酶联免疫吸附实验

酶联免疫吸附实验（共8篇）

酶联免疫吸附实验 篇1

摘要：酶联免疫吸附剂测定(ELISA)方法作为主要生物技术广泛应用于样品抗原抗体免疫检测,已成为一种医学诊断工具,酶标仪已成为临床实验室常备设备。系统介绍了酶联免疫吸附和检测原理,酶标仪(ELISA Reader)的工作原理和结构、日常维护及故障维修方法。

关键词：仪器,酶标仪,实验,维修

1 酶联免疫吸附和检测原理

1.1 酶联免疫吸附酶原理[1]

标联免疫吸附方法简称酶标法(ELISA)，是标记技术中的一种，是从荧光抗体技术，同位素免疫技术发展而来的一种敏感、特异、快速且自动化的现代技术。酶标法的基本原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。这种方法使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留了其免疫活性，又保留了酶的活性。

1.2 检测原理

在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。

用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。由于此技术是建立在抗原-抗体反应和酶的高效催化作用的基础上，因此具有高度的灵敏性和特异性，是一种极富生命力的免疫学试验技术。

1.3 ELISA测定样品体积一般要求

ELISA测定样品一般要求测试液的最终体积在250μl以下。

2 酶标仪(ELISA Reader)的工作原理及结构

2.1 酶联免疫检测仪（ELISA Reader)

酶联免疫检测仪(简称酶标仪)是酶联免疫吸附实验的专用仪器。酶标仪可分为单通道和多通道2种类型，单通道又有自动和手动2种。自动型的仪器有X、Y方向的机械驱动机构，可将微孔板L的小孔依次送入光束下测试，手动型则靠手工移动微孔板来进行测量。在单通道酶标仪的基础上又发展出了多通道酶标仪，此类酶标仪一般都为自动化型的，它们的工作原理基本一致，其核心都是一个比色计，即用比色法来分析抗原或抗体的含量。

2.2 手动型和全自动型

2.2.1 手动型酶标仪

手动型靠手工移动微孔板来进行检测，手动型一般为单通道酶标仪，仪器小巧，结构简单。

2.2.2 全自动型酶标仪

多通道全自动型酶标仪是在手动型单通道酶标仪的基础上发展而来的，由于其采用了微处理机系统，因此检测精度高、重复性好、检测速度快。

2.2.2. 1 全自动型酶标仪结构框图[2,3]（见图1)

2.2.2. 2 全自动型酶标仪原理

酶标仪实际上就是一台变相的专用光电比色计或分光光度计，其基本工作原理与主要结构和光电比色计基本相同。光源灯发出的光波经过滤光片或单色器变成一束单色光，进入塑料微孔极中的待测标本。该单色光一部分被标本吸收，另一部分则透过标本照射到光电检测器上，光电检测器将不同的待测标本且强弱不同的光信号转换成相应的电信号。电信号经前置放大、对数放大、模数转换等信号处理后送入微处理器进行数据处理和计算，最后由显示器和打印机显示结果。微处理机还通过控制电路控制机械驱动机构X方向和Y方向的运动来移动微孔板，微孔板L的小孔依次送入光束下进行测试，它设有多个光束和多个光电检测器，如12个通道的仪器设有12条光束或12个光源、12个检测器和12个放大器。在X方向机械驱动装置的作用下，每12个样品为1排进行检测，从而实现了自动进样检测过程。多通道酶标仪的检测速度快，但其结构较复杂，价格也较高。

2.3 微孔包埋板规格

微孔板是一种经事先包埋专用于放置待测样本的透明塑料板，板上有多排大小均匀一致的小孔，孔内都包埋着相应的抗原或抗体，微孔板上每个小孔可盛放不到1 ml的溶液。其常见规格有40、55、96孔板等多种，不同的仪器选用不同规格的孔板，对其可进行一孔一孔地检测或一排一排地检测。

2.4 酶标仪光路系统

酶标仪所用的单色光既可通过相干滤光片来获得，也可通过分光光度计相同的单色器得到。在使用滤光片作滤波装置时与普通比色计一样，滤光片既可放于微孔板前，也可放于微孔板后，其效果是相同的。目前，常用的酶标仪光路系统光源灯发出的光经聚光镜、光栏后到达反射镜，经反射镜做90°反射后垂直通过比色溶液，然后再经滤光片送至光电管。由于盛装样本的塑料微孔板是多排多孔的，光线只能垂直穿过，因此酶标仪的光束都是垂直通过待测溶液和微孔板的，光束既可从上到下，也可从下到上穿过比色液。

2.5 酶标仪光路系统与普通的光电比色计差异

盛装待测比色液的容器不再使用比色皿，而是使用塑料微孔板。微孔板常用透明的聚乙烯材料制成，对抗原抗体有较强的吸附作用，故将其作为固相载体。

2.6 酶标仪吸光度

酶标仪通常用A，有时也用光密度OD来表示吸光度。光是电磁波，波长为100～400 nm称为紫外光，400～780 nm的光可被人眼观察到，大于780 nm称为红外光。人们之所以能够看到色彩，是因为光照射到物体后被物体反射回来。绿色植物之所以是绿色，是因为植物吸收了光中的红色光谱。酶标仪测定的原理是在特定波长下检测到的被测物的吸光值。

2.6.1 检测单位

光通过被检测物前后的能量差异即为被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系[4,5]。

检测单位用OD值表示，OD是Optical Delnsity(光密度)的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，OD=1og(1/trans)，其中trans为检测物的透光值。根据Bouger-amberT-beer法则，OD值与光强度成下述关系：

其中E表示被吸收的光密度,Ι0为在检测物之前的光强度,Ι为从被检测物出来的光强度。

2.6.2 OD值计算公式[6]

其中,C为检测物的浓度;D为检测物的厚度;E为摩尔因子。

在特定波长下测定每一种物质都有其特定的波长，在此波长下，此物质能够吸收最多的光能量。如果选择其他的波长段，就会造成检测结果的不准确。因此，在测定检测物时，我们选择特定的波长进行检测，称为测量波长。

但是，每一种物质对光能量还存在一定的非特异性吸收。为了消除这种非特异性吸收，我们再选取一个参照波长，以消除其不准确性。在参照波长下，检测物光的吸收最小。检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收。

3 光路检查及日常维护

将1块酶标板正放测量1次，再将酶标板反放测量一次，查看同一孔吸光值是否相同，从而查看其所有光路8通道是否均一。光路不均有以下几种可能：(1)酶标板存在污迹;(2)光导纤维透镜不洁;(3)程控放大器：(4)灯泡老化;(5)滤光片不洁。

4 故障维修

仪器型号为美国酶标仪BIO-RAD550。

4.1 故障一

4.1.1 故障现象

仪器不能通过自检，屏幕提示“light bulb error”[7,8]。

4.1.2 故障排除

打开机盖，检查灯泡未见异常，对光路进行清洁擦拭，包括光源的透镜(聚光镜)、棱镜、滤光片、光导纤维聚光镜(共8只)、光电检测头(共8只)，擦拭后重新启动，仪器顺利完成自检，故障排除。

4.2 故障二

4.2.1 故障现象

故障显示同故障一[9]。

4.2.2 故障排除

按故障一处理后无效，检查光源电源，电压为11.9 V，更换灯泡后，仪器恢复正常。值得注意的是，原仪器上安装的灯泡规格为12 V 20 W24°，目前该规格已停产，维修代理报价1 700元左右，目前市场上有两种类似产品：12 V 20 W 10°和12 V 20 W 45°，经试验，12 V 20 W 10°检测结果与原厂灯泡相同。

