酶联免疫试验（共9篇）
酶联免疫试验 篇1
随着畜牧业产业化的发展, 畜牧养殖越来越集约化, 越来越依赖于兽药、抗生素和激素等外源物质。它们对促进畜牧养殖增产有极其重要的作用, 但由于兽药本身固有的化学属性和对其使用不当必将导致畜产品中的兽药残留超标, 危害到广大人民群众的身体健康, 因此, 加强对兽药残留的快速检测已经成为十分必要的措施。
目前酶联免疫吸附法 (ELISA) 因其具有的灵敏度高, 重现性好, 检测成本低, 操作简单, 样品处理量大等特点, 已成为国内应用最广泛的兽药及违禁添加快速检测方法之一。它是将抗原结合到某种固相载体表面 (酶标板) , 让受检药物和酶标抗原与固相载体上的抗原反应一段时间后, 洗去多余的酶标抗原和杂质, 加入底物显色, 根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高, 可以极大的放大反应效果, 从而使测定方法达到很高的敏感度。
ELISA检测对反应条件要求严格, 在检测过程中每一个步骤都有可能对检测结果产生较大影响, 致使同一批次的样品重现性不好或者出现假阴性、假阳性, 这影响到检测结果的准确性, 对此要采取一些相应的预防措施, 以提高检测结果的准确性。
1 ELISA试剂盒的保存
光照的影响试剂盒储存和反应时, 均应避免直接暴露在阳光下, 底物液和部分标准品对光敏感。试剂盒储藏时要在2~8℃温度条件下保存, 忌冷冻, 未使用完的试剂盒应注意把板条放入铝箔袋封口, 并放入干燥剂小袋, 以避免板条受潮失效。
2 检测前准备工作
2.1 检测室温度
试剂盒最佳的检测温度应在20~40℃之间, 温度过高或过低都会降低酶的活性, 而酶活性的降低会影响测量的准确性。试剂盒打开后, 在室内温度下至少平衡半小时, 如果室温低于20℃须在25℃的培养箱中回温。回温后于室温25℃±2℃使用, 使用时应避免阳光直射, 空调或风扇直吹。
2.2 溶液配制
在整个实验中所使用的水均需是蒸馏水。在配制样品提取液和洗涤液时一定要用蒸馏水或去离子水, 不可使用矿泉水或自来水, 否则, 里面的金属离子会对检测结果产生干扰。
2.3 移液枪的使用
加样的枪头需使用一次性的, 微量枪头清洗不干净, 很容易有药物残留, 重复使用会造成交叉污染。检测员在使用八道移液器时, 在吸取时按至第二停点, 将吸头没入试剂液面下2~3 mm, 轻缓松开按钮回原点, 慢慢提出吸头并在容器壁上停靠一下, 以去除多余试剂, 轻按按钮至第一停点, 排出液体, 保持手势不动, 再次将吸头没入试剂液面稍停片刻按至液面下2~3 mm, 轻缓松开按钮回原点, 此即为“吸二打一”式加样, 避免加样时产生气泡, 导致加样不均。加试剂时, 移液器要保持垂直;吸头有试剂时, 移液器不能平放或者倒置, 避免污染移液器, 进而污染其他试剂和样品。
3 检测仪器对检测结果的影响
3.1 酶标仪的影响
仪器每年均需要检定, 以保证仪器的准确性。酶标仪在使用前需预热30 min, 在室温条件下测定, 室温低于15℃时, 需使用加热等方式使室温保持25℃左右, 以确保酶标仪的正常运行。
3.2 微量移液器的影响
微量移液器需每年进行检定, 检定合格方可使用。微量移液器要有机相、水相分开, 贴上标签。在量取不同溶剂需更换枪头, 避免交叉使用造成污染;试剂从试剂瓶中吸出后, 不能再放回瓶中, 防止试剂污染。
4 检测员的操作对检测结果的影响
对于ELISA试剂盒来说, 检测员的熟练度对结果影响很大。检测人员上岗前需进行相关培训, 需具备基本的检测质控知识。熟练掌握ELISA检测方法的原理, 试验检测的目的, 检测员需保持认真负责的工作态度, 在实验前熟读试剂盒说明书, 对试验中的注意事项、重点难点加以标注, 特别要注意:标准品或抗体是否需要稀释、孵育温度是25℃还是37℃、酶标二抗、抗体工作液、底物液、终止液的加样顺序和时机 (试剂顺序加反通常会造成酶标板不显色, 使实验失败) 、酶标仪检测波长是双波长还是单波长。
5 关键点控制
5.1 样品前处理
样品前处理需根据试剂盒说明, 不同的样品种类有不同的处理方式。有些检测项目需要氮气吹干的方式浓缩富集药物, 在实际操作中, 除非试剂盒说明要求吹至尽量干, 否则只要吹干即可。某些样品 (肝脏样品) 剩余一些油脂很难吹干, 这些油脂干扰可以通过下一步的正己烷溶解去除。氮吹时间过长会造成药物损失严重, 回收率降低, 所以在氮吹时应随时查看吹干情况, 吹干后应尽快加溶剂复溶。
5.2 加样
不管什么试剂, 加样前均需摇匀, 加样时需将处理好的样液加在孔板底部, 避免加在孔壁上部。
5.3 洗板
洗板是关系到实验成败的关键步骤。ELISA通过洗板去除未结合抗原抗体和酶标记物, 同时也可以去除非特异性吸附的蛋白质干扰及样本中的部分杂质干扰。
手动用排枪洗板时需注意, 要垂直悬空加入液体, 吸打液体速度不能过快, 以免液体溅出, 造成交叉污染, 按照规定的洗涤液体积进行洗板, 注意不要出现孔间相溢现象。洗液尽量不要满溢或加到板孔外面, 若洗液不小心加到外面, 需用洁净无毛屑的滤纸沾干, 避免板底不洁净, 造成酶标仪读数出现误差。
5.4 孵育
孵育、显色过程中要在恒温箱里避光进行, 以保持温度的稳定。显色时间、温度需按试剂盒的规定来操作, 加完试剂后将微孔板从室温放入恒温箱时, 孔内温度从室温升至恒温箱温度需要一定时间, 尤其在室温比较低的状态下, 这段升温时间可能比较长。通常是将微孔板一放入恒温箱就开始计时, 这样就容易造成实际测定时孵育时间不够, 导致弱阳性样品测不出来。若温度相差大时, 可以适当延长孵育时间2~5 min。孵育时应盖封口膜, 否则会使孔内反应液蒸发, 导致孔板难以彻底洗净影响检测结果。
5.5 显色
底物液过期或配制时间过长也是影响实验结果的重要因素。尽可能在使用前配制底物液, 底物液禁止接触金属物品。加完底物液后的孵育时间依各孔颜色而定, 若反应时间到了, 但酶标板各孔颜色普遍较浅, 可继续显色5~10 min。
5.6 酶标仪判读结果
ELISA试剂盒内显色剂多为TMB (3, 3, 5, 5, -四甲基联苯胺) , TMB颜色底物显色后, 随着时间的延长, 颜色会逐渐消退, 因此显色并终止反应后必须尽快读数, 以免影响检测结果。测定波长一般为450 nm, 有的厂家会设有参比波长630 nm, 使用双波长可以消除试样的背景吸收干扰和混浊干扰。
