酶联免疫方法

酶联免疫方法（精选9篇）

酶联免疫方法 篇1

临床免疫室开展的乙肝系列、丙肝抗体、艾滋病抗体、梅毒特异性检测等日常检测工作, 最为常用的检测方法为酶联免疫吸附试验。该试验用已知抗原检测未知抗体, 或用已知抗体检测未知抗原, 虽然操作简便, 但影响因素诸多, 一个环节出现问题, 都可能会导致检测的失败。现将酶联免疫吸附试验常见影响因素及处理方法总结如下。

1 试剂因素

1.1 试剂的选择

试剂的选择是保证血液检测质量的关键因素, 要选购知名度高, 质量有保证, 具有“三证”的试剂, 最好选用配套试剂。也可以和同行交流, 其他实验室对某种试剂盒的实际使用效果, 往往具有很强的说服力, 因此应使用检测口碑好的试剂 (可通过室间质评组织获得[1]) 。不使用过期试剂, 不同批号试剂不能混用, 同批号试剂盒的组分也不可混用。

1.2 试剂的储存运输。

1.2.1 试剂的储存至关重要, 试剂一到科室, 即应立即放入冷藏冰箱, 必须注意不得靠近冰箱后壁, 以防试剂冻结, 影响检测结果。

1.2.2 试剂供应商必须保障试剂在进入科室前运输储存的质量, 试剂盒从出厂到用户手中, 均要历经运输 (如送检、检定、发货等) 及运输中的储存环节, 某一环节不当, 均影响试剂盒的临床使用质量。去年我科有一段时间所做的表面抗原项目, 今天阳性, 同一份标本明天复检有可能是弱阳性甚至阴性, 查找原因可能是这批试剂在进入科室前储存温度出现了问题, 与试剂商联系更换新的批号试剂后, 此现象消失。

1.3 试剂的准备

在临床实验室, 试剂的准备一般不太注意, 工作人员通常在试验时将试剂从冰箱中拿出来就用, 其直接后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此酶联免疫吸附试验中, 试剂准备最关键的是使试剂盒在使用前与室温平衡, 以满足检测要求, 一般检测前30 min即应将试剂盒从冰箱中取出, 检测时试剂盒可与室温平衡。

2 标本因素

标本因素包括标本溶血、被污染、标本保存时间过长和标本凝固不全等。

2.1 标本溶血

血红蛋白中含铁血红素有类过氧化物酶活性, 因此以辣根过氧化物酶为标记的酶联免疫吸附试验测定中, 如血清中血红蛋白浓度较高, 很容易在温育过程中吸附于固相, 从而与后面加入的辣根过氧化物酶反应显色, 造成假阳性。因此在采血过程中应注意, 采集血液标本时应缓慢抽动, 注射器插入生化管应让血液自动靠负压注入生化管, 不能用手推注射器栓塞, 以防标本溶血。处理方法:若轻微溶血影响还不大, 若为中度或重度溶血, 则必须与临床联系, 重新抽取标本, 并讲清楚正确采集血标本的重要性。并由有关部门定期培训临床护士怎样正确采集血液标本。

2.2 标本被污染

菌体可能含有内源性过氧化物酶, 可出现非特异性显色, 因此宜用新鲜标本, 如有特殊情况, 应冰箱保存或冰冻保存, 并应加盖保存。阳性结果应重抽血双孔复检。

2.3 标本的保存

标本在冰箱中保存时间过长, 可能造成污染或效价降低, 可引起假阴性, 因此应尽量用新鲜标本。冰冻标本应避免反复冻融, 因冰冻标本的反复冻融产生的机械力对标本中的蛋白分子有破坏作用, 可引起假阴性[2]。

2.4 标本凝固不全

标本凝固不全的血清中有部分纤维蛋白原, 影响结果。有的工作人员着急赶时间, 刚采集的标本就离心 (虽然现在都采用促凝生化管) , 结果刚离心完血清还可以, 但是在洗涤时, 此孔血清呈果冻状, 显然反应不完全。处理方法:标本采集后在37℃水浴30 min后再离心, 以3500转/min离心5 min可获得满意标本[3]。

3 操作因素

3.1 加样

孵育前加样时间过长, 漏加样本, 酶试剂加入孔外, 用滴瓶滴加试剂时加量不准等都可使试验结果不可靠。处理方法: (1) 标本过多时, 可分批操作, 标本要轻拿轻放, 防止标本溅出交叉感染; (2) 加完样品封板前要仔细观察反应板, 看是否有样品漏加, 以便及时发现; (3) 加酶试剂后可用吸水纸吸干孔外试剂; (4) 使用滴瓶加试剂时, 应垂直滴加, 匀速滴加, 以免速度过快有的孔中多加1滴试剂, 建议采用微量加样器加试验中的所有组分; (5) 加样器应定期校准, 消毒, 吸头要一次性使用, 以免交叉污染。

3.2 温育

温育是最为关键、最容易出现问题的步骤;温育的时间、温度选择一般按照试剂盒说明进行, 加完样本和试剂后微孔板放入水浴箱或温箱中, 孔内温度从室温升至摄氏37℃需一定时间, 若一放入就计时, 就容易造成孵育时间不够, 易致弱阳性标本检测不出。处理方法: (1) 可采用适当延长几分钟时间 (大约2 min) ; (2) 可把反应板封板后直接放入37℃水浴箱水中; (3) 用37℃孵育箱将是不错的选择。

3.3 洗板

3.3.1 洗涤液的配制, 按照说明书要求1∶20稀释, 看似很简单, 但必须注意一些细节问题: (1) 注意洗涤液是否有结晶析出, 冬天洗涤液易结晶, 如不注意很容易堵塞洗板机管路。处理方法:事先将洗涤液置37℃水温箱中预温一会再行配制就可解决。 (2) 要注意去离子水的pH值。处理方法:用0.1nNaOH调节pH值至7左右。

3.3.2 洗板有两种, 即手工洗板和洗板机洗板。采取手工洗板, 孔与孔之间液体易交叉;采取洗板机洗板时, 洗液量不足导致洗板不彻底, 针孔堵塞导致抽吸不完全, 清洗效果差。处理方法: (1) 手工洗板时, 孔内洗液不能溢出, 拍板时要垂直, 但用力不能过猛, 防止抗原抗体复合物脱落; (2) 用洗板机洗板, 洗涤液要新鲜配制, 洗板机要经常检查冲洗头是否畅通, 洗涤液瓶应定期彻底清洗, 要定期检查整个管路, 疏通管路, 若针头被堵塞, 可用注射器排除; (3) 我科采用机洗5遍人工加洗1遍, 效果较好; (4) 洗板时, 吸水纸不可重复使用; (5) 洗完板时, 应充分扣干反应孔, 可用吸水纸包住反应板扣干。

3.4 显色

要严格按照说明书进行, 充分显色到预定时间后加入终止液。

3.5 测定

加入终止液后用酶标仪检测, 酶标仪需预热15 min~30 min, 因反应板加入A、B显色剂后在37℃放置30 min, 反应板底部会有水雾, 检测时可出现假阳性, 上机前一定要在吸水纸上吸干。

在以上的操作过程中, 要保持试验的连续性, 有的工作人员在洗完板时, 因故未能及时加A、B显色液, 会对测定结果造成影响, 因此要注意试验的连续性, 这一点至关重要。

综上所述, 尽管酶联免疫吸附试验测定操作简单, 但影响测定结果的因素较多, 所以工作人员要加强责任心, 在操作过程中不能有一点疏忽, 要严格按照试剂盒说明书操作, 尽量避免或减少影响因素, 保证检验质量。

参考文献

[1]马斌国.现代临床检验质量保证[M].太原:山西科学出版社, 2001:6.