4.3 故障三

4.3.1 故障现象

仪器能通过自检，重复性差[10]。

4.3.2 故障排除

应重点检查光源是否稳定(测试光源电压)，程控放大器输出是否稳定。导轨移动是否平稳，导轨应保持清洁，加涂一些润滑脂。

参考文献

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酶联免疫吸附实验 篇2

(辽宁省鞍山市铁西区卫生防疫站辽宁鞍山114012)【摘要】艾滋病是当前严重威胁人类健康和生命的一种传染病,由早期的静脉吸毒者共用注射器传播,发展到当今性传播和母婴垂直传播,即向普通人群的传播, 艾滋病的流行给人类的健康、生命安全以及经济社会发展带来了严重影响。最常用的艾滋病诊断方式是进行抗体检测，要了解和掌握HIV的感染情况，关键就是实验室的检测技术，下文就关于在HIV抗体检测中酶联免疫吸附法和快速法的比较分析及其注意事项的总结。【关键词】酶联免疫吸附法;胶体金快速法;HIV抗体;检测【中图分类号】R446.6【文献标识码】B【文章编号】1004-5511（2012）04-0594-01 一、引言进入20世纪90年代，HIV在我国迅速传播，感染人数成倍增长，艾滋病的防治已经成为全世界面临的重要课题。HIV感染的诊断以HIV抗体的检测为金标准，为了达到早诊断、早治疗、早管理的目的，全国先后建立了大量的HIV抗体初筛实验室，对HIV抗体检测的准确性要求也越来越高。现简述关于我站用酶联免疫吸附法及胶体金快速法检测HIV抗体的思考。二、酶联免疫吸附法对HIV抗体的检测HIV抗体检测是发现HIV感染的有效途径，酶联免疫吸附法（ELISA）是一种敏感性高、特异性强、重复性好的试验诊断方法，由于其试剂具有稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素，以及既适用于 规模筛查试验，又可以使用于少量标本的检测等优点，一直以来，成为艾滋病初筛试验室检测HIV抗体普遍使用的方法之一 1、试剂的选择:试剂盒的质量直接影响到结果的准确性，因此，要选择灵敏度和准确度较高，而且特异性较强的试剂盒。选择试剂盒的原则是，必须是经国家食品药品监督管理局注册批准，批检合格，临床评估质量优良，在有效期内的试剂，并经常了解同行对试剂盒使用的反馈情况一级卫生部临床检验中心对参加室间质评实验室试剂盒的综合评价。本站检测HIV抗体主要采用北京万泰生物药业有限公司试剂盒。另外，也应该注意试剂的保存，试剂从冰箱中取出后，应先平衡到室温后再使用，用多少取多少，防治反复冻融。2、仪器设备的校准与检定: 对实验结果起关键作者用的仪器，水浴箱、洗板机和酶标仪等均需按周期进行计量检定，并在检定周期内进行期间核查，同时，建立仪器设备的维护及操作规程，进行日常维护，保持仪器设备的最佳状态。3、样品样品的采集与保存: 样品采集时候应该尽量避免溶血和细菌污染、霉变，否则会导致假阳性。尽量不用抗凝血，保存时间不宜太长，一般2°C-8°C冰箱中保存一周内完成检验，长期保存最好在零下20oC度低温冰箱存放，并避免反复冻融，浑浊或有沉淀的样品要离心。作HIV抗体检测的血样不宜用塑料试管，应用玻璃试管装。4、检测中关键点的控制：（1）加样：微孔板条从冰箱中取出后应平衡至潮气干尽方可使用，用微量加样器按规定量加入孔底，避免加在孔壁上部，尽量慢慢快放，以免溅出或产生气泡，同时不要使吸头碰到酶标板孔上的包被抗原。（2）温育：调节水溶箱至合适的温度，不能过高也不能过低，放在水溶箱的隔板上或放在温箱的温盒里均可。（3）洗涤： 一定要用洗板机，防治污染。注意洗板机上的每一个放液和吸液纤孔都一致的插入孔底，将孔内液体吸干，严格按照要求设置一定的浸泡时间和洗涤次数，不要将各种试剂盒的洗涤液混用。（4）.显色： 严格按照说明书规定的时间温度恒定反应后终止，不可以随意更改。在加液和混均过程中避免产生气泡，洗涤后反应板用纸吸干后再置酶标液中比色。5、实验室内质量控制： 室内质控一般使用质控品和质控图。联合应用即刻法质控图法进行室内质控也是一种很使用的方法，可以借鉴。并积极参加室间质控活动，了解本实验室的实验误差情况。三、胶体金快速法对HIV抗体的检测与ELISA法相比，胶体金快速法具有快速，安全，操作简单等有点，但是在实际应用中要注意假阳性和假阴性结果。本站主要采用上海科华的胶体金快速检测法检测HIV抗体，其原理是采用HIV特異性抗原gp160和gp36等包被微孔反应板，用gp36、gp41标记辣根过氧化物酶。当待测标本中存在HIV抗体时，该抗体与固相化的抗原结合于反应板上，并进一步与酶结合物相结合，在TMB底物参与反应的情况。对于弱阳性样本的处理要慎重，不能轻易舍去，宜用正常血清稀释后与原液对照一起测定，往往可以收到很好的效果。四、结论ELISA法是实验室检测HIV抗体普遍使用的方法，但影响ELISA法测定结果的因素很多。与ELISA法相比，胶体金快速法具有快速，安全，操作简单等优点，但是在实际应用中要注意假阳性和假阴性结果。将胶体金快速法和ELISA法联合使用，并力求控制各个影响因素，可以大大降低假阳性和假阴性结果，提高检测的准备性，为艾滋病的防治工作提供更有效的依据。参考文献［1］中国疾病预防控制中心.全国艾滋病检测技术规范（2009年版）.北京：中国疾病预防控制中心，2009：6.［2］李秀华，宋爱京，王佑春.HIV抗体快速诊断试剂与酶联免疫诊断试剂灵敏度比较.中国生物制品学杂志，2004；17（3）：175-176.［3］胡静云，陈善昌.胶体金快速检测法与ELISA法检测HIV抗体效果观察.华夏医学，2009；22（3）：488.

酶联免疫吸附实验 篇3

目前酶联免疫吸附法 (ELISA) 因其具有的灵敏度高, 重现性好, 检测成本低, 操作简单, 样品处理量大等特点, 已成为国内应用最广泛的兽药及违禁添加快速检测方法之一。它是将抗原结合到某种固相载体表面 (酶标板) , 让受检药物和酶标抗原与固相载体上的抗原反应一段时间后, 洗去多余的酶标抗原和杂质, 加入底物显色, 根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高, 可以极大的放大反应效果, 从而使测定方法达到很高的敏感度。

ELISA检测对反应条件要求严格, 在检测过程中每一个步骤都有可能对检测结果产生较大影响, 致使同一批次的样品重现性不好或者出现假阴性、假阳性, 这影响到检测结果的准确性, 对此要采取一些相应的预防措施, 以提高检测结果的准确性。

1 ELISA试剂盒的保存

光照的影响试剂盒储存和反应时, 均应避免直接暴露在阳光下, 底物液和部分标准品对光敏感。试剂盒储藏时要在2~8℃温度条件下保存, 忌冷冻, 未使用完的试剂盒应注意把板条放入铝箔袋封口, 并放入干燥剂小袋, 以避免板条受潮失效。

