班114033207王子荣职称:教授

2014 年 6 月 10日

新疆农业大学教务处制

免疫标记技术及其在食品安全检测中的应用

作者：陈泽指导老师：王子荣

摘要：文章介绍了免疫标记技术的发展以及免疫标记技术在食品安全检测中的应用，包括免疫荧光技术、免疫酶技术、放射免疫测定法、免疫胶体金技术和发光免疫测定法，并概述这些检测技术对食品安全的重要作用及影响。

关键词：免疫标记技术；食品安全；检测

免疫分析法是以抗原抗体特异性结合生成抗原抗体免疫复合物为基础，用来检测生物样品中较低含量活性物质的检测方法。此种分析方法的基础是抗原抗体反应的高度专一性和反应灵敏性。进行免疫分析的前提是获得与检测物质相对应的抗体或抗原，抗体的特异性和亲和性都是决定免疫分析能力的重要影响因素。免疫标记技术:泛指使用荧光素、放射性同位素、酶、胶体金以及化学(或生物)发光剂等作为标记物，标记的抗体或抗原和与之对应的抗原或抗体进行特异性的抗原抗体反应，最终借助各种精密的检测仪器对实验结果进行观察和测定。免疫标记技术可以为样本定性研究，或为样本定量或者半定量检测技术，也可以在细胞或者组织中进行定位研究。

一、免疫分析发展的历史世纪50年代，免疫分析方法最初应用在体液中生物大分子的检测。1959年，美国学者Yalow和Bersou建立检测糖尿病患者血浆中胰岛素的免疫标记方法，巧妙地将放射性同位素125I示踪技术和传统的免疫方法相结合，使免疫分析技术从定性技术转变为定量技术，开创免疫标记的先河。1971年，瑞典学者Eugvai和Perlmauu用酶代替放射性同位素进行标记，创建了酶联免疫吸附试验（ELISA）。1982年，Neurmau在免疫分析的基础上发展了一种新型免疫分析技术——时间分辨荧光免疫测定(TRFLA)。1976年，Tsuji等基于酶与其特异性发光物质与免疫反应相结合，建立化学发光免疫测定(CLIA)。1990年，Leland建立电化学发光(ECLIA)，是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫, ELIA以后的新一代标记免疫测定技术。

二、免疫荧光技术

免疫荧光技术又称荧光抗体法(fluorescent antibody technique, FAT)，是一种将结合有荧光素(异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯二嗓基氨基荧光素)的荧光抗体作为分子探针与抗原进行反应，借以提高免疫反应灵敏度和适合显微镜观察的免疫标记技术。该法具有灵敏度高、特异性强的特点。

免疫荧光技术的原理是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微小踪的精确性相结合，以有荧光素作为标记物，与已知抗体结合，但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用以检测和鉴定未知抗原。在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物以及其存在部位。

张冬青等采用膜溶解、密度梯度分离纯化结合免疫荧光技术对饮用水中的“两虫”(隐抱子虫和贾第鞭毛虫)进行定性定量分析检测，其回收率分别为56%和35%，均高于EPA 1623方法的质量控制要求。采用免疫荧光技术操作方法简便且经济，适合在国内水源检测中推广使用。有报道首次将微菌落技术同免疫荧光技术相结合，建立了微菌落免疫荧光技术(M-CIF)。M-CIF法敏感性和重复性好，用已知沙门氏菌浓度做最低检出限量实验，常规法检出限为10个/mL，而该

法为5个/mL;阳性对照和阴性对照重复10次，阳性菌落均荧光明亮，颜色稳定，阴性菌落均荧光很弱。用M-CIF法对不同菌落进行特异性的荧光染色鉴别细菌，仅需5-6 h，在食品有害微生物检测方面有着非常大的应用前景。

三、免疫酶技术

免疫酶技术又称酶免疫测定法，是将抗原和抗体的特异免疫反应和酶催化反应的高效性和专一性相结合而建立的一种新技术，常用的酶是辣根过氧化物酶。其原理和免疫荧光技术相似，不同的是用酶代替荧光剂做标记，以及酶的特殊底物处理标本来显示酶标记的抗体，以检测标记物的有无及含量间接反映被测物的存在与多少。该技术具有操作简单、敏感性高、准确性好、易于商品化等特点，正被广泛应用于微量物质检测、免疫相关物质检测等各个领域的分析检测。免疫酶技术方法很多，最主要的方法为酶联免疫吸附法(ELISA)，简称酶标法，被广泛用于检测抗原或抗体，可进行定性和定量分析。ELISA法可检测食品中的病原菌沙门氏菌、大肠杆菌等，食品中的微量农药残留，以及酱油生产中能引起中毒的霉菌次级代谢产物黄曲霉毒素、超曲霉毒素等方面。用该法进行李斯特氏菌的快速检测，用三株针对单核细胞增生仅需48 h，在人工模拟肉中检测下限为5 cfu/ g样品。陈琦等采用酶联免疫试剂盒及绘制以氯霉素浓度为半对数坐标的标准曲线对牛肉和蜂蜜中氯霉素残留量进行测定，变异系数为3.1%一8.6% ,重复性好，精确度高。有报道用酶联免疫吸附酶标仪分析法和免疫亲和微检荧光仪分析法分别对粮油样品中黄曲霉毒素B1进行测定，对其检测条件和结果进行差异性分析，比较发现酶联免疫吸附分析法适宜大批量样品快速筛选，检出限为0.1μg/kg，可在广大基层实验室推广应用。

四、放射免疫标定法

放射免疫测定法(radioimmuno-assay,RIA)是采用放射性同位素的抗原或抗体来检查相应抗体或抗原的高灵敏度免疫分析方法，此法具有高灵敏度(达10-9或10-12）可进行超微量分析，敏感性高等优点。本法常用的同位素有3H，14C，125I和131I等。放射免疫分析法应用范围广泛，在食品安全检测中可用来检测肉类药物残留，黄曲霉毒素等。

