细胞免疫检测试验

细胞免疫检测试验（精选8篇）

细胞免疫检测试验 篇1

猪圆环病毒 (Porcine circovirus, PCV) 是目前发现的最小的动物病毒, 属圆环病毒科、圆环病毒属病毒[1]。根据PCV的致病性、抗原性和核苷酸的序列差异将它分为猪圆环病毒1型 (PCV-1) 和猪圆环病毒2型 (PCV-2) 2个血清型[2]。以前的研究认为, PCV-1对猪没有致病性[3], PCV-2对猪有致病性, 但两者都不引起细胞病变[4]。但近年来从死产的仔猪分离到该病毒, 表明可能并非如此[5]。PCV-2能在猪源PK-15和Vero细胞中生长繁殖, 应用免疫过氧化物酶单层细胞试验 (IPMA) 、免疫电镜技术、分子克隆及核酸序列分析等鉴定表明:分离株感染细胞后, 病毒抗原主要分布在细胞核及细胞质中; 病毒感染的阳性细胞呈散在分布, 阳性细胞数可达50%以上[6]。目前, PCV在加拿大、美国、丹麦、西班牙及中国均有发现。PCV-2除了能引起仔猪多系统衰竭综合征 (PMWS) 之外, 还与许多猪相关疾病的发生有关, 如猪皮炎与肾炎综合征 (PDNS) 、增生性坏死性肺炎 (PNP) 、猪呼吸道综合征 (PRDC) 、繁殖障碍、先天性颤抖 (CT) 、肠炎等疾病。本试验建立了PCV-2免疫过氧化物酶单层细胞检测技术, 该方法具有良好的敏感性和特异性, 可满足流行病学调查、临床监测和疫苗抗体水平检测的需要[7]。

1 材料

0.01 mol/L PBS (pH值为7.2) 、TBS洗涤液、TBSTx (即在TBS中加入TritonX-100使终浓度为0.1%的溶液) 、牛血清白蛋白 (BSA) 封闭液、甘油-PBS封片液、PCV-2单克隆抗体、HRP-DAB底物显色试剂盒、3%过氧化氢、丙酮-乙醇 (6∶4) 固定液 (4 ℃保存) 、辣根酶标记兔抗猪IgG、Harris-苏木素液、猪圆环病毒株, 由商丘职业技术学院传染病实验室提供;PK-15传代细胞, 购自中国典型培养物保藏中心。

2 方法

2.1 PK-15细胞的培养

将复苏的PK-15传代细胞置于恒温 (37 ℃) 培养箱中培养, 观察细胞生长状况, 待细胞长满单层后用D-Hank’s液洗涤2～3次, 然后用消化液消化, 注意观察细胞形态, 待细胞萎缩、变圆时停止消化, 弃掉消化液并加入DMEM培养基, 充分吹打后1瓶分装成2瓶, 如此传2～3次。

2.2 PK-15接毒细胞的培养

PK-15细胞传代生长稳定后, 接入PCV-2, 于恒温培养箱中培养待长满单层后用D-氨基葡萄糖处理15～20 min;再用D-Hank’s液洗涤2～3次;加入DMEM生长维持液, 放入恒温培养箱中继续传2～3代后, 转移到24孔细胞培养板中;同样让接毒细胞传2～3代, 待细胞生长稳定长成单层。

2.3 IPMA的建立

细胞培养板中的细胞长成单层后弃掉培养液, 每孔加入300 μL固定液固定15 min;弃去固定液, 用洗涤液洗涤3次, 每次3～5 min;弃尽洗涤液 (每次洗涤时用手轻轻晃动数次) , 加入3%双氧水室温作用30 min;弃掉双氧水, 用洗涤液洗涤3次, 每次3～5 min (每次洗涤时用手轻轻摇动平板) ;每孔加入封闭液200 μL, 37 ℃封闭60 min;弃掉封闭液, 每孔加入200 μL稀释好的特定一抗, 37 ℃作用60 min; 洗涤液洗涤3次, 每次3～5 min (每次洗涤时用手轻轻摇动) ;去除洗涤液, 每孔加入200 μL稀释好的辣根过氧化物酶标记的二抗, 37 ℃作用60 min;用洗涤液洗涤3次, 每次3～5 min;弃尽洗涤液 (每次洗涤时用手轻轻晃动数次) , 每孔加入新鲜配制的DAB液200 μL, 在避光处显色5～8 min;弃去上清液, 用纯化水洗涤[8], 每孔加入Harris-苏木素液200 μL复染1～2 min;纯化水冲洗5 min;每孔加入100 μL封片液, 镜检。发现细胞的特定部位被染成棕色或棕黄色, 细胞边界清楚, 结构清晰判为阳性[9];显色超过15 min无着色的判为阴性;染色淡且存在无规律 (不是在细胞的特定位置或存在于细胞间隙) 判为非特异性染色。在试验中设置正常细胞和PCV-2感染细胞的阴性对照。

2.3.1 最佳固定液的确定

将长满细胞的培养板分别用甲醇-丙酮 (1∶1) 、丙酮、4%多聚甲醛、丙酮-乙醇 (6∶4) 固定, 筛选出最佳固定液。

2.3.2 BSA及牛奶封闭液的确定

在长满细胞的培养板上, 加入相同稀释度的PCV单克隆抗体, 在试验单孔细胞中分别加入不同剂量和种类的封闭液, 并做不加封闭液的对照, 以此确定各两种封闭液的封闭效果。

2.3.3 最佳PCV-2单克隆抗体浓度的确定

在长满细胞的培养板中, 加入最佳稀释度的过氧化物酶标二抗, DAB染色, 并采用最佳固定液, 用PCV-2单克隆抗体以1︰10, 1︰20, 1︰40稀释后测定, 以染色结果呈棕褐色为最佳PCV-2单克隆抗体浓度。

2.3.4 过氧化物酶标二抗最佳稀释度的确定

试剂的使用说明建议按照1︰200～1︰500倍稀释, 本试验采用1︰200, 1︰400, 1︰800过氧化物酶标记的二抗稀释度进行试验, 以染色结果呈棕褐色为最佳二抗稀释度。

3 结果

3.1 单层的PK-15细胞培养结果

正常的PK-15细胞与接毒的PK-15细胞长成单层后未能看出明显的区别 (见182页彩图1, 2) 。

3.2 IPMA结果

在倒置显微镜下观察, 被病毒感染的培养细胞可见细胞浆内有单个或成团的棕褐色颗粒, 而对照细胞则没有 (见182页彩图3, 4) 。

3.3 最佳固定液的测定结果

结果表明, 丙酮-乙醇比例为6∶4时固定效果最佳, 能较好地保持细胞形态且对抗原损伤小。

3.4 非特异性染色测定结果

比较加3%双氧水和不加3%双氧水封闭后免疫组化效果, 证明加3%双氧水封闭能消除非特异性染色 (见182页彩图5, 6) 。

3.5 过氧化物酶标记二抗稀释度的选择结果

根据使用说明书所推荐的抗体稀释度, 试验采用1∶200, 1∶400和1∶800 3个过氧化物酶标记二抗的稀释度进行试验, 发现1∶400倍稀释染色效果最好 (见182页彩图7) 。试验最终选用1∶400的过氧化物酶标记二抗稀释度用于PCV-2抗原检测。

3.6 最佳单克隆抗体的选择结果

结果表明, 最佳单克隆抗体稀释浓度为1∶20 (见182页彩图8) 。

4 分析与讨论

目前, 猪圆环病毒病已经给养猪业带来了非常严重的危害, 为了更好地控制该病, 迫切需要寻找一种合适的快速准确的诊断方法。但目前在临床诊断和实验室的诊断过程中, 单一的诊断方法往往受到多种因素的影响, 这就需要根据实际病例, 应用多种方法相结合, 综合诊断结果, 采取合理的应对措施。IPMA为该病的诊断提供了参考方法。IPMA是将酶与抗体 (或抗原) 结合起来, 酶标记后的抗体 (或抗原) 仍然保持与相应抗原 (或抗体) 相结合的免疫学活性以及酶的催化活性。酶标抗体与抗原结合后, 形成酶标抗体-抗原复合物。复合物上的酶, 在遇到相应的底物时催化底物分解, 使供氢体被氧化而生成有色物质[10]。