2 检测前准备工作

2.1 检测室温度

试剂盒最佳的检测温度应在20~40℃之间, 温度过高或过低都会降低酶的活性, 而酶活性的降低会影响测量的准确性。试剂盒打开后, 在室内温度下至少平衡半小时, 如果室温低于20℃须在25℃的培养箱中回温。回温后于室温25℃±2℃使用, 使用时应避免阳光直射, 空调或风扇直吹。

2.2 溶液配制

在整个实验中所使用的水均需是蒸馏水。在配制样品提取液和洗涤液时一定要用蒸馏水或去离子水, 不可使用矿泉水或自来水, 否则, 里面的金属离子会对检测结果产生干扰。

2.3 移液枪的使用

加样的枪头需使用一次性的, 微量枪头清洗不干净, 很容易有药物残留, 重复使用会造成交叉污染。检测员在使用八道移液器时, 在吸取时按至第二停点, 将吸头没入试剂液面下2~3 mm, 轻缓松开按钮回原点, 慢慢提出吸头并在容器壁上停靠一下, 以去除多余试剂, 轻按按钮至第一停点, 排出液体, 保持手势不动, 再次将吸头没入试剂液面稍停片刻按至液面下2~3 mm, 轻缓松开按钮回原点, 此即为“吸二打一”式加样, 避免加样时产生气泡, 导致加样不均。加试剂时, 移液器要保持垂直;吸头有试剂时, 移液器不能平放或者倒置, 避免污染移液器, 进而污染其他试剂和样品。

3 检测仪器对检测结果的影响

3.1 酶标仪的影响

仪器每年均需要检定, 以保证仪器的准确性。酶标仪在使用前需预热30 min, 在室温条件下测定, 室温低于15℃时, 需使用加热等方式使室温保持25℃左右, 以确保酶标仪的正常运行。

3.2 微量移液器的影响

微量移液器需每年进行检定, 检定合格方可使用。微量移液器要有机相、水相分开, 贴上标签。在量取不同溶剂需更换枪头, 避免交叉使用造成污染;试剂从试剂瓶中吸出后, 不能再放回瓶中, 防止试剂污染。

4 检测员的操作对检测结果的影响

对于ELISA试剂盒来说, 检测员的熟练度对结果影响很大。检测人员上岗前需进行相关培训, 需具备基本的检测质控知识。熟练掌握ELISA检测方法的原理, 试验检测的目的, 检测员需保持认真负责的工作态度, 在实验前熟读试剂盒说明书, 对试验中的注意事项、重点难点加以标注, 特别要注意:标准品或抗体是否需要稀释、孵育温度是25℃还是37℃、酶标二抗、抗体工作液、底物液、终止液的加样顺序和时机 (试剂顺序加反通常会造成酶标板不显色, 使实验失败) 、酶标仪检测波长是双波长还是单波长。

5 关键点控制

5.1 样品前处理

样品前处理需根据试剂盒说明, 不同的样品种类有不同的处理方式。有些检测项目需要氮气吹干的方式浓缩富集药物, 在实际操作中, 除非试剂盒说明要求吹至尽量干, 否则只要吹干即可。某些样品 (肝脏样品) 剩余一些油脂很难吹干, 这些油脂干扰可以通过下一步的正己烷溶解去除。氮吹时间过长会造成药物损失严重, 回收率降低, 所以在氮吹时应随时查看吹干情况, 吹干后应尽快加溶剂复溶。

5.2 加样

不管什么试剂, 加样前均需摇匀, 加样时需将处理好的样液加在孔板底部, 避免加在孔壁上部。

5.3 洗板

洗板是关系到实验成败的关键步骤。ELISA通过洗板去除未结合抗原抗体和酶标记物, 同时也可以去除非特异性吸附的蛋白质干扰及样本中的部分杂质干扰。

手动用排枪洗板时需注意, 要垂直悬空加入液体, 吸打液体速度不能过快, 以免液体溅出, 造成交叉污染, 按照规定的洗涤液体积进行洗板, 注意不要出现孔间相溢现象。洗液尽量不要满溢或加到板孔外面, 若洗液不小心加到外面, 需用洁净无毛屑的滤纸沾干, 避免板底不洁净, 造成酶标仪读数出现误差。

5.4 孵育

孵育、显色过程中要在恒温箱里避光进行, 以保持温度的稳定。显色时间、温度需按试剂盒的规定来操作, 加完试剂后将微孔板从室温放入恒温箱时, 孔内温度从室温升至恒温箱温度需要一定时间, 尤其在室温比较低的状态下, 这段升温时间可能比较长。通常是将微孔板一放入恒温箱就开始计时, 这样就容易造成实际测定时孵育时间不够, 导致弱阳性样品测不出来。若温度相差大时, 可以适当延长孵育时间2~5 min。孵育时应盖封口膜, 否则会使孔内反应液蒸发, 导致孔板难以彻底洗净影响检测结果。

5.5 显色

底物液过期或配制时间过长也是影响实验结果的重要因素。尽可能在使用前配制底物液, 底物液禁止接触金属物品。加完底物液后的孵育时间依各孔颜色而定, 若反应时间到了, 但酶标板各孔颜色普遍较浅, 可继续显色5~10 min。

5.6 酶标仪判读结果

ELISA试剂盒内显色剂多为TMB (3, 3, 5, 5, -四甲基联苯胺) , TMB颜色底物显色后, 随着时间的延长, 颜色会逐渐消退, 因此显色并终止反应后必须尽快读数, 以免影响检测结果。测定波长一般为450 nm, 有的厂家会设有参比波长630 nm, 使用双波长可以消除试样的背景吸收干扰和混浊干扰。

综上所述, 尽管ELISA法操作简单, 但可能影响检测结果的因素也较多。故在实验操作中, 需严格按照试剂盒操作步骤操作, 同时做好室内质控、室间比对, 以严谨的工作态度对待每一份样品, 避免或减少影响因素的干扰, 力求结果准确, 为进一步加强畜产品质量监管提供可靠的数据支持。

摘要：酶联免疫吸附法 (ELISA) 因其具有的灵敏度高, 重现性好, 检测成本低, 操作简单, 样品处理量大等特点, 已广泛应用于兽药残留及违禁添加药物的快速检测。ELISA虽然操作简单, 但试验操作中各环节对试验的检测结果影响较大, 如不注意, 很可能导致显色不全、重现性不好、假阳性或假阴性的结果。本文对影响ELISA试验的常见因素进行分析并总结出解决方法, 以提高检测的准确性。

酶联免疫吸附实验 篇4

ELISA是酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)的简称,是以免疫学反应为基础,将抗体、抗原的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种具有高特异性和高敏感性的实验技术。根据样本中待测物质的种类及性质不同,可以设计出各种不同类型的ELISA检测方法,包括抗体夹心法、抗原夹心法、竞争法、间接法及捕获包被法等。1971年瑞典斯德哥尔摩大学的Engvall和Perlmann[1]首次建立了酶联免疫吸附测定方法,短短几十年ELISA检测法的应用已渗入我们生活的许多方面,且在不断发展和完善,包括在临床诊断、医学研究、食品安全、植物资源、环境监测及生态学方面的应用。本文介绍了ELISA检测法的主要应用现状,并综合其优缺点对ELISA检测法的应用前景进行了展望。

