吸附纯化（共7篇）
吸附纯化 篇1
1 仪器和试药
1.1 仪器
Agilent高效液相色谱仪:包括化学工作站, VWD检测器, ZORBAX SB-C18 (5μm, 4.6×250mm) 色谱柱;梅特勒电子天平。
1.2 试剂
甲醇为色谱纯 (美国天地公司) , 其余为分析醇。
1.3 对照品
阿魏酸对照品由中国药品制品检定所提供。
1.4 药材
当归购于甘肃岷县, 为道地药材, 经鉴定为当归Angelica sinensis (Dliv.) Diels的干燥根。
1.5 大孔吸附树脂
购于天津南开大学化工厂。
2 色谱条件
Z O R B A X S B-C 1 8 (5μm, 4.6×250mm) 色谱柱;柱温:30℃;流动相:甲醇∶0.05%冰醋酸 (40∶60) ;检测波长:320nm;流速:0.6ml/min。
3 实验方法
3.1 树脂的前处理
取市售大孔吸附树脂, 用乙醇加热回流提取洗脱, 洗至洗脱液蒸干后无残留。经乙醇洗净的树脂保存备用。以乙醇湿法装柱。继续用乙醇在柱上流动清洗, 不时检查流出的乙醇, 至与水混合不呈白色混浊为止 (取1ml乙醇液加2ml蒸馏水) 。然后以大量的蒸馏水洗去乙醇, 洗至流出液Molish反应呈阴性, 备用。少量乙醇的残留将会大大降低树脂的吸附能力。
3.2 不同树脂比吸附量 (absorbtion ratio) 的测定
精密量取当归提取液75ml (每ml含生药1g) , 加到已经前处理的树脂, 调节流速为0.5ml/min, 过柱流出液重吸附2次, 静置15分钟, 用水洗至流出液Molish反应呈阴性, 再用95%的乙醇洗脱, 洗脱至流出液无色为止。结果见表1, AB-8型大孔吸附树脂具有较大比吸附量, 性能优于其他几种树脂。故选择弱极性树脂AB-8作为当归总酚酸吸附纯化的树脂。
3.3 A B-8型大孔吸附树脂对当归总酚酸吸附, 分离相关参数的研究
3.3.1 比上柱量 (saturation ratio) 的测定
精密量取当归提取液50ml (1g生药/ml) , 加到已经前处理的树脂, 调节流速为0.5ml/min, 过柱流出液重吸附2次, 静置15分钟, 测定其比上柱量。比上柱量是所用树脂达吸附终点时, 单位质量干树脂吸附夹带成分的总和, 即S= (M上-M残) /M。经测定, AB-8型大孔
吸附树脂对当归总酚酸 (以阿魏酸计) 的比上柱量为5.60, RSD=3.40%。
3.3.2 比吸附量 (absorbtion ratio) 的测定
上述树脂用水洗至流出液Molish反应呈阴性, 测定其比吸附量。比吸附量是单位质量干树脂吸附成分的总和。即A= (M上-M残-M水) /M。经测定, AB-8型大孔吸附树脂对当归总酚酸 (以阿魏酸计) 的比吸附量为3.88, RSD=3.99%。
3.3.3 洗脱溶媒的选择
取AB-8型大孔吸附树脂7克, 湿法上柱, 平行制备7份, 分别经过前处理, 根据吸附容量, 精密吸取当归提取液 (1g生药/ml, 含阿魏酸0.8439mg/ml) 上柱, 过柱流出液重吸附2次, 静置15分钟, 用蒸馏水洗脱至流出液Molish反应呈阴性, 分别用30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%的乙醇洗脱, 测定其中阿魏酸的含量。
另当归提取物每ml含固形物0.5373g, 经过计算, 其纯度为0.158%。结果显示30%乙醇洗脱液所得样品中, 阿魏酸纯度为9.60%, 相对含量最高, 故确定洗脱溶媒为30%的乙醇溶液。当归提取物经过AB-8大孔吸附树脂的吸附、洗脱后, 在固形物含量降低的同时, 纯度呈显著性提高。
3.3.4 洗脱累积率的测定
取AB-8型大孔吸附树脂7克, 湿法上柱, 经过前处理, 根据该树脂的吸附容量, 精密吸取当归提取液 (每ml含1克生药) 上柱, 用蒸馏水洗脱至流出液无色, 用30%乙醇液洗脱, 刚开始连续收集50ml洗脱液, 以后分段收集, 每50ml收集一次, 累计收集350ml。计算各部分洗脱液中阿魏酸的含量, 测定结果可知, 用30%乙醇液洗脱, 收集150ml洗脱液, 99.23%的指标成分已从树脂上解吸下来, 即洗脱体积为9BV。
3.3.5 比洗脱量 (Eluation ratio) 的测定
取AB-8型大孔吸附树脂, 湿法上柱, 经过前处理, 根据该树脂的吸附容量, 精密吸取当归提取液 (每ml含1克生药) 上柱, 用蒸馏水洗脱至流出液无色, 用30%乙醇液洗脱, 收集洗脱液200ml (终点) , 计算其比洗脱量。比洗脱量是吸附达饱和后, 用一定浓度的乙醇洗脱至终点, 单位质量干树脂洗脱成分的质量, 即E=M醇/M。经测定, 比洗脱量为3.16, RSD=2.69%。
3.3.6 不同浓度的当归提取物对AB-8树脂吸附性能的影响
原液浓度会直接影响到AB-8树脂吸附性能。故用不同浓度的当归提取物上柱, 考察其比吸附量及解吸率, 为选择适宜的上样浓度提供依据。定量加入已知含量的当归提取物, 以2BV/1小时的流速上样吸附洗脱, 用蒸馏水洗脱至流出液无色, 再用30%乙醇液洗脱至终点。经试验, 虽然上样浓度高, 比吸附量也随之增加, 但解吸率显著降低, 有效成分不能被完全洗脱下来。因此选择当归药液浓度为1.0g/ml为宜。
3.4 讨论
3.4.1 不同类型树脂对同一成分有不同程度的吸附, 同一型号树脂对多种成分也有不同程度的吸附。为了使树脂法成功地应用于生产, 除选用分离介质, 还要配合最佳的工艺条件, 如药液的预处理, 浓度, PH, 吸附和解吸附的速度, 洗脱剂的选用。同一成分, 所用的大孔树脂的型号不同, 其吸附性能有很大的差异, 故富集纯化不同的成分对大孔树脂的选择很有必要。
3.4.2 当归提取物在没有上柱分离之前, 阿魏酸的含量仅为0.9%, 结果大孔吸附树脂富集纯化, 纯度提高到9.6%。
3.4.3 一般情况下, 纯化同一种药物的大孔树脂, 当其吸附量下降30%以上时, 应视为不宜再用。故应该积累树脂再生的研究数据, 建立合理的树脂再生方法及再生合格标准, 使不同批次产品的纯化效果稳定并能节约成本。
摘要：目的:选择适宜的大孔吸附树脂来纯化当归中酚酸类成分, 并优选其相关参数。方法:采用HPLC法, 测定阿魏酸的含量。结果:选择AB-8型大孔树脂作为当归酚酸类成分吸附纯化的树脂。结论:AB-8型大孔树脂对当归酚酸类成分吸附及洗脱参数为:比上柱量=5.6, 比吸附量=3.88, 比洗脱量=3.66, 洗脱溶媒为30%的乙醇, 洗脱体积为9VB。
关键词：大孔吸附树脂,当归,阿魏酸
吸附纯化 篇2
TU-1900双光束紫外-可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司) , 酸枣仁皂苷A对照品 (批号:110734-201201, 中国药品生物制品检定所) 。
