分离纯化方法

分离纯化方法（精选9篇）

分离纯化方法 篇1

糖尿病在中国发病率逐年增加, 本病可发生多种严重的并发症, 如视网膜病变、神经病变、肾脏病变、各种心血管事件等, 并严重影响患者的寿命[1]。对胰岛素缺乏的1型糖尿病及部分2型糖尿病患者必须使用胰岛素治疗。注射合成胰岛素可以出现低血糖、体重增加、水肿、眼屈光变化、注射部位硬结和脂肪萎缩等不良反应, 严重低血糖反应甚至可以危及生命。对部分合并难治性低血糖患者, 胰腺移植和胰岛移植能完全恢复患者生理功能, 是最理想的选择[2]。胰腺移植相对较成熟, 但存在需处理外分泌并发症的问题。胰岛移植是单纯的移植内分泌细胞, 技术难度较小, 并发症较少。但存在胰岛细胞难于分离纯化, 移植胰岛不能长期存活等问题[3]。我们通过实验探讨可靠的胰岛分离纯化技术, 并对胰岛功能进行鉴定。

资料与方法

30例胰腺取自健康成人尸体供者, 供体年龄20~40岁。两组之间的供体年龄、BMI及冷缺血时间等差异无统计学意义。无糖尿病及相关病史。书面签署器官捐献同意书。术前各项常规检查正常。

消化液和分离液的配制: (1) 胶原酶P消化液2 mg/m L (含BSA 20 mg/m L, STI2 mg/m L) :胶原酶P400 mg, Ca Cl2168.5mg, BSA FractionⅤ4 g, 依次完全溶解180 m L Hanks液中, 定容至190 m L, 加甘油10 m L, 混匀, 调p H至7.8, 0.22μm孔径过滤除菌, 分装至20 m L玻璃瓶中, -20℃冻存。 (2) 释放酶消化液1 mg/m L:释放酶100 mg, 完全溶解90 Ml Hanks液中, 定容至100 m L。调p H至7.8, 0.22μm孔径过滤除菌。 (3) Ficoll分离液配制方法:称取Ficoll 400, 11 g, 23 g, 25 g, 20 g, 分别用HC-A液75 m L完全溶解, 高压蒸汽灭菌, 4℃保存, 定容至100 m L。将密度1.100和1.077的Ficoll液缓慢混合用于用COBE2991连续密度梯度离心法分离胰岛。

实验方法:根据使用胶原酶种类不同, 随机将所获胰腺编入实验分组:A:释放酶组;B:胶原酶P组;并统计记录两组胰腺相关实验资料。供体胰腺到达实验室后, 坚持严格无菌操作, 找到主胰管, 插入自制胰腺插管, 直至胰尾部, 无菌丝线结扎固定, 防止导管脱出和漏液;经注射器注入预温至37℃酶消化液, 注入量 (m L) 约为两倍胰腺重量 (g) ;直至整体胰腺均匀膨胀、质地变硬, 灌注时间10~15 min。消化至消化室底部有较多泥沙样颗粒状物出现。立即加入约4倍体积的4℃Hanks液 (含10%小牛血清) 中止消化, 消化液用500μm不锈钢筛网过滤得到胰岛悬液。

分离后胰岛的纯化:采用Ficoll不连续密度梯度离心法, 弃去上清液, 将消化物充分混匀悬浮于10 m L质量浓度250 g/L (密度1.084 g/m L) 的Ficoll溶液中。在其上依次缓慢加入230 g/L (密度1.077 g/m L) , 110 g/L密度 (1.038 g/m L) 的Ficoll溶液各5m L。4℃, 1 000 r/min, 离心10 min。加入4℃RPMI 1640溶液, 1 000 r/min, 离心即得到纯化后的胰岛。用COBE2991连续密度梯度离心法分离胰岛按COBE2991标准操作流程进行。

胰岛活性、特异性鉴定及纯度估计:胰岛活性用AO/PI荧光染色法鉴定, 胰岛细胞存活率用胰岛活细胞占所有胰岛活细胞和死细胞总数的百分比表示。37℃孵育10 min。

生物学活性测定:用Hanks液分别配制浓度3.3 mmol/L的低糖培养液和16.7 mmol/L的高糖培养液。然后用高糖培养液置换低糖培养液, 分别收集上清液用放射免疫法测定胰岛素含量。

统计学方法:所有数据采用SPSS16.0进行统计分析, 计量资料用 (x±s) 表示, 采用t检验;计数资料采用χ2检验;P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

胰岛的分离与纯化:逆行注射胶原酶充分扩张胰腺后, 胰腺膨胀明显。经过胰管内胶原酶灌注水箱孵育消化后, DTZ染色, 胰岛细胞形态完好呈猩红色, 胰腺外分泌组织基本不着色, 纯化后细胞形态完好, 两组胰岛获得量, 见表1。

应用Ficoll不连续密度梯度离心法和应用COBE2991连续密度梯度离心法获得的胰岛纯度情况, 见表2。

双硫腙染色在40X显微镜下观察的情况: (1) 可见胰岛呈明显的猩红色, 周围有消化后的胰腺其他组织; (2) 经过纯化的胰岛呈猩红色, 纯化后非胰岛组织明显减少。两组胰岛经荧光染色后, 胰岛制备物存活率95%左右。两组之间无统计学差异。对胰岛进行AO/PI染色在10X的荧光显微镜下可见大部分胰岛发出绿色荧光。

纯化后胰岛细胞的功能活性测定:低糖情况下胰岛素分泌量 (2.63±0.67) m IU/L, 高糖情况下 (5.33±1.13) m IU/L, 两者差异有统计学意义 (P<0.05) 。

讨论

在胰岛的分离过程中, 大量的胰蛋白酶原及消化酶原会释放出来。胰蛋白酶原具有自我激活释放出胰蛋白酶的能力, 而胰蛋白酶对胰岛细胞具有强大的破坏作用。我们在制备胶原酶的时候加入了STI, 这是减少消化过程中胰岛组织破坏的重要措施。

在胰岛的分离过程中, 氧自由基的产生明显增加, 而氧自由基的过氧化物可造成细胞膜稳定性降低, 使胰腺细胞溶酶体酶释放、消化酶活化从而破坏胰岛。本实验在胶原酶P溶液中加入了牛血清白蛋白第5组分 (BSA-FractionⅤ) , 这一措施减少了氧自由基的产量, 可削弱对胰岛细胞的损害。这样就使得胰岛的获得量及存活率均较高。通过以上措施胰岛获得量明显提高。也有研究应用全氟己基正辛烷等其他抑制氧自由基反应的物质也被应用于胰岛的分离及纯化。

胰腺消化后往往会形成一种黏稠的胶状物, 其可影响胰岛的收获量。我们在实验中严格控制消化温度 (38.0±1.0) ℃及p H值 (7.8±0.1) , 至消化终点时立即加入大量预冷的Hanks液 (体积比约4:1) 。通过这些方法, 在我们的实验中基本避免了胶冻状物质的形成。

胰岛纯化后的活性与功能的测定可以评价分离的胰岛的功能。本实验中分离纯化后的胰岛经AO/PI染色显示胰岛活率>95%, 提示分离纯化后的胰岛具有良好的功能。经胰管内逆行灌注释放酶消化联合Cobe2991连续密度梯度离心法分离纯化胰岛, 可获得高产量、高纯度及活性良好的胰岛。

摘要：目的:探讨胶原酶P、释放酶分离及不连续密度梯度和连续密度梯度纯化方法对胰岛产量、纯度及活动度的影响。方法:分别采用胰管内注射胶原酶P及释放酶水浴消化以及分别采用COBE2991连续密度梯度离心法和Ficoll不连续密度梯度离心法纯化。用DTZ染色计算胰岛细胞的纯度;用AO/PI染色计算胰岛细胞存活率;通过体外葡萄糖刺激胰岛素分泌试验判定胰岛细胞功能。结果:两组活度均在95%左右, 两组之间差异无统计学意义 (P>0.05) 。应用Ficoll不连续密度梯度离心法可获得胰岛纯度 (77.5±13.4) %, 用胶原酶P组, 释放酶组可分别获得 (1 829±517) 和 (3129±893) 个胰岛/每克胰腺, 两者差异有统计学意义 (P<0.05) 。应用COBE2991连续密度梯度离心法可获得胰岛纯度 (92.8±7.4) %, 纯化后细胞形态完好, 两者差异有统计学意义 (P<0.05) 。体外葡萄糖刺激胰岛素分泌实验, 高糖情况下 (5.33±1.13) m IU/L, 两者差异有统计学意义 (P<0.05) , 低糖情况下胰岛素分泌量 (2.63±0.67) m IU/L。结论:用COBE2991连续密度梯度离心法纯化胰岛较Ficoll400不连续密度梯度法纯化可获得纯度更高的胰岛细胞。采用胰管内释放酶灌注进行人胰岛分离优于胶原酶P。

关键词：胰岛,分离,纯化,移植

参考文献

[1]李镒冲, 刘晓婷, 胡楠, 等.中国2010年糖尿病疾病负担[J].中华流行病学杂志, 2013, 34 (1) :33-36.