1 ELISA的应用现状

1.1 临床诊断和医学研究中的应用

ELISA技术被广泛地用来检测与感染性疾病相关的病原因子以及相应的抗体、体液中的抗原成分、激素和药物等。用于临床医学类研究的标本通常以人的血液和尿液等为主,此外还包括粪便、组织等。在基础医学研究中ELISA检测标本则来源广泛,包括人、鼠、兔、猪、犬等多种实验用动物的血液、组织、细胞及细胞培养的上清液等[2]。

ELISA可以测定的项目包括:(1)抗原及其抗体的检测。ELISA在传染性疾病和病毒检测中具有突出的优势,如甲型H1N1流感病毒[3]、艾滋病毒、巨细胞病毒、柯萨奇病毒A组16型[4]、狂犬病毒、肝炎病毒、肠道病毒、风疹病毒、疱疹病毒和脊髓灰质炎病毒等,其敏感性都超过目前常用的检查方法。在细菌感染的检测方面包括:链球菌、金黄色葡萄球菌[5]、布氏杆菌等。ELISA在免疫性疾病方面可进行自身免疫病抗体的测定以及对过敏的诊断,如检测各种过敏原的抗体、甲状腺球蛋白抗体、红斑性痕疮抗体[6]、血清抗碳酸酐酶Ш抗体[7]等。(2)蛋白质的检测。各种免疫球蛋白;肿瘤标志物如:甲胎蛋白、胰岛素、癌胚抗原、磷酯酰肌醇蛋白聚糖3[8]、诱骗受体3(DcR3)[9]、前列腺碱性磷酸酶;其他蛋白等;(3)非肽类激素的检测。如:雌二醇、皮质醇等;(4)血液中药物浓度的检测。如:治疗心脏病类药物、抗哮喘药物、抗癫痫药物、抗生素、庆大霉素等[10]。这些利用ELISA建立起来的检测方法为保障人们的健康与安全提供了一种便捷有效的途径。

1.2 食品安全方面的应用

食品是人类赖以生存的物质基础,食品的安全问题关系到人类的健康和国计民生的重大问题。随着食品工业的发展,传统的分析方法已经不能满足食品检测的需求。ELISA在食品检测中得到了广泛的应用:(1)食品饲料中微生物的检测。用该法对沙门菌、李斯特菌、大肠杆菌、曲霉、毛霉等进行检测,反应特异性和敏感性高,检测时间短;(2)食品中毒素的检测。主要用于水产生物毒素的检测。李闽针等[11]建立了应用ELISA检测麻痹型贝类毒素的方法,检测过程仅需1h且灵敏度高;(3)食品中残留药品的检测。主要涉及动物和植物性食品的检测,包括动植物体内的抗生素,添加剂和药物残留(如水果蔬菜中的百草枯、蜂蜜中的磺胺类药物[12]);用于兽药残留尤其是动物性产品中兽药残留的检测[13](链霉素、氯霉素、青霉素、四环素、盐霉素、磺胺二甲基嘧啶等)。传统的仪器分析方法(高效液相色谱法,气相色谱法,薄层色谱法等)在兽药残留分析中虽然具有较大的优势,但其前处理过程复杂、仪器昂贵、效率低下,不能适应以筛选为目的的大量检测样本分析。ELISA由于具备灵敏度高、特异性强、方便和成本低等优点,越来越多的被应用到兽药残留检测。(4)外源性污染物残留,富集作用,寄生虫、细菌、病毒等的感染[14]以及食品中其他成分的检测。如对鲜乳中三聚氰胺的检测[15]和食品中"瘦肉精"的检测[16]。(5)转基因食品的检测。国外已开发出用于检测转基因食品的PCR-ELISA试剂盒,我国也建立了转基因食品(如大豆,水稻,鱼)的PCR-ELISA检测法。雷勃钧等[17]使用PCR-ELISA法对大豆品种进行转基因的定性检测,灵敏度高达0.1%,达到国际领先水平。

1.3 植物资源研究方面的应用

ELISA在植物资源方面的应用主要包括:(1)用于植物病毒的流行病学分析,研究不同的寄主和介主的关系。随着我国植物种质资源的引进和生态环境的改变,植物病毒株系分化和变异也不断出现。利用ELISA对植物病毒的分布情况进行追踪调查,研究变异株系的地域性,对植物流行病学的研究具有指导意义。李瑛等[18]利用ELISA对兰州百合病毒进行检测,发现兰州百合病情含量随着种植年限的增加而增加;施曼玲等[19]利用三抗体夹心ELISA对芜菁花叶病毒(TuMV)进行了检测,测定出7种农作物上有TuMV感染。(2)用于种子健康测试。秦碧霞等[20]从感染黄瓜绿斑驳花叶病毒的葫芦植株上收取种子,通过双抗体夹心酶联免疫吸附法检测种子的带毒情况,检出率为100%。(3)大规模经济作物中的植物病毒以及自然寄主中的植物病毒的检测等。目前ELISA检测已经应用到番茄、黄瓜、甜菜、甘蔗、花生等多种经济作物病毒的检测和预防。(4)中药材有效成分质量的检测。谭铭铭等[21]使用抗SSa单克隆抗体建立竞争性ELISA法测定广州市售柴胡药材中柴胡皂苷a(SSa)的含量,发现市售柴胡药材质量参差不齐,约30%不符合药典要求。

1.4 环境监测方面的应用

80年代后期,随着半自动化和自动化ELISA分析仪的问世和发展,ELISA技术在药物残留检测中的应用也越来越广泛。可以用于检测水、土壤中的异内甲草胺、苯并咪叶及多种农药等。有机磷和菊酯类农药广泛用于全球各国,为农业发展起了重要作用。但由此产生的毒物经生物圈物质循环后重新汇集到水中,对水环境产生负面影响;海藻水华产生的微囊藻毒素(MCs)是一类环状七肽毒素,具有很强的毒性,人类饮用被污染的水源后残留在体内的毒素逐渐积累富集会造成人体中毒。ELISA被用于水质检测已有多年,近年来刘延凤等[22]建立了氯菊酯农药残留的ELISA检测方法,抗血清检测线性范围为10~800μg·L-1,平均回收率大于97%,且与其他类似结构农药交叉反应率很低。此外,氯代芳烃化合物,二恶英化合物等有机物长期以来一直是环境科学研究的热点,ELISA法在如何快速检测其在水质,土壤,空气中的浓度发挥了重要作用。

1.5 生态学研究中的应用

食物关系分析可能使我们更好地理解和预测生态系统的一些基本过程,更好地了解相互作用的多物种系统的多样性格局和动态,为害虫管理提供新思路。目前,研究者们认为最有前途、应用最多的检测捕食作用的方法是以免疫学为基础的ELISA检测法[23]。最早将ELISA引入捕食作用研究的是Fichter和Stephen。此后,Ragsdale等[24]应用ELISA研究了大豆上一系列捕食者对稻绿蝽的捕食作用。刘雨芳,张古忍等[25]使用酶联免疫吸附试验双抗体夹心法对稻田节肢动物(捕食天敌、水稻害虫、和昆虫)之间的捕食关系进行了研究,为稻田捕食性节肢动物亚群落的重建和发展的研究提供了一定的参考依据。

2 ELISA在免疫检测中的优点

ELISA检测所需仪器化程度低、操作简便,对样本预处理要求简单,易于推广,具有准确、灵敏、特异、快速、经济等特点,除此之外,还有很重要的一点,即对环境没有污染。基于这一系列的优点,使得ELISA成为免疫检验中的主导技术,得到了快速的发展和广泛的应用。国际上许多权威机构将其列为优先发展的分析技术之一。