2 方法与结果
2.1 酸枣仁总皂苷含量测定[1]
2.1.1 对照品溶液的制备
精密称取酸枣仁皂苷A标准品3.0 mg, 置于10 ml容量瓶中, 用甲醇溶解并稀释至刻度, 配制成0.3 mg/ml的对照品溶液备用。
2.1.2 标准曲线的绘制
在472 nm波长处采用比色法, 以吸收度 (Y) 为纵坐标, 以质量 (X) 为横坐标, 计算得回归方程Y=16.205X-0.0015 (r=0.9991) 。
2.1.3 样品测定
精密吸取供试溶液适量, 置于10 ml具塞试管中, 挥尽溶剂, 按照“2.1.2”项下总皂苷测定方法进行样品测定。
2.2 酸枣仁总皂苷纯化工艺参数考察与优化
2.2.1 酸枣仁总皂苷的静态吸附及解吸附考察
精密称取预处理后的六种大孔吸附树脂5 g (干树脂) , 分别将其置于500 ml锥形瓶中, 加入250 ml酸枣仁供试液, 预吸附24 h后吸取上清液测量吸光度, 从而计算吸附量。将上述6种吸附树脂滤出, 水洗, 滤纸吸干, 每种树脂等分成4份, 分别精密加入30%、50%、70%、90%乙醇200 m L, 振摇解吸附24 h, 精密量取1.0 ml, 测定吸收度, 结合吸附量计算解吸率。通过吸附—解吸试验, 可知HPD-100型大孔吸附树脂吸附量为122.5 mg/g, 70%乙醇解吸率为96.93%。综合分析各类型大孔树脂对酸枣仁总皂苷的吸附量、解吸率, 选择HPD-100型大孔吸附树脂对酸枣仁总皂苷进行富集。
2.2.2 HPD-100型大孔吸附树脂动态吸附考察
2.2.2. 1 原液浓度对吸附的影响
取5 g (干树脂) 装柱, 准确称量样品溶液5份, 每份10 ml, 分别加入蒸馏水0、5、10、15、20 ml, 体积流量为0.5 ml/min, 分别收集5份过柱液, 完成含量测定和吸附容量的计算。结果表明, 酸枣仁总皂苷吸附溶液质量浓度在1.05~1.58 mg/ml为最佳, 因此可考虑用1.58 mg/ml酸枣仁提取物直接上大孔吸附树脂进行富集。
2.2.3 HPD-100型大孔吸附树脂动态解吸附考察
2.2.3. 1 洗脱剂浓度的影响
取酸枣仁提取物溶液上样, 将4根HPD-100树脂柱 (干树脂5 g) 分别用等量蒸馏水洗脱, 流速控制为1ml/min, 蒸馏水洗脱馏分中Molish反应呈阳性, 说明蒸馏水可除去糖类杂质, 进而以1 ml/min流速分别用30%、50%、70%、90%乙醇洗脱, 5%香草醛浓硫酸反应作为指标, 洗脱至反应为阴性。洗脱后的各馏分经水浴浓缩至干后减压干燥, 冷却后称重并测定其中总皂苷的含量, 计算总皂苷回收率。结果表明, 选用70%的乙醇作洗脱剂, 总皂苷百分含量和总皂苷回收率均最高。
2.2.3. 2 洗脱剂用量的考察
按照以上试验确定的吸附洗脱条件, 70%乙醇的用量是影响酸枣仁皂苷纯化的主要因素, 称取HPD-100干树脂5 g, 按饱和时上样量取酸枣仁提取物溶液168 ml, 待吸附完全后用蒸馏水洗脱至Molish反应呈阴性, 后用70%乙醇洗脱, 分段收集馏分, 共收集5份, 每份40 ml, 馏分经水浴浓缩至干后减压干燥, 冷却后称重并测定其中总皂苷的含量。结果表明, 总皂苷的含量从第1份到第5份在逐渐减少, 说明酸枣仁总皂苷至第5份时已基本被解析附完全, 故确定洗脱剂的用量为200 ml, 相当于40 ml/g (干树脂) 。
3 讨论
本研究通过静态吸附解吸附实验考察了AB-8、NKA-9、HPD-100、D-101、D-301、X-5等六种大孔吸附树脂对酸枣仁皂苷的吸附与解吸附能, 结果表明HPD-100型大孔吸附树脂吸附容量大、解析率高、吸附速度快, 对纯化酸枣仁皂苷工艺具有较高应用价值。洗脱实验结果表明:酸枣仁总皂苷富集于70%乙醇洗脱液部位, 回收率为91.77%, 工艺稳定可行, 重现性好。
摘要：目的 研究最佳大孔吸附树脂纯化酸枣仁皂苷工艺。方法 分别从静态吸附及解吸附考察酸枣仁总皂苷的解析率, 从动态吸附及解吸附考察洗脱剂用量、浓度。结果 选用HPD-100大孔吸附树脂, 酸枣仁总皂苷富集于70%乙醇洗脱液部位, 回收率为91.77%。结论 通过大孔吸附树脂富集方法可较好地纯化酸枣仁皂苷, 工艺稳定可行。
关键词：酸枣仁,纯化,总皂苷,大孔吸附树脂
参考文献
吸附纯化 篇3
1实验材料
YF200高速中药粉碎机:瑞安永历制药机械有限公司;UV758紫外可见分光光度计:上海精密仪器仪表有限公司。
紫苏于2008-09采自杭州天目山, 经鉴定为紫苏[Perilla frutescens (L.) Britt]的地上部分, 阴干, 备用。芦丁标准品:购自中国药品生物制品检定所, 批号:100080-20030。HPD系列大孔树脂:沧州宝恩化工有限公司;AB-8、D101大孔树脂:天津海光化工有限公司。所用试剂均为分析纯。
2实验方法与结果
2.1 树脂的预处理
大孔树脂分别用蒸馏水、95%乙醇各浸泡、洗涤24小时, 使其充分溶胀, 湿法装柱;95%乙醇洗脱, 至流出液加水无白色混浊为止。用蒸馏水洗尽乙醇, 备用。
2.2 上样液的制备
称取紫苏干燥粗粉200g, 16倍量60%乙醇回流提取2次, 2h/次, 合并滤液, 减压浓缩至含醇量10%左右, 抽滤, 定容至500ml, 作为上样液备用。
2.3 总黄酮含量测定
精密称取105℃干燥恒重的芦丁标准品12mg, 置25ml容量瓶, 加50%乙醇溶解、定容, 即得浓度为0.48mg/ml的标准品溶液。精密吸取标准品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml, 分别置25ml量瓶, 间隔6分钟, 依次加入1ml 5%NaNO2、1ml 10%Al (NO3) 3、10ml 10%NaOH, 加50%乙醇定容, 混匀, 静置15分钟, 于500nm处测定, 以平行试剂为空白[4], 以吸光度 (A) 对浓度 (C) 绘制标准曲线, 得回归方程:A=0.3643C+0.001497 (r=0.9997) , 结果表明芦丁浓度在0.24～2.40mg范围内呈良好的线性关系。
2.4 静态吸附实验
2.4.1 吸附量的测定
精密称取经预处理的树脂各10g, 置100ml具塞锥形瓶中, 分别加入已知浓度的上样液, 静态吸附5小时, 使其饱和吸附, 抽滤, 取续滤液1ml, 按2.3项测定其平衡浓度, 计算静态吸附量。
2.4.2 解吸率的测定
将上述饱和吸附的树脂抽滤, 加95%乙醇静态解吸5小时, 取续滤液1ml按2.3项测定解吸液浓度, 计算静态解吸率。结果见图l。计算公式如下:
①吸附率= (初始浓度-平衡浓度) /初始浓度×100%;②解吸率= (解吸液浓度×解吸液体积) /吸附量×100%;