[2]Hatziavramidis DT, Karatzas TM, Chrousos GP.Pancreatic Islet Cell Transplantation:An Update[J].Annals of biomedical engineering, 2013, 41 (3) :469-476.

[3]刘宝林, 刘世庆, 曹献馗.胰岛移植的临床与科研现状及展望[J].世界华人消化杂志, 2012, 20 (33) :3186-3190.

分离纯化方法 篇2

凝集素(Lectin)是指所有非免疫原的能凝集细胞或沉淀含糖大分子的蛋白质或糖蛋白,一般具有糖结合专一性,能与糖蛋白或糖脂分子中的.糖相结合.

作 者：孙杰 安利国 王雷 王宝杰  作者单位：孙杰(山东师范大学,生命科学学院,山东,济南,250014;中国科学院,海洋研究所,山东,青岛,266071)

安利国(山东师范大学,生命科学学院,山东,济南,250014)

分离纯化方法 篇3

关键词：溶菌酶,分离,纯化,活性,测定方法

1922年,有学者发现人的眼泪存在较强的溶菌活性,并将这种溶菌因子命名为溶菌酶。溶菌酶又称胞壁质酶,是一类专门水解微生物细胞壁的酶的总称,因其具有溶菌的生化特性而得名。溶菌酶可溶于水,水溶液澄清透明,不溶于有机溶剂。其分布广泛,存在于各类生物的不同组织中。它能够选择性地溶解微生物的细胞壁,因而在医疗上可用来抗菌、消炎和预防伤口感染,并且对其他组织器官无影响,是一种对生物体本身没有毒副作用的蛋白质。另外,在食品领域溶菌酶还可以用来防腐保鲜,在畜牧业中可以增强家养动物的抗病力。

1 溶菌酶的分离、纯化与活性测定的历史

1.1 溶菌酶分离、纯化的阶段发展

1.1.1 第一阶段

处于溶菌酶分离、纯化的初级阶段,方法比较粗放,主要有物理吸附法和沉淀法。1936年,K.Meyer等人在丙酮沉淀溶菌酶方法的基础上,换用适当比例的乙醇和乙酸混合物使沉淀析出,再用碱水溶解沉淀,最后用H2SO4酸化以期获得最大量的溶菌酶。1945年,G.Alderton等人用膨土岩吸附,再用吡啶析出得到的卵清溶菌酶回收率较高,之后又用直接结晶法精制卵清溶菌酶,使回收效率达到60%～80%。随着研究的不断深入,卵清溶菌酶的物化性质、酶学性质、氨基酸组成、分子构象、催化机制逐渐清晰。

1.1.2 溶菌酶分离、纯化方法的高速发展阶段

该阶段以柱层析法为一大特色,该方法又以离子交换层析和膜层析为代表。1952年,W.H.Stein等人利用弱酸性阳离子交换树脂从牛的血清中分离出溶菌酶。1956年,P.Jolles等人利用同样类型的树脂提取出了狗的脾脏溶菌酶和肾脏溶菌酶。之后,A.M.Clark等人利用羧甲基纤维素膜的物理特性分离和纯化鼠、狗和人的溶菌酶也取得了成功。

1.1.3 成熟和完美阶段

在各国科学家的共同努力下,溶菌酶的分离、纯化技术日趋成熟和完善。各种方法之间相互联系和补充,形成配套技术体系,大大提高了溶菌酶的纯化效率。这个阶段出现了亲和层析和高效液相色谱(HPLC)等有良好效果的技术。1991年,H.Itoh等人应用高效液相色谱技术分离蛋清溶菌酶,获得了理想的结果。

1.2 溶菌酶活性测定方法的衍变

1)在19世纪30—40年代,目视比色法作为一种早期定量分析的方法得到了广泛应用,并与早期的分离、纯化技术相适应。

它仅仅依靠人的肉眼来比较原液与反应液之间的颜色变化,不适用于无色变化的反应,而且不够准确。随后,在此研究基础上延伸出光电比色法。与前者相比,光电比色法减小了肉眼造成的误差,提高了数据的精确度,并且后者采用滤光片来去除其他颜色和光线的干扰,使得选择强度大大地提高。但由于两者适用范围和准确度的局限性,逐渐被紫外可见分光光度法所取代。琼脂板扩散法原理是依据透明带直径与抗生素的浓度存在一定的线性关系,进而可以粗略地推测出抗生素的浓度范围。

2)高效液相色谱法是20世纪60年代中后期发展起来的一种定量分析方法。

这是一种利用加高压使得流动相中不同微量物质在固定相中的流速不同而将其分离,再通过色谱峰值进一步测定物质含量的技术。该方法因进样量少、分析速度快、灵敏度高而著称。它对食品、化学品、医药、法律等行业做出了重要的贡献。世界上约有70%的有机化合物可以用高效液相色谱法分析测定。

2 溶菌酶的种类和性质

溶菌酶是能溶解细菌细胞壁的一种碱性蛋白质,根据其来源不同可以分为动物型溶菌酶、植物型溶菌酶、微生物型溶菌酶、噬菌体溶菌酶、基因工程源溶菌酶等。不同类型的溶菌酶具有不同的氨基酸序列结构和生化性质。在自然条件下,大多数溶菌酶性质较稳定,当pH值在1.2～11.3范围内变化时,其结构能够基本保持不变。当处于碱性条件下,溶菌酶的热稳定性很差[1],但在酸性环境下对热不敏感。鸡蛋清溶菌酶是目前已知的各类溶菌酶中最耐热的一种,在pH值为3.0时加热(96 ℃)处理15 min仍能保持87%的酶活性[2]。此外,溶菌酶的活性还受溶液pH值、化学性质和离子强度的影响。

2.1 动物型溶菌酶

2.1.1 C型溶菌酶(chicken–type lysozyme)

存在于脊椎动物和非脊椎动物体内,与乳白蛋白、钙结合的溶菌酶共同组成了脊椎动物溶菌酶。它与乳白蛋白有40%的氨基酸序列是相同的,并且有着非常类似的三维结构,与钙结合溶菌酶的共同点是都具有溶菌的作用[3]。它的种类也比预想的要多,从4种脊椎动物和2种昆虫中提取的C型溶菌酶就有88个氨基酸的差异,可见它是一个庞大的家族。从奶牛和绵羊的肾脏匀浆得到的C型溶菌酶和大多数哺乳动物类似,由130个氨基酸组成,并且有95%的相似性,相对于蛋清溶菌酶,在pH值为7.0、30 ℃、离子强度为0.1时,对微球菌的活性分别为3%和29%,在pH值为5.5、40 ℃时对几丁质的活性分别为57%和84%。经过长期的自然进化,蚊子等昆虫、对虾等携带着危害其他生物的寄生菌,因其个体体内有溶菌酶而不会致病。C型溶菌酶因其具有寄主防御功能,现已经被广泛应用于分子生物学、酶学等科学研究领域。

2.1.2 G型溶菌酶(goose–type lysozyme)

G型溶菌酶最初是在鹅的蛋清中发现的。2011年,日本学者在食火鸡的蛋清[4]中也分馏出了G型溶菌酶,这种动物分布在澳大利亚、几内亚等大洋洲,与其他G型溶菌酶相似,此溶菌酶含有186个氨基酸残基,且无N端。它既可以水解细菌细胞壁,也具有几丁质酶的活性。略有不同的是,它溶解细胞壁的最佳条件是温度为30 ℃、pH值为5、离子强度为0.1,当温度上升到80 ℃时已经完全变性;作用于几丁质时,最佳温度为50 ℃、pH值为4.5和11.0。后在大菱鲆[5]等鱼类中也发现此型溶菌酶。G型溶菌酶与C型溶菌酶有相似的催化中心,但它们的氨基酸序列几乎不同[6]。