[2]李会英.酶联免疫吸附试验影响因素的分析[J].检验医学与临床, 2007, 4 (10) :985-986.

[3]程玉萍.标本收集对酶联免疫吸附试验检测结果的影响因素[J].山西医药杂志, 2004, 33 (5) :412.

酶联免疫方法 篇2

酶联免疫法检测试剂注册技术审查指导原则

一、前言

本指导原则主要针对酶联免疫类检测试剂的主要原材料、生产工艺及反应体系、产品质量控制等环节提出指导性技术要求。

本指导原则系对酶联免疫法检测试剂的一般要求，申请人应依据产品特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需详细阐述其理由及相应的科学依据。

本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。

二、适用范围

本指导原则适用于有关病原微生物检测的第三类体外诊断试剂的注册技术审查。其他酶联免疫法检测试剂（如作为二类管理的体外诊断试剂）可参考本指导原则执行。

三、基本要求

（一）基本原则

1.研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。— 2 — 2.试剂生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》；同时，应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；还应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。企业应对试剂的使用范围做出明确规定，并经国家药品监督管理部门批准。

3.诊断试剂的研制应当按照科学、规范的原则，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。

4.试剂在研制、生产过程中所用的各种材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。

5.生产和质量控制的总体目标：保证试剂使用安全、质量稳定、工艺可控、检测有效。

（二）原材料质量控制 1.主要生物原料

与产品质量最密切相关的生物原料主要包括各种天然抗原、重组抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及多肽类、激素类等生物原科。这类原料可用于包被酶标反应板、标记相关酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）、中和反应用抗原或抗体、制备校准品（标准品）等。使用前应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。

主要生物原料的常规检验项目一般包括：（1）外观

肉眼观察，大部分生物原料为澄清均一的液体，不含异物、浑浊或摇不散的沉淀或颗粒；或者为白色粉末，不含其他颜色的杂质；特殊生

— 3 — 物原料应具备相应外观标准。

（2）纯度和分子量

主要经SDS-PAGE 电泳后，利用电泳扫描仪进行分析，也可用其他适宜的方法，如高效液相法等。根据所检测生物原料的分子量选择适宜聚丙烯酰胺凝胶浓度进行电泳，一般每个电泳道加样量为5μg，电泳后的凝胶可用考马斯亮蓝染色或银染法染色。染色后的凝胶用电泳扫描仪分析原料的纯度和分子量，纯度应达到相应的质量标准，分子量大小应在正确的条带位臵。

（3）蛋白浓度

蛋白浓度可通过Lowry法、280nm 光吸收法、双缩脲法或其他适宜的方法进行检测。

（4）效价

效价的测定一般根据蛋白含量测定结果，通过倍比稀释法进行。效价应达到规定的要求。

（5）功能性实验

功能性实验是指生物原料用于试剂盒实际生产中的情况，一般考查使用该原料的试剂盒的灵敏度、特异性和稳定性等，并比较其与上批次原料的相关性。

2.生物辅料

生物辅料一般指在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。这些生物原料的质量标准应符合2000年版的《中国生物制品主要原辅材料质控标准》规定的标准要求，并且要适合于本企业的生产。建议作以下检验：

（1）牛血清或羊血清

外 观：为浅黄色澄清稍粘稠的液体，无溶血或异物。无菌试验：将血清直接37℃放臵7天，明亮处观察，不得出现混浊或— 4 — 沉淀。

总蛋白含量：用双缩脲法测定，蛋白含量≥32mg/ml。

球蛋白含量：取待测血清1ml，采用饱和硫酸铵法进行沉淀，沉淀溶于0.85%氯化钠溶液，至1ml，用Lowry方法测定，蛋白含量应≤2mg/ml。

（2）牛血清白蛋白：

外 观：应为浅黄色、黄色或乳白色的冻干粉末，无吸潮，无结块，无肉眼可见的其它杂质颗粒。

溶解性：将牛血清白蛋白配成10%溶液，在1826℃时，溶解时间应≤15分钟，pH值应为6.57.1。

总蛋白含量：用双缩脲法，其标准为≥95％。

总蛋白中的牛血清白蛋白（BSA）含量：采用硝酸纤维素膜电泳法，其标准为≥95%。

BSA的净含量：总蛋白含量乘总蛋白中的BSA含量，其标准为≥90%。（3）酪蛋白：

应符合生产所需的质量标准。（4）标记用酶

应在产品的质量标准中明示所使用的标记用酶的名称（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等），同时应根据不同生产厂家的检验方法和质量标准进行检验，酶的纯度RZ值（OD403nm/OD280nm）应大于3.0。

对于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，还应进行功能性实验，即以其为原料配制一定浓度的稀释液作为样品，进行酶联免疫测定，均不能出现非特异性反应。

生物辅料的供应商同样要求相对固定，不得随意变更供应商。3.化学原材料

化学原材料的质量标准，包括外观、一般盐类检测、溶液pH值、溶解情况、干燥失重、炽灼残渣等，均应符合《中国生物制品主要原辅材

— 5 — 料质控标准（2000年版）》分析纯级别的要求，并且要适合于本企业的生产。

主要化学原材料的供应商要求相对固定，不得随意发生变更。化学原材料在购入时，原材料的生产商必须提供该批次化学原材料的质量保证材料和质量检验报告。

4.其他物料（1）酶标板 ①外观

明亮处用肉眼观察板条的外观质量，如有欠注、飞边、肮脏、表面光洁度差，底部有波纹及划伤等应剔除。②吸附能力和精密性 采用合适的方法进行检验。

一般用一定浓度的正常人免疫球蛋白G(IgG)包被板条，再用一定浓度的抗人IgG酶结合物吸附，通过显色反应，使用酶标仪读数，计算CV值。CV值结果应符合相关产品的功能性质量标准，一般批内CV≤5％，批间CV≤10％。

（2）液体试剂装量瓶

包括阴阳性对照、样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液等液体组分，均应有相应的装量瓶，并建立相应的质量控制标准，如不同的液体试剂所用的装量瓶规格、装量瓶的颜色、瓶盖的颜色等。

（3）其他材料

包括试剂瓶标签、粘胶纸、铝箔袋、衬垫、可密封塑料袋、说明书、干燥剂和包装外盒等，应参照国家食品药品监督管理局发布的《体外诊断试剂说明书编写指导原则》和《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定》建立相应质量控制标准。— 6 — 5.企业质控品

企业质控品一般包括阴/阳性参考品的符合率、灵敏度（最低检出量）、精密性、钩状效应（hook效应）等质控样品，对于定量检测试剂，还包括线性质控品样品。如该产品具有国家标准品或参考品，应使用国家标准品（参考品）进行标化；若该诊断试剂没有国家标准品（参考品），则企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