与其他检测方法相比,ELISA检测法具有明显的优越性。在口蹄疫诊断检测中新型ELISA(单克隆抗体ELISA、生物素-亲和素ELISA及Dot-ELISA)得到了广泛的应用[26];在梅毒血清学检测中,应用ELISA、TPPA(螺旋体明胶凝集试验)、TRUST(甲苯胺红不加热血清学试验)和RPR(快速血浆反应素试验)四种方法检测梅毒和非梅毒血清,检测结果的阳性率和假阳性率表明:ELISA法敏感性、特异性强都相对较好,是目前梅毒血清学检测的首选方法[27]。应用ELISA方法对鲜奶及肉制品中沙门氏菌进行检测的研究表明:与国际法相比,直接ELISA检验更可靠,同时也可以显著消除样品的非特异性干扰,可以进行大量样品的快速检测[28]。

随着制备单克隆抗体技术的发展,将其和ELISA方法互相结合,极大地提高了分析检测的灵敏性与可靠度。PCR-ELISA技术是将PCR技术、探针技术和ELISA技术三者结合起来的一项技术,即在PCR扩增以后,在微板上借用ELISA的原理,使用酶标抗体,进行固相杂交来实现定量。近年来PCR-ELISA技术被应用于致病菌、病毒的检测,由于该方法是PCR和ELISA技术的结合,是一种两级放大系统、灵敏度高,同时这种方法避免了PCR产物分析时的电泳及染色过程,与普通PCR和荧光PCR相比具有更为快捷、简便和灵敏等优点。除此之外,在端粒酶检测,寄生虫检测,血型基因分型,菌种鉴定等领域也取得了一定的进展[29]。

3 ELISA的局限性及展望

ELISA作为一项免疫检测技术,同时也具有一定的局限性,例如:在所检测的生物学样本中有可能存在各种干扰实验的因素,此外,在实验过程中影响结果的因素也比较多[30,31]。在ELISA定性测定实验中,阳性判定值(Cut-off)的建立是在一定的统计学基础上的,对于某一特定的受检者来说,有可能并不具备适用性。如在使用ELISA方法检测HIV时,检测所得的阳性结果或许并不是真正的阳性,需要利用其他方法如蛋白印迹、重组免疫印迹或中和试验来确认,才能报告阳性。

ELISA测定的基础是抗原与抗体的特异性反应。因此,如果检测抗原,则要求抗体特异性。此外,待测抗原还必须有能与抗体相结合的抗原决定簇,若因某些原因(突变导致某些位点不表达,结合位点因某些原因被封闭或阻断)影响了抗原和抗体的结合,就会造成假阴性结果。如检测抗体,除要求所用包被抗原尽可能包含所有的特异抗原决定簇,还要尽可能不含非特异成分,但是,这一点往往由于受到技术水平的限制难以完全做到。因此,假阳性和假阴性的结果是不能完全避免的。相信随着技术水平的提高,检测所需的抗体和包被抗原的特异性也会得到进一步的提高,从而最大限度的避免假阴性结果的出现,提高检测的准确性。

酶联免疫吸附实验 篇5

为达成我校以学生的发展为本,提高学生的就业竞争能力、升学竞争能力和可持续发展能力的办学目标,免疫检验课程通过制订专业课教学与临床岗位零距离对接的教学目标,实施学生自主学习—教师点拨辅导的实验教学模式。按照免疫检验临床实际的工作流程和质量管理,我们对ELISA检测乙肝两对半进行相应教学设计,将理论知识和技术应用能力的训练渗透到实验教学过程中,便于学生牢固地掌握理论知识,让学生学有所得、学有所思、学有所用,以下谈谈笔者的教学体会。

1采用的教法、学法

以往的理论授课采用传统的讲授法,由于受到课堂规则、心理环境、激励机制等因素的影响,教师在课堂讲授过程中存在许多不尽如人意的地方。如ELISA检测乙肝两对半涉及双抗体夹心法、双抗原夹心法、竞争法原理,内容上有严谨的系统性和组织性,授课中若只是简单地将知识点堆积,没有讲清知识之间的内在联系,会在一定程度上影响课堂教学的实际效果。在实验教学中,实验材料的准备、仪器的准备及调试、标本及试剂的处理等工作基本上是由指导教师包办,实验的许多中间环节学生没有亲自参与,因而在教学任务完成后,部分学生对实验的原理、操作还是一知半解,更谈不上能力的锻炼和培养。我们根据学生的学习特点和认知规律,通过优化教学内容,注重理论联系实际,在教法上采用任务驱动法、直观教学法、讨论教学法及实验教学法等,激发学生进一步探究问题、积极参与教学活动的欲望。

实验过程中注重培养学生的职业能力,提高学生分析问题、解决问题的能力,因而采用自主学习法、合作探究法、分析讨论法等。如在教学准备环节,将学生分组(5人/组),指定各组组长,布置以下学习任务:(1)乙肝两对半包括哪些项目?(2)常见的乙肝两对半检测结果是哪些?有何临床意义?(3)应用了ELISA的什么原理?(4)接触血液、分离血清标本需实施哪些安全保护措施?(5)实验用品的准备和注意事项有哪些?

2使用多媒体信息技术手段辅助教学

2.1登录网站搜集资料,建立QQ、微信讨论组

乙肝两对半检测与实际生活联系较为密切,学生对于乙肝病毒的传染性、病毒携带者、“大三阳”等知识有所了解,但学生对乙肝病毒采用的检测方法及原理、临床意义缺乏认识。教学设计中,我们注重理论联系实际,让学生感到所思考的问题是熟悉的、常见的,同时又是新奇的、富有挑战性的,激发学生探究问题、寻找答案的欲望。教师布置学习任务后,学生通过查阅书籍、登录网站搜集资料,并结合自己或家人曾经到医院检验科化验检查的结果来获取乙肝两对半检测的相关知识。通过QQ、微信的形式建立讨论组,针对ELISA检测乙肝两对半的相关知识进行讨论,分享学习经验,教师及时跟进、指导,在讨论组实现师生、生生讨论。

2.2 Flash动画及图片的应用

ELISA检测乙肝两对半涉及双抗体夹心法、双抗原夹心法、竞争法原理,抽象难懂,通过Flash动画、图片演示,把实验原理直观形象地展示出来,可以增强教学内容的可读性和可接受性,解决内容单调乏味、难以接受的问题。教师针对重要知识点提问,由此突破教学重点、难点,可达到预期的教学效果。

2.3教学录像、视频的应用

教学过程中,以学生的学为中心,以符合学生的认知规律为前提,为使学生对操作步骤有感性认识,我们设计、制作适合于教学对象的教学录像、视频,使得操作更为直观[2],促使学生对原有知识进行回顾和巩固,培养学生的思维能力、记忆力、主动学习能力。如通过视频导入教学,视频内容为某患者出现了肝炎的临床症状,血清乙肝两对半检测结果为HBs Ag(+);HBe Ag(-);抗-HBs(-);抗-HBe(-);抗-HBc(-),提出问题:(1)乙肝两对半常用何种方法检测;(2)患者的检测结果如何分析?有何意义?从一开始上课就牢牢地吸引学生的注意力,加深学生对乙肝两对半检测意义的理解。