2.1.3 I型溶菌酶(invertebrate–type lysozyme)

这类溶菌酶在脊椎动物体内较多,但在牡蛎等双壳类动物[7]亦有发现,且等电点较低,能编码187个氨基酸,氨基酸序列中有较少的酶切位点。当pH值在7.0～8.0之间、离子强度在0.005～0.01时,活性最大。随着历史的进化而产生出新的功能,即由原来的寄主防御作用过渡到接触外来物质后转移到消化腺中消化。

2.2 植物型溶菌酶

1969年,无花果溶菌酶就被Glazer等人分离出来,并测得最佳活性pH值为4.5,比蛋清溶菌酶活性要显著增强。对离子强度的依赖性大,和木瓜溶菌酶一样受组胺抑制。另外,从萝卜根部亲和层析分离的5种蛋白中有2种是有溶菌酶活性的。对卷心菜成分进行柱层析,利用硫酸铵逐级蒸馏、色谱聚焦和上柱分析处理,得到的酶既可以水解几丁质,又对微球菌壁有溶解作用。活性最佳条件是pH值为5.0,温度为40～50 ℃,重金属离子对该酶有抑制性作用,二硝基氟苯、苯甲基磺酰氟等物质可使该酶活性完全丧失[8]。该酶对溶壁微球菌的溶解活性比蛋清溶菌酶要低2/3左右,但其对胶体状甲壳质的作用活性约为蛋清溶菌酶的10倍。

2.3 微生物型溶菌酶

微生物产生的溶菌酶主要有5种:内N-乙酰己糖胺酶,酰胺酶,内肽酶,β-1,3葡聚糖酶、β-1,6葡聚糖酶和甘露聚糖酶,壳多糖酶,分别是以其作用的部位和物质来命名的。

2.4 噬菌体溶菌酶

噬菌体T4溶菌酶是病毒用来侵染细菌的一种高效物质,噬菌体首先吸附到细菌宿主的表面,通过释放溶菌酶溶解寄主细菌的细胞壁,将自身的核酸注入细菌的体内进行复制和繁殖。这种溶菌酶与鸡蛋清溶菌酶和G型溶菌酶结构相似,这说明它们来自相同的进化祖先[9]。T4噬菌体遇热容易导致溶菌酶的突变,即T4溶菌酶具有热敏性。

2.5 基因工程溶菌酶

此类溶菌酶是利用基因工程技术和分子生物学手段得到的。M.D.Andersen等人构建了大麦内切壳多糖酶的异源表达系统,获得了微量的具有抗真菌活性,且与溶菌酶结构相似的酶。由于是体外试验,达不到内环境所具备的各种生理生化条件,往往会出现表达量很低,无法进行大规模生产,或者形成包涵体而缺少活性等情况。因此,控制和优化微生物的生产条件在整个生产链中至关重要。由于人们的不懈努力,目前已经有一些产品面世,如溶菌酶肠溶片、溶菌酶含片等,但种类和数量远不能满足人类的需要。

3 溶菌酶的分离、纯化方法

3.1 结晶法

结晶法是制备溶菌酶的一种传统方法,通过改变溶液条件,使溶菌酶以结晶态析出。此方法分离效率能达到60%～80%,产率较低,产品的成本较低,速率也较低[10],生产周期较长,仅可粗制溶菌酶。

3.2 离子交换吸附法

离子交换吸附法是利用溶液中的正负离子与阴阳离子交换剂的不同结合力来分离、纯化物质组分的技术手段,离子交换剂的材料通常为树脂,而这种结合力则为吸附作用,并结合等电点沉淀、透析和喷雾干燥等技术流程。该方法具有简便、耗样量较大、成本低、回收效率高等特点。

3.3 膜色谱法

膜色谱技术是一项将膜分离技术与色谱技术结合起来的技术。膜分离技术[11]主要是以膜为介质,在压力或离心力的驱动下,使溶液通过特定孔径的膜,膜上的配基和溶液中的靶分子特异结合(如抗原-抗体的结合等),杂质则大部分透过膜孔流出,再通过洗涤除去膜上残留的杂质,然后将靶分子从膜上洗脱下来,最后通过色谱记录和检验其纯化的效率。它具有耗时短、反应温和、纯化效率高等特点,可作为分离、纯化DNA和蛋白质等生物大分子的新型技术手段,现已广泛运用。另外,目前运用膜分离技术制成的过滤器已经作为除菌的一种有效手段而在临床[12]和科研中得到推广。

3.4 亲和层析法

20世纪80年代中后期出现了分离蛋白质大分子的亲和层析技术。该技术原理是以层析柱中的固相填充吸附物为媒介,当载有目标蛋白的液相通过柱子时,目标蛋白和柱中的吸附剂特异而可逆地结合(如受体-配体或酶-底物的结合),而其他杂质因为没有亲和力的作用而从柱中流出,最后选择合适的洗脱液将目标蛋白从柱上洗下来。此外,还有将亲和层析与膜分离技术相结合的亲和超滤方法。

4 溶菌酶的活性测定方法

4.1 比浊法

比浊法也叫微球菌法。其原理是以溶壁微球菌为底物,加入标准品酶与其反应,根据反应液混浊度的变化作出标准曲线,然后再用待测样品与微球菌反应的溶液浑浊度代入标准曲线得出待测样品酶活。比浊法需样量少、省时、灵敏度高。目前,已经利用分光光度计或酶标仪来测定吸光度,操作简便。

4.2 比色法

比色法分为目视比色法和光电比色法两种。前者仅凭肉眼观察反应液的颜色变化,误差较大;而后者克服了前者准确度的缺陷,但适用范围仍局限在需有合适的显色反应的前提下,即选择的显色试剂与待测样品间可以形成有色络合物,这种络合物受反应液的pH值和温度等条件影响较大,因而不太稳定,同时反应的时间应控制在15 min以内,一旦时间过长容易影响数据的准确性。

4.3 琼脂板扩散法

琼脂板扩散法是一种简易的溶菌酶活力测定方法,即用打孔器在混有微球菌的琼脂平板上打上6～8个小孔,把待测样品酶定量滴在小孔中,样品会在琼脂板上扩散并与微球菌反应产生一个不同于周围透光度的抑菌圈,而抑菌圈的直径与待测样品的浓度存在一个线性关系,由此可以得到未知的浓度。

4.4 高效液相色谱法

近年来,高效液相色谱技术也逐渐运用到溶菌酶的活力测定中,该方法又称“近代柱色谱”。其基本原理是以液体为流动相,采用高压输液系统,将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,在柱内各成分被分离后进入检测器检测,从而实现对试样的分析。采用高效液相色谱法可以排除其他成分的干扰,要求溶菌酶的纯度也不太高,但由于柱填料的体积有限,测得溶菌酶的实际含量较低。

5 溶菌酶的前景展望

5.1 溶菌酶在畜牧生产中的应用

在饲料中添加溶菌酶可以延长饲料的保质期和质量,有效提高家畜、家禽的成活率及增重,降低成本,减少疾病的发生,增强抵抗力,大大提高养殖业[13]的经济效益,也间接增强人民的体质。甚至在日粮中溶菌酶可以完全替代抗生素,有试验证明溶菌酶的抗菌效果是普通抗生素的3倍以上,还可有效避免抗生素的负面效应,增强肉质的风味和品质,有利于提高畜牧产品的国际、国内市场竞争力,同时也促进我国养殖业的可持续发展。

5.2 溶菌酶在食品行业中的应用

溶菌酶在海产品、保健食品、乳制品、糕点、饮料等食品各个行业的杀菌、保鲜、防腐以及微生物的发酵等领域中发挥了重要作用。同时,作为21世纪的新兴产品,与其他食品添加剂相比,溶菌酶具有无副作用、无毒害[14]和无残留的“三无”优势,充分保证食品的营养安全。在奶粉行业,溶菌酶和免疫球蛋白A、乳铁蛋白等一起构成新生儿营养所必不可少的有机成分[15],满足后代营养需求的同时增强对外界的抵抗力。

