提取纯化（共11篇）
提取纯化 篇1
甘草是我国传统的“药食兼用”中药材料, 具有多种保健功能。近年来的药理研究表明, 甘草有肾上腺皮质激素样作用、抗炎及抗免疫作用、解毒作用、抗消化道溃疡作用和抗脂肪肝作用。随着人们对甘草多糖认识的提高, 甘草多糖在医药、食品、工业等方面得到广泛应用。因此, 开展甘草多糖提取工艺研究具有重要的意义。
1 材料与方法
1.1 材料
甘草市售;甲醇天津北方天医化学试剂厂;无水乙醇天津北方天医化学试剂厂;苯酚天津北方天医化学试剂厂;硫酸文达稀贵试剂化工厂;甲醇天津大学科威公司。
1.2 仪器与设备
YP型电子天平上海天平仪器厂;LSY电热恒温水浴锅北京医疗设备厂;DG404真空电热干燥箱天津市天宇实验仪器有限公司;LG16-W离心机北京医用离心机厂;QL-901微型漩涡混合器其林贝尔仪器制造公司。
1.3 方法
1.3.1 甘草多糖测定方法
实验采用苯酚-硫酸比色法。该法操作简单、快速、无需多糖纯品等优点, 且对水溶性和非水溶性样品均可测定。
1.3.2 标准溶液的配制
称取干燥的葡萄糖20.00mg, 置500mL容量瓶中, 加水溶解并稀释至刻度线, 摇匀, 配得葡萄糖标准溶液。
1.3.3 苯酚溶液的配制
先配制80%苯酚溶液, 然后称取80.0g苯酚加20.0g水使之溶解, 置于冰箱中避光长期保存。取80%苯酚37.5mL定容到500mL, 配制成6%的苯酚溶液避光保存备用。
1.3.4 单因素对甘草多糖提取的影响
1.3.4. 1 料液比影响
称取5份甘草粉末各1.0g, 置于250mL圆底烧瓶中, 分别加入15、20、25、30、35倍水, 100℃水浴下, 回流提取1h, 离心分离 (5000rpm, 15min) , 浸提液置100mL容量瓶定容, 取2m L于试管中用硫酸-苯酚法测定其吸光度值。
1.3.4. 2 提取温度影响
称取5份甘草粉末各1.0g, 置于250m L圆底烧瓶中, 各加入15倍水, 分别在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴下, 回流提取1h, 离心分离 (5000rpm, 15min) , 浸提液置100mL容量瓶定容, 取2mL于试管中用硫酸-苯酚法测其吸光度值。
1.3.4. 3 提取时间影响
称取5份甘草粉末各1.0g, 置于250m L圆底烧瓶中, 各加入15倍水, 70℃水浴下, 分别回流提取0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h, 离心分离 (5000rpm, 15min) , 浸提液置100m L容量瓶定容, 取2mL于试管中用硫酸-苯酚法测其吸光度值。
1.3.4. 4 提取次数影响
称取5份甘草粉末各1.0g, 置于250mL圆底烧瓶中, 各加入15倍水, 70℃水浴下, 分别回流提取2次、3次、4次、5次、6次, 每次提取0.5h, 离心分离 (5000rpm, 15min) , 浸提液置100m L容量瓶定容, 取2mL于试管中用硫酸-苯酚法测其吸光度值。
2 结果与分析
单因素对甘草多糖提取的影响
2.1 料液比影响
取粉碎样品, 提取条件为100℃、1h、提取次数1次, 料液比分别为15倍、20倍、25倍、30倍、35倍。料液比对甘草多糖提取效果的影响如图1所示。
由图1可以看出, 甘草多糖提取量随料液比的增大而增加。当料液比大于1:30时, 甘草多糖提取量缓慢降低。
2.2 温度影响
取粉碎样品, 提取条件为料液比15倍、1h、提取次数1次, 温度分别为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃。提取温度对甘草多糖提取效果的影响如图2所示。
由图2可以看出, 提取温度由60℃增加到70℃时, 甘草多糖提取量随温度的提高而上升, 当温度超过70℃以后, 继续提高温度, 甘草多糖的提取量缓慢下降。
2.3 提取时间影响
取粉碎样品, 提取条件为料液比15倍、温度70℃、提取次数为一次, 提取时间分别为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h。提取时间对甘草多糖提取效果的影响如图3所示。
由图3可以看出, 在提取时间1h时提取率较高, 随着时间的延长, 提取率缓慢下降。
2.4 提取次数影响
取粉碎样品, 提取条件为料液比15倍、温度70℃, 提取时间为0.5h、提取次数分别为1次、2次、3次、4次、5次、6次。提取次数对甘草多糖提取效果的影响如图4所示。
由图4可以看出, 随着提取次数的增加, 提取率不断提高, 综合考虑, 实验确定提取次数为2次。
3 结论
甘草多糖提取最佳工艺条件为:提取温度90℃, 料液比30倍, 时间0.5h, 提取次数2次。
参考文献
[1]张继, 姚健等.甘草的利用研究进展[J].草原与草坪, 2000, (2) :12-17.