企业质控品的基质应与诊断试剂的待测样品的基质基本一致，如待测样品为血清/血浆，质控品基质也应为血清/血浆。

（三）试剂盒各组分的生产

酶联免疫法检测试剂主要组分的生产包括酶标记物的制备及滴配过程（酶工作液浓度确定）、各种工作溶液的配制、包被酶标反应板、分装及包装等步骤；并通过产品的半成品检验和成品检验两个质控过程来保证其质量符合规定。

1.各种工作液的配制

酶联免疫诊断试剂研制生产过程中所用的工作液一般包括：包被液、封闭液、阴性阳性对照、样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液、终止液等，对定量检测试剂，还包括标准品（或校准品）溶液。若阴性、阳性对照或其他液体组分涉及生物安全性问题，制备时应在相应的生物安全实验室完成。

各种工作液在配制过程中应严格按质量标准中的配方进行配制，充分混匀确保液体中的各种成分均匀，同时进行相应的质量检验并达到质量标准后，方可使用或分装。对于定量检测试剂，其标准品（或校准品）溶液应具有量值溯源性。

应对配制过程及配制的液体进行的质量控制，主要包括酶结合物的

— 7 — 功能性实验及稳定性；各种溶液的外观、pH值等；酶作用底物应测定在无相应酶的情况下自身显色的情况，并制定合理的限定指标；终止液应对其终止酶促反应的能力进行测定。

2.包被酶标反应板

包被前应对酶标反应板进行质量检验，如尺寸、外观、包装、吸附性能、精密性等，并记录酶标反应板的批号、数量、标识。酶标反应板经检验合格后方能用于包被。不同批号的板条不能混用。

选择经检验合格的包被原料（如抗原、抗体等），经一定的方法确定最佳包被浓度和酶结合物工作浓度，按照诊断试剂的生产规程，配制包被缓冲液、封闭液，经检验合格后，包被酶标反应板，经干燥后，已包被的酶标反应板用铝箔纸封闭（内臵干燥剂），保存于28℃。

应对包被过程进行相应的质量控制，如包被用原料（抗原或者抗体等生物活性原料）的质量检验、包被液和封闭液的质控（如配方、外观、pH值）、包被过程的监控（包括包被和封闭的体积、温度、时间等）、包被均一性检验、干燥过程的监控等。

3.分装和包装

样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液等溶液应严格按照质量标准中的量进行过滤后再分装，分装量的误差应小于5%。

分装及包装均应按照相应的标准操作规程要求进行。包装前，应严格检查试剂盒的品名、批号等，核对各试剂盒各组分的数量，并在关盒前进行复核。

（四）质量控制 1.半成品质量控制（1）半成品抽样

检验人员按试剂的批号，根据抽样申请单抽取规定数量的半成品各— 8 — 组分，作号标记、待检。

（2）半成品检验

根据试剂盒的企业标准或者制检规程进行半成品的检验。半成品检验，一般使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参考品）标化后的企业参考品。若某类试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

检验指标一般包括阴/阳性参考品的符合率、灵敏度（最低检出量）、精密性等，均应达到相应的质量标准要求。对于精密性，一般情况下CV不得高于15％（采用竞争抑制法的诊断试剂CV不得高于20％）。对定量检测试剂，同时应分析其线性相关系数和定量质控品检测结果的准确性。

企业应该对每一批试剂的半成品进行稳定性研究。试剂盒各组分应留样，28℃定期作稳定性考核，同时作37℃热稳定性试验，试验结果应符合产品的质量标准。

2.成品质量控制

产品包装完成后，质检人员根据试剂的批号、实际包装量、抽样申请单的要求进行抽样，同时填写抽样数量和抽样日期，并且由抽样人签名。抽样数量应包括检验用数量和留样数量。质检人员同时应检查相关原始记录。

每一批酶联免疫类检测试剂的试生产量应满足工艺研究、分析性能验证、稳定性研究、临床试验、自测及注册检验等各阶段所需样品量的要求。

（1）成品检验

成品检验时，一般使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参考品）标化后的企业参考品，并达到相应质量要求。若该诊断试剂没有国家

— 9 — 标准品（参考品），则使用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

（2）稳定性试验

在批放行前，每一批试剂应完成37℃热稳定性试验，试验结果应符合产品的质量标准。

四、名词解释

酶联免疫法：是指在酶标板上包被特定的抗原（和/或抗体）后，利用直接或间接的方法与待测样品中的相关抗体（和/或抗原）反应，形成的抗原抗体复合物再与相应的酶标记的抗体和/或抗原进一步反应，经过酶催化底物发生显色反应，由形成的颜色的强弱来判断样本中相应的抗体和/或抗原的存在。

五、参考文献：

1.《中国生物制品规程》（2000年版），化学工业出版社

酶联免疫方法 篇3

1材料和对象

1.1乙肝免疫复合物乙肝免疫复合物用酵母表达基因重组乙型肝炎疫苗(HBsAg,深圳生物工程公司出品,10μg:1ml/支)与高效价人乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG,华兰生物工程公司出品,200IU:2ml/支)按照1μg:10IU的比例配制的抗原抗体复合物。

1.2细胞免疫反应实验刺激物HBsAgMHCⅠ多肽,由北京赛百胜公司合成,溶于二甲基亚砜溶液,阳性对照刺激物:ConA(Sigma公司产品)。

1.3细胞免疫检测试剂和仪器淋巴细胞分离液和购自华美生物工程公司;1640培养基、胎牛血清为Sigma公司产品;IFN-yElispot检测试剂盒购自为Mebtech公司;Elispot自动检测仪为美国GE公司产品;

1.4研究对象:为乙型肝炎病毒慢性无症状携带者20人,男女各10人,签署知情同意书作为研究志愿者,首先经过全面体检,排除其它疾病,。

2实验方法

2.1乙肝免疫复合物注射时间和剂量:患者分为两组,每组10名患者,乙肝免疫复合物分别以HBsAg量5μg/次和10μg/次给受试志愿者进行腹部皮下注射,分别于免疫后1周、2周、4周抽静脉血10ml;按照淋巴细胞分离液说明书方法分离制备淋巴细胞悬液并计数,调整细胞浓度为5×106/ml,每孔加入0.1ml;阳性对照为ConA(浓度为1μg/ml),空白对照为不加细胞的培养基;检测孔为HBsAgMHCⅠ多肽(浓度为2μg/ml),阴性对照孔无刺激物。加样后的反应板于37℃5%CO2孵箱培养20～24小时后上机检测IFN-γ的细胞频数(SFC),计算法为:斑点数=刺激孔斑点数-对照孔斑点数[2]。

2.2检测结果判定:检测孔阳性标准:①对照孔SFC≤5时,样本孔SFC≥10;②对照孔5

3结果

3.1乙肝免疫复合物在免疫后不同时间的细胞免疫应答如图所示,免疫接种后,5μg/次剂量组IFN-γSFC在各个时间节点上均显著低于10μg/次剂量,两组相比有显著统计学差异;两组检测值均在两周是SFC最多,因此,乙肝免疫复合物选择10μg/次剂量是免疫效果最强,而在免疫后两周时检测最敏感。

4讨论

检测细胞免疫反应的方法许多,其中Elispot方法是国际公认的最为可靠的方法之一,具有较高的敏感性、特异性和稳定性,可重复性好,操作简单易行,而且在检测抗原特异性效应细胞数量的同时,也能反映其免疫功能强弱[1]。因此,可以作为乙肝免疫复合物免疫反应中检测细胞免疫反应的检测方法。