徐美奕等人用125 I标记的放射免疫试剂盒测定养殖红笛酬与野生红笛酬肌肉中雌二醇、孕酮、睾酮三种性腺激素残留量。在养殖红笛酬与野生红笛酬肌肉中均检出三种激素，野生红笛酬中的激素残留量较低，但仍能被检出，放射免疫分析法放射性活度低、毒性小、样品处理简单、灵敏度高，检出限高于液相色谱法，可达ng-pg级，可作为水产品中激素残留量的有效检测手段。有文献应用Charm II放射免疫分析方法测定猪尿样的磺胺类残留，检测限为200μg/kg，符合欧美等国磺胺类最大残留限量的检测要求，同时快速简便，在30 min内可出初筛结果，假阴性率为0%，有助于大批量样品的初筛，同时本方法为动物养殖过程中的用药监控提供了一种快速检测方法。

五、胶体金免疫技术

采用电子致密物质(通常用辣根过氧化物酶和铁蛋白)标记的抗体与其相应抗原发生特异性结合，借电镜检出这一标记复合物的技术称为免疫电镜技术。近年来逐渐发展到用胶体金作为非放射性示踪剂，即胶体金免疫技术。胶体金免疫技术是20世纪80年代继三大标记技术(荧光素、放射性同位素和酶)后发展起来的固相标记免疫测定技术。

有关胶体金免疫技术的最旱报道是1971年Faulk和T aylor将胶体金与抗

体结合，用于电子显微镜水平的免疫细胞化学研究。此后，胶体金作为一种新型免疫标记技术发展很快。目前在微生物学检验中应用的主要是免疫层析法和快速免疫金渗滤法。胶体金是由氯金酸在还原剂作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。胶体金标记实质上是蛋白等高分子被吸附到胶体金表面的包被过程，利用它在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子或其他生物大分子的正电荷基团借静电吸引而形成牢固结合。

由于胶体金标记蛋白质是物理结合过程，结合牢固，很少引起蛋白质活性改变，所以试剂非常稳定，不受温度等外界因素影响，可在办公室、家中甚至野外进行检测，试验结果也可长期保存。还具有很强的动力学稳定性，可放置数年。胡孔新等人以被列为I类潜在重要生物恐怖因子鼠疫杆菌作为诊断对象，建立了适合于现场快速检测鼠疫杆菌抗原用的胶体金标记免疫层析方法，其检测灵敏度

5达到1 x 10 cfu/ mL，并对常见的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌无明显非特异

作用，该法对出入境口岸的样品安全检测有重要意义。有文献建立了一种简便快速的胶体金免疫层析法来检测沙门氏菌。致病菌污染食物并在其中大量繁殖或产生毒素是细菌性食物中毒发生的首要原因，食入含106-107cfu/ g沙门菌的食品即可发病。该法制备的免疫层析条检测灵敏度为2.1 x 106cfu/ mL，在沙门菌食物中毒菌量范围内。吉坤美等采用简易快速胶体金免疫层析法(GICA)检测食品中花生蛋白成分。通过胶体金标记建立快速检测花生过敏原GICA试条，具有高灵敏度，GICA测试条与花生蛋白抗原呈特异性反应，检测自制的花生抗原标准品的灵敏度可达50 ng/ mL。可有效地快速检测各种样品，满足我国进出口食品贸易的需求，同时为制定我国食品过敏原标签管理奠定了技术基础。同时，胶体金技术还可用于肉类、蛋类中抗生素残留、激素残留的检测。

六、发光免疫分析技术

一种把化学发光或生物发光反应与免疫测定结合后的高灵敏度分析方法，兼具有发光分析的高灵敏性和抗原抗体反应高度特异性。化学发光剂有荧光醇、光泽精等。利用化学发光反应进行检测是从20世纪60年代中期开始的，20世纪70年代后期将化学发光反应与免疫测定方法结合而建立的化学发光免疫分析法可对多种物质进行微量分析，灵敏度比ELISA高1000倍，且无毒、简便快速。发光免疫技术可用于激素类的检测和抗生素残留检测，同时也可用于肉毒素等微生物代谢物检测，可定量分析也可定性，且无放射性物质污染，在食品安全检测中有广泛前景，但由于其应用时间不长，在方法上仍需进一步探索。

七、发展及展望

免疫标记技术是一类不断发展和改进的技术，有很多新的方法正在被研究。在实际操作中几种免疫标记技术可结合使用，例如可将荧光技术和酶免疫技术结合成荧光酶免疫分析技术，大大提高了敏感性。随着各种研究技术的不断进步，在将来的食品安全检测中，简便、灵敏、快速的联用技术、免疫技术能为食品安全检测提供快捷方法，也为人们的营养健康做出保证，为疾病预防做出贡献。

参考文献

[1]刘瑶，田亚平.免疫标记技术的现状和发展.中华临床医师杂志.2013,4

[2]张冬青，李红岩，李栋，等.密度梯度分离纯化免疫荧光技术检测饮用水中“两虫”.中国给水排水.2009,25

[3]徐美奕，蔡琼珍，黄霞云等.红笛细肌肉中三种性腺激素残留的分析.食品工业科技.2007(6): 208-210.[4]吉坤美，陈家杰，詹群珊.胶体金免疫层析法检测食品中花生过敏原蛋白成分.食品研究与开发2009.30

免疫检测 篇6

关键词：免疫层试纸 检测 食品安全

中图分类号：TS207.3文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）14-0030-02

1 食品安全监测技术研究情况概述

食品安全对于社会和谐具有非常重要的影响，如果爆发食品安全问题，就会造成严重的社会不良反响从而严重社会的稳定发展。然而我国在过去开放式经济发展背景下，我们生活环境受到了严重影响，特别是环境污染的危害已经深入到生活的方方面面，并且是食品安全重要的潜在危害，比如农药残留超标等。除此之外食品添加剂使用超标，存储条件不完善等，都容易造成严重的食品安全问题。

对此国际上对于食品安全的重视程度越来越高，国家在应对食品安全的检测技术方面也给予了大力支持，特别是在早期防控和快速检测这两个方面发展很快，对于我国而言，在食品安全检测方面不仅面临着检测任务重，时间急的困难，同时还存在着检测设备昂贵，对于送测样品需要提前做出更加完善的准备，检测时间长等问题，这些都会要求食品安全监测技术需要具备快速检测的功能。