[2]孙萍, 李艳等.甘草多糖的微波提取及含量测定[J].基层中药杂志, 2001, 15 (6) :22-23.
[3]王航宇, 刘金荣等.新疆甘草多糖的超声提取及含量测定[J].基层中药杂志, 2002, 16 (1) :7-8.
提取纯化 篇2
摘要：蓝藻水华污染所带来的主要危害是由毒蓝藻向水体中释放多种不同类型的微囊藻毒素(Microcystis,MCs),其中微囊藻毒素MC-LR和MC-RR是我国富营养化水体中最主要的.2种藻毒素.为解决对MCs进行深入研究中的MCs纯品缺少问题,迫切需要研究1种有效提取.纯化、制备MCs的方法.以天然水华蓝藻为原料,建立了以甲醇溶液提取、固相萃取和半制备色谱分离为主要步骤的微囊藻毒素提取、纯化和制备的方法.通过优化提取、分离和制备条件,制备了一定量的微囊藻毒素MC-LR和MC-RR高纯度样品.样品经HPLC鉴定分析,纯度可达98%以上.干燥后可得2种微囊藻毒素纯品分别为MC-RR:121.1μg,MC-LR:62.8μg.作 者：卫涛 向铮 张婧婧 冯小刚 作者单位：卫涛,向铮,冯小刚(温州医学院药学院化学教研室,温州,325035)
张婧婧(南京理工大学化工学院,南京,210094)
提取纯化 篇3
关键词 火龙果；PMP衍生化；单糖组成；液相色谱
中图分类号：S668.9 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2016）15--03
火龙果是仙人掌科（Cactaceae）三角柱属（Hylocereusundatus Britton et Rose）和蛇鞭柱属（SeleniereusMeja-lantous Britton et Rose）的果用栽培品种，其外观犹如鳞片状因而得名火龙果，又称青龙果、红龙果、仙人掌果等，是一种具有很高观赏性和营养价值的品种[1-2]。火龙果原产于中美洲热带地区，后经移植至东南亚等国后传入我国广东、广西、台湾等地区。因其富含植物性多糖、矿物元素、甾醇及维生素等营养物质[3]，具有增强人体机能、提高免疫力及美容养颜等功效，因此具有广阔的开发前景和利用价值，近年来得到国内外学者的广泛关注[4，5]。本文对火龙果中富含的活性物质植物多糖进行提取、纯化，并采用高效液相色谱法鉴定了其单糖组成，为进一步加工利用火龙果资源提供了理论基础。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
火龙果：购于农贸市场，产地海南。纤维素酶、Sephadex LH-20、单糖对照品（葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖）：上海源叶生物科技有限公司。三氟乙酸、重蒸酚、PMP：北京索莱宝科技有限公司。乙腈为色谱纯。甲醇、乙醇、氯仿、正丁醇、浓硫酸、浓盐酸等为分析纯。
DS-I型高速组织捣碎机；真空冷冻干燥机；BS-100A自动部分收集器；KQ5200DE型数控超声波自动清洗器；759MC紫外可见分光光度计；DZF-6050型真空干燥箱；SHB-B95循环水式真空泵；DT5-4B型低速台式离心机；0.45μm水相过滤膜；Zorbax SB C18；安捷伦高效液相色谱仪Agilent 1100。
1.2 火龙果多糖的提取、纯化及鉴定
本实验采用超声辅助的方法提取火龙果多糖，提取参数参考熊建文等人的方法[6]并加以改进。取新鲜火龙果去皮去籽后于组织斩碎器中充分斩碎，之后取适量火龙果果肉浆进行热水回流提取。提取完成后抽滤，将得到的滤液放入真空冷冻干燥机中干燥，得到火龙果组织粗提物。取粗提物10 g溶于200 mL蒸馏水中并加入0.600 g纤维素酶，在最佳条件下水解1 h灭酶冷却，之后于65 ℃下超声提取50 min。结束后4 500 r/min离心15 min，收集上清液。将上清液按液料比1∶4加入氯仿-正丁醇混合液（4∶1）并充分振摇30 min，充分静置溶液分层后弃去沉淀，如此反复3次以除去蛋白质。将溶液冷冻干燥得到火龙果粗多糖。