因为乙肝免疫复合物分子量大,首先应该被抗原提成细胞摄取、提成抗原给T细胞,才能完成细胞免疫;[2]而多肽刺激物直接刺激CD8+T细胞分泌IFN-7发挥抗病毒的作用。不同的刺激物浓度对检测水平有影响,比较的结果,终浓度2μg/ml时,反应达到稳定水平,作为继续研究的最佳检测实验条件。通过本研究初步建立了乙肝免疫复合物注射后慢性乙肝病毒携带者细胞免功能研究的基本检测方法。

摘要：目的:构建乙肝免疫复合物作为治疗性乙肝疫苗的细胞免疫功能检测方法并摸索最佳试验条件。方法:选择乙肝病毒携带者10人,用酶联免疫斑点实验方法检测外周血淋巴细胞分泌IFN-γ的细胞频数(SFC);探索最佳实验条件。结果:该方法用于免疫复合物作为治疗性疫苗治疗乙肝病毒携带者的免疫功能检测,最佳免疫剂量为10μg组;初次注射后4周患者的SFC开始下降。结论:检测淋巴细胞分泌IFN-γ的细胞频数(SFC)的酶联免疫斑点实验方法可以作为乙肝免疫复合物作为治疗性乙肝疫苗治疗乙肝病毒携带者的细胞免疫功能检测,并且证明其有良好的重复性。

关键词：免疫复合物,乙肝疫苗,细胞免疫,检测方法

参考文献

[1]尚小英,庞学雯,张华刚,等。酶联免疫斑点法检测抗原特异的CTL免疫应答实验条件的优化,中华微生物学和免疫学杂志,2002,6,23~25

酶联免疫方法 篇4

酶联免疫法快速检测牛乳中的三聚氰胺操作视频配音稿

准备好物品后即可进行检测操作，首先进行样品处理。取1mL纯牛奶样本，加入一根小试管，再加1mL去离子水，涡动1min混匀；取出40μL牛奶溶液，加入另一根小试管，再加入960μL样本稀释液稀释，涡动1min混匀。

接下来，吸取50μL牛奶样本到微孔中，做2孔平行，并记录所在位置。再取三聚氰胺标准品各50μL到微孔中，也做2孔平行，并记录所在位置。然后，每孔各加50μL酶标物，每孔再加入抗试剂50μL，轻轻振荡均匀，用盖板膜盖板，置25℃避光环境中反应30min。

取出微孔板，小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，每孔加入洗涤液250μL，充分洗涤4次，每次间隔10s，用吸水纸拍干。接下来各孔加入底物液A液50μL，再每孔加入底物液B液50μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，置25℃避光环境反应15～20min。取出微孔板，每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值。

测定完成后我们得到了三聚氰胺标品和样本的吸光度平均值，如表格所示。首先进行三聚氰胺的定性分析，根据样本的吸光度值1.870，可以得出它的三聚氰胺浓度范围为1ppb-3ppb，再乘以稀释倍数50得出此纯牛奶中三聚氰胺的浓度为50ppb-150ppb。

接着我们进行三聚氰胺的定量分析，先计算百分吸光率和三聚氰胺浓度的对数，如表格中所示。

酶联免疫方法 篇5

目前, 高效液相色谱法[12,13,14]、液相色谱-串联质谱法[5,15,16,17]等仪器分析方法被广泛应用于阿维菌素的残留分析, 但样本前处理繁琐、费时、费力、成本高, 且需专业人员操作, 很难满足对样本进行现场、批量、快速检测的需要[1,2,3,4,5]。而酶联免疫方法具有灵敏度高、设备成本低、特异性好、操作简便快速、可实现大量样本的批量检测等特点, 有利于检测工作的广泛开展。目前, 在阿维菌素的酶联免疫分析方面, 王硕等[18]进行了阿维菌素半抗原的合成及多克隆抗体的制备研究;Shi W等[19]研究报道了牛肝组织中阿维菌素、伊维菌素、依立菌素的多残留检测间接竞争ELISA;杨君宏等[20]建立了一种检测牛组织中阿维菌素类药物残留的间接竞争ELISA方法;赵卫东等[21]运用酶联免疫法建立定量检测动物源性产品中阿维菌素残留的方法;但目前尚未有在蔬菜残留检测中应用酶联免疫方法的报道。为了给现场监控农药残留提供科学参考, 该文拟建立一种灵敏、快速地检测蔬菜中阿维菌素残留的酶联免疫吸附方法[1,2,3,4,5]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试材料为6~8 周龄雌性Balb/c小鼠 (清洁级, 由北京勤邦生物技术有限公司实验动物室提供) 。

仪器有KS-Ⅱ振荡器 (上海跃进医疗器械厂) ;QL-901漩涡混合器 (海门市其林贝尔仪器制造有限公司) ;8010S匀浆机 (上海斯伯明仪器设备有限公司) [1,2,3,4,5];Anke TDL-40B低速离心机 (上海安亭科学仪器有限公司) [1,2,3,4,5,6,7];微量移液器 (单道20~200、100~1 000 μL, 多道20~300 μL, 美国Thermo公司) [1,2,3];2000SBL电子天平 (美国Setra公司) ;DSY-Ⅲ氮吹仪 (北京金科精华苑科技有限公司) ;MK3 酶标仪 (美国Thermo公司) ;DHP -600 生化培养箱 ( 天津市中环实验电炉有限公司) ;均质器。

试剂有阿维菌素标准品 (纯度≥99%) 、重铬酸吡啶、羧乙基羟胺、N, N-二甲基甲酰胺 (DMF) 、碳化二亚胺 (EDC) 、N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 、卵清蛋白 (OVA, 购自美国Sigma公司) 、牛血清白蛋白 (BSA) ;其他常规化学试剂 (分析纯, 购自北京化学试剂公司) [1,2,3,4,5,6]。

1.2 试验方法

1.2.1 合成半抗原。1氧化:取2.0 g阿维菌素溶解于40 m L吡啶中, 加0.8 g重铬酸吡啶于60 ℃反应3 h, TLC检测, 基本反应完全, 抽滤, 蒸干滤液, 乙酸乙酯溶解, 柱层析纯化, 得到酮基阿维菌素。2缩合:将得到的酮基阿维菌素用乙醇溶解, 取0.42 g羧乙基羟胺用4 m L水溶解后加入到乙醇溶液中, 加适量三丁胺催化, 60 ℃搅拌4 h, 检测, 原料基本反应完全, 蒸干乙醇, 水-乙酸乙酯萃取, 得到粗产物, 二氯甲烷与石油醚1∶2 重结晶, 得到半抗原产物。

1.2.2 制备人工抗原。1制备免疫原:取半抗原5 mg溶解于1 m L DMF中, 用0.2 m L水将30 mg EDC和30 mg NHS充分溶解, 再将其加入半抗原溶液中, 室温下搅拌24 h, 得到反应液 Ⅰ[1,2,3,4,5];用3.8 m L PBS (p H值7.2) 充分溶解50 mg BSA, 将反应液Ⅰ逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中[1,2,3,4,5], 于室温下搅拌24 h, 用0.01 mol/L PBS 4 ℃透析3 d, 透析液每天换3次, 可得免疫原, 分装, 保存于-20 ℃条件下, 备用。2制备包被原:将BSA替换为OVA, 其余步骤同1。