2.4.3 吸附动力学曲线
取10ml紫苏总黄酮吸附液, 加5g HPD300大孔树脂进行静态吸附, 间隔0.5小时, 分别计算不同时间总黄酮的吸附量, 绘制静态吸附动力学曲线, 结果见图2。
由图2可知, 随着吸附时间的延长, 树脂的吸附量逐渐增大, 当吸附时间达到2小时时, 吸附量趋于饱和。根据Langmuir吸附速率方程计算[5,6], 可初步分析得不同大孔树脂对紫苏总黄酮的吸附速率:-Ln (1-Qt/Qe) =Kt (Qt为t时刻树脂吸附量, Qe为树脂理论饱和吸附量) , 以-Ln (1-Qt/Qe) 对时间t作直线回归, 得吸附平衡速率方程, 结果见表1。
结合图1和图2结果可知, HPD300大孔树脂不仅具有较好的吸附作用, 其达到吸附平衡的时间也短。因此, 实验优选HPD300大孔树脂作为紫苏总黄酮的吸附纯化材料。
2.4.4 等温吸附曲线
室温下, 分别取2.0g大孔树脂, 加10ml不同浓度的上样液, 静态吸附4小时, 测定吸附残液总黄酮含量, 绘制静态吸附等温线, 结果见图3。
由图3可知, 随着样品浓度的增加, HPD300大孔树脂的吸附量逐渐趋于平缓, 当样品浓度达到6～8mg/ml时, 吸附量趋于饱和。而温度变化对大孔树脂吸附紫苏总黄酮的作用影响较小, 吸附温度宜30℃为佳。
2.5 对样品成分的影响
取大孔树脂吸附纯化前后样液各10ml于100ml圆底烧瓶, 加浓盐酸至终浓度为0.6mol/ml, 80℃水浴回流45分钟, 用10%氢氧化钠溶液调pH=4～5, 4000r/min离心分离5分钟, 取上清液, 加80%甲醇稀释定容至500ml量瓶, 摇匀, 微孔滤膜 (0.45μm) 过滤, 作为供试品溶液。按下列色谱条件进样:Hypersil ODS-C18 (250mm×4.6mm, 2.5μm) ;流动相:甲醇-0.4%磷酸溶液 (70:30) , 流速1.0ml·min-1, 柱温:20℃;检测波长340nm;进样量10μl。结果见图4。
按照所筛选的工艺进行吸附、洗脱, 将所收集的洗脱液减压浓缩, 低温真空烘干至恒重, 得总黄酮粗品, 按2.3项下操作测定总黄酮含量, 结果总黄酮纯度达到56.1%, 比粗提物纯度 (13.7%) 提高了4.1倍, 回收率达70.4%。
3讨论
3.1 本研究采用静态吸附实验, 考察了5种型号大孔树脂对紫苏总黄酮的吸附性能, 综合考虑吸附量、吸附速率、解吸率等多方面因素, 发现HPD300大孔树脂对紫苏总黄酮有较好的吸附分离性能。HPD300大孔树脂为聚苯乙烯型非极性树脂, 比表面积800m2/g, 孔径50Å, 经实验发现, 其对紫苏总黄酮具有良好的吸附性能。同时物质在溶剂中的溶解度与树脂对此物质的吸附能力成反比[7]。因此, 本实验研究针对黄酮类化合物易溶于乙醇, 而微溶于水的特点, 采用乙醇回流提取, 浓缩, 加水溶解, 再上大孔树脂柱进行吸附纯化, 显著增加了大孔树脂对紫苏总黄酮的吸附能力。
3.2 叶类药材醇提液中常常含有大量叶绿素等杂质, 易吸附在大孔树脂上, 造成树脂柱的污染、堵塞, 故本实验对粗提液进行减压、抽滤等预处理, 去除叶绿素、脂质等杂质, 一方面可减少上样量, 一方面也可以提高大孔树脂对总黄酮的吸附率。
参考文献
[1]王玉萍, 杨峻山, 赵杨景, 等.紫苏类中药化学和药理的研究概况.中国药学杂志, 2003, 38 (4) :250.
[2]王静珍, 陶上乘.紫苏与白苏药理作用的研究.中国中药杂志, 1997, 22 (1) :48.
[3]王静, 刘大川.紫苏叶黄酮类化合物抗氧化性能的研究.中国油脂, 2004, 29 (3) :33.
[4]蔡健, 王薇.黄瓜叶中总黄酮含量的研究.食品科学, 2005, 26 (8) :54.
[5]林亚平.一元回归在中药研究中的应用.中国中药杂志, 1998, 23 (3) :27.
[6]江咏, 李琳, 陈玲, 等.ConA Sepharose48亲和填料对巴戟天多糖亲和吸附特性的研究.食品科学, 2007, 27 (12) :22.
吸附纯化 篇4
1 实验仪器与材料
1.1 实验仪器
R-501旋转蒸发仪 (上海申顺生物科技有限公司) 、DZF-6050型恒温干燥箱 (上海精宏实验设备有限公司) 、TU-1810型紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司) 、KQ-250DE数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司) 、30 m L三角瓶若干、漏斗若干、量筒、10 m L容量瓶若干、层析玻璃柱等。
1.2 实验材料
菊米 (浙江省) 、芦丁对照品 (中国药品生物制品检定所) 、95%乙醇 (工业纯) 、无水乙醇 (分析纯, 检测) 、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸银均为分析级。
大孔吸附树脂:D101大孔吸附树脂、HPD100大孔吸附树脂、AB-8大孔吸附树脂、HZ841大孔吸附树脂、HZ841B大孔吸附树脂。
2 实验方法
2.1 菊米提取物的制备
称取已粉碎的菊米粉末200 g, 按固液比1∶10加入70%的乙醇, 微沸状态下, 水浴回流3次, 1 h/次, 合并提取液, 减压回收溶剂至浸膏状, 恒温干燥得菊米提取物。
2.2 大孔吸附树脂的预处理
称取5种大孔吸附树脂各10 g, 用95%乙醇浸泡4 h, 放出洗脱液, 用95%乙醇充分淋洗至流出液加3倍水不显浑浊, 再用纯化水反复冲洗至无乙醇味。处理后的大孔吸附树脂用纯化水浸泡备用。
2.3 大孔吸附树脂筛选实验
吸干已处理好的大孔吸附树脂表面水分, 各称取2 g于三角瓶中。精密称取黄酮提取物, 配制成浓度10 mg/m L的供试液, 精密吸取10 m L供试液, 加入各三角瓶中, 置于超声波振荡吸附8 h, 以达到饱和吸附。取上清液测吸光度, 计算树脂的吸附率。
滤出饱和吸附总黄酮的树脂, 吸干表面水分, 精密加入60%乙醇20 m L, 在超声波中振荡2 h后滤出, 测定吸光度, 计算解吸率。
2.4 D101大孔吸附树脂对总黄酮的静态吸附实验
分别精密称取D101大孔吸附树脂1.0 g置于5个30 m L三角瓶中, 加入不同浓度的黄酮供试液各20 m L, 超声波中振荡吸附30 min。取吸附后的溶液测吸光度, 计算不同浓度黄酮供试液的树脂对黄酮的吸附率, 以确定黄酮供试液的最佳上柱浓度。
2.5 D101大孔吸附树脂对总黄酮的静态解吸实验