使用凝胶色谱层析纯化得到的火龙果粗多糖，填料选用Sephadex LH-20。操作步骤：取100 mg火龙果粗糖充分溶解于10 mL超纯水中，使用0.45 μm水相膜过滤后上样。洗脱液为超纯水，流速12 mL/h，每管收集40 min，收集50管。使用苯酚-硫酸法逐管测定490 nm下吸光度，收集洗脱峰并冻干[7]。使用紫外-可见光全光谱扫描法（200～800 nm）鉴定火龙果多糖提取物的性质。
1.3 火龙果多糖TFA酸水解条件优化
火龙果多糖水解条件正交实验因素和水平见表1，采用L9（34）正交实验设计。精确称取火龙果多糖10.0 mg于具塞试管中，加入2 mL不同浓度的三氟乙酸，氮气置换后封管于烘箱中恒定温度下水解一定时间。结束后加入4 mL甲醇溶液充分振摇后放入真空烘干箱中烘干，反复3次以除去三氟乙酸。
表1 火龙果多糖TFA酸水解正交实验因素与水平表
重复酸浓度/（mol/L）水解温度/℃水解时间/h
11803
221006
341209
1.4 HPLC-DAD法测定单糖组成
1.4.1 单糖对照品和火龙果多糖水解物衍生化
分别取葡萄糖、果糖对照品各3mg于同一试管中，加入0.3 mol/L NaOH溶液5 mL充分振荡。取100 μL溶液加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液50 μL，放入70 ℃恒温水浴锅中加热30 min后冷却至室温，之后添加0.3 mol/L盐酸100 μL中和。将衍生化后的糖液按1∶1的料液比与水-氯仿（1∶1）混合液混合并充分振荡离心。弃去氯仿层后再次加入适量氯仿萃取，重复3次以完全除去PMP，然后使用0.45μm水相滤膜过滤后冷藏备用[8，9]。取火龙果多糖水解残渣3mg，处理步骤与对照品单糖相同。
1.4.2 色谱条件
色谱柱采用Zorbax SB C18，流动相为乙腈∶水=25∶75，流速1 mL/min，柱温25 ℃，检测器波长245 nm，进样量10 μL。
1.4.3 系统适用性参数
使用衍生化后的单糖对照品进行系统精密度测定，进样5次，进样量10μL。结果显示，单糖对照品衍生化物峰的保留时间RSD值均小于0.22%，峰面积的RSD值均小于0.51%，理论塔板数不低于3 000。
2 结果与分析
2.1 火龙果多糖提取、纯化及鉴定
火龙果粗多糖柱层析吸光度图谱见图1。火龙果粗多糖经过Sephadex LH-20葡聚糖凝胶纯化后得到一个吸收峰，收集吸收峰对应的试管溶液并进行全光谱扫描，扫描结果见图2。扫描结果显示，吸收图谱是多糖类物质典型的双曲线型，在250 nm和280 nm处无明显吸收，说明几乎不含核酸和蛋白类杂质[10]。
2.2 多糖单糖组成测定
分别取衍生化后的混合单糖对照品和火龙果多糖水解液按照1.4.2中色谱条件进样，六种混合单糖对照品PMP衍生化物HPLC图谱见图3，火龙果多糖水解液衍生化HPLC色谱图见图4。可以看出火龙果多糖由组成葡萄糖、果糖、阿拉伯糖组成。
2.3 火龙果多糖TFA最佳水解条件
以火龙果多糖水解产物洗脱峰面积为指标，使用SPSS12.0统计软件中正交设计分析工具分析测定指标，优化火龙果多糖TFA水解条件。优化结果表明，酸浓度、水解时间、水解温度3个因素间具有显著性差异（P<0.05）。Post Hoc Tests析因分析（α=0.05）表明TFA最佳水解条件为：酸浓度2 mol/L、水解温度120 ℃、水解时间6 h。
3 结论
采用热水回流提取的方法优化了火龙果粗多糖的提取步骤，并通过Sevag法及Sephadex LH-20柱层析纯化提取得到的火龙果粗多糖。经过紫外-可见光全光谱扫描验证得到的火龙果多糖具有一般多糖的特征吸收曲线。优化了TFA法水解火龙果多糖的条件，结果显示，10 mg火龙果多糖中加入2 mL浓度为2 mol/L的TFA，在120 ℃下水解6h得到的单糖产率最高。该方法通过反复加入甲醇以除去TFA，相比其他水解方法提高了后续步骤中液相分析的分辨率并降低了单糖损失。根据单糖类物质经过PMP衍生化后在特定波长处有紫外吸收的特性，本实验设计了PMP衍生化法测定火龙果单糖组成的方法，结果表明火龙果多糖主要由葡萄糖、果糖和阿拉伯糖组成。
参考文献
[1]黎舒.火龙果不同品系品种植物学形态和生物学特性研究[D].南宁：广西大学，2014.