2 免疫层析试纸检测技术概述

在上个世纪八十年代，免疫层析技术就已经在欧美等发达国家采用，其技术原理主要是根据毛细管层析作用，在硝酸纤维素薄膜上将抗原和抗体进行结合，在这种特异性结合的前提下，通常需要高度显微镜才能够看出，但是通过层析试纸技术，就能够通过创新的标记材料，让这种特异性反应能够在肉眼下看出，或者通过紫外光和红外光线来分辨，如今经过数十年的发展，用于免疫层析试纸的标记材料开始不断创新，而且有关针对标记材料的检测设备也进行了大力创新，从传统通过肉眼进行半定量检测模式转变成通过检测仪器快速读取定量方式，这有效的提升了检测速度，同时也提升了检测的精度。

免疫层析试纸主要是由样品垫、结合垫以及硝酸纤维素膜以及T线也就是检测线和C线又叫做质控线、吸水垫以及PVC底板等模块构成，具体如图1所示。下面就通过分析胶体金免疫层析试纸条的工作原理来说明具体的检测技术。目前针对免疫层析技术主要分为双抗夹心法以及竞争法两种模式。对于双抗夹心法来说，主要是将样品放到样品垫上，然后试纸条中的毛细管就会吸收这个样品中的抗原，并经过通过胶体金材料标记过得抗体结合垫，并在这个结合垫上进行反应，此时继续层析会衍射到T线，此时抗原又会被T线上的抗体所吸引，而过量的金标抗体会继续层析，此时又进一步被C线中的抗体捕捉，这时候就会出现C线和T线同时变红，于是就可以证明是阳性。如果T线不变，但是C线变红，这实际上也说明呈阴性。如果C线没有变化，那就表示这个试纸条检测效应消失。竞争法模式的显色效果和双控夹心模式属于对立面。

3 免疫层析试纸技术研究进展

3.1 检测模式

目前这种技术根据检测模式来划分主要有单检检测和多检检测两种模式。下面就对这两种技术进行简要分析：第一，单检技术。在检测试纸条上只有一条T线和C线就是所谓的单检查技术。这种技术检测准确，灵敏度高，呈现假阳性可能性极低，这种检测技术主要针对少量人员的检测。

第二就是多检测技术，这种技术主要是纸质条上含有两条或者两条以上的T线，但是只有一条C线。那么这种技术就能够在同一个纸条上进行多种检测，因此有效提升检测效率，同时也能够节约相应的检测材料，不过在检测灵敏度方面就相对欠缺，特别是当有害物质浓度较为稀薄时，就很难被检测出来。

3.2 试纸外型

免疫层析技术经过多年的发展，其试纸条的形状也开始呈现多元化的发展趋势，既有双层析通道也有十层析通道，并且能夠在同一个纸条上获得两种或者以上的有害物质。第一，双向层析试纸。这是由梁新苗设计的一种更方便放样的一种新型试纸条类型。这种外形同时还有效节约了相关材料，并对葫芦科病毒有很强的检测能力。且还具备操作方法简单，灵敏度高，检测准确度高的优势。

第二，十通道免疫层析试纸。这种技术是建立在一个试纸槽技术基础上，这个试纸槽含有十个试纸盘，然后在试纸槽中间增加一个引流片，从而保证样品液能够均匀进入到试纸槽之内，于是就能够实现均匀的层析效应。这种检测方式不但具有单通道试纸技术的优势，同时一次性还能够测试多种，所以有效提升了测试效率。

3.3 检测手段

这种技术的核心就是生物技术，并在食品检测方面的应用取得了极大的成功，而随着免疫层析技术的不断发展，再加上融入其他先进的科学知识，如光电传感器的应用，以及自动化技术的使用等，能够从之前的定性检测，逐渐发展到现在的定量检测，有效提升了检测效率和精确度。

4 目前免疫层析试纸技术应用现状

当前免疫层析技术的应用非常广泛，比如在临床检测诊断方面，就可以利用免疫层析检测技术来实现对乙型肝炎病毒的检测，还能够对口蹄疫病毒以及禽流感病毒等进行科学检测。而在食品安全层面，免疫层析试纸技术则能够对食品中潜在的有毒物质进行全面的检测，而且检测方法简单，成本也相对比较低廉。

目前针对免疫层析试纸的广泛应用在定量问题方面还有一定的瓶颈，由于传统的试纸仅仅能够提供半定量的检测，不过这已经比传统的试纸只能够进行定性检测已经取得了重要成绩。但是这种半定量的检测模式，显然还不能够成为当前免疫层析试纸未来的发展，因为从技术突破来看，定量的层析试纸技术才是最终的发展目标，也是当前研究的重要内容。如今在国内外，有关免疫层析试纸条技术应用较为成熟的产品是胶体金免疫层析试纸条。这种标记技术还不能够做到全定量，而在生物技术和纳米科技以及光电技术的持续发展基础上，新型的标记材料会不断涌现，这对于定量检测的最终研究提供了重要的技术基础，而定量检测技术的成功研发，必将为食品的安全监测提供强大的技术保障。

参考文献

[1]周思，肖小华，李攻科.食品安全快速检测方法的研究进展[J].色谱，2011（07）.

[2]李康，应美蓉，盛慧萍，桑丽雅.胶体金免疫层析技术在真菌毒素快速检测中的应用[J].食品安全质量检测学报，2013（02）.

[3]王静，王淼.我国食品安全快速检测技术发展现状研究[J].农产品质量与安全，2014（04）.