此外,我们自制了乙肝两对半检测的教学录像、洗板机及酶标仪的编程录像。教师针对性地对实验环节如操作步骤、结果观察、注意事项进行重点讲解,激发学生参与实验活动的热情,增强学生做好实验的自信心。

2.4计算机交互平台的应用

为了检验学生对ELISA检测乙肝两对半的理论掌握程度、提高学生的实验技能、完善学生免疫检验课程成绩评价体系,我们对学生进行实验考核,采取以考促学的手段,加大ELISA检测乙肝两对半的训练力度,包括理论考核(30分)和操作考核(70分)。

理论考核采用本教研室的计算机交互平台进行,根据教学内容的特点,理论考核我们进行这样的设计:首先收集乙肝两对半检测相关试题共25题,内容涉及实验原理、操作、材料、结果观察及临床意义。如:(1)乙肝两对半检测涉及ELISA的哪些原理?分别检测什么项目?(2)通过各反应孔显色,如何判断疫苗接种者、病毒携带者、“大三阳”、“小三阳”?(3)手工洗涤有何要求?(4)加终止液的目的是什么?(5)ELISA常用的酶是哪种?其底物是什么?考虑到学生对理论考核容易产生畏难情绪,在题型上设有填充题、标示题、连线题及填空题等,内容直观、清晰,以PPT形式组卷,使学生“寓考于乐”,轻松愉快地完成理论考核。从试题库集中抽题组卷,考核内容及题型见表1,共组10套试卷。学生抽签后通过计算机交互平台进行考试,本教研室的计算机交互平台可实现全班学生同时测试及无纸化考试。

2.5开放式微生物教学系统的应用

ELISA检测乙肝两对半在内容上与医学微生物学、生物化学密切相关。开放式微生物教学系统操作简单、直观,同时具有良好的交互界面、动态效果,能够从视觉上、听觉上吸引学生的注意力,为学生提供自主学习的平台,扩充相关学习内容。学生在课后可进入开放式微生物教学系统,通过观看视频,针对乙肝病毒的内容进行学习。该教学系统能帮助学生复习、巩固相关知识,并能重复学习。

3督导实验,及时进行总结

乙肝两对半共有5个检测项目,目前多采用商品化的ELISA试剂盒,需用到5种试剂盒,各个项目的操作步骤不同,实验中若不细心就容易出错。在学生操作过程中,教师巡视指导,督导每位学生的操作。此外,每个小组由小组长协助监督,及时发现错误并纠正,以免影响结果。

由于学生用的是自体标本,实验态度与参与积极性明显提高,且操作认真。实验结束后,学生很急切地想要知道自己的检测方法对不对,结果与预计的是否符合。在教师的组织下,学生对整个实验进行分析及总结,可加深对乙肝和ELISA检测法的认知。如本次课学会了什么?有何体会?总结成功的经验、失败的经验、容易出错的环节等。每组学生对实验过程和实验结果进行整理和综合分析,每名学生完成一份实验报告。通过总结,进一步加深学生对乙肝两对半检测相关知识的理解,加深对免疫学检验专业技能的认知。

4重视人文关怀,拓展知识,做好防治

我国人群中乙肝病毒感染率为10%,医学生是未来的医务人员,是高危人群,医院内污染的器械、血标本及各种不规范操作均可引起感染。ELISA检测乙肝两对半所用的标本为学生自体血清标本,实验结果显示,绝大多数学生为健康人,乙肝两对半5项全阴性的学生要求在实习前完成乙肝疫苗的全程接种,通过接种疫苗关爱自己,保护他人[3]。对乙肝病毒感染的可疑标本,由指导教师复查,以确定是否具有传染性,以便让学生及时到专科诊治,对感染了乙肝病毒的学生,教师要保护学生的隐私,指导学生以正确的态度去面对,不要产生心理负担,同时要重视乙肝的防治。

通过观看乙肝宣传片,完成乙肝手抄报作业,加深学生对乙肝流行情况、临床表现、临床类型、检测方法及防治原则的认知,积累自我保护经验。在集体生活环境中注意个人卫生,不用他人的生活用品,养成良好的卫生习惯[4]。在实际工作中,树立防范意识,在微生物检验、生物化学检验、临床检验等专业课程开设的实验中正确处理血标本、血污染物品,规范操作,避免意外感染的发生。

5制订切实可行的评价标准

结合本课题的教学目标、教学内容和学生的学习环境以及学生个体差异等制订切实可行的评价标准。设计了教师评价、小组评价及个人评价,从各个角度对本课题的实施情况进行评价。以2014级86位学生为例,评价结果见表2。通过评价,有助于学生反思和调控自己的学习过程,让每名学生都能体验到成功的乐趣,非常有利于学生更好地认识自我,树立自信。

免疫学检验课程实践性强,理论内容抽象不易学习。实验前,学生对ELISA夹心法、竞争法等概念及原理存在模糊、混淆的情况。教师应在ELISA检测乙肝两对半的理论和实验教学过程中强调理论联系实际,对教学内容、教学环节进行精心设计,使学生很快掌握该实验的原理、操作、结果判断及分析,对乙肝的传播途径、致病性、防治方法及免疫有一定的认知,使专业技能得到进一步提高,为实习及将来的工作打好基础。

摘要：为达成我校以学生的发展为本,提高学生的就业竞争能力、升学竞争能力和可持续发展能力的办学目标,免疫学检验课程制订专业课教学与临床岗位零距离对接的教学目标。结合酶联免疫吸附试验检测乙肝两对半的理论及实验教学谈谈教学体会。

关键词：酶联免疫吸附试验,乙肝两对半,免疫学检验

参考文献

[1]田兆菊.综合性实验在临床免疫学检验实验教学中的应用及体会[J].国际检验医学杂志,2014,35(2):250-251.

[2]石云.多媒体教学在临床免疫学及检验实验教学中的应用[J].中国实验诊断学,2011,15(2):1379-1380.

[3]邓青.乙肝疫苗免疫效果评价[J].中国卫生统计,2010,27(4):388-389.

酶联免疫吸附实验 篇6

ELISA基本原理与常见类型

该检测法的基本原理是将相关抗原或抗体提前结合到某种固相载体表面, 在检测过程中, 受检样品与酶标抗原或抗体会按照相应的程序与结合在固相载体上的相关抗原或抗体产生反应, 生成新的抗原或抗体复合物。当反应结束后固相载体上酶标抗原或抗体被结合量 (即免疫复合物) 和标本中待检抗体或抗原的量成一定比例。随后将反应液中的其它物质清除后, 加入相关酶反应底物, 固相载体上的酶会直接将底物催化为有色产物。最后, 通过对有色产物进行定性或定量分析即可确定待检样品中相关物质的含量。ELISA技术常见类型: (1) 双抗体夹心法:该检测法适合检测拥有多个抗原决定簇的抗原, 但由于农药分子通常为半抗原, 即只有一个抗原决定簇, 因此, 不适合农药检测。 (2) 简接ELISA法:对抗体无严格要求, 只需改变包被抗原便能检测相应的抗体。 (3) 竞争ELISA法:可检测抗原, 也可检测抗体。待测抗原 (抗体) 与酶标抗原 (抗体) 通过与固定化抗体 (抗原) 间的竞争, 获得与检测目的抗原 (抗体) 结合的机会。