综上所述, 尽管ELISA法操作简单, 但可能影响检测结果的因素也较多。故在实验操作中, 需严格按照试剂盒操作步骤操作, 同时做好室内质控、室间比对, 以严谨的工作态度对待每一份样品, 避免或减少影响因素的干扰, 力求结果准确, 为进一步加强畜产品质量监管提供可靠的数据支持。
摘要：酶联免疫吸附法 (ELISA) 因其具有的灵敏度高, 重现性好, 检测成本低, 操作简单, 样品处理量大等特点, 已广泛应用于兽药残留及违禁添加药物的快速检测。ELISA虽然操作简单, 但试验操作中各环节对试验的检测结果影响较大, 如不注意, 很可能导致显色不全、重现性不好、假阳性或假阴性的结果。本文对影响ELISA试验的常见因素进行分析并总结出解决方法, 以提高检测的准确性。
关键词：酶联免疫吸附试验,兽药残留,影响因素
酶联免疫试验 篇2
[关键词] 酶联免疫吸附实验；HIV抗体；影响因素
[中图分类号] R446.61 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2012）02-0076-02
The impact factors of enzyme-linked immunosorbent assay in detection of HIV antibodies
BI Xiuxin
International Travel Health Care Center of Dandong in Liaoning Province, Dandong 118000, China
[Abstract] By analysis of all relevant factors in pre-test, during test and post-test of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in detection of HIV antibodies, to explore the various impact factors on the results, in order to find a solution and strengthen the quality control management, to ensure accuracy and precision of the test results.
[Key words] ELISA; HIV antibody; Impact factors
酶联免疫吸附实验因其操作简单、灵敏度高、特异性好、价格低廉等特点成为HIV抗体初筛实验的常用方法。优质的试剂、良好的仪器、正确的操作和高素质的技术人员是保证检测结果准确可靠的必要条件。由于ELISA法检测结果受很多因素影响，其中任何一项因素都可造成HIV抗体结果假阴性和假阳性结果的发生。因此必须加强HIV抗体初筛实验室的全面质量控制，保证其结果的准确可靠。笔者从事多年的HIV抗体检测工作，现将影响因素分析如下。
1 检测前
1.1 试剂
1.1.1 试剂的选择 优质的HIV抗体试剂是结果质量的基础。试剂要从灵敏度、特异性、精密度、稳定性、简便性、安全性和经济性做出全面的评价并选择好的试剂，根据实验室要求选择灵敏度高（精密度高，CV值＜15%）、特异性好的试剂。试剂的选择很关键，通过厂家了解试剂包被物的组成，如原料来源（基因组成或合成多肽）、片段组成（按比例组成或化合组成）、片段长短等来判断抗原、抗体包被的完整性和特异性。根据试剂批号检定报告了解其质量水平和试剂的优劣，还可以室间质评报告中对试剂的评价结果来客观评价、选择适合实验室的试剂。要选择和订购长效批号的试剂，避免试剂批号改变而重新建立质量控制体系[1]。
1.1.2 试剂的储存 试剂应储存在2～8℃冰箱中，力求温度恒定，并防止阳光照射。试剂盒中有3个主要的试剂，即免疫吸附剂、酶结合物和底物。酶结合物具有生物活性，保存不当，极易失活；底物容易被氧化，产生颜色。因此，必须加强试剂的储存管理，防止试剂失活和氧化。
1.2 标本
血清是最常用的标本。酶联免疫吸附实验中标本的质量也是影响结果的关键因素之一，标本的干扰物质容易引起假阳性或假阴性的结果。干扰分为外源性和内源性。外源性干扰：细菌污染、溶血、凝固不全、反复冻融和标本相互污染等；标本放置4℃冰箱冷藏一般不超过5 d，如果保存过久，其中的蛋白质可能发生聚合，可使本底加深；冻结的标本要融化后充分混匀，为防止蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分轻轻混匀，避免产生气泡；浑浊或有沉淀的样本应先离心澄清后再检测；防止反复冻融，引起效价降低。内源性干扰：一般包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异性免疫球蛋白、异嗜性抗体及某些自身抗体等，避免内源性干扰因素主要通过选择合适的试剂。①标本溶血时释放大量具有过氧化物酶活性的物质，增加了非特异显色，干扰测定结果[2]；②标本被细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；③血清标本应充分离心，否则可因凝固不全、纤维蛋白原非特异吸附于微孔内而造成假阳性结果。
1.3 仪器
酶联免疫吸附实验中会用到移液器、水浴箱或恒温箱、洗板机、酶标仪等。移液器是一种比较精密的工具，要求比较高，必须定期对加样器进行维护和校准[3]。每次加样需更换吸嘴，以免交叉污染。水浴箱温度要准确恒定；洗板机要定期维护，检测残液量。
2 检测中
2.1 加样
在HIV抗体检测中加样3次，即加标本、加酶结合物、加底物。加样时要将所加物加入板孔底部，避免加在孔壁外部，产生气泡，吸取样品速度要均匀，保证加样量准确；加完样品要在微量振荡器上震荡1min以保证混合均匀。
2.2 温育的时间和温度