在IPMA中, 为了避免一些干扰性物质与显色剂二氨基联苯胺 (DAB) 起反应, 影响染色效果而造成假阳性, 试验中一般采用3%双氧水进行封闭来应对假阳性的产生。 3%双氧水对抗原可能有轻微损伤, 但是封闭效果比较好[11]。

本试验结果表明, 采用稀释度为1∶400的酶标二抗时, 用BSA血清封闭和3%双氧水去底色, 加稀释度为1∶20的PCV-2单克隆抗体染色效果更佳。

为增强特异性染色效果, 减少非特异性染色, 在染色过程中应合理把握各染色步骤的作用时间, 增加洗涤次数, 细胞板上所培养的细胞长成合适的单层, 合理选择封闭液并把握好封闭时间, 注意操作方法。

参考文献

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[11]周庚寅.组织病理学技术[M].北京:北京大学医学出版社, 2006:39-58.

细胞免疫检测试验 篇2

早期玫瑰花环形成的T淋巴细胞是对SRBC具有高度亲和力的T细胞亚群，它与T细胞的体内外功能活性密切相关，能更敏感地反映机体细胞免疫的水平和动态变化，是目前检测细胞免疫水平最为简便快速的方法之一。在总玫瑰花环试验中，静止期和活动期的T淋巴细胞，均能与不同数量的SRBC自发形成E花环，所得E花环的百分率和绝对数可代表被检标本中全部T淋巴细胞的百分率和总数。是目前鉴定和计算外周血液和各种淋巴样组织中T淋巴细胞的最常用方法之一。通过对黄鳝T淋巴细胞的测定，可以了解不同发育阶段黄鳝的免疫活性，运用到实践上，可以对不同阶段的黄鳝的免疫力的强弱进行针对性的照料，当其免疫力弱时，可以加强防病治病的力度，从而达到科技运用到实践中的目的。

材料与方法

·实验材料

1、实验动物

白兔:购于荆州沙市区钟鼓楼菜市场，体重1.32kg，试验前常温饲养10天。

不同规格的黄鳝15条，购于荆州花鸟鱼市场，试验前22℃饲养7天，数据如表1所示。

2、实验器材

离心机；移液枪；枪头；水浴锅；EP管；注射器；显微镜；计数板；载玻片；盖玻片；高温灭菌锅；冰箱；制冰机等。

3、实验试剂

瑞氏粉；甲醇；甘油；姬姆萨氏粉；戊二醛；碳酸氢钠；磷酸氢二钠；磷酸二氢钠；小牛血清；柠檬酸钠；柠檬酸；氯化钠；percoll分层液；蒸馏水；氯化钾；氢氧化钠等。

· 实验方法

1、黄鳝血液的制备

（1）取出黄鳝，用剪刀剪断其脊椎，使其瘫痪，失去抵抗。

（2）用剪刀对准肛门下方少许处斜向剪断尾部，将断口对准事先准备好的装有阿式液的EP管，血液自然流进EP管。

（3）当血液量少的时候可以适当轻挤黄鳝躯体，使血液能更多的被采集。

（4）将收集好的血液存放在碎冰上备用。

2、黄鳝淋巴细胞的分离

（1）将1份10€譖BS与9份Percoll贮存液混合，制成等渗Percoll悬液，此悬液被认为是100 % Percoll悬液，其密度为1.1294 g/ml。

（2）用PBS稀释100% Percoll而获得所需密度的Percoll分离液。

（3）用稀释液稀释60 %则此时的Percoll分离液比重为1.0777g/ml，即可用于淋巴细胞的分离。

（4）取5ml的Percoll分离液于10ml的EP管中，将等倍稀释的黄鳝血液0.5ml小心叠加在分离液上。

（5）将EP管放在离心机上进行离心（1500rpm/min，10min）

（6）离心之后将EP管取出，可以看到EP管中有四个细胞层，从上到下第二层为淋巴细胞。

（7）用10um的移液枪小心的将这层细胞吸出，即为比较纯的淋巴细胞，将其收集好放在碎冰上备用。

3、兔红细胞的采集

（1）取5ml的注射器，用阿式液润洗。

（2）将白兔取出，按住其四肢和耳朵，让其面朝上躺着不能动弹。

（3）将注射器插入其心脏，缓缓抽出2ml血液，将血液迅速移入装有阿式液的EP管中，上下轻轻转动，让血液充分和阿式液混合。

（4）将制备好的兔血液放在碎冰上备用。

4、兔红细胞和黄鳝淋巴细胞的计数

（1）将采集好的兔红细胞稀释100倍，充分混匀。

（2）用移液枪吸取少量混液，小心的加在计数板上。

（3）将计数板放在显微镜下进行计数，计算出原兔红细胞的密度，配制出所需浓度的兔红细胞悬液

（4）用同样的方法配制出黄鳝淋巴细胞悬液。

5、玫瑰花环的形成

（1）取0.3ml小牛血清于1ml的EP管中，再加入0.3ml兔红细胞和0.1ml黄鳝淋巴细胞，混匀。

（2）将EP管放在37℃水浴锅中反应25min。

（3）将EP管取出，放在离心机里离心（500 rpm/min，5min）。

6、玫瑰花环的制片、染色及镜检；

（1）将1滴反应好的培养物滴在玻璃片上，用枪头将其均与的涂抹在一定范围之内。

（2）将玻璃片放在一边让其自然干燥，干燥后滴加1滴甲醛在上面，5min后用6.4的PBS液冲洗。

（3）等其自然干燥后再滴加瑞式液，4min后再用6.4的PBS液冲洗。

（4）等其自然干燥后再滴加吉姆萨式液，4min后用6.4PBS液冲洗，干燥。

（5）每份培养液制备3份玻璃片。

（6）将制备好的玻璃片放在显微镜下进行观察，凡吸附3个或更多家兔红细胞的单核细胞，为RE花环形成细胞，共计数100个细胞，计算出百分率

不同规格黄鳝T淋巴细胞数量的比较（如表2所示）

通过上面表格可以看到，随着黄鳝规格的变大，其E玫瑰花环形成率逐渐增高，这也就是说，随着黄鳝的长大，其免疫力会逐步增强，而小黄鳝的免疫力最弱，在生活当中，应该更加注重黄鳝幼体的防病抗病工作。

细胞免疫检测试验 篇3

1 材料

猪圆环病毒Ⅱ型淋巴组织毒,由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司分离鉴定;PK-15细胞,由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司传代与保存,经PCR检测无PCV-1污染;VectorVIP SUBSTRATE KIT FOR PEROXIDASE,购自Vector Laboratories公司;DMEM和胎牛血清,购自Gibco公司;猪圆环病毒Ⅱ型ELISA抗体检测试剂盒,购自JBT生物技术股份有限公司;辣根过氧化物酶标记的兔抗猪二抗,购自Sigma公司;BSA,购自Amresco公司。