[2]朱春华，李进学，龚琪，等.火龙果加工综合利用状况[J].保鲜与加工，2014（1）：57-61，64.
[3]邓仁菊，范建新，蔡永强.国内外火龙果研究进展及产业发展现状[J].贵州农业科学，2011（6）：188-192.
[4]李鹏.火龙果茎凝胶汁、多糖的初步研究[D].北京：首都师范大学，2009.
[5]蔡永强，向青云，陈家龙，等.火龙果的营养成分分析[J].经济林研究，2008（4）：53-56.
[6]熊建文，许金蓉，张佳艳，等.酶法辅助超声波提取火龙果多糖及其抗菌活性[J].食品工业科技，2015（17）：229-233，238.
[7]张杰，李春艳，李劲平，等.蒽酮硫酸法与苯酚硫酸法测定竹节参多糖含量的比较研究[J].中南药学，2012（6）：421-424.
[8]许杜娟，夏泉，刘钢，等.高效液相法测定黄芪中性多糖的单糖组成[J].中国实验方剂学杂志，2008（9）：4-6.
[9]万强，吴学昊，范华均，等.HPLC衍生化法分析决明子多糖水解产物中单糖组分及其多糖组成特征的研究[J].分析测试学报，2014（11）：1231-1236.
[10]陈小强，成浩，叶阳，等.茶多糖纯化组分的理化分析[J].中草药，2008（6）：828-830.
米糠蛋白提取及纯化工艺的研究 篇4
目前米糠蛋白的提取方法主要有3种, 包括碱溶酸沉法、酶法和物理提取法。碱溶酸沉法是最常见的米糠蛋白提取方法, 该方法简单易行, 且提取较为完全。碱液可使米糠紧密结构变得疏松, 同时碱液对蛋白质分子次级键特别是氢键具有破坏作用, 并可使某些极性基团发生解离, 使蛋白质分子表面分子具有相同电荷, 促进结合物与蛋白质分离, 从而对蛋白质分子有增溶作用, 并随着碱性增加, 米糠中蛋白质提取率增加。但须注意避免碱液浓度过高, 较高浓度碱溶液会促使蛋白质中赖氨酸与丙氨酸、胱氨酸发生缩合反应, 生成有毒化合物, 使赖氨酸营养价值大大降低。另外, 高碱条件下还会产生一些不利反应, 如蛋白质变性和水解;增加美拉德反应促使产品颜色加深;增加非蛋白成分提取, 降低提取效率。
酶法提取米糠蛋白反应条件温和, 蛋白质提取得率较高, 且能更多保留蛋白质营养价值;同时也避免传统碱法提取米糠蛋白所带来负面效应, 因此酶法提取米糠蛋白为米糠利用开辟新的途径。
Anderson等人将全脂或脱脂米糠采用胶体磨粉碎和均质, 通过破碎米糠细胞结构, 使米糠蛋白溶出而进行提取米糠蛋白方法。全脂米糠经微粉碎和均质后, 蛋白质溶出浓度比单纯水溶液提取率提高75%, 脱脂米糠经物理方法处理, 其蛋白质溶出浓度可提高18.7%, 且磨浆和均质可使溶出组分分子量差别很大, 所以利用物理方法增进米糠蛋白提取率也是可行的。
在米糠蛋白的纯化方面还很少见到相关报道, 本研究在酶辅助碱溶酸沉法提取米糠蛋白的基础上, 利用糖化酶对米糠蛋白进行纯化, 提高了产品的蛋白质含量。
1 试验材料与方法
1.1 试验原料
脱脂米糠, 试验室制备, 过40目筛备用;碱性蛋白酶, 庞博生物工程有限公司。
1.2 仪器与设备
TD5Z台式离心机, 湖南凯达科学仪器有限公司;电子分析天平 (AB204-E) 、p H计, METTLERTOLEDO, Switzerland;数显恒温水浴锅 (HH-6型) , 常州市国华电器有限公司;数显鼓风干燥箱 (101-1-S) 、真空干燥箱 (101-1-S) , 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;集热式恒温磁力搅拌器 (FS-1) 、DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器, 巩义市英峪予华仪器厂;FZ102型微型植物粉碎机, 天津泰斯特仪器有限公司;RE52CS旋转蒸发器, 上海亚荣生化仪器厂;超级恒温水浴, 金坛市精达仪器制造厂;冷冻干燥机 (Freezone 6) , 美国Labconco公司。