分别精密称取D101大孔吸附树脂1.0 g置于6个30 m L三角瓶中。精密称取黄酮提取物, 制成最佳上柱浓度的总黄酮供试液, 精密吸取20 m L加入大孔吸附树脂中, 超声波中振荡吸附30 min。过滤, 吸干表面的水分, 加入不同浓度的乙醇溶液15 m L解吸, 测定解吸液吸光度, 计算不同浓度乙醇对黄酮的解吸率, 以确定洗脱剂最佳浓度。
2.6 D101大孔吸附树脂对总黄酮的动态吸附与及解吸实验
称取D101树脂10 g装柱, 以最佳上柱浓度配置溶液上样, 流速1 m L/min, 每1个柱体积收集1瓶流出液, 测定吸光度, 计算出流出液中黄酮的浓度, 绘制树脂对菊米黄酮的吸附曲线。用纯化水洗脱杂质——多糖, 纯化水洗脱液每1个柱体积测定1次总黄酮的吸光度, 计算出总黄酮浓度, 确定水的洗脱倍量。再用60%乙醇对吸附后的树脂解吸, 每半个柱体积收集一瓶解吸液, 测定吸光度, 计算出解吸液中黄酮的浓度。
2.7 D101大孔吸附树脂的使用次数实验
取100 g D101大孔吸附树脂装柱, 用95%乙醇浸泡3～4 h (乙醇高于树脂层10～20 cm) 。结束后用95%乙醇洗至流出液加3倍量的水不显浑浊, 再加纯化水洗至流出液无明显乙醇味。以最佳上样浓度1.5 mg/m L配置溶液上样, 上样量为28 BV, 取吸附后的溶液测吸光度计算黄酮的总吸附量和吸附率, 再用6 BV的纯化水洗脱多糖, 用3 BV的60%乙醇洗脱黄酮。树脂再生:5个柱体积的5%HCL吸脱, 纯化水吸脱至中性, 5个柱体积5%NAOH洗脱至中性。将再生后的树脂重复上述实验, 通过计算吸附后的溶液的浓度确定树脂的吸附能力, 直至树脂的吸附能力降低, 确定大孔吸附树脂的重复使用次数。
2.8 提取液中黄酮含量测定
以芦丁作为标准物质, 采用紫外分光光度法测定总黄酮含量。
计算公式为:
黄酮含量 (以芦丁计) =nC0V1V3/ (WV2) 100%式中n——提取液稀释倍数 (未稀释为1) ;
C0——样液含黄酮浓度, mg/m L;
V1——定容体积, m L;
V2——显色反应测定取用样液体积, m L;
V3——提取液体积, m L;
W——称样量, mg。
3 结果与分析
3.1 大孔吸附树脂吸附量实验
大孔吸附树脂吸附量实验结果如表1所示。
从表1可知:D101大孔吸附树脂的吸附量最高, 吸附率及解析率都较高, 故选用D101大孔吸附树脂分离纯化菊米总黄酮。
3.2 大孔吸附树脂对菊米总黄酮的静态吸附实验
菊米总黄酮上柱液浓度。菊米总黄酮供试液浓度对树脂吸附效果的影响如图1所示。
由图1可见:随着黄酮浓度的增加, 其吸附率呈递减趋势。0.5 mg/m L时吸附率最大, 但供试液浓度偏小, 在生产操作中, 供试液体积偏大;1.0 mg/m L和1.5 mg/m L吸附率差别不明显。基于最大限度处理量的考虑, 选取1.5 mg/m L作为上柱浓度, 其吸附率达到73%, 即菊米总黄酮浓度在1.5 mg/m L左右时更有利于吸附。
3.3 D101大孔吸附树脂对总黄酮的静态解吸实验
洗脱剂的浓度。洗脱剂浓度对树脂解吸效果的影响如图2所示。
由图2可见:随着乙醇浓度的增加, D101大孔吸附树脂对菊米黄酮的解吸率呈递增趋势。当乙醇浓度达到60%以后, 解吸率趋于恒定。且乙醇浓度偏高, 会使其他杂货一起洗脱下来。基于实验的可行性及经济多种因素综合考虑, 选取60%乙醇作为洗脱剂。
3.4 D101大孔吸附树脂对总黄酮的动态吸附与及解吸实验
3.4.1 大孔吸附树脂对黄酮的动态吸附性能
大孔树脂对黄酮的吸附曲线如图3所示。
由图3可见:随着供试液上样量的增加, 流出液中黄酮含量增加, 即树脂对黄酮的吸附效果随上样量的增加而下降。上样量>28 BV (即405 m L) 时, 流出液中黄酮含量基本趋于平衡趋势, 即树脂吸附达到饱和。
3.4.2 纯化水洗脱的用量
纯化水对黄酮的解吸曲线如图4所示。
由图4可见:纯化水用量在6 BV时, 解吸液中黄酮总量基本不变, 所以纯化水的用量为6 BV。
3.4.3 60%乙醇洗脱的用量
60%乙醇对黄酮的解吸曲线如图5所示。
由图5可见:60%乙醇用量在6个1/2 BV时, 解吸液中黄酮总量基本不变, 所以60%乙醇用量为3 BV。
3.5 D101大孔吸附树脂对总黄酮分离纯化的次数实验
D101大孔吸附树脂使用次数与收率的关系如表2所示。
D101大孔吸附树脂吸附率变化曲线如图6所示。
由图6可见:D101大孔吸附树脂的吸附率随着使用次数的增加而不断下降, 第6次后吸附率降低至50%以下。从实际生产时的经济效益来看, D101大孔吸附树脂对总黄酮分离纯化次数为6次。
4 结语
(1) 5种大孔吸附树脂中, D101对菊米黄酮的吸附量较大, 吸附率与解吸率较高, 是较理想的载体, 适用于菊米黄酮的分离纯化。
(2) D101大孔吸附树脂分离纯化菊米黄酮流速为10 m L/min时, 最佳上柱供试液浓度约为1.5 mg/m L, 上样量为28 BV, 纯化水洗脱用量6 BV, 洗脱剂乙醇浓度60%, 乙醇洗脱用量3 BV, D101大孔吸附树脂柱的使用次数6次。
摘要：以总黄酮吸附量、吸附率及解析率为指标筛选分离纯化菊米总黄酮的工艺参数。结果:5种大孔吸附树脂中, D101大孔吸附树脂的静态饱和吸附量最高, 为46.2mg/mL, 最佳上柱供试液浓度约为1.5mg/mL, 纯化水洗脱用量6BV, 洗脱剂乙醇浓度60%, 乙醇洗脱用量3BV, D101大孔吸附树脂柱的使用次数5次。结论:D101大孔吸附树脂的静态饱和吸附量为46.2mg/mL, 上柱供试液浓度约为1.5mg/mL, 最佳上样量为28BV, 纯化水洗脱用量6BV, 洗脱剂乙醇浓度60%, 乙醇洗脱用量3BV, D101大孔吸附树脂柱的使用次数6次。
关键词：分离纯化,大孔吸附树脂,菊米,总黄酮,工艺
参考文献
[1]国家药典委员会.中国药典:一部[M].北京:中国医药科技出版社, 2010.1
[2]浙江大学.菊米中黄酮类物质的提取方法[P].中华人民共和国国家知识产权局, 200810162423.8
[3]张素华, 王正云.大孔树脂纯化芦笋黄酮工艺研究[J].食品科学, 2006, 27 (2) :182～186
[4]谢贞建, 唐鹏程, 焦士蓉.大孔树脂分离纯化枳实总黄酮工艺研究[J].食品与药品, 2009, 3:16～19
吸附纯化 篇5
关键词：毛头牛蒡子,多糖,大孔吸附树脂,纯化
牛蒡子,来源于菊科两年生草本植物,是牛蒡属牛蒡(ArctiumLappa L)的干燥成熟果实,为常用中药。同属植物毛头牛蒡(Arctium tomentosum Mill)的干燥成熟果实在新疆有大面积分布[1]。毛头牛蒡子的化学成分较多,主要含有多糖类,木脂素类、黄酮类物质,挥发油,此外还有酚羟基物质、脂肪酸、生物碱等[2]。