免疫检测 篇7

1.1 试验材料

试验动物:选择中宁县规模化鸡场 (3 000只以上的饲养户) 8户, 每户随机按比例采鸡血若干份, 共240份。

疫苗来源:重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗 (H5N1, RE-5株+Re-4株) 由肇庆大华农生物药品有限公司生产 (批准号:农医药便函[2009]27号) 。

试验器材:一次性采血注射器, V型微量反应板, 8孔道可调微量移液器, 滴头 (相匹配) , 微量振荡器, 离心机。

诊断试剂:配置稀释好3只未免疫高致病性禽流感、新城疫疫苗的鸡1.0%红细胞、pH值7.2的磷酸盐缓冲液 (PBS液) 。禽流感抗原 (批号201007、抗原凝聚价210) 和禽流感阳性血清 (批号201001) , 均由哈尔滨维科生物技术开发公司生产。

1.2 试验步骤

1) 群体差异及血样的采集。鸡群免疫情况及血样的采集, 如表1所示。

2) 对所采集血样, 分离血清, 分装离心管, 编号登记。

1.3 检测方法

1) 检测方法:

禽流感免疫抗体血凝 (HA) 和血凝抑制 (HI) 试验, 按照GB/T18936-2003高致病性禽流感诊断技术进行检测。

2) 结果判定方法:

以完全抑制4个血凝单位 (HAU) 抗原的血清最高稀释倍数, 作为HI试验的滴度。

3) 判定标准:

只有阴性对照孔血清滴度≤22, 阳性对照孔血清误差不超过1个滴度, 试验结果才有效。当进行免疫抗体检测时, HI价≤22判定HI试验阴性;HI价为24时属于可疑, 需要重复试验;HI价≥25为阳性, 判为免疫合格, 因此禽流感的抗体效价≥25判定为免疫合格。免疫合格率应达到70%以上, 即合格率≥70%为免疫合格鸡群;合格率<70%, 则为不合格鸡群。

2 结果与分析

抗体检测结果, 如表2所示。

由表1和2可分为4组进行分析。

第1组:王朝清饲养的8 000只蛋鸡, 只防疫了禽流感H9而未免疫高致病性禽流感H5N1疫苗, H5N1的免疫抗体为0, 鸡群无抵抗高致病性禽流感H5N1病毒侵袭的能力, 遇到高致病性禽流感H5N1疫病流行时, 最易发病。在采血后的1周左右, 该鸡群发生了疫病, 损失惨重。

第2组:张军、康义农和平自强饲养的鸡群, 高致病性禽流感H5N1疫苗免疫了1次, 免疫合格率分别为38.0%、0和6.7%。免疫时间与采血时间相隔3个多月, 免疫抗体水平很低, 在25以下, 为不合格鸡群, 给高致病性禽流感H5N1疫病的发生埋下了隐患。

第3组:贺宗定、李福成和闫树文饲养的鸡群, 高致病性禽流感H5N1疫苗免疫了2次, 免疫滴度均在25以上, 集中而整齐, 免疫合格率100%, 为免疫合格鸡群, 能抵御高致病性禽流感H5N1病毒的侵袭。

第4组:张俊峰饲养的3 000只蛋鸡 (18.5月龄) , 每4个月免疫高致病性禽流感H5N1疫苗1次, 免疫时间与采血时间相差80 d, 而鸡群的免疫抗体在27以上, 高而整齐, 免疫合格率100%, 为免疫合格鸡群, 能抵御高致病性禽流感H5N1病毒的侵袭。

3 讨 论

1) 从以上试验4组的检测结果, 可以得出以下结论。

一是高致病性禽流感H5N1疫苗免疫的有效期为4个月, 间隔4个月可以加强免疫1次。

二是首次免疫高致病性禽流感H5N1疫苗后的3个月内, 抗体消失很快, 如试验第2组, 必须在首免1个月左右加强免疫1次, 才能保证鸡群有高而稳定的免疫抗体水平。

三是张俊峰 (第4组) 的鸡群, 在加强二免后每4个月免疫高致病性禽流感H5N1疫苗1次, 间隔4个月后的免疫抗体仍然很高 (27以上) , 以后可以通过测定鸡群免疫抗体的高低, 确定鸡群免疫的最佳时间。

2) 就高致病性禽流感H5N1疫苗免疫次数与免疫时间不同, 所产生的不同免疫结果的原因, 分析如下。

免疫学的有关理论提出, 首免的免疫学意义在于诱发动物机体产生免疫记忆反应, 而不是产生高效的免疫抗体。机体首次接种外来抗原后, 产生的抗体以免疫球蛋白 (IGM) 为主, IGM有5个抗原结合点, 可以在短期内中和大量的抗原, 但它与抗原的结合力比较弱, 在体内维持时间不长, 且不稳定, 二者形成的抗体抗原复合物, 之后被补体清除, 并产生记忆细胞。2次接触相同的抗原后, 记忆细胞迅速激活, 诱导机体产生高效的免疫球蛋白G (IGG) 抗体, IGG是介导体液免疫的主要抗体, 是动物血清中含量最高的免疫球蛋白, 占血清免疫球蛋白总量的75%～80%, 不仅含量高而且维持时间长。因此, 2次免疫后激活了记忆细胞, 刺激机体快速产生大量的IGG抗体, 从而使机体的抗体水平高而持久, 这样在机体受到相同的病原刺激时而不至于发病。

3) 通过以上的检测分析, 结合免疫学相关的理论, 高致病性禽流感H5N1疫苗必须经过首免后, 间隔1个月左右, 加强免疫1次, 以后每间隔4个月免疫1次, 使鸡群产生坚强的免疫抗体, 鸡群免疫抗体的合格率才能达到100%, 以保证鸡群免遭高致病性禽流感H5N1病毒的侵袭。

摘要：为确定鸡群免疫高致病性禽流感H5N1疫苗的最佳免疫时间, 选择8户规模化鸡场, 采集240份鸡血样, 进行免疫抗体检测。结果发现, 第1组鸡群只防疫禽流感H9、未免疫高致病性禽流感H5N1疫苗, H5N1的免疫抗体为0;第2组鸡群高致病性禽流感H5N1疫苗免疫了1次, 3个多月后, 免疫抗体水平很低, 在25以下;第3组鸡群高致病性禽流感H5N1疫苗免疫了2次, 免疫滴度均在25以上;第4组鸡群高致病性禽流感H5N1疫苗每4个月免疫1次, 免疫抗体在27以上。试验表明, 高致病性禽流感H5N1疫苗经过首免后, 间隔1个月左右, 必须加强免疫1次, 以后每间隔4个月免疫1次, 使鸡群产生坚强的免疫抗体, 才能确保鸡群的免疫抗体合格率达到100%。