2 方法

2.1 PCV-2抗原诊断板的制备

取出于-70℃条件下保存的猪圆环病毒Ⅱ型淋巴组织毒,用无血清的DMEM培养液稀释至2×104TCID50/m L,将稀释好的病毒加到96孔细胞培养板中,每孔100μL;用胰蛋白酶消化PK-15细胞,然后用0.04%台盼蓝染色进行细胞计数;用含8%胎牛血清的DMEM将细胞密度调整至1×105个/m L,每孔加入PK-15细胞100μL,第12排只接种PK-15细胞;将96孔细胞培养板置36~38℃、5%CO2培养箱中培养3 d;取出细胞培养板,将病毒液倒入含2%Na OH的废弃桶中,每孔加入200μL PBST(0.1 mol/L PBS中加入0.05%吐温-20)清洗3次,然后每孔加入100μL固定液,室温条件下固定10 min;弃去固定液,将细胞培养板于超净工作台中放置5 min,自然干燥。

2.2 猪血清PCV-2抗体的IPMA检测

血清样本于56℃水浴灭活30 min;向固定好的抗原诊断板加入PBST,200μL/孔,洗板4次,拍干;各孔加入75μL抗体稀释液,第1孔加入25μL血清样本,连续4倍稀释血清,4℃感作过夜;去除一抗后每孔加入200μL PBST,清洗4次;以抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗猪二抗,每孔加入50μL二抗,于25℃感作1 h;去除二抗后每孔加入200μL PBST,清洗4次。每孔加入AEC显色液100μL,显色15 min;弃去显色液,每孔加入200μL超纯水,清洗4次,拍干,每孔再加入100μL超纯水,在显微镜下观察并拍照。结果判定:显微镜下可清晰观察到细胞的胞核内或胞浆有典型的红棕色着染,细胞边界清楚,结构清晰,判为阳性[7];阳性对照的细胞孔内应有红棕色着染;阴性对照、空白对照的细胞孔内无红棕色着染。满足以上条件试验成立;否则试验不成立,应重检。待检血清的抗体效价应为出现红棕色着染细胞的最大血清稀释倍数。

2.3 IPMA反应条件的确定

2.3.1 固定液最佳使用浓度的确定

分别用-20℃预冷的80%、100%丙酮固定培养好的PCV-2抗原诊断板,对猪血清PCV-2抗体进行IP-MA检测,筛选最佳固定液浓度。

2.3.2 抗体稀释液最佳使用浓度的确定

向固定好的PCV-2抗原诊断板分别加入1%、5%BSA浓度的抗体稀释液,稀释相同工作浓度的PCV-2阳性血清,并以不加抗体稀释液的细胞孔作为对照,确定两个浓度抗体稀释液的封闭效果。

2.3.3 PCV-2阳性血清最佳工作浓度的确定

向固定好的PCV-2抗原诊断板加入1∶256,1∶1 024,1∶4 096,1∶16 384倍稀释的PCV-2阳性血清,再加入最佳工作浓度的二抗,AEC染色,以染色结果呈红棕色为最佳PCV-2阳性血清抗体浓度。

2.3.4 辣根过氧化物酶标记兔抗猪二抗最佳工作浓度的确定

采用1∶1 000,1∶2 000,1∶3 000,1∶4 000,1∶5 000,1∶6 000,1∶8 000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗猪二抗工作浓度进行试验,以染色结果呈红棕色为最佳二抗工作浓度。

2.4 特异性、敏感性与交叉反应试验

用人工感染猪血清和已知阴性血清进行IPMA检测,确定反应的敏感性与特异性。用猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和PCV-1参考血清进行交叉反应与符合试验。

2.5 IPMA与ELISA符合试验

用IPMA与猪圆环病毒Ⅱ型ELISA抗体检测试剂盒进行对比试验。

2.6 临床血清样品的检测

血清样品采自新疆昌吉、石河子、玛纳斯、米泉等地区,共采集血清380份,所有样品均用于抗体检测。

3 结果与分析

3.1 IPMA反应条件的确定

3.1.1 固定液最佳使用浓度的确定

用预冷的80%、100%丙酮将培养好的PCV-2抗原诊断板于室温条件下固定10 min,肉眼观察发现:100%丙酮对细胞培养板有腐蚀性,细胞培养板的清晰度差,影响PCV-2抗体效价的判定;而用预冷的80%丙酮固定PCV-2抗原诊断板效果最佳,无脱落细胞,能较好地保持细胞形态且对抗原损伤小,显微镜下可清晰观察到阳性细胞的胞核内或胞浆有典型的红棕色着染,细胞边界清楚。

3.1.2 抗体稀释液最佳使用浓度的确定

经测定显示,两个浓度的抗体稀释液的背景均较干净,无非特异性着色。1%、5%BSA浓度的抗体稀释液均可在今后的PCV-2抗体检测的待检血清和二抗的稀释中应用。

3.1.3 PCV-2阳性血清最佳工作浓度的确定

经测定发现,1∶1 024倍稀释时染色效果最好,试验最终选用1∶1 024的一抗稀释浓度作为阳性血清工作浓度用于PCV-2抗体检测。经AEC染色可见,阳性血清与病毒感染细胞染色,细胞的胞核内或胞浆有典型的红棕色着染,细胞边界清楚,结构清晰,判定为阳性,见282页彩图1A;阴性血清与细胞及抗原感染细胞孔对照均无着色反应,判定为阴性,见282页彩图1B。随着血清稀释倍数增加,着染细胞数量也呈梯度下降,这与理论上是相符合的。

3.1.4 辣根过氧化物酶标记的兔抗猪二抗工作浓度的确定

经测定发现,1∶5 000倍稀释时染色效果最好,阳性细胞的胞核内或胞浆有典型的红棕色着染。试验最终选用1∶5 000的过氧化物酶标记二抗工作浓度用于PCV-2抗体的检测。

3.2 特异性、敏感性与交叉反应试验

用人工感染猪血清和已知阴性血清进行IPMA检测,结果只与PCV-2抗血清呈特异性阳性反应,与PCV-2阴性血清呈阴性反应。与PCV-2和PPV、PRV、CSFV、PRRSV、PCV-1阳性参考血清进行交叉反应,结果只与PCV-2抗血清呈特异性阳性反应,与其他几种猪病毒参考血清均呈阴性反应,证明无血清学交叉反应。

3.3 IPMA与ELISA符合试验

用IPMA与ELISA对135份猪血清进行平行试验,结果表明,IPMA法检测样品中有73份呈阳性和62份呈阴性,而ELISA法检测有87份呈阳性和48份呈阴性。采用IPMA法检测ELISA法检测的阳性样品,其中阴性者有14份;检测ELISA法检测的阴性样品,其中阳性者有2份。两种方法检测出均为阳性者73份,均为阴性者46份,总符合率为88.15%。

3.4 临床血清样品的检测

用IPMA法对采自不同地区的临床健康仔猪血清进行抗体检测,结果见表1。

由表1可知,阳性检出率为50.00%~100%。说明大多数猪只有机会感染上PCV-2,感染率高。

4 讨论

试验依据所研究的抗原和组织细胞种类的不同,采用不同固定液,从而确保固定后,标本可保持目的抗原自然形态、位置和活性不受损失,可见染色标本的固定是个重要步骤。目前,应用最广泛的固定液是丙酮和乙醇[8]。在IPMA试验中,本研究采用预冷的100%、80%丙酮于室温条件下固定10 min,80%丙酮固定效果比较好,在规定时间内未见细胞板的腐蚀,保持良好的细胞形态且对抗原无损伤。

PCV-2抗体检测对于进行PCV-2流行病学调查、疫苗效果评价及试验用阴性猪的筛选等具有重要意义。目前,检测PCV-2抗体的常用方法有ELISA、IPMA和IFA方法。虽然ELISA方法因具有敏感、快速、简便等特点得到广泛应用[9],但国内的PCV-2抗体检测试剂盒种类繁多,质量参差不齐[10],而进口的PCV-2抗体检测试剂盒费用高昂,使得ELISA方法的应用很受限制。在操作方法上IPMA和IFA基本一致,但是两者的显色系统不一样,IPMA是采用AEC显色系统,在固定病毒制备的抗原诊断板上,有PCV-2抗体细胞孔的细胞核或胞浆呈红棕色着染,而无PCV-2抗体的PK-15细胞不能被染色,结果判定在普通的倒置显微镜下观察即可,IFA则需要在荧光显微镜下观察。因此,IPMA检测一般基层单位均有条件实施,但需要具备一定实际操作经验者进行检测方可保证结果判定的准确性。

用建立的IPMA方法对新疆各地猪场血清样品进行检测,结果发现,目前新疆各地猪群中广泛存在PCV-2抗体,380份血清的阳性率达86.32%,与临床上PCV-2感染导致的猪群发病的实际情况相符合,表明猪场PCV-2感染率很高,证实了此方法临床应用的可行性。

参考文献

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[8]崔尚金,全艳平,李曦,等.猪圆环病毒间接免疫荧光方法的建立[J].中国预防兽医学报,2007,29(1):63-66.