要力求保证温育的时间和温度，酶联免疫吸附实验属于固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相的表面发生，样品中的抗体并不是都有均等的机会与固相的抗原结合，而是最贴近孔壁的一层溶液中的直接与抗原接触，是一个逐渐平衡的过程，因此需要经过扩散才能达到反应的终点，要保证足够的温育时间，才能使产物生成达到顶峰，有的实验室为加快速度，提高反应温度，但盲目提高温度会影响酶的活性。
2.3 温育的方式
常采用温箱法、微波辐射法和水浴法。其中水浴法能较好地解决因受热不均衡所致周围孔与中央孔结果的吸光度差异（即边缘效应），可将ELISA板置于水浴箱中。无论温育还是水浴，反应板不可叠放，以保证各板的温度尽快达到平衡，反应板要贴近水面，温育时要防止挥发或水珠溅入影响结果。
2.4 洗涤
洗涤虽然不是一个反应步骤，但也影响实验的成败。洗涤的目的是分离游离和结合的酶标记物，通过洗涤来实现清除残留在板孔中的没能与固相抗原结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质，洗液的配制要按照要求，太浓会解离包被在固相的抗原，过低削弱洗涤效果。可以说洗涤是HIV抗体ELISA法检测的最主要的技术，操作者要严格按照要求洗涤，不能马虎，否则前功尽弃。洗涤包括仪器自动洗涤和手工洗涤。仪器洗涤要注意定期检测残余量，检测吸液针和注液针是否堵塞，及时更换洗液和废液，防止时间过长引起细菌污染和废液倒流；手工洗涤包括有浸泡式和流水冲洗式两种。手工洗板要注意孔间的交叉污染和洗涤间隔时间。
2.5 显色与比色
显色是ELISA法中最后一步温育反应，反应时间和温度仍是影响显色的因素。TMB受光照影响不大，但OPD底物受光照会自行变色，因此，显色反应应避光进行。显色的温度和时间要力求准确充分，并在规定的时间内比色，防止时间过长会褪色。比色时应尽量选用双波长进行比色，这样可以排除干扰，比色前要用吸水纸拭干板底附着的液体，防止孔内产生气泡，对测定结果产生干扰。
3 质量控制
3.1 开展室内质量控制（IQC）
室内质量控制程序，每次或每天之间不可能没有误差，决定允许的误差范围以临床上不造成误诊和漏诊为准，选择一个弱阳性的室内质量控制品，其S/CO值应该为2～4之间。利用L-J质量控制图，认真分析每次的失控的原因，要解决失控，必须分析造成失控是随机的还是系统的很重要，随机误差表现离散度增大，而系统误差逐渐产生，如漂移或者倾向性，如果是系统误差，再对系统误差进行分析。实验室每月、每一季度要对室内质量控制结果进行分析总结，对当月的均值、变异系数等进行比对分析，及时发现问题，及时采取纠正措施来提高检测结果的可靠性。
3.2 外部质量控制
积极参加室间质评能力验证活动，通过室间质评和能力验证，利用实验室间比对来确定实验室检测或校准能力的活动，判断和监控实验室内部质量控制方法，有效消除偏差，对分析结果起到校准和复核作用。有效地实施能力验证，在实验室质量控制中起着非常重要的作用。利用实验室间的比对和能力验证来不断提升实验室的能力。
3.3 加强人员培训
人员是实验室最宝贵的资源，一个实验室水平的高低很大程度上取决于人员的素质，尤其是关键的技术岗位人员，因此，有针对性地加强人员培训，对艾滋病初筛实验室是非常重要的[4]。
[参考文献]
[1] 于振喜，李连洁. 用ELISA法检测HIV抗体时如何避免“花板”[J]. 中国医药导报，2006，3（23）：56.
[2] 陈云钰. ELISA法检测HIV抗体需注意的影响因素[J]. 中国卫生检验杂志，2011，21（6）：1564-1565.
[3] 全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版）[S]. 中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心，2009：1-5.
[4] 张斌. 实验室管理、认可与运作[M]. 北京：中国标准出版社，2005：162-164.
（收稿日期：2011-11-18）
酶联免疫试验 篇3
1 试剂因素
1.1 试剂的选择
试剂的选择是保证血液检测质量的关键因素, 要选购知名度高, 质量有保证, 具有“三证”的试剂, 最好选用配套试剂。也可以和同行交流, 其他实验室对某种试剂盒的实际使用效果, 往往具有很强的说服力, 因此应使用检测口碑好的试剂 (可通过室间质评组织获得[1]) 。不使用过期试剂, 不同批号试剂不能混用, 同批号试剂盒的组分也不可混用。
1.2 试剂的储存运输。
1.2.1 试剂的储存至关重要, 试剂一到科室, 即应立即放入冷藏冰箱, 必须注意不得靠近冰箱后壁, 以防试剂冻结, 影响检测结果。
1.2.2 试剂供应商必须保障试剂在进入科室前运输储存的质量, 试剂盒从出厂到用户手中, 均要历经运输 (如送检、检定、发货等) 及运输中的储存环节, 某一环节不当, 均影响试剂盒的临床使用质量。去年我科有一段时间所做的表面抗原项目, 今天阳性, 同一份标本明天复检有可能是弱阳性甚至阴性, 查找原因可能是这批试剂在进入科室前储存温度出现了问题, 与试剂商联系更换新的批号试剂后, 此现象消失。
1.3 试剂的准备
在临床实验室, 试剂的准备一般不太注意, 工作人员通常在试验时将试剂从冰箱中拿出来就用, 其直接后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此酶联免疫吸附试验中, 试剂准备最关键的是使试剂盒在使用前与室温平衡, 以满足检测要求, 一般检测前30 min即应将试剂盒从冰箱中取出, 检测时试剂盒可与室温平衡。
2 标本因素
标本因素包括标本溶血、被污染、标本保存时间过长和标本凝固不全等。
2.1 标本溶血
血红蛋白中含铁血红素有类过氧化物酶活性, 因此以辣根过氧化物酶为标记的酶联免疫吸附试验测定中, 如血清中血红蛋白浓度较高, 很容易在温育过程中吸附于固相, 从而与后面加入的辣根过氧化物酶反应显色, 造成假阳性。因此在采血过程中应注意, 采集血液标本时应缓慢抽动, 注射器插入生化管应让血液自动靠负压注入生化管, 不能用手推注射器栓塞, 以防标本溶血。处理方法:若轻微溶血影响还不大, 若为中度或重度溶血, 则必须与临床联系, 重新抽取标本, 并讲清楚正确采集血标本的重要性。并由有关部门定期培训临床护士怎样正确采集血液标本。