猪瘟免疫抗体检测及效果分析 篇8

关键词：猪瘟,免疫抗体检测,效果分析

猪瘟是由黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒引起的一种急性、发热、接触性传染传染病。具有高度传染性和致死性。被世界动物卫生组织 (OIE) 列为必须报告的传染病, 对养猪业危害极大。近几年来潼南县通过加大免疫力度防控猪瘟的发生, 为了检测猪瘟免疫效果, 制定合理的免疫程序, 潼南县动物疫病控制部门和养猪场业主制定猪瘟免疫计划提供依据, 于2011年10月在潼南县22个镇 (街) 的规模化猪场和和散养户采血进行猪瘟免疫抗体进行了检测, 现将检测结果分析报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂:

间接血凝抗原、猪瘟标准阴性、阳性血清购自中国农业科学院兰州兽医研究所, 诊断试剂在有效期内使用。

1.1.2 器械:

移液器 (50μL、20μL) 、取液塑料嘴、V型110°96孔血凝板和微量振荡器。

1.1.3 被检血清:

在潼南县22个镇 (街) 的规模化猪场和和散养户中采集猪瘟免疫接种21 d后的猪血清826份, 根据养殖规模和免疫情况分为3个组, 其中第一组:种猪场血清132份, 供采集血清的猪免疫接种2次猪瘟兔化弱毒脾淋苗, 剂量分别为3头份、2头份;第二组:4个规模化商品猪场血清258份, 供采集血清的猪免疫接种2次猪瘟兔化弱毒细胞苗, 剂量为每次3头份;第三组:22个镇 (街) 的散养户130个散养猪场血清436份, 供采集血清的猪免疫接种1次猪瘟兔化弱毒细胞苗, 剂量为2头份。

1.2 检测方法

应用猪瘟正向间接血凝试验 (IHA) , 严格按照诊断试剂说明书的要求进行操作。

1.3 判定标准

在阴性、阳性血清稀释液对照孔合格的前提下, 再观察待检血清各孔, 以呈现“++”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价, 受检血清抗体效价≥1∶32判为合格, 存栏猪免疫抗体合格率≥70%判为合格。。

2 结果

从表1可以看出, 22镇 (街) 的规模化猪场和散养猪场共检测血清样品826份, 抗体效价≥1∶32为826份, 免疫抗体合格率为80.99%, 其中种猪场免疫合格率为94.70%, 规模商品猪场免疫合格率为85.66%, 散养猪场免疫合格率为74.08%。

3 讨论

3.1 检测结果表明, 潼南县种猪场猪瘟免疫效果较好, 但部分规模化商品猪场免疫抗体水平不容乐观, 散养户猪的免疫抗体合格率虽然达到农业部规定的≥70%标准, 但存在感染猪瘟疫情的隐患。免疫抗体合格率不高的原因主要有以下几方面。

3.1.1 疫苗的保存和运输存在问题:有的畜牧兽医站、业主在疫苗运输过程中无冷藏设备, 部分养殖户将疫苗领回去后没有条件达不到将稀释的猪瘟冻干苗存放过久, 造成疫苗效价降低或失效。

3.1.2 免疫注射存在问题:疫苗剂量不足;免疫密度偏低;过早注射, 对刚生下几天的仔猪注射猪瘟疫苗, 母源抗体干扰, 影响免疫效果;注射技术不规范, 不消毒, 不换针头。

3.1.3 没有按科学合理的免疫程序进行免疫, 没有及时采取补免工作一些散养户和专业养殖户动物防疫意识比较淡薄, 1年仅免疫1次, 甚至在猪出现疫病迹象时, 才开展免疫工作, 造成猪群免疫合格率达不到要求。

3.1.4 疾病的影响部分猪场存在普通猪繁殖与呼吸综合征 (PRRS) 等疫病, 使猪体免疫力下降, 对猪瘟疫苗的免疫应答下降, 造成免疫失败;有的猪场存在温和性猪瘟, 由猪瘟病毒的持续感染造成免疫耐受。

3.1.5 饲养管理水平较低的影响部分散养户利用剩饭泔水、霉变饲料, 引起肝细胞的变性坏死、淋巴出血水肿, 严重破坏机体免疫器官, 造成机体的免疫抑制。

3.2 针对潼南县猪瘟免疫现状, 各猪场免疫状态不尽一致, 仔猪的母源抗体消长规律也不相同, 各猪场要建立免疫抗体检测制度, 掌握母源抗体消长规律, 制定适合本猪场的免疫程序, 选定首免日龄, 做好补免工作

3.3 从潼南县部分猪场使用猪瘟兔化弱毒脾淋苗反应效果不错, 而且这次免疫抗体检测, 抗体效价较高, 建议使用猪瘟兔化弱毒脾淋苗, 据研究表明, 猪瘟兔化弱毒脾淋苗的主要优点有:产生免疫快且坚强 (4 d可产生坚强免疫力) ;可抵抗亚临床感染;无外源病毒之忧。

3.4 加强猪场疫病综合防控能力, 淘汰PRRSV、CSFV阳性猪, 减少混合感染机会, 提高猪群整体健康水平。

3.5 对猪瘟的防控不能单靠免疫接种, 还要实行严格卫生消毒制度、科学饲喂、坚持自繁自养、全进全出的饲养方式等综合防控措施。

参考文献

[1]蔡宝祥.当前我国猪瘟防制中存在的问题和对策.现代化养猪企业经营管理研讨会论文集[C];2004年.

[2]邓心武.在猪体内猪瘟兔化弱毒和猪瘟强毒之间的干扰作用.中国兽医科技;1980年03期.

[3]李海明.猪瘟免疫程序的研究.福建农林大学;2003年.