[9]刘长明,张超范,危艳武,等.猪圆环病毒2型免疫过氧化物酶单层细胞试验抗体检测试剂盒的研制及应用[J].中国预防兽医学报,2007,29(8):621-624,633.

细胞免疫检测试验 篇4

1 材料与方法

1.1 试验动物

选取某规模猪场中同品种5窝体型较为一致的30日龄断乳仔猪, 每窝选取9头, 每窝按顺序编号, 共45头, 分为3组, 每窝编号1、2、3为A组, 4、5、6为B组, 7、8、9为C组, 每组15头。该批断乳仔猪已经按照该养殖场内的免疫程序, 3日龄滴鼻免疫猪伪狂犬病疫苗, 10日龄注射副猪嗜血杆菌病疫苗, 20日龄注射猪圆环病毒2型疫苗。

1.2 供试疫苗试验选用3家不同厂家生产的传代细胞苗和脾淋苗, 见表1。

1.3 试验方法

仔猪的猪瘟免疫程序按照该养殖场的免疫计划进行, 试验前采集3组45头30日龄断乳仔猪血样, 用于检测本底抗体水平。采血后仔猪通过剪耳进行标记, 然后按疫苗分组, 颈部肌肉注射相应的猪瘟疫苗, 首免后28 d采用同批次疫苗进行二免, 在首免后7 d、21 d以及二免后7 d、38 d采血检测猪瘟免疫抗体水平。

1.4 检测方法

采用ID.vet猪瘟E2抗体检测试剂盒竞争性酶联免疫吸附法 (ELISA) 对仔猪血清猪瘟抗体水平进行检测。根据试剂盒说明, 测定结果以竞争百分率 (S/N%) 表示, S/N%= (样品OD450值/阴性对照OD450值) ×100, 被检样本的S/N%值小于或等于50%, 该样本就被判为阳性。S/N%越小, 特异性抗体含量越高, 反之亦然。

对免疫前抽取的血清进行猪瘟抗体、O型口蹄疫、蓝耳病抗体和猪伪狂犬病g B抗体检测、本底分析。O型口蹄疫抗体采用兰州兽医研究所的液相阻断酶联免疫吸附法试剂盒, 蓝耳病采用LSI的ELISA试剂盒, 伪狂犬病g B抗体采用ID.vet的ELISA试剂盒进行检测。O型口蹄疫抗体效价≥5log2判为阳性, 蓝耳病和伪狂犬病g B检测结果按试剂盒说明书进行判定。

1.5 统计分析

采用SPSS 20软件对各组仔猪血清中的抗体水平进行统计学分析, 并对3个试验组的平均S/N%值进行独立样本t检验, 用来比较各两组之间差异显著性分析;对各两组之间的抗体阳性率进行Fisher确切概率法检验, 用来推断两组之间抗体阳性率有无差别。假设检验显著性水准设为0.05, P<0.05即认为显著差异, 有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 试验动物本底抗体水平比较

对试验仔猪进行猪瘟、O型口蹄疫和蓝耳病3种母源抗体检测, 结果见表2, 显示3组试验仔猪的3种母源抗体水平较为一致, 各组母源抗体阳性率经Fisher确切概率法检验, P>0.05, 进一步对各两组之间猪瘟抗体的S/N%值进行独立样本t检验, P>0.05, 说明各组猪瘟母源抗体水平没有显著差异。另外, 各组猪伪狂犬病g B抗体阳性率完全一致。

2.2 猪瘟抗体水平变化

首免和二免后各采血2次, 检测各组猪瘟抗体的S/N%值, 见表3。从3组猪瘟抗体水平跟踪监测结果看 (见图1) , A组猪瘟抗体水平在首免7 d后出现下降, 并保持在一定水平, 二免后38 d, 抗体水平再显著下降;B组的猪瘟抗体水平在一免后出现下降, 二免后7 d呈现上升趋势。C组抗体水平在一免后7 d略有下降, 21 d呈上升趋势, 二免后抗体水平进一步上升。

从各组猪瘟抗体阳性合格率来看, 3组猪瘟抗体阳性率均保持在75%以上, 超过国家强制标准70%的要求, 能产生有效的保护作用。但在二免后38 d (见表3) , 各组间的抗体阳性率差异较大, 以C组猪群的抗体阳性率最高, 其次是B组, A组猪群的抗体阳性率最低。

注:猪瘟抗体S/N%平均值以 (平均数±标准误) 表示。

采用统计学方法分析, 各两组之间猪瘟抗体水平经独立样本T检验, 3组猪群从一免至二免后7 d前, 免疫抗体水平和阳性合格率无显著差异, 38 d后才呈现免疫抗体水平和阳性合格率差异较大, C组和A组之间P=0.022, 差异显著, 以C组猪群的抗体阳性率最高, A组猪群的抗体阳性率最低。

3 讨论与结论

我国现有的猪瘟疫苗根据生产方式分为脾淋苗、原代细胞苗和传代细胞苗。从理论上讲, 猪瘟脾淋苗是经典疫苗, 属于组织苗, 保护力很优秀。长期以来, 生猪养殖户已经习惯使用猪瘟脾淋苗, 但是由于时代的发展和生猪养殖量的增加, 脾淋苗已经不能适应需求, 特别是合格兔源的减少, 很难满足猪瘟脾淋苗的生产需要, 而且落后的生产工艺较难保证产品的稳定性, 所以, 今后用猪瘟细胞苗代替脾淋苗是大势所趋[1]。本次试验选用两家猪瘟脾淋苗与一家猪瘟传代细胞苗进行免疫效果比较, 抗体阳性合格率结果显示, 无论是猪瘟传代细胞苗还是猪瘟脾淋苗都能提供较好保护力, 但免疫抗体水平和维持时间还是有差异的, 传代细胞苗免疫效果优于猪瘟脾淋苗, 这与其他地方类似试验的结果比较一致[2,3]。在福建省南平市延平区母猪50头以上的7个养殖场进行猪瘟疫苗临床使用效果的问卷调查, 也显示猪瘟传代细胞苗的免疫副反应率低, 疫苗免疫效果是比较理想的[4]。

比较疫苗间的免疫效果, 最好是选用没有母源抗体的动物做试验, 大量的研究证实母源抗体对主动免疫效果有干扰作用。本次试验仔猪的猪瘟母源抗体水平较高, 从3个试验组的母源抗体水平高低对免疫效果的影响结果显示, A组母源抗体最高, 影响最大, C组母源抗体最低, 影响也最小。由于本试验目的旨在研究养殖场猪瘟免疫的真实现状, 比较不同猪瘟疫苗的田间使用效果, 因此, 未排除母源抗体因素, 完全按照养猪场的免疫计划进行试验。由此可见, 猪瘟免疫成败除了疫苗质量外, 猪瘟母源抗体水平对免疫效果的干扰也是猪瘟免疫成败的关键。建议养殖场在制定猪瘟免疫程序时, 要考虑仔猪体内的猪瘟母源抗体水平, 在实施免疫之前应加强仔猪母源抗体水平监测, 从而提高免疫质量。由于机体免疫是很复杂的系统, 评价疫苗免疫效果的指标应该是多方面的, 抗体水平跟踪只是其中一个方面, 本次试验仅对免疫效果的抗体水平进行了比较, 未能考虑其他方面的因素, 因此, 还有待进一步研究。

参考文献

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[2]殷方芝, 陶军, 黄忠, 等.某规模猪场两种猪瘟疫苗的免疫效果评估[J].畜牧兽医科技信息, 2015 (3) :37.