溶菌酶可以单独使用,且效果较显著,对抑制细菌增殖具有极其重要的作用。在肉制品真空包装前添加一定量的溶菌酶,然后经过巴氏杀菌处理,可有效地延长食品保质期。

5.3 溶菌酶在医药行业的应用

在医学上,溶菌酶可以作为诊断动物是否健康的标志[16],这为预防疾病打下了坚实的基础。人得了蜕皮间质肺炎,血清中的血管紧张肽就会向溶菌酶和其他酶转化,在中性粒细胞和肺泡巨噬细胞中溶菌酶的表达水平超出了正常水平,同样的现象也发生在肉状瘤病患者身上。动物的许多组织中都有溶菌酶,正常情况下维持在一定浓度,若出现较大幅度的变化,则说明身体健康受到威胁。溶菌酶参与人体的免疫防御机制,增强抵抗力,在抗感染、抗病毒和增强免疫力等领域发挥明显作用。在临床上,由溶菌酶制成的各种药物具有抗菌消炎、消肿止痛、促进损伤组织修复,和抗菌素一起使用有增强疗效等作用。

5.4 溶菌酶在生物学领域的应用

溶菌酶可以溶解、破坏细菌细胞壁结构,以此来溶解革兰阳性细菌,获得原生质体或细胞内容物,为后续试验打下基础。采用分子生物学克隆技术和原核表达技术,利用微生物工程、细胞工程等生物学技术进行溶菌酶的异源表达,可得到高通量表达的溶菌酶,来满足研究者的日常需求和生物试验的材料来源。

5.5 溶菌酶在环境卫生领域的应用

抗体分离纯化技术的研究进展 篇4

抗体分离纯化技术的研究进展

制备高特异性、高效价的抗体是实验免疫学技术的基础,抗体质量的高低,将直接影响试验的成败.抗体的制备有两个途径:一是一般通用的方法,以纯化的抗原免疫动物,获得多克隆抗体;二是应用杂交瘤技术制备单克隆抗体.但不论用何种技术制备的.抗体都需要进行纯化.重要的是根据抗体的性质和来源选择一个合适的分离纯化方法.对当前的纯化方法进行了一个简要的综述.

作 者：侯越 罗奋华 吴应积 Hou Yue Luo Fenhua Wu Yingji 作者单位：内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室,呼和浩特,010021刊 名：生物技术通报 PKU英文刊名：BIOTECHNOLOGY BULLETIN年，卷(期)：2008“”(3)分类号：Q95关键词：抗体 分离 纯化

成人胰岛细胞的分离纯化与应用 篇5

1 材料与方法

1.1 胰腺来源

2006年3月～2007年5月，30例胰腺均取自自愿捐献者，年龄20～55岁，冷缺血时间2～19 h，腹部多器官原位灌注联合切取，置于预充氧气的全氟化碳(PFC)和威斯康星大学器官保存液(UW液)双层冷藏保存(图1)，立即送往实验室。

1.2 主要试剂及仪器

LiberaseHI酶(罗氏公司);RPMI1640、HEPES、CMRL1066等(美国MediaTech公司)，并以RP-MI1640为基础配制稀释液和洗液;密度梯度液Ficoll1.100,1.077(美国Biochrom公司)。COBE2991细胞纯化仪及相应的配件(美国GAMBROBCT公司)，消化罐(Ricordi chamber)(美国迈阿密大学)，低温水平离心机(美国Beckman公司)，二氧化碳培养箱，水浴箱，超净台以及手术器械若干套等。

1.3 胰岛细胞的分离纯化

胰岛细胞分离纯化参照美国迈阿密大学RI-CORDI自动分离纯化技术[3]做部分改良。超净台内，冰浴上进行修剪，去除外周脂肪组织、血管和附带的十二指肠、脾脏等，修剪干净的胰腺经聚维酮碘液、抗生素液消毒清洗处理，横断胰头，经胰导管插入18G留置针，将配制好的消化酶灌注入胰腺，使胰腺充分膨胀。将胰腺切成7～9段置入消化罐(Ricordi chamber)，迅速升温到37℃，机械震摇，并取样观察，当出现游离的大胰岛细胞团时，迅速用稀释液冷却稀释，终止消化，收集细胞悬液，280×g离心力、4℃离心1 min，用洗液洗涤细胞2、3次，加UW液制成细胞悬液。新型COBE2991细胞纯化仪中装载1.100、1.077Ficoll液建立连续密度梯度，泵入细胞悬液进行离心纯化，收集纯化的胰岛细胞，离心洗涤去掉Ficoll液，定容。

1.4 胰岛细胞计数

纯化后定容的胰岛细胞悬液混匀取0.1 m L经双硫腙(DTZ)染色后计数。以50μm为直径的数量级，计数100～450μm各数量级胰岛细胞数，以直径150μm为基准系数1，计算胰岛当量(islet equivalent,IEQ)。IEQ=∑(各直径范围胰岛细胞数×相应的系数)×稀释倍数。

1.4.1 胰岛细胞活性的鉴定

另取0.1 m L胰岛细胞悬液，采用吖啶橙(acridin orange,AO)与碘丙啶(propidium iodide,PI)荧光染色，荧光显微镜下计数红绿染色的细胞数，计算细胞的活性。

1.4.2 胰岛细胞功能鉴定

采用胰岛刺激释放指数试验，分别取0.1 m L胰岛细胞悬液在1640无糖培养基中于37℃、二氧化碳浓度5%环境下孵育24 h，分别加入含有2.8 mmol/L葡萄糖的培养基和含有20 mmol/L葡萄糖的培养基2 m L进行培养各2 h，收集上清液，检测胰岛素含量。并计算胰岛素释放指数，即以胰岛细胞在含有20 mmol/L葡萄糖的培养基中分泌的胰岛素量除以在含2.8 mmol/L葡萄糖中的胰岛素分泌量。

1.4.3 安全性检查

移植输注前需要进行细菌学、内毒素等安全性检查。

1.4.4 胰岛细胞培养

根据计算的胰岛细胞IEQ数，按20 000 IEQ/瓶在175 cm2悬浮细胞培养瓶中于37℃、二氧化碳浓度5%环境下培养。做临床移植的通常在培养24 h内输注。超过24 h要将胰岛细胞移至22℃、二氧化碳浓度5%环境下培养。

1.4.5 输注移植和疗效判定

1型糖尿病患者，签署知情同意书，根据输血血型配对原则，按每千克体重8 000～10 000 IEQ，经门静脉肝内输注。疗效判定以国际上认可的胰岛素减量1/3以上为治疗有效[4,5]。

1.4.6 统计学分析

应用EXCEL 2003进行数据录入与整理，然后用SAS 8.1进行统计学处理，结果以(x±s)表示，两组间采用t检验，P<0.05视为差异有显著性。

2 结果

2.1 胰腺分离结果

本组共分离30个成人胰腺供体胰腺重量62.4～133.7 g，平均(95.1±17.9)g;收集的胰岛细胞经DTZ染色后在镜下观察，典型胰岛染成猩红色的圆形或椭圆形细胞团，包膜完整，轮廓清晰，大小不一，外分泌腺细胞则不着色(图2、3)。纯化后的胰岛数量为(69 269～799 733)IEQ，均(316 626±191972)IEQ，平均每克胰腺收获胰岛细胞3389IEQ，收获的胰岛纯度为64.50%～95.00%，均为(74.70±7.84)%。

a:染成猩红色的为胰岛细胞团;b:不染色为腺泡细胞,DTZ染色×40

a:染成猩红色的为胰岛细胞团;b:不染色为腺泡细胞DTZ染色×100

呈绿色荧光的为活的胰岛细胞,显示获得的胰岛细胞活性>95%

2.2 胰岛活性染色结果

经AO-PI染色在荧光显微镜下用490 nm激发光滤光片，510 nm光栅滤光片观察，见活的胰岛呈绿色荧光(图4)，凋亡的胰岛呈红色荧光(图5)。经AO-PI染色后检测胰岛的活度为90.00%～98.00%，平均为(94.10±2.19)%。