2.2 标本被污染
菌体可能含有内源性过氧化物酶, 可出现非特异性显色, 因此宜用新鲜标本, 如有特殊情况, 应冰箱保存或冰冻保存, 并应加盖保存。阳性结果应重抽血双孔复检。
2.3 标本的保存
标本在冰箱中保存时间过长, 可能造成污染或效价降低, 可引起假阴性, 因此应尽量用新鲜标本。冰冻标本应避免反复冻融, 因冰冻标本的反复冻融产生的机械力对标本中的蛋白分子有破坏作用, 可引起假阴性[2]。
2.4 标本凝固不全
标本凝固不全的血清中有部分纤维蛋白原, 影响结果。有的工作人员着急赶时间, 刚采集的标本就离心 (虽然现在都采用促凝生化管) , 结果刚离心完血清还可以, 但是在洗涤时, 此孔血清呈果冻状, 显然反应不完全。处理方法:标本采集后在37℃水浴30 min后再离心, 以3500转/min离心5 min可获得满意标本[3]。
3 操作因素
3.1 加样
孵育前加样时间过长, 漏加样本, 酶试剂加入孔外, 用滴瓶滴加试剂时加量不准等都可使试验结果不可靠。处理方法: (1) 标本过多时, 可分批操作, 标本要轻拿轻放, 防止标本溅出交叉感染; (2) 加完样品封板前要仔细观察反应板, 看是否有样品漏加, 以便及时发现; (3) 加酶试剂后可用吸水纸吸干孔外试剂; (4) 使用滴瓶加试剂时, 应垂直滴加, 匀速滴加, 以免速度过快有的孔中多加1滴试剂, 建议采用微量加样器加试验中的所有组分; (5) 加样器应定期校准, 消毒, 吸头要一次性使用, 以免交叉污染。
3.2 温育
温育是最为关键、最容易出现问题的步骤;温育的时间、温度选择一般按照试剂盒说明进行, 加完样本和试剂后微孔板放入水浴箱或温箱中, 孔内温度从室温升至摄氏37℃需一定时间, 若一放入就计时, 就容易造成孵育时间不够, 易致弱阳性标本检测不出。处理方法: (1) 可采用适当延长几分钟时间 (大约2 min) ; (2) 可把反应板封板后直接放入37℃水浴箱水中; (3) 用37℃孵育箱将是不错的选择。
3.3 洗板
3.3.1 洗涤液的配制, 按照说明书要求1∶20稀释, 看似很简单, 但必须注意一些细节问题: (1) 注意洗涤液是否有结晶析出, 冬天洗涤液易结晶, 如不注意很容易堵塞洗板机管路。处理方法:事先将洗涤液置37℃水温箱中预温一会再行配制就可解决。 (2) 要注意去离子水的pH值。处理方法:用0.1nNaOH调节pH值至7左右。
3.3.2 洗板有两种, 即手工洗板和洗板机洗板。采取手工洗板, 孔与孔之间液体易交叉;采取洗板机洗板时, 洗液量不足导致洗板不彻底, 针孔堵塞导致抽吸不完全, 清洗效果差。处理方法: (1) 手工洗板时, 孔内洗液不能溢出, 拍板时要垂直, 但用力不能过猛, 防止抗原抗体复合物脱落; (2) 用洗板机洗板, 洗涤液要新鲜配制, 洗板机要经常检查冲洗头是否畅通, 洗涤液瓶应定期彻底清洗, 要定期检查整个管路, 疏通管路, 若针头被堵塞, 可用注射器排除; (3) 我科采用机洗5遍人工加洗1遍, 效果较好; (4) 洗板时, 吸水纸不可重复使用; (5) 洗完板时, 应充分扣干反应孔, 可用吸水纸包住反应板扣干。
3.4 显色
要严格按照说明书进行, 充分显色到预定时间后加入终止液。
3.5 测定
加入终止液后用酶标仪检测, 酶标仪需预热15 min~30 min, 因反应板加入A、B显色剂后在37℃放置30 min, 反应板底部会有水雾, 检测时可出现假阳性, 上机前一定要在吸水纸上吸干。
在以上的操作过程中, 要保持试验的连续性, 有的工作人员在洗完板时, 因故未能及时加A、B显色液, 会对测定结果造成影响, 因此要注意试验的连续性, 这一点至关重要。
综上所述, 尽管酶联免疫吸附试验测定操作简单, 但影响测定结果的因素较多, 所以工作人员要加强责任心, 在操作过程中不能有一点疏忽, 要严格按照试剂盒说明书操作, 尽量避免或减少影响因素, 保证检验质量。
参考文献
[1]马斌国.现代临床检验质量保证[M].太原:山西科学出版社, 2001:6.
[2]李会英.酶联免疫吸附试验影响因素的分析[J].检验医学与临床, 2007, 4 (10) :985-986.
酶联免疫试验 篇4
(辽宁省鞍山市铁西区卫生防疫站辽宁鞍山114012)【摘要】艾滋病是当前严重威胁人类健康和生命的一种传染病,由早期的静脉吸毒者共用注射器传播,发展到当今性传播和母婴垂直传播,即向普通人群的传播, 艾滋病的流行给人类的健康、生命安全以及经济社会发展带来了严重影响。最常用的艾滋病诊断方式是进行抗体检测，要了解和掌握HIV的感染情况，关键就是实验室的检测技术，下文就关于在HIV抗体检测中酶联免疫吸附法和快速法的比较分析及其注意事项的总结。【关键词】酶联免疫吸附法;胶体金快速法;HIV抗体;检测【中图分类号】R446.6【文献标识码】B【文章编号】1004-5511（2012）04-0594-01 一、引言进入20世纪90年代，HIV在我国迅速传播，感染人数成倍增长，艾滋病的防治已经成为全世界面临的重要课题。HIV感染的诊断以HIV抗体的检测为金标准，为了达到早诊断、早治疗、早管理的目的，全国先后建立了大量的HIV抗体初筛实验室，对HIV抗体检测的准确性要求也越来越高。现简述关于我站用酶联免疫吸附法及胶体金快速法检测HIV抗体的思考。二、酶联免疫吸附法对HIV抗体的检测HIV抗体检测是发现HIV感染的有效途径，酶联免疫吸附法（ELISA）是一种敏感性高、特异性强、重复性好的试验诊断方法，由于其试剂具有稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素，以及既适用于 规模筛查试验，又可以使用于少量标本的检测等优点，一直以来，成为艾滋病初筛试验室检测HIV抗体普遍使用的方法之一 1、试剂的选择:试剂盒的质量直接影响到结果的准确性，因此，要选择灵敏度和准确度较高，而且特异性较强的试剂盒。选择试剂盒的原则是，必须是经国家食品药品监督管理局注册批准，批检合格，临床评估质量优良，在有效期内的试剂，并经常了解同行对试剂盒使用的反馈情况一级卫生部临床检验中心对参加室间质评实验室试剂盒的综合评价。本站检测HIV抗体主要采用北京万泰生物药业有限公司试剂盒。