[3]陈培赛, 薛成俊, 施希祥, 等.不同来源猪瘟疫苗的免疫效果试验[J].浙江畜牧兽医, 2014 (6) :3-5.

细胞免疫检测试验 篇5

关键词：白血病,免疫表型,流式细胞术

急性白血病是血液系统恶性克隆性疾病, 急性白血病正确的分型对急性白血病的治疗选择及预后判断有着重要的意义。白血病的免疫学分型是应用人类血细胞表面分化抗原 (CD) 系统进行, 流式细胞术为白血病的免疫分型提供了较好的手段, 且为临床诊断、治疗和预后观察提供了确切的指标。本文回顾性地对58例初诊急性髓细胞白血病免疫表型检测结果进行分析, 并观察了58例患者免疫表型与临床的关系。初步探讨免疫表型检测对急性髓细胞白血病诊断、治疗、预后等方面的临床意义。现将结果报道告如下。

1 资料与方法

1.1 材料及研究对象

本组58例患者, 为我院报告的2007年1月至2009年10月初诊的急性髓细胞白血病患者, 男30例, 女28例, 年龄15~85岁, 中位年龄45岁, 按FAB分型, M0 1例, M2 15例, M3 12例, M4 3例, M5 24例, M6 2例, M7 1例。材料主要是骨髓标本, 均取自急性髓细胞白血病患者治疗前的髂前或髂后上棘。

1.2 研究方法

1.2.1 流式细胞术分析

应用FACS Canto流式细胞仪, 配置氩离子激光器及氦一氖激光器, 激发波长分别为488和633nm。采用CD45/SSC设门方法, Diva软件进行分析, 收集测定细胞30000个。结果判定以淋系抗原阳性细胞≥30%为阳性标准, 髓系抗原阳性细胞≥20%为阳性标准。

1.2.2 治疗方案

采用标准DA (柔红霉素+阿糖胞苷) 或IDA (去甲氧柔红霉素+阿糖胞苷) 或MA (米托蒽醌+阿糖胞苷) 诱导缓解方案, M3采用全反式维甲酸或亚砷酸诱导分化+DA或IDA联合治疗, M5主要采用MV (米托蒽醌+替尼泊苷) 诱导缓解。

1.2.3 疗效判断

参照张之南《血液病诊断及疗效标准》[1]。

1.2.4 统计方法

应用SPSS17.0统计软件统计数据。组间比较采用χ2检验, P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 形态学分型

58例患者中以M5最多, 24例, 占41%, 其次为M2, 15例, 占26%, M3为12例, 占21%, M4为3例, M6为3例, M0及M7各1例。

2.2 免疫分型

58例急性髓细胞白血病患者应用流式细胞仪进行了免疫分型检测, AML免疫表型与FAB各亚型的关系 (表1) , CD117、CD33及CD13表达率较高, 淋系抗原CD7、CD10、CD19在急性髓细胞白血病患者中也有阳性表达, 其中CD7表达率最高, 占22.4%, ;M3较少表达CD34及HLA-DR。其中有1例患者形态学无法分类, POX、SB染色阴性, 免疫学表型示:CD7、CD13、CD33、CD34、CD41阳性, 最终诊断为Ly+AML (M0) 。本组形态学分型与免疫表型符合率98.2%。

2.3 治疗效果

本组58例急性髓细胞白血病患者接受诱导缓解治疗, CR41例, CR率70.7%。Ly+AML的CR率为66.7%, Ly-AML的CR率为73.5% (表2) , P值无统计学差异。本组免疫表型与疗效关系的观察 (表3) , 除了CD7+组与CD7-组P值=0.011有统计学差异, 其余组P>0.05, 无统计学差异。

3 讨论

急性白血病是造血干细胞的恶性克隆性疾病, 现今急性白血病的诊断已进入到MICM诊断。在造血干细胞的发育、分化过程中, 伴随着胞膜、胞浆及胞核特异抗原的出现和消失, 这些在不同时相出现的抗原被称之为分化抗原 (cluster differentiation, CD) 。免疫分型就是通过特异的膜表面或胞内单克隆抗体 (Mc Ab) 鉴定这些分化抗原标志, 流式细胞仪 (flow cytometer, FCM) 免疫分型中采用最多且简单易行的方法。

本组58例急性髓细胞白血病均应用流式细胞仪进行细胞免疫表型的检测, 从表1可以看出在本组急性髓细胞白血病58例患者免疫表型中, 髓系抗原阳性表达率的依次为CD117 (91.4%) , CD33 (89.7%) , CD13 (74.1%) , CD15 (51.7%) , CD34 (51.7%) , HLA-DR (50%) 。CD117为C-Kit原癌基因细胞表面分化抗原, 主要是在正常造血干细胞或髓系干细胞表达, 在80%以上的AML中有表达, 正常成熟血细胞不表达;CD33作为髓前体细胞的标志, 同时在粒细胞及单核细胞中也有较高表达;CD13除了在髓系祖细胞表达外, 也可存在于成熟粒细胞上。因此CD33和CD13在判断白血病细胞是否为髓系来源时具有很高鉴别价值。CD34和HLA-DR作为干/祖细胞相关抗原, 无系列特异性, 常常表达于分化低的亚型中, 而在分化相对成熟的亚型中相对缺少, 有利于区分白血病细胞的分化。在M3这种分化相对成熟的亚型中CD34和HLA-DR表达极少表达, 本组48例M3患者也极少表达CD34和HLA-DR。CD14单核细胞系特异性的表面标记, 本组58例患者中除了M4、M5患者, 其他亚型均未表达CD14, 故CD14阳性有助于M4、M5这两个亚型与其他亚型AML的鉴别。

抗原的交叉表达是指急性髓系白血病患者伴有淋系抗原的表达 (Ly+AML) 或急性淋系白血病患者伴有髓系抗原的表达 (My+ALL) 。本组58例AML患者中, 13例表达CD7, 10例表达CD10, 2例表达CD19, CD7是AML中最常见表达的淋系抗原, 主要见于M2、M5。其中有1例患者形态学无法分类, POX、SB染色阴性, 免疫学表型示:CD7、CD13、CD33、CD34、CD41阳性, 最终诊断为Ly+AML (M0) 。本组形态学分型与免疫表型符合率98.2%%。形态学分型简便、易行, 目前仍然是白血病诊断分型的基本方法。但形态学分型容易受主观因素的影响, 而且不能说明白血病细胞来源、性质及相关的生物学特征。文献报道[10], FAB与MIC诊断符合率约为60%~80%, 本组为98.2%, 较与文献报道高, 原因考虑主要与入组标准有关, 本组病例入组标准为急性髓细胞白血病, 将急性混合细胞白血病排除在外, 而国外文献报道统计的为急性白血病的FAB与MIC诊断符合率, 其中包含急性混合细胞白血病, 而急性混合细胞白血病又是FAB与MIC诊断不符合的常见类型。

急性髓细胞白血病免疫表型与临床疗效的关系方面, 现在仍有争议, 许多研究结果都有不一致的方面。表达CD34、HLA-DR的急性白血病细胞可能来源于多系性分化不良前体细胞, 提示幼稚程度高。有报道表明CD34+、HLA-DR+的急性髓细胞白血病CR率低[4,5]。CD7是急性髓细胞白血病中最常见的淋系抗原, 这部分患者可能起源于较早期造血干细胞水平, 化疗效果不佳[6]。Amirghofran等[7]研究发现, 表达CD11b者CR率高, 表达CD7的AML预后差[8]。也有学者认为免疫表型不能提示急性髓细胞白血病白血病的预后[2]。本组做了免疫表型与疗效关系的观察 (表2、表3) , 除了CD7+组与CD7-组P值=0.011有统计学差异, 其余组P>0.05, 无统计学差异。

总之, 流式细胞术目前已成为白血病免疫分型的重要手段, 白血病免疫表型检测是对形态学诊断重要补充, 以提高诊断分型的准确性, 更好的指导治疗方案的制定, 而在判断预后仍有一定的争议。

参考文献

[1]张之南.血液病诊断及疗效标准[S].北京:科学出版社, 2007.