大孔吸附树脂(macroporous adsorbing resins)是在离子交换树脂的基础上发展起来并于70年代末用于中草药有效成分的分离[3]。近几年,大孔树脂技术逐渐应用于皂苷及多糖类成分研究。本实验以4种不同型号大孔吸附树脂对毛头牛蒡子的吸附解析性能,筛选出适宜的大孔吸附树脂,最佳洗脱条件,确定纯化工艺,以期为制备高纯度毛头牛蒡子多糖奠定理论基础。
1 材料与仪器
毛头牛蒡子 (采自新疆阿勒泰地区,经中医学院李永和主任药师鉴定为毛头牛蒡的干燥成熟果实);葡萄糖对照品,乙醇,蒽酮-浓硫酸试剂,石油醚,无水乙醇,丙酮,氯仿,正丁醇均为市售分析纯。
大孔吸附树脂:AB-8(天津南大树脂科技有限公司),HPD-300、HPD- 450、HPD- 600型(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)
UV-2550(日本岛津),RE-2000A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),S22PC型可见分光光度计(上海棱光仪器有限公司),AL204电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司),玻璃色谱柱。
2.实验方法
2.1 毛头牛蒡子多糖的提取[4]
粉碎毛头牛蒡子过40目筛,按料液比1∶5加70%乙醇80 ℃恒温浸提3小时,回收乙醇,再以料液比1∶2加蒸馏水超声辅助浸提4小时,3000 r/min离心10分钟,上清液采用Sevage法除去蛋白(Sevage法:按氯仿-正丁醇体积比4∶1配制Sevage试剂,将10 ml Sevage试剂与50 ml质量浓度一定的粗多糖样液混合,剧烈振摇20分钟,4000 r/min离心10分钟分去下层有机相和中间的变性蛋白,收集上清液。将上述方法反复4次),即得毛头牛蒡子多糖粗提液。
2.2 标准曲线的绘制
2.2.1 选择最大吸收波长
精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品25.0 mg,至25 ml容量瓶中,加蒸馏水溶解并定容,摇匀,制得标准品储备液。取1.0 ml标准品储备液置试管中,在另一个试管中取1.0 ml样品粗体液,分别在两个试管中加硫酸-蒽酮试剂4.0 ml,充分振摇,在紫外可见光区(200～800 nm)扫描。在628 nm处,标准品和样品都有最大吸收峰,即为最大吸收波长。(见图1)。
2.2.2 标准曲线的绘制
精密吸取标准品储备液0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0 ml,分别置10 ml容量瓶中,用蒸馏水定容。分别精密吸取以上新配制标准溶液各1.0 ml, 分别加入硫酸-蒽酮试剂4.0 ml,摇匀。于沸水浴中加热10分钟,冷却至室温。另取蒸馏水1.0 ml,加硫酸-蒽酮试剂4.0 ml,同法制成空白对照,于628 nm波长测定吸光度。以吸光度值(A)为纵坐标,以葡萄糖浓度(C)为横坐标绘制标准曲线,计算的回归方程,得:A=0.0261C+0.2453(r=0.9900)。
2.3 多糖的测定
精密移取样品溶液1.0 ml,按“2.2.2”项下方法操作,于628 nm波长测定吸光度(经测定毛头牛蒡子粗多糖的浓度为5.6 mg/ml)。
2.4 大孔吸附树脂的预处理[5]
大孔吸附树脂用水洗去除悬浮物及水溶性杂质,并洗至无气泡后,用95%乙醇浸泡24小时后装柱,再用95%乙醇洗脱至流出液与水不产生混浊,继续洗,至流出液无异味,再用蒸馏水洗,至流出液无醇味,既得。
2.5 树脂的筛选
2.5.1 静态吸附研究[6]
称取4种预处理过的大孔吸附树脂(湿重5 g),分置100 ml锥形瓶中,各加入毛头牛蒡子多糖样品溶液5 ml,每隔5分钟振摇10秒持续2小时,静置12小时,使其达到饱和吸附,过滤,测定毛头牛蒡子多糖浓度,按下式计算吸附率:吸附率(%)=(C0-C1)/C0×100%。式中:C0为吸附前液体多糖浓度(mg/ml);C1为吸附后液体多糖浓度(mg/ml)。
2.5.2 静态解析研究
对达到饱和的树脂用5ml,50%乙醇解析,每隔5分钟振摇10秒持续5小时,过滤,取溶液定容,测定滤液中毛头牛蒡子多糖浓度。按下式计算解析率:解析率(%)=C0/(C1-C2)×100%式中:C0为吸附前液体多糖浓度(mg/ml);C1为吸附后液体多糖浓度(mg/ml);C2为上清液的平衡多糖浓度(mg/ml),结果AB-8型大孔吸附树脂的多糖吸附率,解析率均较高,故选用AB-8型大孔吸附树脂为最佳树脂进行后续实验。详见表1。
2.6 上样液浓度的确定
用不同浓度的毛头牛蒡子提取液进行吸附实验,浓度高于或低于2.8 mg/ml时吸附率明显降低,不便于上样,因此上样液浓度以2.8 mg/ml时为宜。
2.7 洗脱溶剂浓度的确定[7]
依次用水、30%、50%、70%乙醇,用2 BV/h的流速,对已装好一定浓度的样品水溶液的大孔树脂柱进行洗脱,测定洗脱液中毛头牛蒡子浓度。结果50%乙醇洗脱液中毛头牛蒡子多糖含量最高。所以确定洗脱剂乙醇浓度50%为最佳。
2.8 洗脱剂用量的确定
选用AB-8型大孔吸附树脂,按“2.4”项下处理,上样液浓度2.8 mg/ml,进行上柱,吸附。用50%乙醇洗脱,分段收集50%乙醇洗脱液。每个树脂体积收集洗脱液,每次用Molish试剂验证有无多糖洗出,洗至无多糖洗出。2 BV的洗脱溶剂把毛头牛蒡子中多糖已洗脱完全。故确定洗脱剂用量为2倍树脂体积。
2.9 重复性实验
选用AB-8型大孔吸附树脂,按“2.4”项下处理,精密吸取3份样品溶液(浓度2.8 mg/ml),分别进行上柱,吸附。用50%乙醇洗脱,洗脱速度2 BV/h,收集洗脱液,测定毛头牛蒡子多糖含量,结果表明实验方法可靠稳定,见表2。
3.讨论
(1)上样液浓度是影响树脂吸附性能的重要因素之一,浓度低,树脂未被饱和,浓度高则不能被完全洗脱,导致最终结果不准确。(2)确定洗脱溶剂用量可以使多糖完全的洗脱,还可以避免溶剂的消耗。(3)洗脱流速会影响测定结果,流速太低,多糖流出速度慢,消耗时间较长;流速过快,大孔吸附树脂对多糖的吸附量减少,不能发挥出树脂的吸附功能。所以应选出最佳流速。(4)本实验对比考察4种树脂的吸附,解析能力,AB-8型大孔吸附树脂表现出对毛头牛蒡子中多糖分离纯化的最优能力,确定上样液浓度以2.8 mg/ml时为宜,洗脱剂乙醇浓度50%为最佳,洗脱剂用量为2倍树脂体积,用2 BV/h的流速,可很好的将毛头牛蒡子多糖进行洗脱富集,为毛头牛蒡子的综合开发提供新的思路和方法。大孔吸附树脂具有良好的吸附解析能力,在天然产物的分离纯化方面表现出很好的优越性,可广泛用于各类中草药有效成分的现代化研究。
参考文献
[1]韩潇,赵艳龙.毛头毛头牛蒡子中总黄酮最佳提取工艺研究[J].亚太传统医药,2010,6(8):34-35.