胰岛中间染成红色的为凋亡的胰岛AO/PI染色100×AO/PI染色×40

2.3 胰岛细胞功能测定结果

胰岛素释放实验结果显示胰岛细胞在20mmol/L高糖刺激下释放胰岛素平均为(427±74)IU/L，低糖刺激释放胰岛素平均为(117±19)IU/L，显示收获的胰岛细胞良好的分泌功能。

2.4 临床移植

分离的胰岛细胞进行了细菌学等生物安全性的检查，符合人体安全和病人自愿签署知情同意书的前提下，进行了7人12次临床移植输注，其中6例患者全部撤掉胰岛素注射，1例患者胰岛素减量达2/3，取得了较好的治疗效果[6]。

3 讨论

成人胰岛细胞分离纯化是一个复杂的、技术性强的过程。国内外许多实验室都在研究如何提高其分离的得率，但多数都不能达到临床移植要求的数量和纯度。国外也仅有少数实验室完全掌握了此项技术，达到临床移植的要求[2]。本实验室在RICORDI自动胰岛分离纯化技术的基础上，成功建立了改良的胰岛细胞分离纯化技术，成功获得了数量较多的高质量的胰岛细胞，平均每克胰腺收获胰岛细胞3389IEQ，较RICORDI报道的2279IEQ明显增加[3]，收获的胰岛细胞平均纯度为74.70%，满足临床移植的要求。

影响胰岛分离结果的因素很多，包括供者的年龄，冷缺血时间，胰腺的大小及重量，胰腺本身是否有病变以及胰腺切取的完整性，胰腺的保存和消化时间的掌握等[7,8,9]。本研究采用双层保护法运送胰腺：即下层的PFC和上层的UW液，再加入适量的胰蛋白酶抑制剂，并充氧半小时。实验证实分离效果明显优于单纯用UW液冷保存方式，更优于国内的HC-A液保存法[10]。国外学者的研究也证明这一点，通过双层法保存的胰腺分离结果较单纯用UW液保存的分离成功率高[11,12,13]。

胰岛细胞分离纯化技术的关键点在于消化。消化酶的选择非常重要，国内很多研究者选用胶原酶P、V等，所分离得到的胰岛数量和纯度有限，不能满足临床移植的要求。本组采用的是Liberase HI，它是一种新型的高度纯化混合酶，是由高纯度胶原酶Ⅰ、Ⅱ和中性蛋白酶混合而成，具有更高的稳定性和低毒性，在用于胰岛的分离中被证实能增加胰岛细胞的量及活性，是目前最适宜用于临床的胰岛分离酶。Liberase HI不但可以提高每克胰腺组织分离后的胰岛细胞获得率，增加胰岛的数量，而且可以保持胰岛作为一个胰腺内分泌单位的完整性，减少对胰岛细胞的破坏[14]。

胰腺消化后可能有很多组织碎片，如果直接进行移植，大量失去活性的组织碎片在门静脉内短时间内难以清除，甚至造成栓塞，所以胰岛的纯化是必要的，不仅是为了提高移植物效能，同时也是为了将混在其中的外分泌部成分分离出去，降低移植物的免疫原性[15]。本实验室采用COBE2991细胞淘洗仪和密度为1.077和1.100的Ficoll液组成的连续梯度密度离心法纯化胰岛细胞，可以获得高纯度的胰岛，最高可达98.00%，明显高于国内用手工不连续梯度密度离心法所得。

植物细胞核分离纯化的探讨 篇6

关键词：植物,细胞核,分离,纯化

植物细胞非对称融合、染色体杂交育种、大片段基因组文库构建、DNA纤维制备、细胞核中DNA、RNA、蛋白质含量的分析及染色质结构分析等, 需要分离纯化出较多个体完整, 分散较好的细胞核。学者们曾尝试用不同方法进行植物细胞核的分离, 比如大豆、玉米、水稻、烟草、小麦、棉花、长春花、杉木等细胞核的分离或纯化近来又有过报道[1,2,3,4,5,6,7], 但由于不同植物材料由于结构和组分的不同, 所以适合一种植物的细胞核制备方法并不适合于其它植物。本文就一些分离纯化植物细胞核的方法进行探讨。

对动物细胞核的分离纯化已经有了比较好的方案可查, 然而对植物细胞却不尽然。主要是由于植物细胞在结构与内含物等方面显著不同于动物细胞, 植物细胞除了具有细胞壁外, 还含有胞间连丝和次生代谢物, 这就给细胞核的制备增加了难度。分离纯化细胞核需要在材料选择、预处理、提取液选择、细胞的破碎方法及纯化方法上做综合考虑。

1 材料选择

制备植物细胞核一般可以选择愈伤组织、下胚轴、子叶、悬浮培养细胞和叶片等材料, 其中选择后者居多。然而, 愈伤组织和悬浮培养细胞有着自身的优越性。愈伤组织和悬浮培养细胞取材方便, 本身就是无菌材料更便于做融合、杂交试验。离体培养的植物细胞更易于进行同步化处理, 且黑暗下培养的细胞基本不含叶绿体, 这些都便于核的纯化。

2 预处理

处于不同细胞周期的细胞核的大小是不同的, 体积可相差几倍之多, 为了便于纯化、提高收率, 可先将用于制备细胞核的植物材料进行同步化处理。通常可采用低温 (用冰水混合物) 培养12h-48h的物理方法;也可采用使用羟基脲、8-羟基喹啉 (0.001M-0.004M) 或秋水仙素 (0.01%-0.5%) 的化学方法, 处理时间在4h-24h。对于离体培养材料, 还可以尽量缩短继代的周期使得细胞经常处于对数增殖期的办法使细胞核尽可能均匀一致。对于悬浮培养细胞还应在破碎细胞之前去除漂浮的已自溶的细胞碎片等杂质。

3 细胞破碎方法

主要有研磨法、刀切法、酸解法和酶解法。研磨法提取植物细胞核, 在研磨过程中酚类等物质易氧化, 不可避免的对提取细胞核产生影响, 细胞核提取质量不高。研磨时间长短和力度大小难以掌握, 致使很多细胞核被破坏, 产率较低。刀切法, 一种是用剪刀将叶片快速剪碎, 另一种是用锋利刀片在放置于冰上的培养皿中于将叶片切碎至尽量细小的匀浆状。刀切法的操作手法也不容易保持一致, 不适用于愈伤组织、悬浮细胞和根茎尖等材料。酸解法一般采用1M-3M盐酸解离细胞。酸解法效果不稳定。酶解法是利用纤维素酶、果胶酶和/或半纤维素酶等处理细胞。酶浓度在0.5%-2%, 纤维素酶浓度高于果胶酶, 半纤维素酶有助于纯化过程, 不添加也可。使用蜗牛酶没有看到更好的结果。酶解时间为4h-24h。酶解法可以先得到原生质体, 再通过挤压低渗涨破质膜或添加表面活性剂溶膜而释放细胞核, 也可以不收集原生质体, 一步实现收获细胞核, 而且不必使用表面活性剂, 这时需要延长酶解时间 (12h左右) 并使材料处于震荡当中。利用酶解法制备植物细胞核收获量较大, 当然收获量的大小还与所用的提取液 (酶解液) 的其它成分密切相关。

4 提取液

可以使用缓冲盐或非缓冲盐。缓冲盐常被选用的包括Tris、MES、HEPES、MOPS和柠檬酸等, 浓度在0.015-0.2M, p H7.0-8.0居多, 也有使用p H2.0-3.0的。提取液中可选择添加的成分比较多, 比如Mg2+、K+、Na+、精胺、Triton X-100、Tween20、EDTA、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、甘油、PVP、β-巯基乙醇、DTT、PMSF、抗坏血酸等。这些成份能够稳定核染色质 (体) 、提供一定的离子强度、维持渗透压、促进细胞核释放, 移走细胞质, 分散叶绿体, 减少核粘连、防止细胞核被氧化、减轻酚类等次生物质的干扰, 提高细胞核质量。这些成份用量在0.1m M-0.6M, 其中糖类物质用量大。