另外，也应该注意试剂的保存，试剂从冰箱中取出后，应先平衡到室温后再使用，用多少取多少，防治反复冻融。2、仪器设备的校准与检定: 对实验结果起关键作者用的仪器，水浴箱、洗板机和酶标仪等均需按周期进行计量检定，并在检定周期内进行期间核查，同时，建立仪器设备的维护及操作规程，进行日常维护，保持仪器设备的最佳状态。3、样品样品的采集与保存: 样品采集时候应该尽量避免溶血和细菌污染、霉变，否则会导致假阳性。尽量不用抗凝血，保存时间不宜太长，一般2°C-8°C冰箱中保存一周内完成检验，长期保存最好在零下20oC度低温冰箱存放，并避免反复冻融，浑浊或有沉淀的样品要离心。作HIV抗体检测的血样不宜用塑料试管，应用玻璃试管装。4、检测中关键点的控制：（1）加样：微孔板条从冰箱中取出后应平衡至潮气干尽方可使用，用微量加样器按规定量加入孔底，避免加在孔壁上部，尽量慢慢快放，以免溅出或产生气泡，同时不要使吸头碰到酶标板孔上的包被抗原。（2）温育：调节水溶箱至合适的温度，不能过高也不能过低，放在水溶箱的隔板上或放在温箱的温盒里均可。（3）洗涤： 一定要用洗板机，防治污染。注意洗板机上的每一个放液和吸液纤孔都一致的插入孔底，将孔内液体吸干，严格按照要求设置一定的浸泡时间和洗涤次数，不要将各种试剂盒的洗涤液混用。（4）.显色： 严格按照说明书规定的时间温度恒定反应后终止，不可以随意更改。在加液和混均过程中避免产生气泡，洗涤后反应板用纸吸干后再置酶标液中比色。5、实验室内质量控制： 室内质控一般使用质控品和质控图。联合应用即刻法质控图法进行室内质控也是一种很使用的方法，可以借鉴。并积极参加室间质控活动，了解本实验室的实验误差情况。三、胶体金快速法对HIV抗体的检测与ELISA法相比，胶体金快速法具有快速，安全，操作简单等有点，但是在实际应用中要注意假阳性和假阴性结果。本站主要采用上海科华的胶体金快速检测法检测HIV抗体，其原理是采用HIV特異性抗原gp160和gp36等包被微孔反应板，用gp36、gp41标记辣根过氧化物酶。当待测标本中存在HIV抗体时，该抗体与固相化的抗原结合于反应板上，并进一步与酶结合物相结合，在TMB底物参与反应的情况。对于弱阳性样本的处理要慎重，不能轻易舍去，宜用正常血清稀释后与原液对照一起测定，往往可以收到很好的效果。四、结论ELISA法是实验室检测HIV抗体普遍使用的方法，但影响ELISA法测定结果的因素很多。与ELISA法相比，胶体金快速法具有快速，安全，操作简单等优点，但是在实际应用中要注意假阳性和假阴性结果。将胶体金快速法和ELISA法联合使用，并力求控制各个影响因素，可以大大降低假阳性和假阴性结果，提高检测的准备性，为艾滋病的防治工作提供更有效的依据。参考文献［1］中国疾病预防控制中心.全国艾滋病检测技术规范（2009年版）.北京：中国疾病预防控制中心，2009：6.［2］李秀华，宋爱京，王佑春.HIV抗体快速诊断试剂与酶联免疫诊断试剂灵敏度比较.中国生物制品学杂志，2004；17（3）：175-176.［3］胡静云，陈善昌.胶体金快速检测法与ELISA法检测HIV抗体效果观察.华夏医学，2009；22（3）：488.
酶联免疫试验 篇5
1 材料与方法
1.1 样本与试剂
北京康彻思坦生物技术有限公司HbsAg标准品 (标准值:2ng/ml) , 批号GBW (E) 090072;珠海丽珠试剂股份有限公司生产的ELISA试剂盒。
1.2 仪器
MR-96A酶标仪, 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司;移液器 (50μl) , 大龙医疗设备 (上海) 有限公司。
1.3 方法
以试剂盒说明书为参照, 基本流程为, 移液器加入血清和酶标抗体, 37℃孵育30min后洗涤, 然后加入显色剂A、B液, 37℃孵育15min, 然后加终止液, 最后酶标仪比色。HbsAg的不确定度包含测量重复性、操作过程以及酶标仪比色的不确定度。
1.4 数学模型
通过标准系列的OD值测定, 建立标准线性曲线, 数学模型为:y=x, (x—被测样本的浓度, 单位为ng/ml;y—被测样本的浓度, 单位为ng/ml) 。
2 结果
2.1 不确定度的计算
2.1.1 输入量的标准不确定度的分析与计算
由于工作曲线非线性引起的输入量x的标准不确定度分项u1。分别对质控血清中的HBsAg标准系列进行5次重复测定, 其吸光度/值测量数据见表1。
根据测量数据用线性回归法得标准工作曲线:Y=0.012+0.244x, 相关系数为r=0.999 6。
对于拟合的标准工作曲线非线性引起的不确定度u1=Sy/[∑ (xi-x) ]1/2=4.73×10-3v1=4。
测定未知样本浓度时重复性引起输入量X的标准不确定度分项u2, 测定5次结果分别为0.672、0.668、0.675、0.670、0.675。
实验标准差s通常可采用贝塞尔法计算:u2=S/n1/2=1.38×10-3v2=4。
2.1.2
由酶标仪测定OD值引起的不确定度为u3。u3由市质量技术监督局检定酶标仪并提供不确定度0.005, 自由度v3=47。
2.1.3
移液器实验过程中造成的不确定度u4, 移液器检定证书提供的数据, 加样量为50ul的误差为0.004。u4=0.004/31/2=2.31×10-3v4→∞。
2.2 合成标准不确定度
由于u1、u2、u3、u4各自独立, 因此u= (u12+u22+u32+u42) 1/2=7.39×10-3
有效自由度veff=21.40≈21。
2.3 扩展不确定度
Up=kp×up=95%kp=t95 (21) =2.080U95=2.080×0.007 39=0.015。
3 结论
综上所述, 实验中的HBsAg不确定度由直线回归曲线的标准差、酶标仪的不确定度、测量值的标准偏差、移液器的不确定度组成, 其它的因素可忽略不计。
结果得出该未知血清的HBsAg浓度为0.672ng/ml, 扩展不确定度U95=0.015ng/ml (自由度为21) 。
参考文献
酶联免疫试验 篇6
1 明确ELISA检测“乙肝二对半”的重要性