1.2.3 制备酶标单克隆抗体。按照常规方法免疫Balb/c小鼠制备腹水抗体, 用饱和硫酸铵法纯化后备用[1,2,3,4,5,22]。采用过碘酸钠氧化法[1,2,3,4,5,23], 单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记, 合成酶标单克隆抗体。

1.2.4 直接竞争酶联免疫方法的建立。将包被原包被在96孔酶标板上, 100 μL/孔, 放置于4 ℃条件下过夜;倾去板中溶液, 用PBST洗涤3 次, 加入封闭液, 200 μL/孔, 于37 ℃温育2 h;洗涤3 次, 加入系列浓度的阿维菌素标准溶液[1,2,3,4,5], 100 μL/孔, 再加入酶标单克隆抗体溶液, 50 μL/孔, 于25 ℃避光反应0.5 h;洗涤4~5 次后加入底物液A液 (过氧化脲) 50 μL/孔和B液 ( 四甲基联苯胺) 50 μL/孔, 25 ℃ 显色15min, 加入2 mol/L H2SO4终止液50 μL/孔[1,2,3], 设定酶标仪于450 nm处测定没空吸光度值 (OD值) 。

1.2.5 绘制标准曲线。采用直接竞争ELISA方法建立标准曲线。分别选择0、1、3、9、27、81 μg/L阿维菌素标准品, 以0 μg/L时的OD值为B0值, 其他质量浓度的OD值为B值, 以标准品质量浓度的对数值为横坐标, 百分吸光度值 (B/B0) 为纵坐标, 用RIDASCREEN软件分析[1,2,3,4], 绘制标准曲线。

1.2.6 样本前处理方法的建立。在50 m L聚苯乙烯离心管中加入 (1.00±0.05) g已均质的样本, 再加入甲醇4 m L, 用涡旋仪涡动5 min, 混匀;3 000 g 20~25 ℃ (室温) 条件下离心5 min;取上层澄清液于1~10 m L玻璃试管中, 于50~60 ℃水浴氮气流下吹干[1,2,3];加入复溶工作液1 m L[1,2,3,4,5], 用涡旋仪涡动30 s, 混匀;取100 μL, 待测。

1.2.7 ELISA方法技术性能的评价。①敏感性试验。通过测定20次标准曲线的IC50, 统计其平均值和浮动范围;并测定20个空白样本[1,2], 求出其B/B0在标准曲线上对应浓度的平均值和标准差 (S) [1,2,3,4,5], 方法检测限。②添加回收试验。以5、10、20μg/kg阿维菌素标准品分别对空白白菜、黄瓜、胡萝卜样本进行添加回收试验, 每个浓度做5个平行, 用3个批次的试剂测定, 分别计算回收率和批内、批间变异系数。ELISA测定的准确度以回收率表示, 精密度以变异系数表示。③特异性试验。选择与阿维菌素具有类似结构和类似功能的药物埃普菌素、伊维菌素、多拉菌素进行交叉反应性检测。计算公式如下:交叉反应率 (%) =A/B×100, 式中A、B分别表示引起50%抑制的阿维菌素质量浓度、引起50%抑制的其他药物质量浓度, 单位均为μg/L[1,2,3,4,5]。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

以标准品质量浓度的对数值为横坐标, Logit (B/B0) 为纵坐标, 建立标准曲线, 如图1 所示。将图1 转换后可知, 在1~81 μg/L范围内, Logit (B/B0) 与标准品质量浓度对数的线性关系良好, 如图2 所示, 得回归方程Y=-2.103 1X+1.247 2, R2=0.999 0, IC50为4.1 μg/L。

2.2 敏感性试验

统计20 次标准曲线的IC50平均值为5.6 μg/L[1,2,3,4,5], 浮动范围为3.9~6.0 μg/L;20 个空白样本的B/B0在标准曲线上对应添加量的平均值和标准差如表1 所示。经综合考虑, 该方法对蔬菜样本的检测限为5.0 μg/kg。

2.3 添加回收试验

如表2 所示, 对蔬菜样品的加标回收率范围为74.8%~105.6%, 可见方法准确度较高[1,2,3,4,5];批内变异系数范围、 批间变异系数范围分别为7.5%~12.4%、8.8%~13.2%, 均小于15%, 可见方法精密度 (重复性) 良好。

2.4 特异性试验

如表3 所示, 选用的抗阿维菌素单克隆抗体与埃普菌素有130.6%的交叉反应, 与伊维菌素、多拉菌素的交叉反应分别为33.1%、<10%。阿维菌素与伊维菌素、埃普菌素之间有一定的交叉反应[1,2,3,4], 因此该方法还可以同时用于检测伊维菌素、埃普菌素。

3 结论与讨论

该研究成功制备出阿维菌素单克隆抗体, 初步建立了蔬菜中阿维菌素检测的酶联免疫吸附法。该方法的IC50浮动范围、对蔬菜的检测限分别为3.9~6.0、5.0μg/kg;样本添加回收率、变异系数分别为74.8%~105.6%、7.5%~13.2%, 检测时间45 min, 省时、省力、省成本, 适合于快速筛选大量样本中残留的阿维菌素[1,2,3,4,5,24,25,26,27,28]。

酶联免疫方法 篇6

1 资料与方法

1.1 一般资料:

本组选择在2013年7月至2014年7月, 通过临床检查确诊为肿瘤的患者50例, 进行肿瘤标志物进行筛查是阴性, 其中男性28例, 女性22例, 年龄在32~66岁, 平均年龄49岁。肺癌21例, 胃癌14例, 肝癌15例。选取健康的志愿者50名, 其中男性27名, 女性23名, 年龄36~69岁, 平均年龄52.5岁, 经过检查健康状况良好, 经过其同意可以进行接下来的检测。获得的样品均当天采集后进行离心处理。

1.2 双夹心免疫吸附试验步骤

1.2.1 制备过程:

将鼠的抗肝素酶单克隆抗体包被于p H值为9.6的Na2CO3-Na HCO3的缓冲溶液中, 从中取出50μL的液体置于96孔酶标板中, 在4℃条件下放置18 h, 并用p H值为7.4的磷酸缓冲溶液反复冲洗干净, 置于有20 g/LBSA的磷酸盐缓冲液进行96孔酶标板封闭1 h, 随后反复冲洗3~5次后, 处于4℃环境下保存待用。

1.2.2 反应过程:

在96孔酶标板中分别加入200μL的血清样品, 相同血清样品重复做三个, 在室温环境下放置2 h, 随后反复冲洗5次后, 在向其中加入兔的抗肝素酶多克隆抗体100μL, 处于室温环境下放置2 h, 反复冲洗5次。将100μL稀释到20000倍的HRP标记羊抗兔Ig G置于酶标板微孔中, 在室温环境下放置1 h, 最后加入TMB显色底物50μL放置半个小时, 随后用硫酸100μL结束反应进程。在D450 nm及D603 nm条件下应用酶标仪进行检测。