5 分离纯化方法

过滤、差速离心和密度梯度离心是最常用的方法。细胞破碎以后通常需要过滤。过滤常利用不锈钢、尼龙网 (120目-400目) 和过滤棉等。差速离心需多次反复沉淀和再悬浮, 容易使核破裂。沉淀核的离心速度很低即可, 如果离心时间过长和速度过高, 虽然会提高核的产量, 但也会增加其他非核材料的沾染。密度梯度溶液多用蔗糖、甘露醇和Percoll。浓度高的蔗糖溶液是非常粘的, 而且这种溶液的粘度受蔗糖含量的增加影响大, 浓度高的蔗糖溶液浓度的小的改变对核的沉淀速度会产生很大的影响, 所以用蔗糖作梯度离心纯化细胞核需格外小心。甘露醇溶液用粘度没有蔗糖高, 但同密度情况下, 甘露醇溶液的渗透压要高于蔗糖溶液的, 这也是需要注意的, 以免核皱缩。Percoll是较好的介质, 只是价格偏高。低速离心 (500×g左右) , 细胞核集中30%、35%的蔗糖界面较多。

6 存在主要问题及解决措施

植物细胞核提取遇到的主要问题有杂质多、核与内质网等粘连成网、容易破裂。杂质主要来自细胞壁、膜碎片和细胞质成分。过滤可以去除一些杂质, 但严重降低核的收率, 一方面网筛的大小不好选择, 另一方面导致细胞核破裂, 特别是使用抽滤。图1告诉我们植物细胞核膜连着一些网状的细胞成分, 筛孔小了, 它过不去, 筛孔大了, 大的杂质就会多。如果将通过化学的方法将与膜连接的成分尽量去除, 发现核又非常容易破损, 即使是盖玻片轻轻的一压 (见图2) 。因此, 对于与核膜连接的成分, 既要去除, 又要不能伤及核膜。减轻核与其它细胞成分粘连方法, 可以考虑使用偏酸性的提取液、酶, 不建议使用表面活性剂。低速离心甚至静止片刻 (相当于1×g的离心) 是较好的初步去除杂质的方法, 精细去除杂质则需要进行梯度离心了。对于核容易破裂的问题, 可以考虑使用一些膜的保护试剂, 特别是在纯化的后期, 比如葡聚糖硫酸钾、葡聚糖、蔗聚糖、2- (N-吗啉) -乙烷磺酸、氯化钙、磷酸二氢钾等, 同时注意提取纯化过程中溶液酸碱度的稳定, 离心时尽量不使细胞核沉到离心管底部, 而用蔗糖等溶液托住更好。

总之, 植物细胞核的提取纯化目前还没有普遍适用的方法, 探索适用不同植物、不同材料的核提取纯化方法还是需要研究的工作。

A被盖玻片压破的细胞核 (箭头指处, 棒状影像是由盖玻片造成的) , B是未加盖玻片观察到的细胞核

参考文献

[1]刘育乐, 米景九, King.J.大豆细胞核的分离及其超显微结构的研究[J].遗传学报, 15 (1) :21-24, 1988.

[2]金亮, 张宪银, 薛庆中.分离缓冲液对水稻细胞核悬液DNA分辨率效应的比较[J].浙江农业学报, 19 (2) :93-96, 2007.

[3]费一楠, 张钊, 张飞雄.烟草悬浮细胞细胞核及核骨架中存在有肌动蛋白和肌球蛋白的证据[J].首都师范大学学报 (自然科学版) , 29 (1) :55-63, 2008.

[4]彭仁海, 刘方, 宋国立, 王春英, 黎绍惠, 张香娣, 王玉红, 王坤波.一种高效提取棉花细胞核的技术[J].安徽农业科学, 37 (18) :8755-8756, 2009.

[5]宁华.植物细胞核不同制备方法的比较研究[J].华中师范大学学报 (自然科学版) , 43 (2) :308-312, 2009.

[6]孙永星, 李素花, 魏小丽, 韩榕.适合流式细胞仪分析的小麦细胞核提取方法比较[J].生物学杂志, 29 (3) :88-91, 2012.

辣椒素提取及初步分离纯化研究 篇7

辣椒素可促进肾上腺分泌儿茶酚胺, 并有抑制细菌的作用, 具有镇痛止痒、抗炎消肿[3]、调节食欲、促进脂肪代谢[4]、催泪催嚏、防治风湿与抗肿瘤[5]等作用, 在医药工业中已得到广泛应用。因辣椒素具有纯天然、低毒害、无污染、有多种生物功能等特点, 因而在食品工业和饲料工业中作为添加剂广泛使用。高纯度的辣椒素晶体在军事上是制造催泪弹、催泪枪和防卫武器的主要原料, 具有重要的研究价值[9]。因此研究从辣椒中有效提取分离辣椒素具有重要的意义。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

干红辣椒 (购自山西省忻州市高城乡) , 辣椒碱标准品 (购自贵州五倍子公司, 其纯度≥98.5%) 、95%乙醇为药用级别、乙醇 (分析纯, 江苏强盛化工有限公司出品) 、木质颗粒活性炭、盐酸 (分析纯, 江苏强盛化工有限公司出品) 、乙醚 (分析纯, 天津市富宇来精细化工有限公司) 、甲醇 (色谱纯, 天津市四友精细化工有限公司) 、恒温水浴锅、TDL80-2B型台式离心机。

1.2 实验仪器

万能粉碎机 (30B型, 常州市苏力干燥设备有限公司) ;萃取浓缩设备 (型号YC-EC-30、YC-VC-10, 元成机械股份有限公司) ;UV-1800紫外分光光度计 (北京瑞利仪器有限公司) ;岛津UV-2350可见-紫外分光光度仪;日本岛津高效液相色谱仪 (LC-10ATVP溶剂输入泵, SPD-10AVP紫外检测器) ;HW-2000色谱工作站 (南京千谱软件有限公司) 。

2 方法与结果

2.1 辣椒素提取工艺

辣椒素的提取工艺流程见图2。

2.2 辣椒素分离纯化工艺

(1) 辣椒碱标准曲线的制备。取120μg/mL的辣椒碱乙醇溶液, 将此溶液以无水乙醇稀释成下列浓度:10、17、34、50、60μg/mg。在280nm波长下测定各溶液的吸光值 (A) , 处理得回归方程A=0.0093C+0.0123, R2=0.9992。见图3。

(2) 活性炭分离纯化工艺结果。见表1。

辣椒素粗提物经活性炭纯化后, 其溶液颜色由深红变成浅红色, 辣椒碱转移率为60.1%。

(3) pH法分离纯化工艺结果。根据辣椒素分子中含有酚羟基, 呈弱酸性, 可与强碱发生反应的原理, 进行纯化。比较加入碱液后, 辣椒素中辣椒碱在沉淀层及溶液层中含量的分布, 从而计算出辣椒碱的转移率, 验证该方法对辣椒碱的影响, 其紫外吸收值如表2。

辣椒素粗提物经pH法纯化后, 沉淀层颜色仍为深红色, 其中辣椒碱的转移率为55.7%。

(4) 萃取-结晶法结果。利用辣椒素物质均含有酚羟基的特点, 采用乙醚萃取、氢氧化钠溶液反萃辣椒素, 再结晶的方法分离制备辣椒素化合物, 比较萃取结晶前后, 辣椒素中辣椒碱的转移情况, 其紫外吸收值如表3。

辣椒素粗提物经萃取结晶后, 结晶物呈淡红色, 其中辣椒碱的转移率为87.1%。

2.3 HPLC法测定辣椒碱转移率

前述采用UV对不同纯化辣椒碱的工艺进行了探索, 在确定了乙醚-酸碱萃取分离辣椒素的工艺后, 为了准确检测在萃取过程辣椒碱的转移率, 选择HPLC[11]测定辣椒粗提物及萃取结晶后辣椒碱的含量。

(1) 色谱条件。仪器:岛津液相色谱仪LC-20A;色谱柱为ODS-C18柱 (4.6mm×150mm, 5mm) ;检测器:SPD-10A紫外检测器;柱温:40℃;流动相:甲醇-水 (60∶40) ;流速:1.0mL/min;检测波长:280nm。

(2) 辣椒碱对照品溶液的配制及HPLC图谱。见图4。

(3) 辣椒素结晶物溶液的配制及HPLC图谱。取0.8g萃取结晶物加乙醇至10mL, 取1mL加无水乙醇至10mL。取1mL加无水乙醇至30mL, 其高效液相色谱如图5。

精密量取供试液, 进样20μL, 用外标法 (峰面积) 计算辣椒碱含量, 辣椒提取物萃取结晶过程中辣椒碱的转移率为81.1%。

3 讨论

本次实验主要解决的难点在于从辣椒粗提物中分离辣椒素, 共采取了3种不同方法, 结果分析如下:

活性炭分离纯化辣椒素方案:结果表明辣椒碱洗脱不完全, 辣椒碱转移率低。

pH法分离纯化辣椒素方案:该方法所得到的结晶物为深红色, 达不到分离辣椒素与辣椒色素的目的。其可能原因是辣椒色素有一部分可溶解于NaOH溶液中, 造成结晶物颜色呈深红色。

萃取-结晶法:该方案所得到的溶液呈浅红色, 其紫外分光光度图谱显示, 在400nm后基本无吸收, 说明辣椒素与辣椒色素得到初步分离, 辣椒碱的转移率为81.1%。该方案工艺成本低, 辣椒碱转移率高, 操作简单, 可作为分离纯化辣椒素的最终方案。

4 结语

从本实验结果来看, 相比活性炭纯化法及pH法, 乙醚萃取—结晶法分离纯化辣椒素的效果较好, 辣椒碱转移率高, 工艺成本低, 操作简单, 辣椒素物质得到初步分离, 有利于辣椒素类物质的精制, 可作为工业化分离纯化辣椒素的方案。

摘要：目的:从辣椒中提取并分离纯化辣椒素。方法:采用70%乙醇提取辣椒素;以辣椒碱的含量为指标, 运用紫外-可见分光光度法及高效液相色谱法比较活性炭法、pH法、乙醚萃取结晶法三种方法分离纯化辣椒素的效果。结果:采用乙醚萃取辣椒粗提物, 乙醚相用氢氧化钠水溶液萃取, 所得氢氧化钠萃取液调pH值后结晶, 得到辣椒素粗品, 辣椒碱总收率为81.1%。结论:乙醚萃取结晶工艺得到的辣椒素含量高, 回收率高, 工艺成本低, 可作为辣椒素的生产方案。

关键词：辣椒,辣椒素,活性炭法,pH法,乙醚萃取结晶法

参考文献

[1]董新荣, 刘仲华, 李本祥, 等.制备型高效液相色谱法制备纯化3种辣椒素单体[J].色谱, 2008, 3 (26) :366-369.

[2]吴艳阳, 陈开勋, 邵纪生.辣椒素的制备工艺及分析方法[J].化学世界, 2004 (4) :218-221.

[3]CATERINA MJ, LEFFLER A, MALMBERG AB.et a1.Impaired nocicepfion and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor[J].Science, 2000, 288 (5484) :306-313.

[4]HANUMANTHAPPA M, KRISHNAPURA S.Protective effect of dietary curcumin and capsaicin on induced oxidation of low-density iipoprotein, iron-induced hepatotoxicity and carrageenan-induced inflammafion in experimental rats[J].FEBSJ, 2006, 273:4528-4537.

蛹虫草子实体多糖的分离纯化 篇8

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

蛹虫草(Cordyceps militaris L.Link)C19子实体由深圳澎源生物科技有限公司提供。

1.1.2 试剂:

木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白为Sigma试剂;Sephadex G-100 为Pharmacia进口分装试剂;其它试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器:

5810R高速冷冻离心机,MP502B电子天平,2×60cm层析柱。

1.1.4 培养基:

大米培养基。

1.2 方法

1.2.1 多糖测定:

苯酚-硫酸法。多糖总量的测定根据文献[6,7]进行。多糖得率(%)=0.9×(总糖百分含量-还原糖百分含量)×100 %,其中0.9为葡萄糖换算为多糖的系数。

1.2.2 多糖除色素实验:

扫描粗多糖溶液的紫外-可见吸收光谱,结果表明溶液没有最大吸收波长,在445 nm有较高吸收值,且溶液脱色前后均为橙黄色,故从互补色考虑选取445 nm作为检测波长。

1.2.3 多糖醇析实验:

多糖浓缩后用乙醇沉淀。选定影响多糖得率的3个主要因素进行正交实验(表1)。于4℃醇析,以10 000r/mim离心10min,挥发干乙醇,溶解沉淀,测定多糖得率,确定最佳醇析条件。

1.2.4 多糖除蛋白实验:

粗多糖溶液经95 %乙醇沉淀、无水乙醇洗涤后,用丙酮搅拌洗涤30min,以3 500r/min 离心10min,沉淀再用乙醚搅拌洗涤30min,除去乙醚,沉淀溶于适量的纯水配成多糖溶液后,进行除蛋白处理。采用考马斯亮蓝G250法测蛋白质,以牛血清白蛋白为标准蛋白。

1.2.4.1 Sevag法:

将氯仿:正丁醇配按4:1(V/V)混合,即为Sevag试剂。法Ⅰ:将粗多糖溶液与Sevag试剂按3:1(V/V)混合,充分振荡抽提30min,10 000r/min离心10min,上层为脱蛋白的多糖溶液。重复3～7次,分别取上清液测蛋白质和多糖含量。法Ⅱ:充分振荡抽提1h,11 000r/min离心20min,其它操作同前。

1.2.4.2 蛋白酶法

(1)单因素实验

将木瓜蛋白酶与粗多糖溶液按体积比1:15混合,于60℃分别酶解1h、2h、3h、4h,沸水浴5min灭活,用95%乙醇于4℃醇析24h,测定蛋白质和多糖含量。

将酶与激活剂等体积混合,室温激活25min,测蛋白质含量;将酶与多糖溶液按1:10混合,于60℃分别酶解0.25h 、0.5h、1h 、2h、3h、4h、6h,其它操作同前。

(2)正交实验

选定影响蛋白去除率的三个因素进行正交实验(表2)。

1.2.4.3 蛋白酶法结合Sevag法

粗多糖经激活15min的木瓜蛋白酶于55℃、1:15、处理2h后,再经Sevag法处理2次,分析脱蛋白率与多糖损失率。

1.2.5 乙醇分级沉淀

透析后的样品加无水乙醇至终浓度为50%,于4℃醇析3.5h,10 000r/min离心10min,收集沉淀,为50%醇析样品;离心后收集的上清液加无水乙醇至终浓度为80%,于4℃醇析27h,10 000r/inm离心20min,收集沉淀,为80%醇析样品。

1.2.6 Sephadex G100 柱层析法

50%醇析样品复溶,上样,流速为4ml/10min/管;80%醇析样品复溶,上样,流速为4ml/10min/管;样品全部进入柱后开始洗脱并收集。

2 结果与分析

2.1 多糖除色素实验结果

多糖溶液经201×7树脂脱色后颜色变淡,吸光值降低。同一温度下保温时间越长脱色率越高,60℃脱色9h脱色率最高(表3)。

2.2 多糖醇析实验结果

多糖醇析正交实验结果见表4。影响多糖得率的因子顺序为:乙醇浓度A>乙醇与样品比例C>醇析时间B。最优条件为A2B2C2(无水乙醇、24h、4倍乙醇)。考虑后者到成本问题,追加了95 %乙醇的实验。结果表明,两者多糖得率接近且更高,故醇析可选定95%乙醇、24h、4倍乙醇进行。

2.3 多糖除蛋白实验结果

2.3.1 Sevag法除蛋白结果

Sevag试剂振荡抽提30min结果表明(图1),操作6次除蛋白率可达84.09%,但多糖损失率在第3次已达44.77%。Sevag试剂振荡抽提1h 结果表明(图2),操作3次除蛋白率即可达到81.14%,之后除蛋白效果不明显,操作6次除蛋白率达到84.47%;抽提3次多糖损失率为27.03%,抽提6次多糖损失率达到43.16%。Sevag法除蛋白较彻底,但多糖损失率也高,操作3次后除蛋白效果不明显,可能溶液中Pr量太微,沉淀离心后极易再次进入溶液;振荡30min与60min差别不大。比较表明,用Sevag试剂振荡抽提1h,除蛋白3次即可。