1.3 试验方法
1.3.1 原料基础数据测定
水分的测定采用105℃恒重法, GB/T 5009·3-2003;蛋白质的测定采用微量凯氏定氮法, GB/T 5009·5-2003;粗脂肪的测定采用索氏抽提法, GB/T 5009·6-2003;粗纤维的测定采用GB/T 5009·10-2003;灰分的测定采用灼烧重量法, GB/T 5509.4-2003。
蛋白质提取率=产品中蛋白质的量 (g) /原料中蛋白质总质量 (g) ×100%
1.3.2 碱溶酸沉法制备米糠蛋白
脱脂米糠→加水搅拌→Na OH调节p H值、温度→搅拌碱提→离心分离→上清液→HCl调节p H值→等电点酸沉→离心分离→冷冻干燥→米糠蛋白
按照上述工艺流程, 先将脱脂米糠加水混合, 用Na OH调节p H值至10.5, 在50℃下保温搅拌2h。碱提完成后, 在4 000r/min下离心分离10min, 将上清液加酸调节p H值至米糠蛋白等电点, 50℃下保温酸沉0.5h。酸沉完成后离心分离, 得到浆状米糠蛋白, 冷冻干燥后得到粉末状米糠蛋白。称量米糠蛋白, 计算提取率。
1.3.3 酶辅助碱溶酸沉法制备米糠蛋白
脱脂米糠→加水搅拌→调节p H值、温度→加酶水解→灭酶→调节p H值→碱提→离心分离→上清液→调节p H值→酸沉→离心分离→冷冻干燥→米糠蛋白
按照上述工艺流程, 先将脱脂米糠加水混合, 在恒温搅拌水浴锅中调节温度至40℃, 加Na OH调节p H值至10.5左右, 加入碱性蛋白酶水解0.5h, 调节温度至100℃灭酶20min。维持p H值在10.5左右, 调节温度至55℃, 继续搅拌碱提2h, 在4 000r/min下离心分离15min。将上清液调节p H值至4.7使米糠蛋白沉淀。在4 000r/min下离心分离25min, 之后将浆状沉淀物冷冻干燥得米糠蛋白。称量米糠蛋白, 计算提取率。
1.3.4 米糠蛋白的纯化
浆状米糠蛋白→加水搅拌→调节p H值和温度→糖化酶酶解→灭酶→离心→冷冻干燥→纯化米糠蛋白
将碱溶酸沉所得的浆状米糠蛋白加水搅拌均匀, 调节p H值和温度, 加入糖化酶进行酶解反应。反应完成后90℃高温灭酶, 离心分离得浆状米糠蛋白, 冷冻干燥后得粉末状米糠蛋白产品。用凯氏定氮法测定产品的蛋白质含量。
2 试验结果与讨论
2.1 传统碱溶酸沉与酶辅助碱溶酸沉法的比较
经过计算得知, 传统碱溶酸沉法得到的米糠蛋白提取率为46.28%, 而酶辅助碱溶酸沉法得到的米糠蛋白提取率为61.73%。
如图1所示, 在传统的碱溶酸沉法提取米糠蛋白基础上, 先通过碱性蛋白酶处理浸提物料, 可以使米糠蛋白提取率提高约18%。
2.2 糖化酶处理纯化米糠蛋白
2.2.1 酶解温度的影响
调节酶解温度分别为50、55、60、65和70℃, 按试验方案进行米糠蛋白的提取, 结果如图2所示。
由图2可知:温度在60℃左右时, 所得产品的蛋白含量最高。温度过低过高都会抑制酶的活性, 导致反应速率变慢, 糖类杂质得不到很好的去除, 从而使蛋白质含量偏低。
2.2.2 p H值的影响
调节p H值分别为3.5、4.0、4.5、5.0和5.5, 按试验方案进行米糠蛋白的提取, 结果如图3所示。
由图3可知:p H值在4.5左右时, 所得产品的蛋白质含量最高。p H值过高或过低都会抑制糖化酶的活性, 导致蛋白质含量偏低。
2.2.3 酶解时间的影响
酶解时间分别设置为60、90、120、150和180min, 按照试验方案提取米糠蛋白, 结果如图4所示。