1.2.3 酶联免疫吸附试验方法及其作用原理。

(1) 酶联免疫吸附试验的基本原理:酶和相应的抗体及抗抗体分子进行共价结合, 共价键的结合特点就是不影响及改变抗体的免疫学性质, 对生物学性质也不产生妨碍。被酶标记抗体可以和被吸附在相应载体上的抗原抗体进行连接。在上述溶液中加入底物, 酶可以使底物的没有颜色的还原型的供氢体转变成有颜色的氧化型的状态, 呈现出颜色的变化来反应体系的进程。为此可观察反应体系的颜色变化来判断免疫反应是否发生。在反应体系中, 呈现出的颜色深浅程度和样品中的抗体抗原的量有关, 相应的抗原抗体量多, 反应的颜色就较深。这种颜色深浅的变化可以通过酶联免疫吸附试验的检测仪器来定量测定检测[2]。 (2) 酶联免疫吸附试验, 在免疫技术中应用广泛, 其常用方法有双抗体夹心法及间接法, 双抗体夹心法主要应用于分子量大的抗原检测, 间接法多用于特异性抗体的测定。双抗体夹心法主要分为四个步骤, 首先要进行特异性的抗体和载体想结合, 反复洗涤去除杂质, 然后加入需要检测的样品, 并使之平衡一段时间, 目的是使样品中的抗原和相应的抗体结合上, 同样需要洗涤掉未结合的抗体以及杂质等。第三步需要加入酶标物, 使上述免疫结合物的抗原和酶标物进行连接, 同样进行洗涤的步骤清除杂质。酶量和样品中的要进行检测的物质量有关系。最后将底物反应变成有色的物质, 并根据颜色的深浅程度对进行定量判断[3]。

1.4 统计学处理:

选用SAS统计软件分析处理实验数据, 对每个样品的3个重复实验计算平均值及标准偏差, 对稳定性进行评估。分析健康患者血清D值的状况, 肿瘤患者血清D值的状况, 对两组的血清肝素酶的水平进行对比, 比较其差异水平, 确定此种方法对血清肝素酶的检测对辅助肿瘤的临床价值。

2 结果

对每个样品平行测定三次进行平均值的计算, 并计算微孔间的标准差都<0.019, 且相对标准偏差也要<9.0%, 从统计结果来看检测方法稳定, 可靠。经过数据处理:50名健康志愿者的血清肝素酶的D值呈现正态分布趋势, 其平均值是0.094, 处于95%置信区间内其范围在0.067~0.106。50例肿瘤的患者, 血清肝素酶的D值也呈现正态分布趋势, 平均值是0.178, 处于95%置信区间内其范围在0.152~0.191。经两组数据进行比较, 存在显著性差异, 通过对血清肝素酶D值的检测, 肿瘤患者的D值要比健康志愿者的D值明显增高。

3 讨论

肝素酶和肿瘤的产生及变化有着密切的关系, 尤其肿瘤处于转移阶段的患者体内肝素酶的水平和肿瘤的动态变化息息相关。为此, 对肿瘤患者血清肝素酶的有效检测, 可以辅助肿瘤的诊断, 用于评价其恶化程度。但就目前的研究状况来说, 因为血清中的肝素酶的存在量很低, 而且又存在特异性的免疫性质, 反应性好的抗体价格很高, 限制了此种方法的发展。现在, 在国内及国外市场上并没有相应的检测试剂盒, 相关的研究报道也很少见。因此, 研究一个可以有效的检测血清肝素酶的办法对肝素酶的发展起到很重要的作用[4]。搭建灵敏度高, 重现性好的酶联免疫吸附试验第一个需要解决的问题就是筛选出适合的抗体, 本研究综合考虑了实验准确率及成本的因素, 最终筛选出用鼠抗肝素酶单克隆抗体及兔抗肝素酶多克隆抗体, 并采用双抗体夹心法进行先关研究, 最后得到的结果稳定好, 重现性也较好。和别的检测方法比较, 此种检测方法具有材料选择简便, 操作简单的优点, 而且定量精准, 可以影响定量的因素少, 对于免疫组化及原位PCR等方法, 会因为选取的部位不同, 选取的样品大小不一或是人为的一些因素对检测的结果影响很大, 此两种方法需要在患者的身体上得到肿瘤的样本或是一些癌症组织, 进行这样的处理给患者的身体及心理上造成很大影响, 产生较大负担。采取双抗体夹心法不仅不会给患者带来身体上的伤害及心理上的负担, 还在准确及重现性上体现出自身方法的优点。最重要的是双抗体夹心方法操作简单易学, 可以动手完成也可以用仪器机械化完成, 更有利于肿瘤的筛查。本组对50例肿瘤患者的血清肝素酶水平进行检测, 其水平值显著高于健康志愿者的血清肝素酶水平值, 这一结果和国外对血清肝素酶水平的研究结果趋势相同, 这一结果可以在一定程度上说明可以选择血清肝素酶代替组织肝素酶的检测。

酶联免疫吸附试验是到目前为止使用最广的一项技术, 特异性的将抗原抗体相结合, 并使之酶的催化底物进行有效的结合起来, 检测血清中微量的肝素酶, 在操作的过程中需要对样品进行采集、保存, 准备相应的试剂, 随后进行加样品, 显色比色等步骤, 如果其中一个步骤出现人为的操作问题都会影响结果的准确性。显色这一步骤对酶联免疫吸附的方法得到的结果影响较大。目前来讲, 常用的测定显色物质是四甲基联苯胺及过氧化氢, 在辣根过氧化物酶的作用下, 产生颜色的变化。所以, 目前把研究重点放在肿瘤患者血清肝素酶水平上的研究是十分有意义的, 可以评估患者肿瘤的变化情况, 为临床的诊断提供了很好的参考和有力的依据。

参考文献

[1]田曙光, 虞立霞.酶联免疫吸附试验定量检测血清肝素酶方法的建立及应用[J].生物技术通讯, 2009, 20 (4) :545-546.

[2]王晓秋.酶联免疫吸附试验在蛋白质/多肽类药物药代动力学研究中的应用[J].中国药理学与毒理学杂志, 2013, 27 (3) :534-535.

[3]尹利民.动力学法在酶联免疫吸附试验定量检测中的应用[J].检验医学与临床, 2012, 9 (7) :852-853.

酶联免疫方法 篇7

酶联免疫分析法 (ELISA) 是一种将抗原或抗体吸附在固相载体表面, 加入酶标抗体或抗原, 使抗原抗体反应在固相载体表面进行, 形成酶标记的免疫复合物, 经过洗涤后, 游离的酶标抗体或抗原被冲掉, 而形成的酶标记免疫复合物不能被冲掉, 加入底物显色, 颜色的深浅与待测抗原或抗体的量相关, 借助分光光度计的光吸收计算抗原 (抗体) 的量[2]。此法具有简单、快速、处理量大、灵敏度高、特异性强等特点, 列入我国相关行业标准[3], 被广泛应用于水产中呋喃唑酮残留检测。另外, 此法影响因素较多, 容易出现假阳性、重现性不好、回收率不稳定等问题, 影响最终的测定结果。本位对其影响因素进行分析, 探索减少或消除各种不利因素的控制方法, 应用到检测日常工作中, 是检测结果更加准确和稳定。

1 样品采集保存

呋喃唑酮检测的水产品大多为各种鱼类和甲壳类, 在采样和备样的过程中要注意以下四点:

1.1 应尽量采集鲜活的水产品

因为腐败菌会分解抗原蛋白, 酶促反应影响标记酶的特异性, 酸度增加p H值下降影响特异性酶的活性。

1.2 样品采集后应当密封

防交叉污染, 样品保存在阴凉避光处, 并在0~5℃的条件下送达实验室, 以免样品在高温下腐败变质。

1.3 制备样品时

水产品要去皮、去壳、剔骨取肌肉部分, 用绞肉机绞碎, -18℃以下冷藏保存。

1.4 待测样品不宜反复冻融

反复冻融会破坏样品的细胞结构, 使细胞液流失, 从而降低样品中待测物的浓度。

2 试剂的制备

试剂的制备必须要准确和纯净, 避免试剂中的杂质污染样品, 只有这样才能保证样品的纯净, 所以我们在制备试剂时要注意以下细节:

2.1 使用的容器必须是干净和干燥的

防止容器内的残留物质污染试剂。

2.2 溶剂要使用经过处理的纯净水

因为自来水残留的氯会影响酶联免疫反应。

2.3 试剂的浓度和体积要拿捏得非常准确。

2.4 试剂最好是现配现用

以免试剂在存放的过程中发生其他化学反应而发生变质。

2.5 稀释试剂时要先加稀释液再加稀释物

并且要充分均合均匀后再使用。

3 样品的前处理

样品的前处理目的是祛除样品中的杂质, 保留且浓缩待测物。为了更好地提纯待测物, 以下的关键步骤需要特别留意:

3.1 样品加入有机溶剂后要充分振荡使待测物更好地溶入有机溶剂中。

3.2 为了减少共萃取物对测定的干扰需要对样品进行液-液分离的净化处理。

3.3 保持恒定的温度37℃孵育16h不断变化的温度会影响呋喃唑酮的衍生。

3.4 氮吹样品必须要把有机溶剂吹干以达到快速富集的目的。

3.5 溶解干燥物时要先用正己烷脱脂再加入提取液提取。

4 洗板

洗板对于ELISA测定来说是极其关键的, 它虽然不是其中的一个反应步骤, 却决定着酶联免疫反应结果的成败。洗板的目的是洗去反应液中未与固相抗原-抗体结合的物质, 保证ELISA测定的特异性。

4.1 吐温20洗液含有亲水和疏水基团

其疏水基团与被动吸附于聚苯乙烯固相蛋白的疏水基团形成疏水键, 从而削弱蛋白质与固相蛋白的吸附, 同时其亲水基团与水分子结合, 促使蛋白质脱离固相蛋白, 从而达到洗脱非特异性吸附物的目的。

4.2 洗涤微孔板时要垂直甩水

在吸水纸上轻轻拍干, 每拍一次水就换一张吸水纸, 防止交叉污染。拍板时要用力均匀而且不要用力过猛, 以免出现抗原-抗体结合物脱离微孔板。

综上所述, 采用酶联免疫法进行水产中呋喃唑酮代谢物AOZ残留检测, 其操作步骤简单快捷, 但影响因素较多。通过对样品采集保存、试剂的制备、样品的前处理、洗板等关键步骤进行控制, 可以减少误差, 提高检测方法的灵敏度、准确度、精密度, 提高检测结果的准确性和重现性。因此, 在日常检测工作中要时刻注意每一个关键步骤的操作, 避免出现人为误差, 为监督水产品质量安全提供可靠的数据。

摘要：酶联免疫法 (ELISA) 检测水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ残留量具有简单、快速、处理量大、灵敏度高、特异性强等优点。但由于此法影响因素较多, 通过控制样品采集保存、试剂的制备、样品的前处理、洗板等关键步骤进行控制, 减少误差, 提高检测方法的灵敏度、准确度、精密度, 提高检测结果的准确性和重现性。

关键词：酶联免疫法,呋喃唑酮,影响因素,关键步骤,控制方法

参考文献

[1]余孔捷, 等.水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ的检测能力验证分析[J].分析实验室, 2012, 31 (7) :40-42.

[2]庞国芳, 等.农药兽药残留现代分析技术[M].北京:科学出版社, 2007:115.

酶联免疫方法 篇8

1 材料和方法

1.1 标本

来源为2009年至2010年来本院住院和门诊的患者,随机抽取50例血清标本。

1.2 仪器和方法

酶联免疫法使用雷勃酶标仪(MULTISKAN MK3)试剂使用上海科华。化学发光免疫法使用西门子全自动化学发光仪(ADVIA Centaur XP)和配套试剂,采用吖啶酯为发光底物,采用双抗体夹心法[3]。

1.3 统计学处理

采用统计学软件包SPSS11.0进行分析处理,所得数据以均数±标准差(x±s)表示,以p<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 线性实验

将标准液按不同浓度稀释后做线性实验,结果显示ELISA法和化学发光法呈良好的线性关系,见表1。

2.2 对比实验

用ELISA法和化学发光免疫法同时对血清标本进行定量分析,结果表明,两法差异无统计学意义(p>0.05),相关系数r=0.996,提示两法呈良好相关性,见表2。

2.3 精密度实验

用两种方法对低、中、高质控品分别进行精密度实验,表明化学发光免疫法重复性好于ELISA法,特别是病理高值化学发光免疫法明显优于ELISA法,见表3。

3 讨论

化学发光免疫技术既具有发光检测的高度敏感性,又具有高度特异性[4],是公认快速、精确、重复性好且安全无毒的方法。ELISA法也以快速、简便实效而被广泛应用[5~7]。我们检测AFP结果指示化学发光法和ELISA法之间差异无统计学意义(p>0.05)相关性好r=0.996.通过比较显示化学发光法线性范围宽,精密度等方面明显优于ELISA法,因此我们认为化学发光法可广泛应用于临床项目的检测[8]。

摘要：目的:探讨两种方法检测AFP的优缺点。方法:采用西门子全自动发光免疫分析仪和雷勃酶标仪。结果:化学发光法和ELISA法之间差异无统计学意义(P>0.05),相关性良好(r=0.996)。结论:化学发光法的精密度和准确性均优于酶联免疫法。

关键词：化学发光免疫法,酶联免疫法,甲胎蛋白

参考文献

[1]崔锐.肿瘤标志物在良性疾病中浓度观察[J].放射免疫学杂志,2004;17(2):138

[2]陶义训.免疫学和免疫学检验.第二版.北京:人民出版社.1997,174

[3]章谷生.发光分析和发光免疫技术.余传霖.现代医学免疫学.上海:上海医科大学出版社.1999,16

[4]张丽民.化学发光标记及发光免疫分析.基础医学与临床,1995;15(4)::247

[5]张强,雷清.乙肝表面抗原大蛋白在基层医院的应用.中国医药导刊,2008;(8):1249～1250

[6]邢文革,马嵘.HIV抗体快速检测试剂的临床评估.中国医药导刊,2004;(4)::208～292

[7]李金明.临床酶免疫测定技术[M].北京:人民军医出版社.2005,217

酶联免疫方法 篇9

目前酶联免疫吸附法 (ELISA) 因其具有的灵敏度高, 重现性好, 检测成本低, 操作简单, 样品处理量大等特点, 已成为国内应用最广泛的兽药及违禁添加快速检测方法之一。它是将抗原结合到某种固相载体表面 (酶标板) , 让受检药物和酶标抗原与固相载体上的抗原反应一段时间后, 洗去多余的酶标抗原和杂质, 加入底物显色, 根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高, 可以极大的放大反应效果, 从而使测定方法达到很高的敏感度。