ELISA是目前临床上最常用的免疫标记技术, 是免疫检验技术课程的重要内容之一, 而ELISA检测“乙肝二对半”是ELISA在临床上应用的代表, 其灵敏度高、特异性强、操作简单, 同时运用到ELISA的3种方法, 即双抗体夹心法、双抗原夹心法、竞争抑制法, 是在学习了抗原抗体反应等基础上进一步学习的内容, 起到承前启后的作用。掌握这项技术可为以后的临床工作打下牢固的基础。
2 确立ELISA检测“乙肝二对半”的重点、难点
由于授课对象是检验专业的学生, 对其而言, 掌握操作过程和判断实验结果最重要, 因此, 应把操作方法及结果判断列为重点内容;而掌握实验原理对于中职生来说有一定难度, 所以列为难点内容。在教学过程中, 一方面, 安排的任务要符合学生实际, 注意任务的层次性;另一方面, 要根据实际情况灵活调整教学进度和深度。
3 合理运用各种教学方法
3.1 PBL教学法
PBL是以问题为基础的教学法, 它最大的优势, 就是要求学生主动学习。在学习过程中, 学生可以自主地探索某些问题, 虽然有时可能是失败的探索, 但是他们从失败中获得了智慧, 从成功中得到了快乐, 从学习中获得了经验。研究表明[1,2], 采用PBL教学法可以激发学生的学习热情、培养学生创新思维及自学能力、提高人际交往及协作能力、形成终身学习意识, 在以后的工作中更具开拓精神。
本次实验设计了以下问题: (1) 什么是乙型肝炎?它的病原体是什么? (2) 什么是“乙肝二对半”?想知道是否感染了乙肝病毒可以做什么检查? (3) 什么是酶联免疫吸附试验?ELISA检测“乙肝二对半”的原理是什么?如何进行操作及判断结果?如何解释得出的实验结果?什么是“大三阳”?激发学生的求知欲和探究欲, 促使学生主动学习实验所涉及的相关知识, 为实验打好理论基础。
3.2 实验操作多媒体演示法
很多中职生接受能力较差, 对做好ELISA没有信心。实验课可通过播放高年级学生的实验操作录像, 把操作内容直观、形象地展示给学生, 便于学生理解和掌握, 达到增强学生信心的目的:学长能做到的, 我们也能做到。
3.3 情境角色扮演法
本次课给学生创设情境, 让学生扮演检验科的“医生”和“病人”角色, 在角色扮演中学习, 在解决问题中达到理论和实践的有机结合, 即“做中学, 学中做”, 强调工作过程的整体性, 注重职业情境中实践能力的培养, 锻炼了学生的动手能力、分析和解决问题的能力。
3.4 启发、归纳教学法
从临床检验实际出发, 启发学生对ELISA的认识, 培养和提高学生团队协作精神及学习的积极性、主动性;引导学生以探讨、研究的方式, 认识思考和解决问题。
通过本次实验课, 引导学生归纳出5个检测项目操作步骤的异同, 举一反三, 更好地进行ELISA的相关检测。
4 加强对学生学习方法的指导, 培养学生的自学能力
最有价值的知识是关于方法的知识, 掌握了正确的学习方法就像有了能打开知识大门的金钥匙, 因此, 教师应当加强对学生学习方法的指导, 把金钥匙交给学生。本次课主要让学生学会以下学习方法。
4.1 问题讨论学习法
通过问题的导入, 让学生讨论, 并在操作过程中发现问题、分析问题、解决问题。让学生学会分析、归纳, 提高解决问题的能力。
4.2“一读、二联、三写、四练、五创”的学习方法
“一读”, 指教师指导学生阅读教材, 对学习好的学生指导其阅读课外资料和相关参考书。要求学生遇到问题, 学会查阅相关资料, 如实验操作说明书、微生物检验技术中乙肝病毒相关知识等。
“二联”, 指教师指导、启发学生进行联想, 把与问题相关联的知识串联起来, 理成线, 织成网, 总结出规律, 同时学生间相互讨论。学生学会将知识前后联系, 融会贯通;本次实验要求学生归纳出乙肝病毒5项检测指标操作、结果判断的异同, 以锻炼学生概括能力。
“三写”, 指学生在学完一章后, 写出知识要点和小结, 以培养学生的文字概括、写作和书面表达能力。在本次实验后要求学生概括出“乙肝二对半”所需试剂种类、操作步骤、结果判断, 加深对实验的印象。
“四练”, 指让学生自己动手做实验, 培养和提高其实验操作能力。
“五创”, 指教师尽量开拓学生的视野, 培养学生举一反三的知识迁移能力和创新精神, 把所学操作知识运用于临床检验工作。
通过学习方法指导, 既要学生学会, 又要学生会学, 在教知识的同时教方法。
5 合理安排实验各环节
(1) 做好实验前准备工作。实验课前一周进行实验分组, 布置学习任务, 让学生通过各种途径, 如利用网络查阅相关资料, 获取ELISA检测“乙肝二对半”的相关知识, 为实验打下良好的理论基础。
(2) 在实验过程中严格小组操作, 发挥“小老师”的监督作用。每个小组选出一位能力较强的组长进行培训, 做“小老师”, 全程负责监督, 从而保证实验顺利进行, 事实证明, 这个方法行之有效。同时, 教师负责巡回, 给予必要的指导和纠正;注意实验原理的分析, 及时了解学生对实验的掌握情况。
(3) 实验结果的判断。让学生自己思考判断, 记住自己的实验结果, 教师检查, 给予必要的指导和纠正, 激发学生的求知欲, 锻炼他们独立分析、解决问题的能力。在实验时要注意学生个人隐私的保密, 注意乙肝防治知识的拓展。
(4) 实验小结。实验结束后, 要及时进行总结, 由一位学生总结本次实验心得, 其他学生补充, 最后教师加以点评, 以加深对本次实验的印象, 锻炼学生的概括、总结能力。
(5) 课后布置作业, 加深印象, 进一步巩固所学知识;同时开放实验室, 让学生到实验室进行操作练习, 巩固操作技能。
6 实验反馈和评价
本实验的目标是让学生学会正确操作、结果判断和分析, 同时训练及提高学生的操作能力, 培养团体合作精神。只要学生得出正确的实验结果, 书写检验报告, 并且课后能独立完成布置的作业, 就达到了本次实验的目的。当然, 要熟练掌握一项实验技能不是一次实验课就能够实现的, 需要不断地巩固和练习。
总之, 在ELISA检测“乙肝二对半”的实验教学中, 学生充分认识到本次实验的重要性, 采用恰当的教学方法, 加强对学生学习方法的指导, 充分发挥学生学习的主动性, 合理安排实验各环节, 使学生更好地掌握操作技能。
参考文献
[1]魏红蕾, 方芳, 刘慧珠, 等.PBL教学法在临床护理教学中的应用[J].解放军护理杂志, 2005, 22 (7) :81~82.