免疫检测 篇9

1 材料和方法

1.1 标本

来源为2009年至2010年来本院住院和门诊的患者,随机抽取50例血清标本。

1.2 仪器和方法

酶联免疫法使用雷勃酶标仪(MULTISKAN MK3)试剂使用上海科华。化学发光免疫法使用西门子全自动化学发光仪(ADVIA Centaur XP)和配套试剂,采用吖啶酯为发光底物,采用双抗体夹心法[3]。

1.3 统计学处理

采用统计学软件包SPSS11.0进行分析处理,所得数据以均数±标准差(x±s)表示,以p<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 线性实验

将标准液按不同浓度稀释后做线性实验,结果显示ELISA法和化学发光法呈良好的线性关系,见表1。

2.2 对比实验

用ELISA法和化学发光免疫法同时对血清标本进行定量分析,结果表明,两法差异无统计学意义(p>0.05),相关系数r=0.996,提示两法呈良好相关性,见表2。

2.3 精密度实验

用两种方法对低、中、高质控品分别进行精密度实验,表明化学发光免疫法重复性好于ELISA法,特别是病理高值化学发光免疫法明显优于ELISA法,见表3。

3 讨论

化学发光免疫技术既具有发光检测的高度敏感性,又具有高度特异性[4],是公认快速、精确、重复性好且安全无毒的方法。ELISA法也以快速、简便实效而被广泛应用[5~7]。我们检测AFP结果指示化学发光法和ELISA法之间差异无统计学意义(p>0.05)相关性好r=0.996.通过比较显示化学发光法线性范围宽,精密度等方面明显优于ELISA法,因此我们认为化学发光法可广泛应用于临床项目的检测[8]。

摘要：目的:探讨两种方法检测AFP的优缺点。方法:采用西门子全自动发光免疫分析仪和雷勃酶标仪。结果:化学发光法和ELISA法之间差异无统计学意义(P>0.05),相关性良好(r=0.996)。结论:化学发光法的精密度和准确性均优于酶联免疫法。

关键词：化学发光免疫法,酶联免疫法,甲胎蛋白

参考文献

[1]崔锐.肿瘤标志物在良性疾病中浓度观察[J].放射免疫学杂志,2004;17(2):138

[2]陶义训.免疫学和免疫学检验.第二版.北京:人民出版社.1997,174

[3]章谷生.发光分析和发光免疫技术.余传霖.现代医学免疫学.上海:上海医科大学出版社.1999,16

[4]张丽民.化学发光标记及发光免疫分析.基础医学与临床,1995;15(4)::247

[5]张强,雷清.乙肝表面抗原大蛋白在基层医院的应用.中国医药导刊,2008;(8):1249～1250

[6]邢文革,马嵘.HIV抗体快速检测试剂的临床评估.中国医药导刊,2004;(4)::208～292

[7]李金明.临床酶免疫测定技术[M].北京:人民军医出版社.2005,217

免疫检测 篇10

1资料与方法

1.1一般资料:选择2014年1~12月在本院的同时申请检测ANA和ANAs的门诊和住院患者6121例。其中男1020例,年龄18~75岁,女5101例,年龄14~86岁。

1.2 IIF检测ANA:采用德国欧蒙公司提供的ANA(马赛克)IIF试剂盒,商品号:FA1510-1005-1,每个反应区含2种抗原复合基质:HEP-2细胞和猴肝组织。以抗体滴度≥1∶100为阳性。

1.3 LIA检测ANAs:ANAs检测采用LIA法,检测试剂盒由深圳市亚辉龙生物科技有限公司提供,其试剂条含有17个测定项目:抗ds DNA、抗核小体抗体、抗组蛋白抗体(抗histones)、抗Sm D1、抗增殖性细胞核抗原抗体(抗PCNA)、抗核糖体P蛋白抗体(抗P0)、抗SSA/Ro52kd、抗SSA/Ro60kd、抗SSB/La、抗着丝点蛋白B抗体(Cenp B)、抗硬皮病70抗体(抗Scl-70)、抗U1-sn RNP、抗线粒体M2型抗体(抗AMA-M2)、抗J0-1、抗多发性肌炎/硬皮病抗体(抗PM-Sc1)、抗Mi-2、抗Ku。将血清1∶100稀释,严格按试剂说明书操作,肉眼判断反应结果。

1.4统计学分析:统计学分析采用SPSS19.0统计软件,率的比较采用χ2检验,以P<0.05为差别有统计学意义。

2结果

2.1对2014年6121例标本同时用IIF检测ANA和LIA检测17种自身抗体,发现有IIF检测ANA阳性1200例,占19.6%,阴性4921例,占80.4%,LIA检测ANAs阳性1659例,占21.1%,阴性4462例,占70.9%。其中IIF-ANA-/LIA-ANAs+的有1107例,不一致率为22.5%。IIF-ANA+/LIA-ANAs-的有124例,不一致率为10.3%。见表1。

2.2在1107份IIF-ANA-/LIA-ANAs+标本中,中阳性率最高的前五种自身抗体是SSA/Ro60kd、SSA/Ro52kd、抗Sm D1、抗SSB抗体、抗histones,阳性率为分别为29.62%、18.32%、10.20%、9.58%、8.61%,总占76.33%,其余的占23.67%。见表2。

3讨论

抗核抗体是以细胞成分为靶抗原的器官非特异性自身抗体的总称,以Hep-2细胞为抗原基质的间接免疫荧光法(IIF)被认为是ANA检测的“金标准”[2]。而随着靶抗原的纯化技术不断提高,不断涌现自动化程度较高、易于标准化的检测方法,其中LIA是近年来研究较多的一种检测方法。但在实际检测过程中,我们会发现IIF检测ANA与LIA检测ANAs的结果不一致,笔者通过对二者不同结果进行分析,试图阐述该类标本检测自身特异性抗体的临床意义。

在对2014年6121例标本同时用IIF检测ANA和LIA检测17种自身抗体中发现,IF-ANA-/LIA-ANAs+的有1107例,不一致率为22.5%。其中阳性率最高的前五种自身抗体是SSA/Ro60kd、SSA/Ro52kd、抗Sm D1、抗SSB抗体、抗histones,阳性率为分别为29.62%、18.32%、10.20%、9.58%、8.61%,总占76.33%,其余的占23.67%,结果与周仁芳等人的报道的以SSA为主要抗体一致[3]。分析原因可能是HEP-2细胞SSA的表达丰度低以及固定过程中抗核抗原出现弥散丢失。有文献报道,如选择转染Ro60c DNA的HEp-2000细胞基质可提高检测的灵敏度[4],另外其他抗体也有不同程度的漏检,笔者认为可能是:(1)IIF中HEp-2细胞为人源的细胞,部分表达的靶抗原含量低,且不均一,不同固定方法对特定抗原可能会丢失,故容易漏检,而LIA所包被的是来源于牛的胸腺和脾脏纯化抗原,含量高且固定,当标本抗体浓度低时,也可被检测(灵敏度高)。(2)方法学上IIF一般手工操作,且操作繁琐,滴度判断需系列稀释,荧光染色不稳定,荧光类型需肉眼判断,少见的特殊类型还需经验丰富专业技术人员鉴定等;而IIF可自动化,判读方便,重复性较好。