2.3.2 蛋白酶法

单因素实验中,木瓜蛋白酶不激活(图3)或采用激活剂激活(图4)除蛋白率都不高,但后者多糖提取率远高于前者。

正交实验结果表明(表5),最优条件A3B3C2(70 ℃、1:10、2h);影响因素顺序为:反应温度>酶与样品比例>处理时间。

2.3.3 蛋白酶法结合Sevag法

样品经木瓜蛋白酶处理后再用Sevag法处理,除蛋白率比单独采用酶法高但比单独采用Sevag法低(图5)。

2.4 多糖柱层析结果

50%醇析样品经Sephadex G100柱层析后得到两个多糖吸收峰,其中第一个吸收峰多糖含量高,且与蛋白质吸收峰重叠,说明多糖与蛋白可能没有完全分开,需进一步纯化;亦可能为含蛋白多糖;第二吸收峰多糖含量低,且在280nm没有吸收峰,不含蛋白质,可收集进行后续实验。80%醇析样品经Sephadex G100柱层析后得到一个多糖吸收峰,与蛋白质峰有部分重叠,说明多糖与蛋白可能没有完全分开,需进一步纯化,亦可能为含蛋白多糖。

3 讨论

蛹虫草粗多糖含色素、蛋白质、脂质等杂质,要对多糖特性、药理等进行研究首先要除掉上述杂质,并进行精制纯化。文献报道以DEAE纤维素纯化[4,9,10]或将DEAE纤维素与Sephacryl S-100 HR、 Sephacryl S-400柱层析法结合纯化[3,8],均得到较好纯化效果。Rongmin Yu,et al[2]将蛹虫草多糖经50%乙醇沉淀、Sephadex G100柱层析分离得到4种成分。本研究先经50%、80%乙醇分级沉淀得2种粗多糖成分,再分别采用Sephadex G100柱层析,可将粗多糖纯化为较纯的3种成分,方法简便易行,纯化效果较好,纯化周期缩短、成本相对降低。而分离出的3个峰具体成分及性质有待进一步研究。

参考文献

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[2]Rongmin Yu,Lei Wang,Hui Zhang,et al.Isolation,purification and i-dentification of polysaccharides from cultured Cordyceps militaris[J].Fitot-erapia,2004,75(7-8):662-666.

[3]Wu Guang-Hao,Wang Min.Separation,purification and the immuno-regulation effect of polysaccharides in cultured Cordyceps militaris[J].Chin J Nat Med,2007,5(1):73-76.

[4]Hui Yan,Dongjie Zhu,Dabao Xu,et al.A study on Cordyceps militarispolysaccharide purification,composition and activity analysis[J].AfricanJournal of Biotechnology,2008,7(22):4004-4009.

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抗菌肽的分离纯化研究进展 篇9

1 抗菌肽的抗菌优势

抗菌肽拥有的与传统型抗生素不同的抗菌机制, 使得抗菌肽具有抗细菌、抗病毒、抗寄生虫等病原体活性高和靶向点多、耐药性低等优势。抗菌肽的肽链长度相对较短, 一般为15~50个氨基酸残基构成, 其分子量小, 更易于快速到达感染部位。另外, 抗菌肽可以不同功能类型联合使用或与抗生素互相联合发挥其协同效应, 增强机体免疫能力。

2 抗菌肽的分离纯化与结构测定

分离纯化是天然抗菌肽获取过程中的一项重要环节, 是进一步对抗菌肽的人工合成与机理研究的基础步骤。分离纯化的过程复杂, 对于未知成分和结构复杂的抗菌肽, 其难度更大。分离纯化的关键在于既要保持抗菌肽的生物活性, 又要得到纯的单一活性的肽。所以, 在分离纯化阶段每操作一步都要对其抗菌活性进行检测, 只有具备抗菌活性, 才有必要进行接下来的试验, 从而得到理想的单一活性肽。

2.1 纯化前处理

在分离纯化步骤前, 要注意对样品的前处理:若抗菌肽存在于体积偏大的有机体内的组织或器官, 应在提取前将其按照不同组织或器官分类;若抗菌肽存在于机体偏小至难分割状态时, 要使整个机体作为提取的对象。同时, 要注意对干燥温度、储藏时间等因素的调控, 以防对试验结果产生影响。

2.2 分离纯化

2.2.1 分离纯化的步骤。

抗菌肽的分离纯化基本都是根据抗菌肽的两亲性、带正电荷和分子量小的特性进行。另外, 抗菌肽的纯度与上样量和层析柱等均有关系。目前的分离纯化步骤可归纳为以下3步[1]: (1) 使用高速离心或者超滤的方法除去样品中的大分子蛋白质、脂肪和颗粒物; (2) 使用分子筛、固相萃取、离子交换色谱等方法去除部分较大分子蛋白质、无机盐和脂肪等干扰物, 进一步分离提取得到分子量比之更小的成分; (3) 将滤液通过阳离子交换层析、反相高效液相色谱法 (RP-HPLC) 分离纯化活性物质。

2.2.2 分离纯化的方法。

抗菌肽的分离纯化方法主要有:依据溶解性能差别分离, 可将其分为低温有机溶剂沉淀、盐析法等;根据分子大小的不同分离, 可将其分为超滤、透析和凝胶过滤等;根据配体特异性分离, 如亲和层析法[2]等。研究表明, 大部分的分离纯化是根据多肽类的理化性质而采用多级纯化方法和多种分离方法结合使用。陈玉清等[3]通过Sephadex G-100凝胶过滤层析和CM-Sepharose CL-6G离子交换层析及HPLC分离, 在家蚕幼虫免疫血淋巴内分离出2种抗菌蛋白。

2.3 抗菌肽结构测定方法

2.3.1 非质谱技术。

如今, N端测序法是应用于氨基酸序列的主要测定方法。虽然N端测序法已被广泛应用于氨基酸测序中, 但存在一个弊端, 就是位于N端的多肽或蛋白质无法被测定。此时, 可以使用脱修饰反应, 使得N端的氨基酸序列暴露出来进行测定。而且, Edman降解是N端测定法的基础, 较小的肽段是无法被Edman讲解法测定出全序列的。所以, 其灵敏度较低, 不适合应用于高通量分析中。

2.3.2 质谱技术。

近年来, 质谱技术飞速发展, 针对分子量相对较小的蛋白开发出了4种测定技术:电喷雾、离子体解吸、基质辅助激光解吸/电离和快原子轰击。而纳升电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱技术的出现, 使得测定微量蛋白质的领域得到巨大提升。电喷雾质谱测度的原理是肽段通过与惰性气体不断碰撞, 诱导分裂而衍生出的一系列碎片离子, 通过他们的质量差推断所需测定的氨基酸序列。纳升电喷雾串联质谱就是安装一系列纳升喷雾源在四极杆-飞行时间串联质谱 (Q-TOF2) 上, 该方法的优点是可以使翻译后的氨基酸纯度及修饰不能够制约抗菌肽的序列测定。使离子阱电喷雾串联质谱或三四级电喷雾串联质谱与其比较可知, 四级杆-飞行时间电喷雾串联质谱 (Q-TOF-ESI-Ms/Ms) 的灵敏度和分辨率要高一些, 质量测定的准确度同样较高。所以, 四级杆-飞行时间电喷雾串联质谱更佳适用于抗菌肽的测序, 更有益于获得准确度高的数据。

质谱软电离技术在进行蛋白质测定时, 所产生分子相对稳定, 方法有效, 因此受到众多领域的重视, 不仅在蛋白质序列测定上, 还在有机化学、药学和高分子化学上发挥巨大潜力, 成为众多研究学者分析分子纯度、质量的有效工具。

3 展望

天然抗菌肽针对致病菌的入侵和免疫功能的调节均有显著功效, 并且其广谱抗细菌、无免疫源性和分子量小等功效均有待开发, 其毒副作用等无明确阐述, 仍需要不断优化抗菌肽的分离提纯等技术, 不断加深对抗菌肽的研究和探索。

抗菌肽在农业、食品、医药方面表现出很大的潜力价值, 但若是将其投入畜牧业, 开始大规模生产仍存在很多待解决的问题, 如从自然物质中提取抗菌肽是一个相对来讲比较复杂的过程, 来源受限, 分离纯化步骤繁琐, 投入高是回报率低。所以, 想要让抗菌肽更广泛地应用于各个领域, 仍需要进一步研究其副作用、相互作用及各个环节。

参考文献

[1]苗建银, 柯畅, 郭浩贤, 等.抗菌肽的提取分离及抑菌机理研究进展[J].现代食品科技, 201 (413) :203-240.

[2]韩金玉, 那平, 元英进.亲和色谱纯化蛋白质新进展[J].色谱, 199 (66) :447.