[2]黄走方, 孟凡义.成人急性髓系白血病的现代预后因素分析[J].实用医学杂志, 2008, 24 (12) :2020-2022.

[3]Li X, Du W, Liu W, et al.Comprehensive flow cytometry phenotype in acute leukemia at diagnosis and at relapse[J].APMIS, 2010, 118 (5) :353-359.

[4]Byrd JC, Mro'zek K, Dodge RK, et al.Pretreatment cytogenetic abnormalities are predictive of induction success, cumulative incidence of relapse, and overall survival in adultpatients with de novo acute myeloid leukemia:results from Cancer andLeukemia Group B (CALGB 8461) [J].Blood, 2002, 100 (13) :4325-4336.

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[6]程晓文, 马红霞, 陈钰, 等.成人急性白血病细胞CD表型与预后的关系[M].现代免疫学, 2005, 25 (1) :70-73.

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细胞免疫检测试验 篇6

主要检测规模化猪场不同猪群注射猪O型口蹄疫灭活苗后, 根据免疫时间和免疫次数的不同, 判断猪群O型口蹄疫免疫抗体的合格程度。为猪群免疫猪O型口蹄疫提供科学合理的免疫时间。

2 试验材料

2.1 试验动物

选自中宁县规模化猪场300头以上的饲养户八户, 每户随机按比例采猪血若干份, 共130份。

2.2 疫苗来源

猪口蹄疫O型灭活疫苗 (O/MYA98、BY/2010株) 由中农威特生物科技股份有限公司 (兰州市城关区徐家坪1号) 生产, 批准文号:农医药便函[2011]29号。

2.3 试验器材及诊断试剂

一次性的采血注射器5mL装量、离心机V型微量反应板、8孔道可调微量移液器、滴头 (相匹配) 、微量振荡器。O型正向稀释液:批号:20110826, 生产厂家:中国农科院兰州兽医研究所。O型口蹄疫正向血凝抗原, 5 mL/瓶, 批号:110315, 效价1∶1024, 阳性血清、阴性血清、生产厂家均为中国农科院兰州兽医研究所。

3 检测方法及步骤

3.1 群体差异及血样的采集

群体差异及血样的采集见表1。

对所采集血样分离血清, 分装离心管、编号登记。

3.2 检测方法

口蹄疫正向间接血凝试验 (IHA) 国标GB/T 18935-2003 (本标准所规定的试验技术适用于检测各种不同样品中的口蹄疫病毒抗原或抗体) 。

3.3 结果判定

判定标准:只有阴性对照孔血清滴度不大于24 (血球全部沉入孔底形成边缘整齐的小圆点) , 或仅出现“+”凝集 (血球大部分沉于孔底, 边缘稍有少量的血球悬浮) , 阳性血清对照孔1∶256 即 28凝集为试验成立 (少量的血清沉于孔底, 大部分血球悬浮于孔内) 。阳性对照孔血清误差不超过一个滴度, 试验结果才有效。当进行免疫抗体检测时, IHA≤22判定IHA试验阴性;IHA价=24为可疑, 需要重复试验;IHA价≥25为阳性。判为免疫合格。

接种口蹄疫疫苗猪群免疫抗体效价≥25判定为免疫合格, 免疫合格率应达到70%以上。即≥70%为免疫合格猪群。合格率<70%, 则为不合格猪群。

4 检测结果

检测结果见表2。

以上两表可分为两组进行分析。

第一组:21～40、61～70、91～100、111～130四户的猪, O型口蹄疫为两次免疫猪群, O型口蹄疫的免疫抗体的合格率都在80%以上, 猪群为免疫合格群体。若是育肥猪群, 在猪群的整个饲养期中, 再不注射O型口蹄疫疫苗, 猪群不易感染O型口蹄疫病毒, 直到出栏可安全饲养。若是后备种猪, 从第二次免疫O型口蹄疫疫苗后, 间隔6个月再加强免疫一次, 以后每半年免疫一次。猪群可免遭O型口蹄疫病毒的威胁, 安全度过饲养期。

第二组:1～20、41～50、51～60、71～90、四户是O型口蹄疫疫苗免疫了一次, 其抗体水平合格率≤40%, 而O型口蹄疫免疫抗体的合格率≥70%, 为不合格猪群, 猪群无抵抗O型口蹄疫病毒侵袭的能力, 遇到猪O型口蹄疫病毒流行时, 最易发病。为了安全, 这些猪场在第一次免疫O型口蹄疫后, 间隔3～4周再加强免疫一次, 可有效的控制猪O型口蹄疫病的发生, 即使是在猪O型口蹄疫病毒的流行期, 也可以免遭该病毒的侵袭, 可安全度过。实践经验证明了这一点。

就猪O型口蹄疫疫苗免疫次数的不同所产生的不同免疫结果的原因分析如下。

免疫学的有关理论提出, 首免的免疫学意义在于诱发动物机体产生免疫记忆反应, 而不是产生高效的免疫抗体。机体首次接种外来抗原后, 产生的抗体以IgM为主, IgM有5个抗原结合点, 可以在短期内中和大量的抗原, 但它与抗原的结合力比较弱, 在体内维持时间不长, 且不稳定。二者形成的抗体抗原复合物之后被补体清除, 并产生记忆细胞。二次接触相同的抗原后, 记忆细胞迅速激活, 诱导机体产生高效的IgG抗体, IgG是介导体液免疫的主要抗体, 是动物血清中含量最高的免疫球蛋白, 占血清免疫球蛋白总量的75%～80%, 不仅含量高而且维持时间长。因此二次免疫后激活了记忆细胞, 刺激机体快速产生大量的IgG抗体, 从而使机体的抗体水平高而持久, 这样在机体受到相同的病原刺激时而不至于发病。

细胞免疫检测试验 篇7

1 资料与方法

1.1 病例

2003年1月～2011年10月在大连医科大学附属第一医院确诊的MM患者118例。年龄34～88岁,平均62.9岁,男女比例为1.23︰1.00。选择15例非MM的健康献髓者为对照组。MM的诊断参照《血液病诊断及疗效标准》[1]。

1.2 标本

治疗前取骨髓血2 m L,肝素抗凝。

1.3 主要仪器与试剂

流式细胞仪为美国BD公司,型号为FACS Vantage SE;所有单克隆抗体FITC、PerCP、PE标记的同型对照,CD138、CD33、CD7、CD38、CD20、CD13、HLA-DR、CD9、CD117、CD56、CD19、CD16、CD34、CD22、lambda、kappa均购自美国BD公司;标准红细胞裂解液购自美国BD公司。

1.4 实验方法

按照多色直接标记方法进行染色。每个上样管加入骨髓血50μL及3种荧光标记抗体各20μL,抗体组合为:(1)CD45-PerCP/IgG1-FITC/IgG2a-PE;(2)CD45-PerCP/CD138-FITC/CD33-PE;(3)CD45-Per CP/CD7-FITC/CD38-PE;(4)CD45-PerCP/CD20-FITC/CD13-PE;(5)CD45-PerCP/CD9-FITC/CD117-PE;(6)CD45-PerCP/CD56-FITC/CD19-PE;(7)CD45-PerCP/CD16-FITC/CD34-PE;(8)CD45-PerCP/lambda-FITC/Kappa-PE;(9)CD45-PerCP/CD22-FITC/HLA-DR-PE。