ELISA检测对反应条件要求严格, 在检测过程中每一个步骤都有可能对检测结果产生较大影响, 致使同一批次的样品重现性不好或者出现假阴性、假阳性, 这影响到检测结果的准确性, 对此要采取一些相应的预防措施, 以提高检测结果的准确性。

1 ELISA试剂盒的保存

光照的影响试剂盒储存和反应时, 均应避免直接暴露在阳光下, 底物液和部分标准品对光敏感。试剂盒储藏时要在2~8℃温度条件下保存, 忌冷冻, 未使用完的试剂盒应注意把板条放入铝箔袋封口, 并放入干燥剂小袋, 以避免板条受潮失效。

2 检测前准备工作

2.1 检测室温度

试剂盒最佳的检测温度应在20~40℃之间, 温度过高或过低都会降低酶的活性, 而酶活性的降低会影响测量的准确性。试剂盒打开后, 在室内温度下至少平衡半小时, 如果室温低于20℃须在25℃的培养箱中回温。回温后于室温25℃±2℃使用, 使用时应避免阳光直射, 空调或风扇直吹。

2.2 溶液配制

在整个实验中所使用的水均需是蒸馏水。在配制样品提取液和洗涤液时一定要用蒸馏水或去离子水, 不可使用矿泉水或自来水, 否则, 里面的金属离子会对检测结果产生干扰。

2.3 移液枪的使用

加样的枪头需使用一次性的, 微量枪头清洗不干净, 很容易有药物残留, 重复使用会造成交叉污染。检测员在使用八道移液器时, 在吸取时按至第二停点, 将吸头没入试剂液面下2~3 mm, 轻缓松开按钮回原点, 慢慢提出吸头并在容器壁上停靠一下, 以去除多余试剂, 轻按按钮至第一停点, 排出液体, 保持手势不动, 再次将吸头没入试剂液面稍停片刻按至液面下2~3 mm, 轻缓松开按钮回原点, 此即为“吸二打一”式加样, 避免加样时产生气泡, 导致加样不均。加试剂时, 移液器要保持垂直;吸头有试剂时, 移液器不能平放或者倒置, 避免污染移液器, 进而污染其他试剂和样品。

3 检测仪器对检测结果的影响

3.1 酶标仪的影响

仪器每年均需要检定, 以保证仪器的准确性。酶标仪在使用前需预热30 min, 在室温条件下测定, 室温低于15℃时, 需使用加热等方式使室温保持25℃左右, 以确保酶标仪的正常运行。

3.2 微量移液器的影响

微量移液器需每年进行检定, 检定合格方可使用。微量移液器要有机相、水相分开, 贴上标签。在量取不同溶剂需更换枪头, 避免交叉使用造成污染;试剂从试剂瓶中吸出后, 不能再放回瓶中, 防止试剂污染。

4 检测员的操作对检测结果的影响

对于ELISA试剂盒来说, 检测员的熟练度对结果影响很大。检测人员上岗前需进行相关培训, 需具备基本的检测质控知识。熟练掌握ELISA检测方法的原理, 试验检测的目的, 检测员需保持认真负责的工作态度, 在实验前熟读试剂盒说明书, 对试验中的注意事项、重点难点加以标注, 特别要注意:标准品或抗体是否需要稀释、孵育温度是25℃还是37℃、酶标二抗、抗体工作液、底物液、终止液的加样顺序和时机 (试剂顺序加反通常会造成酶标板不显色, 使实验失败) 、酶标仪检测波长是双波长还是单波长。

5 关键点控制

5.1 样品前处理

样品前处理需根据试剂盒说明, 不同的样品种类有不同的处理方式。有些检测项目需要氮气吹干的方式浓缩富集药物, 在实际操作中, 除非试剂盒说明要求吹至尽量干, 否则只要吹干即可。某些样品 (肝脏样品) 剩余一些油脂很难吹干, 这些油脂干扰可以通过下一步的正己烷溶解去除。氮吹时间过长会造成药物损失严重, 回收率降低, 所以在氮吹时应随时查看吹干情况, 吹干后应尽快加溶剂复溶。

5.2 加样

不管什么试剂, 加样前均需摇匀, 加样时需将处理好的样液加在孔板底部, 避免加在孔壁上部。

5.3 洗板

洗板是关系到实验成败的关键步骤。ELISA通过洗板去除未结合抗原抗体和酶标记物, 同时也可以去除非特异性吸附的蛋白质干扰及样本中的部分杂质干扰。

手动用排枪洗板时需注意, 要垂直悬空加入液体, 吸打液体速度不能过快, 以免液体溅出, 造成交叉污染, 按照规定的洗涤液体积进行洗板, 注意不要出现孔间相溢现象。洗液尽量不要满溢或加到板孔外面, 若洗液不小心加到外面, 需用洁净无毛屑的滤纸沾干, 避免板底不洁净, 造成酶标仪读数出现误差。

5.4 孵育

孵育、显色过程中要在恒温箱里避光进行, 以保持温度的稳定。显色时间、温度需按试剂盒的规定来操作, 加完试剂后将微孔板从室温放入恒温箱时, 孔内温度从室温升至恒温箱温度需要一定时间, 尤其在室温比较低的状态下, 这段升温时间可能比较长。通常是将微孔板一放入恒温箱就开始计时, 这样就容易造成实际测定时孵育时间不够, 导致弱阳性样品测不出来。若温度相差大时, 可以适当延长孵育时间2~5 min。孵育时应盖封口膜, 否则会使孔内反应液蒸发, 导致孔板难以彻底洗净影响检测结果。

5.5 显色

底物液过期或配制时间过长也是影响实验结果的重要因素。尽可能在使用前配制底物液, 底物液禁止接触金属物品。加完底物液后的孵育时间依各孔颜色而定, 若反应时间到了, 但酶标板各孔颜色普遍较浅, 可继续显色5~10 min。

5.6 酶标仪判读结果

ELISA试剂盒内显色剂多为TMB (3, 3, 5, 5, -四甲基联苯胺) , TMB颜色底物显色后, 随着时间的延长, 颜色会逐渐消退, 因此显色并终止反应后必须尽快读数, 以免影响检测结果。测定波长一般为450 nm, 有的厂家会设有参比波长630 nm, 使用双波长可以消除试样的背景吸收干扰和混浊干扰。

综上所述, 尽管ELISA法操作简单, 但可能影响检测结果的因素也较多。故在实验操作中, 需严格按照试剂盒操作步骤操作, 同时做好室内质控、室间比对, 以严谨的工作态度对待每一份样品, 避免或减少影响因素的干扰, 力求结果准确, 为进一步加强畜产品质量监管提供可靠的数据支持。

摘要：酶联免疫吸附法 (ELISA) 因其具有的灵敏度高, 重现性好, 检测成本低, 操作简单, 样品处理量大等特点, 已广泛应用于兽药残留及违禁添加药物的快速检测。ELISA虽然操作简单, 但试验操作中各环节对试验的检测结果影响较大, 如不注意, 很可能导致显色不全、重现性不好、假阳性或假阴性的结果。本文对影响ELISA试验的常见因素进行分析并总结出解决方法, 以提高检测的准确性。