酶联免疫试验 篇7
1 资料与方法
1.1 一般资料
随机选取本院2013年8月~2014年8月收治的70例老年骨关节结核患者,按照诊断方式的不同将患者分为观察组和对照组,各35例。观察组中男21例,女14例,年龄62~87岁,平均年龄(75.3±6.8)岁;12例患者为脊柱结核,9例患者为髋关节结核,6例患者为膝关节结核,8例患者为其他部位的骨关节结核。对照组中男19例,女16例,年龄64~89岁,平均年龄(78.2±7.1)岁;10例患者为脊柱结核,11例患者为髋关节结核,7例患者为膝关节结核,7例患者为其他部位的骨关节结核。两组患者性别、年龄等一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
1.2 诊断方法
给予观察组患者酶联免疫斑点试验诊断。采集患者5 ml的肝素抗凝静脉血,制备2.0×106/ml的细胞悬液,且通过分离获得外周血单个核细胞。将植物血凝素(PHA)作为本次研究的阳性对照,阴性对照为细胞培养液,而刺激抗原采用结核菌特异性抗原CFP-10与ESAT-6。将含有2.5×105个细胞的细胞悬液注入到患者骨关节结核孔,且在含有5%CO2的培养箱中将微孔板放入并培养18~20 h[3]。在反应完成后,清洗微孔板并用颜色标记,终止反应。给予对照组患者结核抗体检测。对患者进行手术分离标本或骨关节穿刺液。对比两组观察结果。两组患者再分别做结核菌培养、聚合酶链反应、抗酸杆菌涂片,检查骨关节结核的阳性率,并进行比较。
1.3统计学方法采用SPSS20.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验;计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 两组诊断情况比较观察组患者的检测敏感性、阳性预测值、阳性似然比、阴性预测值、特异性分别为94.29%、8 5. 7 1%、8.57%、91.43%、7 7. 1 4%;对照组患者的检测敏感性、阳性预测值、阳性似然比、阴性预测值、特异性分别为7 7. 1 4%、62.86%、5.71%、8 5. 7 1%、54.29%。观察组检测敏感性、阳性预测值、特异性优于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。两组阳性似然比、阴性预测值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
2.2 两组结核菌培养、聚合酶链反应、抗酸杆菌涂片检查阳性情况比较
观察组患者的结核菌培养、聚合酶链反应、抗酸杆菌涂片阳性率分别为31.43%、51.43%、25.71%;对照组患者的结核菌培养、聚合酶链反应、抗酸杆菌涂片阳性率分别为25.71%、42.86%、20.00%。两组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。
表1 两组患者诊断结果比较[n(%)]
注:与对照组比较,aP<0.05,bP>0.0
表2 两组患者诊断结果比较[n(%)]
注:与对照组比较,aP>0.05
3 讨论
老年骨关节结核是一种起病隐匿、发展进程缓慢、无明显临床症状且早期诊断比较困难,而导致疾病诊治延误的疾病。因此,对老年骨关节结核的早期诊断是十分重要的,早期诊断,能够使患者得到较为及时的临床治疗,降低对患者身体机能的损害
而酶联免疫斑点试验诊断方法的应用弥补了常规性的结核抗体检测的缺点,已经被广泛的应用于老骨关节结核疾病的临床诊断,本次调查研究发现,观察组患者的检测敏感性、阳性预测值、阳性似然比、阴性预测值、特异性分别为94.29%、85.71%、8.57%、91.43%、77.14%;对照组患者的检测敏感性、阳性预测值、阳性似然比、阴性预测值、特异性分别为77.14%、62.86%、5.71%、85.71%、54.29%。观察组检测敏感性、阳性预测值、特异性优于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。两组阳性似然比、阴性预测值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。观察组患者的结核菌培养、聚合酶链反应、抗酸杆菌涂片阳性率分别为31.43%、51.43%、25.71%;对照组患者的结核菌培养、聚合酶链反应、抗酸杆菌涂片阳性率分别为25.71%、42.86%、20.00%。两组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。说明患者的诊断效果比较之后,不能满足患者的及时临床治疗的需要,因而采用酶联免疫斑点试验诊断,则能够增强患者的敏感性,有利于诊断的施展。
酶联免疫试验 篇8
猪由于吞食生活泔水、吃死老鼠、吃人的粪便、吃某些昆虫等引起感染囊虫、旋毛虫病。猪患囊虫病时表现为营养不良, 生长发育受阻, 贫血, 水肿等, 如囊尾蚴侵害肺及喉时则出现呼吸困难, 声音嘶哑, 吞咽困难, 寄生在眼内可使视觉障碍甚至失明;寄生在大脑时, 出现癫痫, 急性脑炎, 甚至突然死亡, 影响了养猪业生产的健康发展。
近年来我国也经常发生人感染旋毛虫病。人感染主要是摄食了生的或未熟透的含有虫体包囊的猪肉, 或是食入被幼虫污染的食品, 可引起多种病症, 严重的导致死亡, 对人体健康带来了威胁。如1986年12月河南平顶山发生人体旋毛虫病流行, 仅1987年3月就发病103例。1995年1月6日广西德保县一村庄发生一起旋毛虫病流行, 发病53人, 死亡4人, 给人体健康造成危害。因此猪囊虫、旋毛虫的检验被列入肉品卫生检验的重要检验项目之一。
猪囊虫主要寄生部位为咬肌、腰肌、肩胛外侧肌等。旋毛虫主要寄生部位为膈肌。传统检验方法是宰后剖检猪胴体的咬肌、腰肌、肩胛外侧肌检验猪囊虫;采膈肌角压片镜检旋毛虫, 对检出病猪胴体进行无害化处理 (高温炼油) , 造成了很大的经济损失, 同时检验费时费事, 准确率低, 容易造成误检、漏检。我们与兰州兽医研究所寄生虫病防治专家联系提出采用酶联免疫吸附试验活体检验猪囊虫、旋毛虫。
1 试验方法
宰前采用酶联免疫吸附试验, 宰后采用剖检、压片镜检。
2 酶联免疫吸附试验原理
酶联吸附试验是根据被本病感染的血清中的抗体能特异性地吸附到经抗原致敏的聚苯乙烯板上, 再与酶标抗体结合, 加入底物后, 呈现颜色反应, 根据颜色的深浅作出判定。该试验操作简便、敏感性高, 是目前国内较先进的检验方法, 属农业部推广的检测方法。