而IIF-ANA+/LIA-ANAs-的有124例,不一致率只为10.3%,表明以Hep-2细胞作为抗原基质的IIF法能检测出绝大多数自身抗体,是目前筛选ANA的理想实验。

综上所述,IIF-ANA与LIA-ANAs的检测有其互补性,二者不相互替代。IIF-ANA具有覆盖ANA抗体面广,同时即是筛查试验又是ANA检测金标准的特点,而LIA-ANAs有较高的检测敏感性和疾病特异性,故两种方法学间存在检测敏感性和特异性的差异。如果单用任何一种方法检测都有可能造成ANA阳性结果的漏检、漏报或AID的漏诊。因此,临床应用时,尤其对AID的早期诊断、鉴别和治疗,需联合进行IIF-ANA筛查和LIA-ANAs检测,减少漏诊或误诊。

参考文献

[1]Shoenfeld Y,Gershwin ME,Maroni PL,et a1.Auto antibodies[M].Second Edition.Netherlands,2007:29-32.

[2]Ghirardello A,Bendo R,Rampudda ME,et a1,Commercial blot assays in the diagnosis of systemic rheumatic diseases[J].Autoimmun Rev,2009,8(8):645-649.

[3]周仁芳,胡朝军,张蜀澜,等.抗核抗体筛查实验与特异性抗体确认实验相关性研究[J].中华检验医学杂志,2009,32(12):1344-1348.

免疫检测 篇11

【关键词】 HBsAg；HBV

【中国分类号】 R67.18【文献标识码】 B【文章编号】 1044-5511（2012）02-0141-01

乙肝表面抗原（HBsAg），核心部分含有核心抗原即HBcAg，e抗原即HBEAg及乙肝病毒的脱氧核糖核酸即HBV-DNA、脱氧核糖核酸多聚酶即DNA-P^［1］。人感染乙肝病毒后，血液内常有大量的表面抗原剩余下来，形成表面抗原血症。表面抗原本身不是完整的乙肝病毒，而是乙肝病毒的外壳，它本身没有传染性但有抗原性，它只是乙肝病毒感染的标志之一。它可以表示过去感染过乙肝病毒，或者目前正在受到乙肝病毒的感染。为此我们对慢性HBV感染人群以HBsAg浓度及自然史进行分组检测，采用捕捉法酶联免疫吸附试验(ELISA)和流式细胞术(FCM)分别测定血清双特异性免疫复合物及淋巴细胞亚群，以了解低浓度HBsAg人群的临床特征及宿主免疫功能。

1.一般资料

选择在我院接收检测的慢性乙肝病毒感染者124份的检测病理资料，男84例，女40例，年龄16-65岁，其中低浓度HBsAg血清标本36份（A组），高浓度HBsAg血清标本共68份(B组），另收集健康体检者乙肝病毒血清学标志物(HBV M)全阴性标本20份作为对照(C组)。上述所有受检者无其他类型肝炎病毒和HIV感染史，A组、 C组及B组的非活动期和免疫耐受期HBV感染者无保肝、 降酶、 免疫调节剂和抗病毒药物应用史，B组的免疫活动期HBV感染者在治疗前采集标本或近半年内无免疫调节剂及抗病毒药物应用史，血清标本置于-20℃保存待测， EDTAK2抗凝静脉血标本在2 h内测定。

2.检测方法

取EDTAK2抗凝外周血100 μL分别加入10 μL CD3FITC/CD16+56PE/CD19PC5、 CD4FITC/CD8PE/CD3PECy5和同型对照抗体进行标记，经孵育、溶血、洗涤后由专业人员在流式细胞仪上进行CD3+、 CD3+CD4+、 CD3+CD8+、 CD3-CD19+、 CD16+56+百分率测定，CD4+/CD8+比值通过CD3+CD4+、 CD3+CD8+计算获得。血清TCIC阳性率及(A)值、 淋巴细胞亚群结果比较分别采用两样本的χ2检验或精确概率法和t检验。

3. 结果

低浓度HBsAg血清标本36份中，32例分布于非活动期，呈低浓度表现达9个月-6年，平均1.6年，其中2例免疫耐受期患者HBV DNA分别达1011copies/L和107copies/L，2例免疫活动期患者中，1例HBV DNA达109copies/L， 1例HBV DNA达106copies/L，ALT在50-70 U/L之间，32例非活动期患者中，2例HBsAg/抗HBc阳性，2例HBV DNA达106copies/L；未发现低浓度HBsAg家族聚集现象及职业差别。血清标本TCIC测定结果：aP<0.05, cP<0.05 vs非活动期; bP<0.01, dP<0.01 vs B组；外周血标本淋巴细胞亚群测定结果：aP<0.05, bP<0.01 vs非活动期； cP<0.05, dP<0.01 vs C组.

4.讨论

日常生活中常会遇到一些非常健康的人在查体中发现乙肝表面抗原阳性，便以为自己得了乙肝，心情非常沮丧，而其周围的人也非常紧张，害怕自己被传染，尤其是未婚青年更为自己的前途担忧。事实上，单凭乙肝表面抗原阳性是不能断定其有无传染性的，而主要取决于病毒在肝内的复制程度。如果病毒的复制很活跃，大量的病毒颗粒釋放到血液中去，这个人的血液就有很强的传染性。反映乙肝病毒复制的指标很多，如HBsAg，HBV-DNA、抗-HBclgM等，最简单的方法就是查一下乙肝五项指标。如果HBsAg、HBeAg和抗HBc三项阳性（即为大三阳），其血液就有高度传染性；如果抗-HBe阳性，其血液的传染性就较低。 