[2]于宏.牛蒡的化学成分与生物活性[J].国外医药·植物药分册,2007,22(6):244-246.
[3]李崇明,熊富良,黄志军,等.新药研究中大孔树脂型号与规格的选择应用[J].中成药,2008,30(8):1208.
[4]任海伟,陈海秀,唐学慧,等.大孔吸附树脂纯化薏苡多糖的研究[J].食品工业技术,2012,33(3):249-254.
[5]吕新建,廉宜君,刘红,等.LSA-5B型大孔树脂纯化沙枣多糖的工艺研究[J].时珍国医国药,2010,21(11):2785-2786.
[6]汤伟,彭求贤,严愉妙,等.大孔吸附树脂法及分离交换层析柱法精制纯化丹参多糖的研究[J].中药材,2010,33(12):1937-1941.
吸附纯化 篇6
1 仪器与试剂 (原料、药材)
1.1 仪器:
HH-4数显恒温水浴锅;RE-52A型旋转蒸发器;UV-3010型紫外可见分光光度计 (日本东芝公司) ;CP225D型电子天平 (北京赛多利斯仪器系统有限公司)
1.2 试药:
乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等, 均为分析纯。
1.3 药材:
菊花:购于安徽亳州药材市场, 经辽宁中医药大学王冰教授鉴定为正品。
1.4 对照品:
芦丁对照品中国药品生物制品检定所供含量测定用批号:2010-0821
2 方法与结果
2.1 树脂静态吸附考察:
2.1.1 对照品溶液的制备
精密称取芦丁对照品适量, 置100mL容量瓶中, 加60%乙醇溶解, 定容, 即得0.23mg/mL的对照品溶液。
2.1.2 标准曲线的确定
精密吸取芦丁对照品溶液0mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL、15mL, 分别置25mL容量瓶中, 加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL摇匀, 放置6min, 加入10%硝酸铝溶液0.3mL摇匀, 放置6min, 加入4%氢氧化钠溶液4mL摇匀, 放置15min, 用60%乙醇稀释至刻度。以1号作为空白, 510nm处测吸收度, 绘制标准曲线, 计算回归方程为Y=0.2066X+0.0048, r=0.9996.可知芦丁含量在0.23mg-3.45mg范围内, 与吸光度之间呈现良好的线性关系[1,2,3,4]。
2.1.3 药物的提取
称取菊花300g, 以60%乙醇为溶剂, 提取3次, 每次2小时, 合并提取液, 回收乙醇, 定容至600mL。
2.1.5 最大吸附率的测定
称取经预处理的各型号树脂, 各约4g (抽滤至干) , 分别加入50mL药液, 密闭放置。分别于0、1、2、3、6、12、24、36、48小时吸取2mL药液, 置25mL容量瓶中, 按2.1.2方法显色, 在510nm处测定吸光度值, 计算最大吸附率。结果见表1
结果可见, 大孔吸附树脂D101、AB-8的吸附率较高。
2.2 树脂解吸率测定
将完成静态吸附的树脂与药液分离, 用水淋洗一次, 置具塞三角瓶中, 各加入60%乙醇50mL, 静置, 分别在0、1、2、3、6、12、24、36、48小时取样2mL液, 置25mL容量瓶中, 按2.1.2方法显色, 在510nm处测定吸收度, 计算各树脂的解吸率, 结果见表2。
通过实验结果分析可见, 在相同条件下, 大孔吸附树脂D101对菊花总黄酮的解吸率较高。
2.3 树脂的选择
通过实验所得数据, 选用吸附率、解吸率均较高的D101作为对菊花总黄酮进行纯化分离的树脂。
3 讨论与结论
3.1 讨论
静态吸附并不能完全确定生产过程中的具体参数, 还需要通过动态吸附试验来进行参数的确定, 通过静态试验, 完成的是树脂种类的选择, 具体参数的确定还需要在今后实验中通过动态吸附考察来完成。
3.2 结论
通过实验结果显示, D101大孔吸附树脂用于对菊花提取物中总黄酮的纯化, 其静态吸附率和静态解吸率均高于其它树脂, 应用于菊花中总黄酮的纯化分离, 可以减少黄酮的损失。
摘要：目的 本实验主要对菊花中总黄酮的大孔树脂纯化工艺进行研究, 从5种不同的大孔树脂中筛选分离纯化菊花总黄酮的最佳树脂。方法 以菊花中总黄酮的静态吸附参数为指标, 确定最优的大孔吸附树脂。结果 经过各种指标研究, 发现D-101型树脂对菊花总黄酮的吸附率、解吸率均好于其他树脂。结论 D-101型大孔吸附树脂法能有效地分离纯化菊花中的总黄酮。
关键词：菊花,总黄酮,大孔吸附树脂
参考文献
[1]卫强, 彭如玉.滁菊中总黄酮的大孔树脂纯化工艺研究[J].中药材, 2008, 31 (1) :147-149.
[2]张健, 钱大玮.菊花的化学成分研究[J].中国中药杂志, 20O6, 33 (5) :526-529.
[3]程文明, 汪燕燕.大孔吸附树脂法纯化野菊花总黄酮[J].安徽医科大学学报, 2006, 41 (4) :406-409.