3 试验数量
根据《动物疫病检测方法》检测范围, 对猪囊虫散发区2%屠宰猪进行病原学调查, 检测猪囊虫生猪560头份, 旋毛虫560头份, 共计1120头份。
4 试验器械、试剂准备
4.1 器械
聚苯乙烯板 (20孔或40孔) 定量加样器 (0.1mL) 及其吸嘴、酶标检测仪、普通滤纸条、微量注射器、电冰箱
4.2 试剂
抗原, 阴、阳性血清, 酶标抗体 (均有兰州兽医研究所提供) 。
包被液:碳酸钠缓冲液pH9.5~9.6
稀释液:磷酸盐缓冲液pH7.4
底物液:磷酸柠檬酸缓冲液pH5.0
终止液:2MH2SO4液
5 试验方法、步骤
5.1 采血对待宰生猪进行编号, 静脉采血2mL, 静止, 血凝后取出血清, 待检。血清样与生猪编号一致。
5.2 包被
取40孔聚苯乙烯反应板, 每次每孔注0.1mL包被液, 静置2min, 重复3次, 甩干后加诊断抗原0.1mL, 50℃恒温水浴1h, 置4℃冰箱过夜。
5.3 加被检血样
每孔加0.1mL被检血样, 每头份只加1孔, 按照血清样本编号依次加入, 每块反应板留下1孔加阳性对照血清, 1孔加阴性对照血清, 1孔空白, 室温下放置4~8min。
5.4 加酶标抗体, 弃去被样血样及阳性和阴性对照血样,
加稀释液洗涤3次, 甩干后加酶标抗体, 每孔0.1mL, 室温置4min。
5.5 加终止液, 底物显色时, 每孔加1滴终止液。
6 结果判定
6.1 眼观判定有色, 阳性;无色, 阴性。
6.2 酶标仪读数
将反应板放置在酶标仪中先对空白孔和阴性对照孔进行读数, 然后逐孔依次进行读数, 凡试验样本血清OD值高于阴性血清OD值2倍以上者, 判为阳性。
7 试验分析
按照国家农业部《动物疫病监测方法》对本地待宰生猪按10%抽样, 共对560头生猪进行宰前采血, 应用酶联免疫吸附试验检测猪囊虫, 宰后剖检咬肌、腰肌、肩胛外侧肌与酶标检测结果进行对照。560头生猪宰前采血应用酶联免疫吸附试验检测旋毛虫, 宰后采集隔肌角压片检验, 宰前与宰后检验结果进行对照。通过试验宰前采血应用酶标检测猪囊虫、旋毛虫结果与宰后检验结果完全一致。检出猪囊虫阳性生猪3头, 占检验总数的0.6%。旋毛虫全部为阴性。酶联免疫吸附试验主要是在宰前活体采血检测, 能够作到及早发现病猪, 及早治疗, 减少发病率, 同时一方面避免了宰后检出患病生猪销毁造成的经济损失。一方面避免了宰后误检, 漏检, 杜绝了病害肉上市。
8 试验结论
通过此方法对活体猪快速、准确的监测, 即时发现、即时治愈, 可以降低本地区猪囊虫、旋毛虫的发病率, 减少感染, 保护人体健康, 促进畜牧业健康发展。
9 猪囊虫病的治疗推荐用药
⑴吡喹酮100mg/kg.bw加适量面粉和水调成丸剂口服;间隔7d重复给药1次。⑵丙硫咪唑80mg/kg.bw, 分3~4次拌入饲料中喂服。
摘要：猪囊虫、旋毛虫病严重威胁着人体健康, 传统的检验方法是屠宰后剖检、压片镜检, 检出病猪销毁处理, 造成了很大积极损失。应用酶联免疫吸附试验活体检验猪囊虫、旋毛虫病, 对病猪进行有效治疗, 减少经济损失。
酶联免疫试验 篇9
酶联免疫吸附试验 (ELISA) 是血站实验室检测的一项重要内容。ELISA法具有灵敏度高、特异性强、重复性好的特点, 并具有操作简便、无放射性危害的优点, 因而多年来广泛应用于实验室的各种检测。ELSIA实验操作步骤复杂, 影响反应因素较多, 笔者通过一段时间的观察对影响ELISA检测结果的原因分析总结如下。
1 标本因素
标本采集前工作人员要对献血者进行健康征询, 以排除一些不适宜献血的献血者, 保证所采集的血液都来自低危人群, 确保血液标本质量。血液标本采集后血管必须立即加塞、管口向上, 防止标本蒸发、污染和外溅。另外还要垂直放置, 以减少血液振动, 促进凝血完全。标本采集后应尽快送往实验室, 尤其当采集温度超过22℃时此点更为重要, 因为温度过高会导致标本溶血, 使乙型肝炎、丙氨酸转氨酶 (ALT) 等检测结果增高。离心一定要按要求的转速和时间, 因为离心过快或离心时间过长会造成溶血;离心过慢或离心时间过短则离心不完全、不充分, 可能还会有少量的纤维蛋白原存在, 这两种情况均影响检测结果。
2 质控品、试剂因素
质控品的检测结果是衡量每次实验成败的关键因素。质控品购自卫生部临检中心, 要定期及时更换, 确保在有效期内使用。实验时注意加样量要准确, 不能有错加、漏加情况发生, 确保检测结果的准确性。所用试剂应通过卫生部批批检, 并在有效期内使用。每天实验前应在规定的试剂槽内倒入相应的检测试剂, 并仔细核对确保准确无误后使用。实验过程中要注意及时添加试剂, 防止因试剂量不足而中断实验, 影响检测结果的准确性。实验结束后要把试剂倒回相应的试剂瓶内或用封条封住试剂槽, 然后置2～8℃冰箱内保存。这样可以有效防止试剂污染或蒸发, 保证第2天实验的正常使用。
3 操作因素
实验前要把试剂盒和检测标本室温平衡30min后再开始实验, 要准备充足的加样针、试剂、质控品、洗液、清洗液等, 另外还要注意观察废液桶是否该清理等等。还要特别注意样品是否有漏加现象, 如果发现有漏加要用手工及时补充完整。手工加样时首先要将正在运行的仪器暂停, 然后要确定漏加的位置, 最后挑出相对应的标本, 将标本再次离心后进行加样。加样时要注意加样量要精确, 以保证检测结果的准确性。仪器运行过程中难免会出现一些故障, 无法继续运行, 这种情况就要进行手工实验。首先将每块板分别放入37℃水浴箱内继续孵育, 然后记录下每个实验项目的运行进度, 对照实验列表计算出下次洗板的时间。手工实验过程中要注意孵育温度和孵育时间要精确, 洗板要充分等等, 保证检测结果的准确性。
4 仪器设备因素
严格按照仪器设备操作步骤操作, 注意观察仪器运行情况, 发现问题及时处理。每天实验结束后要对仪器设备进行维护清洗。对设备的维护保养, 须养成良好的习惯, 使用后的仪器必须擦拭干净, 保持仪器设备清洁卫生。各种仪器要求定期校验, 大型设备应让技术监督部门按时标定校核, 保证设备精度。
5 环境因素
实验室温度应控制在18～25℃, 湿度应控制在30%～70%, 这样才有利于仪器设备的正常运行, 确保检测结果。必须养成良好习惯, 每天认真打扫实验室卫生, 对实验室进行严格消毒, 保证实验室清洁整齐。
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