一般来说，HBsAg阳性者可以和正常人一样参加工作、学习和社交活动，他们对周围的同志不构成明显的威胁。HBsAg阳性携带者结婚前最好先查一下本人的HBeAg和抗-HBe，如果抗-HBe阳性，说明传染性较低，可以结婚；如果HBeAg阳性，就要再查对方的血清，如果是抗-HBs阳性，说明对方对乙肝病毒已有免疫力，不会再感染。如果对方HBsAg、抗-HBs和抗-HBc都是阴性，则可注射乙型肝炎病毒灭活疫苗，待体内产生保护性抗体后再结婚。 

把患者血清稀释2-12倍后，与已知浓度的表面抗体相混合，产生凝集反应的最高值便为表面抗原滴度。从这里可以看出，稀释数愈大而出现凝集时，说明血清中表面抗原含量愈多。血清中HBsAg含量与传染性成正变关系，但非肯定的一致关系。高滴度的HBsAg可作为有传染性的参考指标。临床可根据乙肝表面抗原滴度的高低估计患者传染性的大小。滴度越高，e抗原（HBeAg）、脱氧核糖核酸聚合酶（DNAP）、乙肝病毒脱氧核糖核酸（HBV-DNA）阳性的可能性越大，传染性也越强。 肝炎的严重程度和HBsAg的滴度间没有必然的内在联系，譬如相同的HBsAg携带者，既可见于慢性活动性肝炎，也可见于肝硬化甚至肝癌。有些无症状HBsAg携带者，肝功正常，HBsAg滴度往往很高，而在一些重型肝炎肝功能严重损害，HBsAg滴度却较低，有时甚至是阴性。 

通过测定3组人群淋巴细胞亚群发现：低浓度HBsAg组非活动期的CD3+CD8+低于高浓度HBsAg组非活动期的CD3+CD8+(P<0.05)，CD4+/CD8+则相反(P<0.01)；低浓度HBsAg组非活动期的各淋巴细胞亚群与C组无统计学意义，而高浓度HBsAg组各分期中部分或全部的淋巴细胞亚群与C组存在显著性差异(P<0.01或P<0.05)；结果提示, 低浓度HBsAg组非活动期也存在免疫耐受现象，我们认为属于低剂量耐受(低浓度HBsAg)，而高浓度HBsAg组免疫耐受期存在的耐受现象^［2］应属于高剂量耐受(高浓度HBsAg)，高浓度HBsAg组非活动期、 免疫活动期则存在免疫功能紊乱现象。综上所述, 低浓度乙型肝炎表面抗原人群是慢性乙型肝炎病毒感染、传播过程中形成的一个特殊的群体，低浓度低浓度乙型肝炎表面抗原的产生并较长时间的存在不仅与机体本身的免疫复合物形成和清除能力低下有关，还与慢性乙型肝炎病毒低抗原浓度诱导机体淋巴细胞产生完全或不完全的免疫耐受有关，而且还可能与慢性乙型肝炎病毒的分子生物学机制有关，检测低浓度乙型肝炎表面抗原人群免疫耐受产生的机制及免疫耐受的打破对慢性乙型肝炎病毒的感染、传播，清除及预防具有重要的临床学意义。

参考文献

［1］ 李金明. 感染性疾病血清学检验中应重视对弱反应性标本的确认［J］. 中华检验医学杂志, 2007, 22(7): 57-58.

［2］ 林春景, 吴金明. 乙型肝炎病毒感染免疫耐受机制的研究进展［J］. 国际流行病学传染病学杂志,2005, 12(4): 27-28.

免疫检测 篇12

1 材料与方法

1.1 试验动物及疫苗

试验动物:选择15只1.5～2千克健康家兔, 初步测得其体温波动不大, 并在试验前1天测定基础体温。

试验疫苗:兔源猪瘟疫苗, A生物公司生产, 批号为089060;细胞源猪瘟疫苗, B生物公司生产, 批号为080309。

1.2 方法

将10只家兔随机分成5组, 每组2只, 于试验前1天测基础体温。1～5组分别静脉注射10 RID/只A公司兔源疫苗、20 RID/只A公司兔源疫苗、10 RID/只B公司细胞源疫苗、20 RID/只B公司细胞源疫苗、生理盐水1毫升/只 (对照组) 。注射后每隔6小时测量体温一次, 连测96小时, 对照组不出现定型热或轻型热, 试验成立。

1.3 注意事项

(1) 试验兔必须要健康, 最好是2千克左右的青年兔, 不要选择仔兔、妊娠母兔和体型过大的兔。同时要了解兔子的习性, 尽量避免兔子体温波动太大。

(2) 测量体温时动作要轻, 避免使用粗暴动作, 同时注意规范操作, 读数准确。

(3) 试验期间尽量保持以前的生活环境, 避免外界应激带来的不良影响, 比如不要随便改变饲养方式、温湿度等。

1.4 兔体交互免疫试验结果判定

接种猪瘟疫苗后, 试验兔体温有热型反应的为含猪瘟弱化病毒, 没有热型反应的为不含猪瘟弱化病毒。

2 结果与分析

注射疫苗后每隔6小时测量体温, 连续16次测得各组的体温变化结果见表1。

从表1数据可以看出, 对照组 (第5组) 9号、10号兔, 体温变化范围分别为39.8～40.1℃、39.5～40.2℃, 温差0.3～0.7℃, 基本没有出现热型反应。第1组的1号、2号兔的体温变化范围分别为40～40.9℃、39.7～40.3℃, 温差0.6～0.9℃, 第2组的

℃

3 号、4号兔体温变化范围为39.

5～40.2℃、39.5～40.1℃, 温差0.6～0.7℃, 说明第1组和第2组的兔基本没有出现热型反应。第3组的5号、6号兔的温度变化范围为39.3～40.9℃、39.6～41℃, 温差1.4～1.6℃, 说明第3组有微量的热型反应, 第4组的7号、8号兔温度变化范围为39.8～41.8℃、39.4～41.6℃, 温差1.2～2.0℃的, 说明第4组有明显的热型反应。

第5组对照组没出现热型反应, 表明整个试验成立;第1组、第2组基本没有出现热型反应, 表明此次试验的A生物公司的兔源疫苗基本没有效果。第3组、第4组出现了热型反应, 表明此次试验的B生物公司细胞源疫苗有一定效果。