由图4可知:在120min之前, 随着酶解时间的延长, 蛋白质含量显著上升。但到了120min之后, 延长酶解时间蛋白质含量不会有太大变化, 这可能是由于酶解一定时间后, 蛋白液中的糖类杂质大部分已被去除, 再延长酶解时间已很难再提高蛋白含量。因此试验确定酶解时间在120min左右为宜。
2.2.4 加酶量的影响
将加酶量分别确定为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%, 按照试验方案提取米糠蛋白, 结果如图5所示。
由图5可知:加酶量在0.4%之前, 随着加酶量的增加, 蛋白质含量不断升高。随后蛋白质含量出现下降, 原因可能与酶解时间过长导致蛋白质含量很难再提高类似。
2.2.5 液料比的影响
将液料比分别确定为6∶1、5∶1、4∶1、3∶1和2∶1, 按照试验方案提取米糠蛋白, 结果如图6所示。
由图6可知:在液料比4∶1以下时, 随着液料比的升高, 蛋白质含量升高, 随后蛋白质含量降低。这是因为液料比太小, 不利于可溶性糖的溶解分离, 导致蛋白质含量偏低;液料比太大, 则底物浓度太小, 不利于酶的作用, 导致蛋白含量下降。
2.2.6 糖化酶处理提高蛋白质含量的正交试验优化
选取酶解温度、p H值、酶解时间、加酶量和液料比5个因素进行正交试验, 在单因素试验的基础上, 确定正交试验因素水平。确定的L16 (45) 正交试验, 以产品的蛋白质含量为考察指标, 试验结果见表1。
由表1可知:各因素对糖化酶提高米糠蛋白含量的影响大小次序为:酶解温度>p H值>酶解时间>液料比>加酶量。糖化酶处理提高米糠蛋白含量的最佳条件为A3B3C2D3E3, 即酶解温度60℃、p H值4.5、酶解时间90min、加酶量0.3%和液料比3∶1, 在此条件下所做验证试验得到米糠蛋白的蛋白质含量为82.43%。
由于米糠原料的蛋白质含量较低, 用酶辅助碱溶酸沉法提取的米糠蛋白其蛋白质含量也较低, 通常在60%~70%。1次糖化处理能够显著提高产品的蛋白含量, 但经过正交试验优化其含量仍然只能达到80%左右。因此, 考虑在一次糖化酶处理的基础上, 再次利用糖化酶对糖类物质进行酶解。酶解步骤如下:
浆状米糠蛋白→加水搅拌→调节p H值和温度→糖化酶酶解→灭酶→离心→冷冻干燥→纯化米糠蛋白
酶解的条件根据正交试验优化后的参数确定为:酶解温度60℃、p H值4.5、酶解时间90min、加酶量0.3%和液料比3∶1。2次糖化酶处理米糠蛋白所得产品的蛋白质含量可以达到88.74%。
3 结论
(1) 碱溶酸沉法是一种较好的蛋白质提取方法, 但其提取率不是很高, 且所得蛋白含有较多的杂质, 纯度较低。本研究利用酶辅助碱溶酸沉法将米糠蛋白的提取率提高到70%左右。
提取纯化 篇5
作 者：吴旭东 张奇 侯玉霞 张文吉 WU Xu-dong ZHANG Qi HOU Yu-xia ZHANG Wen-ji 作者单位：吴旭东,侯玉霞,张文吉,WU Xu-dong,HOU Yu-xia,ZHANG Wen-ji(中国农业大学理学院,北京,100094)
张奇,ZHANG Qi(宁夏回族自治区水产研究所,银川,750001)
提取纯化 篇6
关键词：绿原酸；金银花；提取；纯化
中图分类号：R932 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2016）07-0055-03