ELISA法在食品农药残留检测中的应用

目前, 有机磷农药是我国农业生产中最常用的农药, 常见类型包括甲胺磷、敌敌畏、氧乐果、对硫磷、敌百虫等。大部分为高毒类农药, 通过降低生物体内胆碱酯酶活性, 引起迟发性神经毒性, 从而达到消灭害虫的目的。农药残留在人体内蓄积后可造成慢性中毒, 具体表现为神经功能紊乱、精神错乱等。王华等研制出竞争酶联免疫检测试剂盒, 可用于检测果蔬中含有的甲胺磷含量, 最低检测限为0.01g/ml, 线性检测范围在0.01~100g/ml[2]。该试剂盒具有非常高的特异性, 且回收率至少在93%以上, 在4℃条件下可保存半年以上。

这是一种仿生杀虫剂, 模拟天然除虫菊素结构达到杀虫的目的。这类农药的用量仅次于有机磷农药。若长期食用含有拟除虫菊酯类农药的食物容易引起慢性中毒。通过碳二亚胺法把相关半抗原与牛血清偶联制成免疫原, 形成联苯菊酯的竞争间接酶联免疫检测法。在合适的条件下, 此法的检出限值可降到 (0.016±0.002) mg/L, 并和其它菊酯类农药不会发生交叉反应。此类农药对人体的危害与有机磷农药比较相似。吴慧明等开发了一种直接ELISA试剂盒, 可用于检测土壤中残留的克百威含量, 其最低检测限位0.01mg/L, 线性检测分为在0.01~10mg/L之间[3]。另外, 现已研制出定量定性检测速灭威的间接竞争ELISA法, 对此种农药的检出限在0.08~0.10g/ml之间, 检测线性范围在1~10000g/L。

苏丹红是一种工业染色剂, 成本低, 被非法用作食品添加剂, 常见于辣椒粉与咸鸭蛋中。这给公众造成了极大的恐慌。目前, 已研制出基于单克隆抗体的间接竞争性酶联免疫吸附法, 对苏丹红有非常高的灵敏度, 操作简单, 适合大批量检测, 成本低。盐酸克伦特罗 (即“瘦肉精”) 曾被广泛用于畜牧养殖业, 以提高瘦肉率。目前, 通过竞争酶联免疫法能快速检测出猪尿、猪肝内的“瘦肉精”残余量, 可重复使用, 成本低廉。

酶联免疫吸附实验 篇7

目前,关于检测饲料原料、饲料、牛奶、鸡蛋和肉产品中MA的方法国内外有很多报道,包括HPLC[2,3,4,5,6,7,8,9,10]、LC-MS/MS[10,11,12,13,14]、GC/MS[15,16]。这些方法虽可定性定量,但需要昂贵的仪器设备,操作复杂,耗费大量时间和人力物力。而酶联免疫吸附检测法(ELISA)快速、简单、灵敏,一次可同时检测几十份样品,对于国内需要检测样品量巨大的实际情况来说,不失为一种最佳的选择。到目前为止,只有Kim[10]和Garber[17]分别以美国Beacon公司和美国Abraxis公司的商品化试剂盒对宠物饲料中的MA进行了检测,检测限分别为0.02 mg/kg和0.009 mg/kg。而至今国内外均未见有建立ELISA方法对MA进行检测的研究报道。因此,该研究旨在合成MA的人工抗原,制备特异性抗体,建立一种简单、快速、灵敏地检测MA的间接竞争ELISA方法,以对鸡蛋中可能残留的MA进行检测。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试药品。

三聚氰胺标准品由中国兽医药品监察所提供;牛血清白蛋白、卵清蛋白和弗氏佐剂均购自美国Sigma公司;吡啶、琥珀酸酐、四氯化碳及其他试剂均为分析纯,购自北京化学试剂公司;三聚氰胺标准储备液和系列浓度的工作液均由甲醇/水(2∶8,v/v)配制。

1.1.2 供试仪器。

美国550型Bio2Rad酶标仪;JJ-2B型组织捣碎匀浆机。

1.1.3 试验动物。

4周龄(1.5 kg)新西兰白兔8只,雌雄各半。

1.2 MA人工抗原的合成

MA人工抗原的合成过程见图2。将0.248 g(1.96 mmol)MA、0.156 g(1.96 mmol)吡啶和5 m L CCl4置于一圆底烧瓶中加热回流。在回流过程中于25~30 min内逐滴加入10 m L含有0.197 g琥珀酸酐的CCl4,然后回执回流4 h。待冷却后,得到白色沉淀。沉淀物先后用少量水和无水乙醇淋洗,干燥后得MA半抗原(熔点360℃;红外扫描结果:(KBr)Vmax3 342、3 212、1 668、1 627、1 587、1 560、1 498、1 405、1 348 cm-1)。

称取10 mg半抗原溶于2 m L的1 mol/L的碳酸钠溶液中,加入1.6 m L二氧六烷和100μL三乙胺,混合均匀后再加入15μL氯甲酸异丁酯,此混合液于4℃搅拌反应30 min。然后将此溶液逐滴加入到含有60 mg BSA或20 mg OA的碳酸钠溶液中,4℃搅拌反应过夜。最后,将反应液用生理盐水透析3 d,每12 h换液1次,分装后于-20℃保存备用。

分别将偶联物、载体蛋白和半抗原配制成一定浓度的溶液后,在200~300 nm范围内用紫外分光光度计进行全波长扫描,以鉴定是否成功偶联,并计算偶联比。

1.3 MA抗血清的制备

首次免疫,取MA-BSA与等量弗氏完全佐剂充分乳化后,在新西兰白兔背部皮下多点注射,加强免疫以抗原与弗氏不完全佐剂乳化后皮下注射。免疫剂量每只兔子0.5mg(以载体蛋白计算),每隔4周加强免疫1次,共免疫8次。最后心脏采血,分离血清,-20℃保存备用。

1.4 间接竞争ELISA方法的建立

1.4.1采用方阵滴定法确定包被抗原与抗体的最佳工作浓度。每孔加入100μL最佳工作浓度的包被原包被酶标板,4℃过夜。封闭,洗涤后,将50μL工作浓度的抗体与等体积倍比稀释的MA标准液或样品提取液加到酶标板上,以抗体与同体积磷酸盐缓冲液(PBS,0.01 mol/L,p H值7.2)的混合物为零标准,37℃反应1 h。然后加入100μL HRP-羊抗兔Ig G溶液,37℃反应30 min。再加入100μL TMB系统底物显色液,37℃显色15 min,最后加入50μL终止液(2mol/L H2SO4),在酶标仪上测定450 nm处各孔的OD值。

1.4.2以1.4.1中所测MA各浓度的OD值(B)与零标准孔OD值(B0)的比值(B/B0)为纵坐标,以各标准浓度的对数值(Log C)为横坐标,绘制标准抑制曲线。

1.4.3检测抗体与其他同系物的交叉反应率。方法同1.4.1,抑制物分别为环丙氨嗪、三聚氰胺一酰胺、三聚氰胺二酰胺和三聚氰酸。根据抑制曲线计算抑制抗原抗体结合50%时的各竞争物浓度,以抑制率为50%时的MA浓度与各竞争物浓度之比计算交叉反应率。

1.5 样品提取方法

将鸡蛋去壳后充分搅拌均匀,取5 g置于100 m L离心管中(空白样品按20、50、100 ng/g的浓度添加MA标准品),然后加入50 m L含20%氨水的乙腈,剧烈振荡10 min后在4 000 r/min下离心15 min。取10 m L上清液转移至干净分液漏斗中,加入10 m L正己烷,剧烈振荡1 min,静置分层。收集下层乙腈相,在50℃水浴中旋转蒸干后复溶于1m L的甲醇/水(2∶8,v/v)中,用0.45μm的滤膜过滤后供ELISA检测。