吸附纯化 篇7
1 仪器与试药
1.1 仪器
Waters2695高效液相色谱仪 (美国沃特世公司) ;AS20500A型超声波清洗器 (天津奥特赛恩斯仪器有限公司) ;TGL-18C-C型高速台式离心机 (上海安亭科学仪器厂) ;CPA225D型电子分析天平 (德国sartorius公司) ;Lichrospher C18 (250 mm×4.6 mm, 5µm) (江苏汉邦科技有限公司) ;SHB-Ⅲ真空泵 (郑州长城科工有限公司) ;UV-1100红外分光光度计 (上海美普达仪器公司) 。
1.2 试剂及药品
北五味子 (安徽万生中药饮片有限公司) ;五味子醇甲 (批号:110857-201010, 中国药品生物制品检定所) ;五味子甲素 (批号:110857-201010, 中国药品生物制品检定所) ;五味子乙素 (批号:110765-200710, 中国药品生物制品检定所) ;甲醇 (分析纯, 江苏汉邦科技有限公司) ;乙腈 (色谱纯, 美国Tedia公司) ;磷酸 (分析纯, 南京化学试剂有限公司) ;纯净水 (娃哈哈集团) ;AB-8型树脂 (河北沧州宝恩有限公司) ;D101型树脂 (河北沧州宝恩有限公司) ;X-5型树脂 (河北沧州宝恩有限公司) ;HPD100型树脂 (河北沧州宝恩有限公司) 。
2 实验方法和结果
2.1 三种五味子木脂素的HPLC分析方法的建立
2.1.1 色谱条件
色谱柱为Lichrospher C18 (250 mm×4.6 mm, 5µm) , 柱温35℃, 进样量10µl, 体积流量为1.00 ml/min, 波长检测λ=254 nm, 流动相为A (乙腈) -B (水) , 梯度洗脱程序见表1。
2.1.2 溶液的制备
2.1.2. 1 提取液的制备
取干燥的五味子适量, 用8倍药材量30%乙醇浸泡过夜, 滤过, 滤液弃去, 生药残渣干燥, 粉碎成粗粉, 干燥, 称重。用75%乙醇回流提取3次, 第1次加入4倍量提取3 h, 第2次2倍量2 h, 第3次3倍量1 h, 合并提取液, 放置48 h, 弃去沉淀, 虹吸上清液, 减压回收乙醇得稠状物, 再加2倍粗粉量95%乙醇, 摇匀, 静置24 h, 滤过, 收集滤液即得五味子提取液。将醇提液回收乙醇后, 取3等份, 分别加水稀释成药材浓度为0.128、0.064、0.032 g/ml的药液, 备用。
2.1.2. 2 混合标准品溶液制备
精密称取标准品五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素适量, 置于25 ml的容量瓶中, 加甲醇溶解并稀释至刻度, 即得含五味子醇甲281.6µg/ml、五味子甲素264.0µg/ml、五味子乙素493.6µg/ml的混合标准品溶液, 备用。
2.1.2. 3 供试品的制备
取上述提取液适量, 加倍量甲醇, 摇匀, 14000 rpm离心10 min, 取上清液微孔滤膜 (0.45µm) 滤过, 备用。
2.1.3 系统适应性考察
取混合标准品溶液和供试品溶液按上述色谱条件注入色谱仪, 结果色谱图见图1和图2。
注:1:五味子醇甲, 2:五味子甲素, 3:五味子乙素
注:1:五味子醇甲, 2:五味子甲素, 3:五味子乙素
2.1.4 标准曲线的绘制
精密吸取2.1.2.2项下混合标准品溶液5 ml, 置10 ml量瓶中, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀。以此法等比例配制后续溶液。分别吸取各浓度溶液10µl, 按2.1.1色谱条件, 进样测定。以质量浓度 (X) 对峰面积 (Y) 进行线性回归, 得到三条标准曲线, 结果见表2, 三种成分在各自浓度范围内线性关系良好。
2.1.5 精密度
精密吸取同一浓度的混合标准品溶液10µl, 按2.1.1色谱条件, 连续进样6次, 积分三种成分的面积, 分别记录五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的面积, RSD (n=6) 分别为1.05%、1.15%、1.20%。该测定方法的精密度良好。
2.1.6 稳定性
精密吸取同一供试品溶液分别于0、2、4、6、12、24 h进样10µl, 在2. 1.1色谱条件下测定各成分的峰面积, 计算各成分峰面积的RSD (n=6) , 结果为五味子醇甲0.46%、五味子甲素0.44%、五味子乙素0.078%。结果表明供试品溶液中上述三种成分在室温条件下24 h内稳定。
2.1.7 重复性
按2.1.2.3制备方法制备成供试品溶液, 平行6份。在2.1.1色谱条件下分别进样10µl测定, 以峰面积代入回归方程计算三种成分质量浓度, 并计算各成分质量浓度的RSD (n=6) , 结果为五味子醇甲0.94%、五味子甲素1.14%、五味子乙素1.68%。表明该方法重复性良好。
2.1.8 加样回收
精密吸取已知含量的供试品适量置于10 ml容量瓶中, 再加入含五味子醇甲281.6µg/ml、五味子甲素264.0µg/ml、五味子乙素493.6µg/ml的混合标准品溶液5 ml, 加甲醇至刻度, 按2.1.2.3方法制备成供试品溶液, 平行6份, 即得。精密吸取上述溶液10µl, 按2.1.1色谱条件进样测定, 计算各成分回收率和RSD, 结果见表3。
2.2 大孔树脂的纯化工艺考察
2.2.1 大孔树脂的前处理
称取一定量的大孔树脂AB-8、D101、X-5、HPD100, 置于适量体积的95%乙醇浸泡24 h (乙醇没过树脂即可) , 过滤, 置于玻璃层析柱内, 用95%的乙醇洗涤, 直到洗涤液加水无浑浊为止。再改用蒸馏水洗涤, 至洗涤液没有醇味, 取出树脂, 抽滤干, 密封保存于4℃冰箱内, 备用。
2.2.2 大孔吸附树脂的筛选
2.2.2. 1 取AB-8、X-5、D101、HPD100四种树脂各5 g于相同的玻璃层析柱中, 取已知浓度的提取液60 ml, 上样流速1 ml/min, 残留液定容到50 ml, 再用50 ml的水冲洗柱子, 测定残留液中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的含量 (水洗液中未检测出三种成分) 结果见图3。
2.2.2. 2 取上述已吸附有五味子木脂素的树脂, 用95%的乙醇冲洗, 直到冲洗液中检测不到五味子醇甲、甲素、乙素为止, 合并醇洗液, 测定洗脱液中所含醇甲、乙素、甲素的解吸量, 结果见图4。四种树脂对三种成分都能达到较好的吸附, 对五味子乙素的吸附呈现出较大差异, 以AB-8的吸附最高, 故考虑选择AB-8作为纯化木脂素的树脂。
2.2.3 上样工艺考察
2.2.3. 1 上样浓度考察
取AB-8树脂5 g 3份, 分别置于相同的层析柱中, 再取浓度分别为0.128、0.064、0.032 g/ml的药液, 以1 ml/min的流速上样, 每5 ml收集流出液, 检测三种成分, 直到检测出三种成分为止, 记录上样液体积, 计算三种成分的上样量, 结果见图5。三种上样浓度之间没有较大的差异, 考虑到上样时间及未来工业生产, 选择0.128 g/ml为最佳上样浓度, 开展后续研究。
2.2.3. 2 上样流速考察
取AB-8树脂5 g 3份, 分别置于相同的层析柱中, 取浓度为0.128 g/ml的药液60 ml, 分别以1、2、3 ml/min的流速上样, 收集残留液, 50 ml的水冲洗柱子, 检测残留液与水洗液中三者成分的量, 三种成分的上样量结果见图6。上样流速之间没有较大差别, 考虑到上样时间, 选取3 ml/min作为最终上样流速。
2.2.3. 3 径高比考察