金银花（Flos Lonicerae）为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或初开花，具有清热解毒、凉散风热、保肝利胆等功效，是常用中药材之一。金银花之所以具有清热解毒等功效，是因为其含有一种有效成分—绿原酸（chlorogenic acid）。绿原酸是一种多酚类化合物，分式子为C16H18O9，易溶于水、醇、丙酮等，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血压、降血脂、提高白细胞数量、增强免疫调节、增香护色等作用。近年来，常以绿原酸含量高低来评价金银花质量好坏。国内对于金银花中绿原酸的提取、分离纯化工艺等进行了大量研究，在查阅收集大量文献的基础上，综述近几年来金银花中绿原酸的提取、分离纯化工艺研究进展，旨在为相关研究提供参考。
1 金银花中绿原酸提取方法
1.1 溶剂提取法
用溶剂提取金银花中绿原酸是较为传统的提取工艺，按提取介质分为水提法和醇提法，按提取方式分为煎煮法和回流法。其中水提法成本低，操作简单，但因提取物中蛋白质、多糖、鞣质等杂质比较多，提取液易发霉等原因而应用较少。目前较为常用的是醇提回流法，与水提法相比，该法提取时耗用大量乙醇，加大了生产成本，但提取物中水溶性杂质少，且提取液不易发霉变质，后期处理较方便。近几年金银花中绿原酸醇提研究的工藝参数见表1。
1.2 超声波辅助提取
超声波辅助提取是在水浸提的同时加超声波辅助。此法不仅缩短提取时间、提高提取率，同时避免高温对有效成分的影响。
袁飞采用正交试验优化绿原酸超声波提取工艺，确定影响超声提取绿原酸的因素为溶剂类型>预处理>提取时间>物料比，最佳提取工艺为：60%乙醇为溶剂，物料比1︰30，提取时间45 min，远红外微波1 min。试验结果还表明，溶剂为60%乙醇得到的绿原酸含量比水、乙酸乙酯高近2倍。同时，微波破壁浸提加速绿原酸提取速率，超声提高提取率。周莲比较超声波和索氏提取金银花叶中绿原酸的效果，结果表明：超声法的最优工艺条件为提取温度60 ℃、提取时间240 min、乙醇浓度35%、超声功率200 W、料液比1︰40，绿原酸得率10.5 mg/g；索氏法的最优工艺条件为提取时间240 min、乙醇浓度55%、料液比1︰10，绿原酸得率10.18 mg/g。从结果可以看出，虽然超声法的得率和索氏提取法的得率几乎一样，但超声提取的原料用量更少且能控制提取温度。
1.3 微波辅助提取
微波辅助提取是在水浸提的同时加入微波，与传统的水浸提法相比，微波辅助提取具有选择性高、操作时间短、溶剂消耗小、有效成分收率高的特点。
李燕婷等研究乙醇体积分数、料液比、微波功率和微波处理时间对绿原酸提取率的影响，采用单因素试验和正交试验确定微波辅助提取法的最佳工艺为：乙醇体积分数60%、微波处理时间9 min、微波功率300 W、料液比1︰10（g︰mL），提取率3.779%；与传统提取方法相比，操作时间明显缩短，且无需回收溶剂。
张霞等以甲醇浓度、料液比、提取时间为考察因素，以提取液在327 nm波长的吸光度为响应值，采用响应曲面法确定最佳提取工艺为：43%的甲醇溶液做提取剂，液料比40 mL/g，微波功率400 W，提取时间8 min，绿原酸提取率为7.62%。
尤秀丽、肖卓炳等分别采用微波超声双辅助提取绿原酸，结果均表明：采用超声波和微波双辅助提取技术得到的绿原酸提取率较单独采用超声波或微波辅助得到的绿原酸高。
1.4 其他提取方法
除以上常用的提取方法外，有很多研究采用其他提取技术，如酶解法辅助提取、酶法辅助聚二乙醇（PEG）-200提取、微波辅助聚二乙醇（PEG）提取、破壁法辅助提取等，均取得了较好的提取效果。
2 金银花中绿原酸纯化方法
2.1 大孔树脂柱层析
大孔树脂吸附量大、选择性好、易解吸、易再生、成本低、效率高，特别适用水溶性化合物的提取分离。利用大孔吸附树脂分离纯化绿原酸，工艺较简单、成本低、产率高，现较多采用。