室温避光孵育15 min,加入红细胞裂解液孵育10 min,用PBS洗2遍,管内补足0.5 m L PBS,1 h内上机检测。

1.5 流式细胞仪分析

应用CELLQUEST软件,采集10 000个细胞的信息。通过CD45/SSC设门,根据CD45表达的强度和细胞颗粒性的大小,选取CD45表达阴性或弱阳性而颗粒性SSC值比有核红细胞大的幼稚细胞群进行免疫表型分析。

1.6 判断标准

结果判断以细胞表面抗原表达≥20%、CD34表达≥5%为阳性。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析,样本率的比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

CD45/SSC设门后可将骨髓细胞分为成熟淋巴细胞群、单核细胞群、髓细胞群、幼稚细胞群及有核红细胞群。与对照组骨髓细胞相比,MM患者骨髓中存在一群表型异常细胞,比例为5.18%～86.09%。这群细胞在CD45/SSC二维点图上的特点:CD45表达阴性或弱阳性而颗粒性SSC值比有核红细胞大,可通过SSC的荧光强度区别于有核红细胞。选定这群细胞为骨髓瘤细胞,对其进行单独免疫表型分析(见附图)。

本研究中MM细胞免疫表型特点:表达CD138108例(91.53%),CD38 112例(94.92%),CD117 52例(44.07%),CD56 85例(72.03%),CD33 30例(25.42%),CD13 21例(17.80%),CD9 35例(29.66%),Lambda 47例(39.83%),Kappa 36例(30.51%),HLA-DR 74例(62.71%),CD34 3例(0.03%),CD192例(0.02%),CD20 7例(0.06%),其他抗体均不表达。与对照组相比,MM组患者CD56、CD117、CD138的表达明显高于对照组正常浆细胞(P<0.05);而MM组CD19表达明显低于对照组(P<0.05)。CD38、CD33、CD13、HLA-DR、CD20等抗体的表达,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)(见附表)。

注:1)与对照组相比,P<0.05;2)与对照组相比,P>0.05

3 讨论

临床上,多依据形态学检查和免疫学方法检测血清及尿中的异常单克隆免疫球蛋白(M蛋白),结合溶骨性或广泛骨质疏松等[1]临床表现诊断MM。然而,MM细胞存在灶性分布的特性,部分疑似病例标本浆细胞比例难以达到诊断标准,而且成熟的MM细胞在形态学上与浆细胞相似,难以确切鉴别。近年来,随着流式细胞术技术的迅速发展以及单克隆抗体的广泛使用,流式细胞术免疫分型应用于MM的诊断和鉴别诊断成为可能。本研究118例患者骨髓免疫表型特征:CD45阴性或弱阳性,高表达CD138、CD38、CD117、CD56,不表达CD19,与文献报道[2,3]基本相符。可见,应用多参数流式细胞术检测细胞表面CD138、CD38、CD56、CD19的异常表达能够鉴别正常和恶性浆细胞[4]。

CD138(Syndecan-1)是黏附分子跨膜黏结蛋白聚糖家族成员,它的表达对控制骨髓瘤细胞生长和转移具有重要作用,而且可以作为肿瘤患者的预后因子。有研究表明,CD138可表达于患者骨髓和外周血浆细胞,但在骨髓造血前体细胞或淋巴细胞上无表达,可以作为分离细胞的相对特异性标志[5,6],CD138+/CD38++可作为识别浆细胞的特异性标志[7]。本研究中CD138在MM细胞和正常浆细胞上均有表达,但是MM细胞表达水平高于正常浆细胞。随着MM细胞凋亡,CD138表达逐渐缺失,可将CD138作为监测肿瘤细胞数量变化的标志。高水平的血清可溶性CD138和低水平的细胞表面CD138是MM预后不良的因素之一[8]。

本研究发现,CD56抗体在大多数MM细胞上有表达,但是在正常浆细胞上却未见表达,与文献报道基本一致[9,10]。可以将其作为鉴别正常浆细胞与骨髓瘤细胞的重要指标之一[11]。但是,本例中仍有33例患者不表达CD56,因此不能因为CD56阴性就排除MM的诊断。CD56属于免疫球蛋白超家族的成员,是介导造血细胞黏附的黏附分子之一,与骨髓瘤细胞和骨髓基质细胞的相互作用有关。有学者认为,CD56与MM病程的进展和恶性程度密切相关,可作为早期预测病程进展及预后的指标[12]。CD19是B细胞的主要标志,本组中118例MM患者仅有2例表达CD19,阳性率仅为0.02%,而对照组正常浆细胞的表达率达到93.33%,可见根据CD19表达水平,并结合CD56的表达,可用于鉴别正常与恶性浆细胞,前者CD19+CD56-,后者CD19-CD56+。

CD117(c-kit)是一种由c-kit原癌基因编码的跨膜蛋白受体,其配体为干细胞因子(SCF),被认为是肿瘤的相关标志,也可作为靶向信号传导抑制剂酪氨酸酶抑制剂应用的选择性标志。本研究发现其表达阳性率在不同的MM患者中不同,与肿瘤细胞的比例呈正相关,肿瘤细胞的比例越高,表达阳性率也越高;而在正常浆细胞中表达为阴性。本研究中CD38在MM细胞和正常浆细胞上表达强度较高,与文献报道一致[13,14]。有研究[15]通过CD38/SSC设门来提高MM细胞的识别,进而提高其检出率。但是,CD38在髓系、B淋系前体细胞以及成熟的淋巴、单核、粒细胞均有不同程度的表达,需要结合这些细胞的特异性标志进一步区别于MM细胞。Lambda、Kappa是浆细胞的标志。本组研究中,Lambda和Kappa的表达率分别是39.83%和30.51%,且高表达多见于瘤细胞>70%的MM患者骨髓细胞中。可见,当瘤细胞比例较高时,可以通过Lambda和Kappa的表型特征作为MM的辅助诊断指标。

细胞免疫检测试验 篇8

T淋巴细胞亚群计数、NK细胞计数对于对评定运动员细胞免疫机能有一定作用,一般采用流式细胞仪进行检测。用流式细胞仪进行检测时,根据细胞上的特异抗原CD分子(如CD3阳性即总T细胞、CD3/CD4双阳性即辅助性T细胞、CD3/CD8双阳性即抑制性T细胞、CD3阴性且CD16/CD56双阳性即NK细胞)不同,而需采用特异性荧光标记抗体。目前,有一种新推出的Biolegend的CD3-P E Cy5/C D4-P E/CD 8-F ITC鸡尾酒抗体和CD 3-F IT C(CD16+CD56)-PE鸡尾酒抗体,和传统抗体相比虽标记顺序略有差异但使用荧光相同且更经济。但在流式细胞仪上是否适用这种新抗体检测T细胞亚群和NK细胞,并未见有报道。

本研究的目的是在流式细胞仪上用此新抗体检测运动员T细胞亚群和NK细胞并和传统抗体进行比较,确定2种抗体的分析检测结果是否具有差异和可比性,从而明确在流式细胞仪上是否适用这种新抗体检测T细胞亚群和NK细胞。

2 对象与方法

2.1 研究对象

运动员男21人,年龄(17±1.20)岁,身高(176±4.28)cm,体重(71±5.10)kg,专项训练年限(3±1.19)年。女29人,年龄(18±2.40)岁,身高(166.5±2.69)cm,体重(61.4±4.98)kg,专项训练年限(2.4±1.25)年。