取AB-8树脂5 g 3份, 分别置于不同粗细的层析柱中, 形成径高比为1∶9、1∶3.5、1∶2的层析柱, 取0.128 g/ml的药液60 ml, 以3 ml/min的流速上样, 收集残留液, 50 ml水冲洗柱子, 检测残留液和水洗液, 三种成分的上样量结果见图7。径高比为1∶9和1∶3.5时差异较小, 但当径高比为1∶2时, 柱子的吸附量减少。故选择1∶9或1∶3.5最为最佳径高比。
2.2.4 泄露曲线的绘制
取AB-8树脂5 g置于层析柱中, 径高比为1∶9, 取0.128 g/ml的药液适量, 以3 ml/min的流速上样, 残留液每20 ml收集1次, 检测三种成分的含量, 以残留液体积为横坐标, 以残留液中三种成分的质量浓度与上样药液中质量浓度的百分比为纵坐标绘制泄露曲线, 结果见图8。
2.2.5 洗脱工艺考察
2.2.5. 1 洗脱浓度考察
取AB-8树脂5 g置于层析柱中, 径高比为1∶9, 取0.128 g/ml的药液40 ml, 以3 ml/min的流速上样, 收集残留液, 50 ml水洗柱, 分别用95%、80%、60%的乙醇适量, 流速为1 ml/min洗脱, 每20 ml收集1次洗脱液, 检测三种成分的含量, 直到检测不到为止, 合并洗脱液, 检测三种成分的总量, 并各取50 ml洗脱液蒸干, 测定固形物的量, 再用10 ml甲醇溶解固形物, 并测定固形物中三种成分含量, 结果见图9。洗脱液所用乙醇浓度之间有差异, 选取95%的醇浓度为最佳。
2.2.5. 2 脱流速考察
取AB-8树脂5 g 3份置于相同的层析柱中, 径高比为1∶9, 取0.128 g/ml的药液40 ml, 以3 ml/min的流速上样, 收集残留液, 50 ml水洗柱, 用95%乙醇适量, 流速分别为1、2、3 ml/min洗脱, 每20 ml收集1次洗脱液, 检测三种成分的含量, 直到检测不到为止, 合并洗脱液, 检测三种成分的总量, 并各取50 ml洗脱液蒸干, 测定固形物的量, 再用10 ml甲醇溶解固形物, 并测定固形物中三种成分含量, 结果见图10。洗脱流速以1 ml/min为最佳, 但三者差异较小, 考虑到洗脱时间, 选择3 ml/min。
2.2.6 洗脱曲线的绘制
取AB-8树脂5 g置于层析柱中, 径高比为1∶9, 取0.128 g/ml的药液40 ml, 以3 ml/min的流速上样, 收集残留液, 50 ml水洗柱, 用95%乙醇适量, 流速分别为3 ml/min洗脱, 每20 ml收集1次洗脱液, 检测三种成分的含量, 直到检测不到为止, 以洗脱液体积为横坐标, 三种成分的质量浓度为纵坐标绘制洗脱曲线, 结果见图11。95%的乙醇洗脱液洗脱至200 ml时能将三种成分完全洗脱。
2.2.7 大孔吸附树脂纯化工艺的验证
按照上述实验结果, 最终确定最佳纯化工艺为:以AB-8树脂, 上样液体积与树脂用量的比例为40 ml∶5 g, 上样浓度为0.128 mg/ml, 流速为3 ml/min, 径高比为1∶3以上;洗脱乙醇浓度为95%, 洗脱流速为3 ml/min。按照上述上样工艺和洗脱工艺平行3份, 验证所选工艺。结果见图12。工艺平行性较好, 能得到较好的验证。
2.3 提取液纯化前后HPLC色谱图的对比研究
取20 ml提取液和相对提取液的过柱滤液置于蒸发皿中蒸干, 测定固形物的含量, 再取20 ml的甲醇溶解, 取适量按2.1.1的色谱条件进样, 得到色谱图13。过柱前后HPLC的色谱峰没有增减, 所选6种木脂素的转移率都能达到75%以上, 在固形物中的含量由99.58 mg/g上升到299.11 mg/g, 占固形物含量的30%。固形物中醇甲、甲素、乙素转移率为80%, 固形物中乙素含量为80 mg/g, 固形物得率:4.8 g/100 g药材。以上数据显示选用AB-8大孔吸附树脂纯化五味子提取液合理。
2.4 大孔树脂纯化固形物中总木脂素的含量测定
2.4.1 标准曲线绘制
采用紫外分光光度法测定, 准确称取适量五味子乙素标准品于10 ml容量瓶中, 用甲醇定容, 取0.1 ml甲醇作为空白样, 依次取0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 ml五味子乙素标准溶液, 挥去甲醇, 再分别精密加入5%变色酸澄清水溶液0.5 ml、硫酸1.5 ml、水1 ml摇匀, 置沸水浴中加热30 min后, 迅速冷却, 以上述甲醇管为空白, 分别在488 nm波长处测定吸光度, 计算含量, 以五味子乙素含量为横坐标 (X) , 以吸光度为纵坐标 (Y) 绘制标准曲线, 得回归方程Y=12.51X-0.100, r2=0.988。
2.4.2 木脂素含量测定
取适量纯化液3等份分别置于蒸发皿中蒸干, 用甲醇溶解, 置于容量瓶中, 再加甲醇定容到一定量, 精密吸取适量置于EP管中, 挥干甲醇, 按2.4.1试剂的加入方法和测定方法, 测定固形物中总木脂素的含量。结果见表4。
3 讨论
3.1 本文选取三种木脂素作为大孔树脂纯化五味子木脂素的纯化工艺指标, 是因为首先这三种成分的极性在木脂素中位于高中低的位置, 能最大程度的代表木脂素成分的富集, 再者, 这三种成分在木脂素中含量大, 在临床上的疗效更为广泛确切, 没有选择总木脂素作为指标, 因为显色反应条件不稳定, 误差大, 红外测定精密度差[4,5,6,7,8,9]。
3.2 AB-8大孔吸附树脂最适用于从极性溶剂中吸附弱极性物质。五味子中的木脂素成分大多具有联苯环辛二烯母核, 是一类低极性小分子化合物[10]。用AB-8来纯化能达到很好的分离效果。
3.3 由于木脂素为难溶性有效部位, 浓度过大会形成混悬液, 导致上样量难以控制, 堵塞大孔树脂[11,12,13]。所以在上样浓度的考察时, 结合预实验选择上述的三种浓度。上样流速间没有明显的差异, 考虑到上样时间和工业生产, 选择最大的流速。
3.4 通过对比纯化前后的色谱图, 作者发现6种木脂素的转移率都在75%以上, 固形物量减少两倍, 总木脂素的量占固形物的64%。结果表明大孔树脂纯化能达到精致富集木脂素类成分的目的。可用于五味子药材入药的前处理。
本文建立了同时测定固形物中6种木脂素的方法, 为五味子固形物质量控制提供依据。选择五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素作为大孔树脂纯化的指标, 最后确定了纯化工艺为:AB-8树脂纯化, 上样药液浓度0.128 g/ml, 流速3 ml/min, 径高比1∶3以上, 95%乙醇洗脱。对纯化前后的固形物进行含量测定和分析, 确定AB-8纯化五味子木脂素的科学合理性。
摘要：目的 建立五味子中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的高效液相色谱法 (HPLC) 分析方法 , 以此为指标成分, 利用大孔树脂纯化五味子醇提液, 筛选纯化五味子木脂素的最佳树脂及纯化的最佳工艺。对纯化前后HPLC色谱图进行比较, 并测定五味子总木脂素的含量。方法 动态上样法比较各种树脂对三种成分的吸附及解吸量来筛选最佳纯化树脂, 通过测定三种成分的上样量和洗脱量来考察最佳上样工艺及洗脱工艺, 对比纯化前后HPLC色谱图来研究纯化合理性, 利用紫外分光光度法来测定纯化后五味子总木脂素的含量。结果 最佳纯化树脂为AB-8, 上样药液浓度0.128 g/ml, 流速3 ml/min, 径高比1∶3以上, 95%乙醇洗脱。对比HPLC色谱图发现, 纯化前后色谱峰并无减少。木脂素含量测定结果显示纯化后五味子木脂素的含量占固形物60%以上。结论 纯化合理且必要, 并且工艺简单实用, 可用于工业生产。