1.6 未知样品ELISA检测

从不同超市、农贸市场和养鸡场购得未知的鸡蛋50枚,按上述方法提取后进行ELISA检测。

2 结果与分析

2.1 抗原合成

MA具有环状对称的特殊结构,有3个氨基可供偶联载体。如果采用氨基的反应直接与蛋白连接,则3个氨基都可以同载体蛋白偶合,导致MA完全被大分子蛋白包围,这样的抗原不能刺激产生高效价抗体。因此,该研究采用控制MA和琥珀酸酐等量反应摩尔比的方法,只将其中1个氨基连接上带有羧基的4碳间隔臂以合成半抗原。所得半抗原的熔点高于MA的熔点说明产生了一种新物质,红外扫描的数据可证明半抗原上连接了羧基和羰基。另外,半抗原的全波长紫外扫描曲线和最大波长均与MA相似,说明MA分子中的三嗪环没有被破坏。这些均证明半抗原合成成功。

在用混合酸酐法将半抗原与载体蛋白连接后,将半抗原、载体蛋白和偶联物进行紫外全波长扫描,从图3可以看出,偶联物的曲线是半抗原和载体曲线的叠加,从而证明免疫原和包被抗原均偶联成功。

2.2 抗体灵敏度与特异性

要建立一种ELISA方法,必须要获得针对被测物的特异性抗体。该研究用自制的抗原免疫动物获得了针对MA的特异性抗体,以该抗体为基础首次建立了检测MA的间接竞争ELISA方法。该法对MA的半数抑制浓度(IC50)为42ng/m L,在3、6、12、25、50、100、200、400 ng/m L的浓度范围内,MA对该抗体的竞争抑制曲线见图4。以抑制率为10%计算,该ELISA方法对MA的检测限为8.5 ng/m L,完全可以满足对MA的残留检测要求。因此,该方法的灵敏度等同或优于文献报道的ELISA试剂盒的灵敏度,明显高于报道的仪器方法的灵敏度。由于合成的半抗原中还有2个游离的氨基,与其结构有相似性的物质可对该抗体产生抑制作用。因此,该抗体对环丙氨嗪有70%的交叉反应率,对三聚氰胺二酰胺有5%的交叉反应率,对其他代谢物没有交叉反应。

2.3 样品提取

对于从生物样品中提取MA的溶剂,国内外有许多文献报道。中国农业部发布的标准方法是采用三氯乙酸作为提取液,国家质检总局发布的公告中采用三氯乙酸和乙腈作提取液。另外,还有采用乙腈∶水(1∶1)[2]、柠檬酸和己烷磺酸钠的缓冲液[3]、盐酸[4]或乙酸[5]、甲醇∶水(1∶1)[10]、酸性乙腈[13]等溶液来提取MA。因为MA属于强极性碱性化合物,它应该在碱性溶液中溶解度更大。因此,有多篇文献报道采用碱性乙腈来提取肌肉、鸡蛋、牛奶[6,7,18]和饲料[19]中的MA,均达到了理想的提取效果。该研究采用含20%氨水的乙腈对鸡蛋中的MA进行提取,然后过滤膜后ELISA检测。从图4可以看出,空白样品提取液中添加MA标准液的抑制曲线与MA标准品的曲线相似,说明该提取方法可基本除去样品基质中的干扰。由于本提取方法未对提取液进行稀释或浓缩,因此,该ELISA方法对MA标准品的检测限也被认定为对鸡蛋中MA的检测限,即8.5 ng/g。在空白鸡蛋中按20、50、100ng/g的浓度添加MA标准液后,按该方法提取,ELISA检测,添加回收率结果见表1。可以看出,在3个添加浓度下,MA的日间和日内回收率范围均在88.9%~96.1%之间,变异系数均小于11.6%。

2.4 未知样品检测

ELISA方法是目前兽药残留检测中常用的筛选方法,但到目前为止,国内外均未见有建立ELISA方法对MA进行检测的研究报道。该研究利用建立的ELISA方法用于对市场购得的50枚鸡蛋进行检测。结果发现,有2枚鸡蛋中检测出含有MA残留,浓度分别为36、84 ng/g。这可能是由于给鸡饲喂了高浓度的环丙氨嗪代谢而来,或是使用了MA非法添加的饲料。但残留浓度较低,远低于国家规定的在奶制品中的含量限值,应该不会对消费者身体健康造成危害。

3 结论与讨论

酶联免疫吸附实验 篇8

1 材料与方法

1.1 样本与试剂

北京康彻思坦生物技术有限公司HbsAg标准品 (标准值:2ng/ml) , 批号GBW (E) 090072;珠海丽珠试剂股份有限公司生产的ELISA试剂盒。

1.2 仪器

MR-96A酶标仪, 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司;移液器 (50μl) , 大龙医疗设备 (上海) 有限公司。

1.3 方法

以试剂盒说明书为参照, 基本流程为, 移液器加入血清和酶标抗体, 37℃孵育30min后洗涤, 然后加入显色剂A、B液, 37℃孵育15min, 然后加终止液, 最后酶标仪比色。HbsAg的不确定度包含测量重复性、操作过程以及酶标仪比色的不确定度。

1.4 数学模型

通过标准系列的OD值测定, 建立标准线性曲线, 数学模型为:y=x, (x—被测样本的浓度, 单位为ng/ml;y—被测样本的浓度, 单位为ng/ml) 。

2 结果

2.1 不确定度的计算

2.1.1 输入量的标准不确定度的分析与计算

由于工作曲线非线性引起的输入量x的标准不确定度分项u1。分别对质控血清中的HBsAg标准系列进行5次重复测定, 其吸光度/值测量数据见表1。

根据测量数据用线性回归法得标准工作曲线:Y=0.012+0.244x, 相关系数为r=0.999 6。

对于拟合的标准工作曲线非线性引起的不确定度u1=Sy/[∑ (xi-x) ]1/2=4.73×10-3v1=4。

测定未知样本浓度时重复性引起输入量X的标准不确定度分项u2, 测定5次结果分别为0.672、0.668、0.675、0.670、0.675。

实验标准差s通常可采用贝塞尔法计算:u2=S/n1/2=1.38×10-3v2=4。

2.1.2

由酶标仪测定OD值引起的不确定度为u3。u3由市质量技术监督局检定酶标仪并提供不确定度0.005, 自由度v3=47。

2.1.3

移液器实验过程中造成的不确定度u4, 移液器检定证书提供的数据, 加样量为50ul的误差为0.004。u4=0.004/31/2=2.31×10-3v4→∞。

2.2 合成标准不确定度

由于u1、u2、u3、u4各自独立, 因此u= (u12+u22+u32+u42) 1/2=7.39×10-3

有效自由度veff=21.40≈21。

2.3 扩展不确定度

Up=kp×up=95%kp=t95 (21) =2.080U95=2.080×0.007 39=0.015。

3 结论

综上所述, 实验中的HBsAg不确定度由直线回归曲线的标准差、酶标仪的不确定度、测量值的标准偏差、移液器的不确定度组成, 其它的因素可忽略不计。

结果得出该未知血清的HBsAg浓度为0.672ng/ml, 扩展不确定度U95=0.015ng/ml (自由度为21) 。

参考文献