2.2 测试方法

2.2.1 仪器

贝克曼EPICS XL型流式细胞仪,白杨BFX5-320低速离心机,VORTEX涡旋混合器。

2.2.2 试剂

(1)荧光抗体:Coulter的抗人的CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE Cy5三标抗体,同型对照鼠抗人IgG 1-FITC IgG 1-PE/IgG 1-PE Cy5抗体;Coulter的抗人的CD3-FITC/(CD16+CD56)-PE双标抗体,同型对照鼠抗人IgG 1-FITC/IgG1-PE抗体;Biolegend的抗人CD3-PE Cy5/CD4-PE/CD8-FITC Cocktail抗体,同型对照IgG 1-PE Cy5/IgG 1-PE/IgG 1-FITC抗体;Biolegend的抗人CD3-FITC/(CD16+CD56)-PE Cocktail抗体,同型对照IgG 1-FITC/IgG 2a-PE抗体;(2)其他试剂:Flow Check质控品,OptiLyse C溶血剂,15%EDTAK2溶液,1×PBS缓冲液,抗凝剂取5ul置于1.5mL离心管中。

2.2.3 血样采集

分3～4次,采集50例(男21例,女29例)运动员静脉血1mL;混匀。白细胞计数控制在5～10×109/L,全血采集后6小时内制备。

2.2.4 样本编号

(1)流式细胞仪上2种抗体检测T细胞亚群:每份血样制备4份,阴性对照管编号C1～N,用Coulter抗体标记的记做C_C1～N,用Biolegend抗体标记的记做B_C1～N。阳性测试管编号T1～N,用Coulter抗体标记的记做C_T1～N,用Biolegend抗体标记的记做B_T1～N。(2)流式细胞仪上2种抗体检测NK细胞每份血样制备4份,阴性对照管编号D1～N,用Coulter抗体标记的记做C_D1～N,用Biolegend抗体标记的记做B_D1～N。阳性测试管编号N1～N,用Coulter抗体标记的记做C_N1～N,用Biolegend抗体标记的记做B_N1～N。

2.2.5 测试方法

(1)100uL全血加入20uL阴性对照或荧光抗体混匀,25℃避光存放20min;(2)加入500uL溶血剂,25℃混匀避光存放10min;(3)加入500uL1×PBS缓冲液,25℃混匀避存放10min;(4)1500rpm,离心5min;(5)弃上清液,加入1mL1×PBS缓冲液;(6)上机分析。分析方案,FITC-FL1通道/PE-FL2通道/PE Cy5-FL4通道,进行T细胞亚群计数。FITC-FL1通道/PE-FL2通道,进行NK细胞计数。阴性对照要求FL1/FL2/FL4通道计数<2%。(7)分析指标:T细胞亚群(T3、T4、T8百分比、T4/T8比值)、NK细胞(T3、NK百分比)。

2.3 统计方法

用SPSS统计软件进行配对t检验。

3 结果

3.1 流式细胞仪上2种荧光抗体检测T细胞亚群的比较结果(表1)

表1显示,流式细胞仪上2种荧光抗体检测T细胞亚群,T3、T4、T8百分比、T4/T8比值等指标无显著性差异。

3.2 流式细胞仪上2种荧光抗体检测NK细胞比较结果(表2)

表2显示,流式细胞仪上2种荧光抗体检测NK细胞,T3、NK百分比等指标无显著性差异。

4 讨论

血液中T淋巴细胞亚群和NK细胞的检测是观察机体细胞免疫水平的重要方法。体育科研中也常检测外周血中T细胞亚群(CD3/4/8)和NK细胞(CD3/16/56)检测,并结合其他指标对于分析运动员的细胞免疫状况,进行运动员机能评定可以提供相当佐证。我中心运动病理实验室的贝克曼EPICS XL流式细胞仪进行T细胞亚群和NK细胞检测时,原使用Coulter抗体。如抗人的CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE Cy5三标抗体及其同型对照用于检测T细胞亚群,抗人的CD3-FITC/(CD16+CD56)-PE双标抗体及其同型对照用于检测NK细胞。但在使用上述抗体时,我们发现并和同行交流后提出如下问题:

(1)原抗体实际使用过程中预处理时间较长,步骤繁琐,平均一个样本的预处理时间需要30min左右,如再加上阴性对照和上机分析的时间就非常耗时耗力,这常是制约大通道、快速检测样本的瓶颈。因此,寻找其他便捷、可替代的抗体标记方法和样本预处理方法,缩短检测时间就是我们必须考虑的任务之一。

(2)原抗体的成本较高。如这2种抗体的包装规格仅都是50Test/每瓶,不计其他耗才的情况下,每一个样本上述2种指标的检测成本都十分惊人。同样在临床上,这种检测也是相对昂贵的收费项目,但通过相对大的测试样本数仍可较好维持此项检测。但对于体育科研而言,检测样本无法与临床相比,因此社会效益就是我们必须考虑的任务之二。

(3)有报道的自制试剂或国产试剂由于多为单标抗体,不仅没有简化标本预处理步骤,反而增加了荧光抗体的互相干扰而检测结果差强人意。

最近一种新推出的Biolegend的CD3-PE Cy5/CD4-PE/CD8-FITC鸡尾酒抗体和CD3-FITC/(CD16+CD56)-PE鸡尾酒抗体和原抗体比较虽抗原标记荧光顺序略有差异但有如下特点,可一定程度上解决上述矛盾。

(1)标记荧光与原抗体完全一致保证了在流式细胞仪上使用的通用性和替换可能,而且是三标或双表抗体这一良好特性保证了预处理的简易性。

(2)新抗体具有更佳的性价比,而且临床实验室也已开始大量使用。

(3)在流式细胞仪上用这2种抗体检测T细胞亚群和NK细胞并进行比较,还未见报道。(1)临床上由于前述测试样本相对较大,基本不存在成本压力问题;(2)基础科研上多用单标抗体进行肿瘤标记物检测,开展正常人(如运动员机能评定)T细胞亚群和NK细胞的三标或双标荧光抗体法检测并不多见。因此,本研究不仅具有非常大的实际测试和工作必要性,而且有一定社会效益。

本研究的实验结果显示,流式细胞仪上2种荧光抗体检测T细胞亚群、NK细胞,T3、T4、T8、NK百分比、T4/T8比值等指标无显著性差异(P>0.05),结果具有高度可比性。Biolegend新抗体高度适用于流式细胞仪上检测运动员T细胞亚群、NK细胞,而且长期使用更经济,建议作为首选标记抗体。

摘要：目的 通过用2种不同免疫荧光抗体标记运动员T细胞亚群和NK细胞,在流式细胞仪上测定并进行结果比较。方法 采集50例运动员静脉血,分别用Coulter原抗体和Biolegend新抗体标记T细胞亚群和NK细胞,在流式细胞仪上检测T细胞(T3)、辅助性T细胞(T4)、抑制性T细胞(T8)、NK细胞(百分比)等指标,比较测试结果的差异。结果 用2种荧光抗体检测运动员上述指标无统计学差异(P>0.05),结果具有高度可比性。结论 Biolegend新抗体高度适用于流式细胞仪上检测运动员T细胞亚群、NK细胞检测,而且长期使用更经济,建议作为首选标记抗体。

关键词：免疫荧光,抗体,T细胞,NK细胞,流式细胞术

参考文献

[1]冯连世,李开刚.运动员机能评定常用生理生化指标测试方法及应用[M].北京:人民体育出版社,2002:144～153.

[2]秦雪,李山,林发全,等.COULTER流式细胞仪试剂的配制及应用探讨[J].临床检验杂志,2002,20(2):100～101.

[3]徐明辉,陈智平,秦雪,等.自配试剂在COULTER流式细胞仪检测NK细胞和B细胞中的应用[J].标记免疫分析与临床,2009,16(2):103～105.