龚志华以金银花粗提物为原料，比较NKA-2、D1400、聚酰胺、HP2MGL、ADS-21、D101及AB-8 等7种大孔吸附树脂对金银花绿原酸静态吸附与解吸的效果，结果表明，NKA-2树脂吸附效果最好，静态饱和吸附量可达212.17 mg/g，在乙醇含量为90%下的解吸率达81.4%，绿原酸纯度可达53.07%，得率达73.33%。兰雪萍、凌益平等分别考察各种类型的大孔树脂对金银花中绿原酸的提取，结果表明，HPD450大孔树脂、ADS-21型大孔树脂和D101型大孔树脂均对绿原酸有较好的纯化效果，可用工业化大生产。
2.2 膜分离
膜分离技术对无机物、有机物等均适用，应用范围广泛，尤其适用于对热过敏物质的分离。大多数膜分离过程不发生相的变化，具有无需加热、能耗低、不需添加任何物质的优点。但膜面易污染，耐压性、耐热性、耐溶剂能力有限。
高红宁等采用醇沉、离心-超滤、微滤-超滤、大孔吸附树脂等4种工艺对金银花水提液进行精制，并采用HPLC法测定金银花水提液中绿原酸的含量。结果表明，金银花水提液经醇沉、离心-超滤、微滤-超滤、大孔吸附树脂工艺处理后，其绿原酸的转移率分别为59.30%，83.07%，80.13%，23.47%；固形物去除率分别为36.59%，40.12%，39.81%，90.07%。范远景等以金银花为原料，以平均通量、膜截留率、绿原酸透过率为指标，比较3种微滤膜（MF1，MF2和MF3）、4种超滤膜（UF1、UF2、UF3和UF4）及2种两种反渗透膜（RO1和RO2）对绿原酸提取液的过滤特性，并研究浓缩液洗滤对绿原酸截留率的影响。试验结果表明：MF1、UF1和RO2膜的过滤性能明显优于其他同类型膜，使用MF1-UF1-RO2膜组合处理效果最佳，其绿原酸回收率可达67.75%，产品纯度可达13.21%以上。
nlc202309082225
潘广勇等以金银花为原料，通过微滤、超滤、纳滤3级膜纯化金银花中的绿原酸。结果表明：微滤膜Ⅱ、超滤膜Ⅰ、纳滤膜Ⅰ组合能达到纯化效果，微滤膜通量186.7 L/hm2，透过率92.2%；超滤膜通量50.1 L/hm2，透过率89.7%；纳滤膜通量32.8 L/hm2，透过率1.5%。
2.3 凝胶柱层析
徐晓伟、阙斐在对金银花提取液进行D101大孔树脂纯化和絮凝处理的基础上，再通过SephadexLH-20层析柱进行分离纯化，结果表明，绿原酸的纯度分别为86.16%和98.3%。
3 结语
金银花是一类传统中药材，具有较高的药用价值和保健价值，而绿原酸是金银花中的有效成分，开展绿原酸提取、分离纯化等方面的研究，对金银花资源的进一步开发利用具有重要意义。
参考文献
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提取纯化大黄素的工艺研究 篇7
1 仪器与材料
1.1 药材
虎杖饮片购于湖北省药材公司,经湖北中医学院陈科力教授鉴定为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zuce.的干燥根,
1.2 仪器试剂
p680高效液相色谱仪(德国戴安),UVD170U检测器(德国戴安),HKZJZ-830171BAF高效液相数据处理系统(戴安变色龙),BP-211D型十万分之一分析天平(Mettler Toledo公司),大黄素标准品(中国药品生物制品检定所 批号110756-200110)
色谱纯乙腈(安捷伦公司),水为超纯水,其他试剂为分析纯
1.3 色谱条件
色谱柱: ZORBA×SB-C18 (安捷伦公司),流动相:乙腈-0.1%磷酸(80:20)
柱温:40℃;流速:1.0 ml·min-1;检测波长:254 nm;灵敏度:0.08 AUFS
2 方法与结果
2.1 标准曲线的绘制
2.1.1标准品溶液的制备
精密称取大黄素标准品4.3 mg于50 mL量瓶中,加入适量甲醇超声溶解并定容至刻度,配成0.086 g·L-1的对照品溶液。
2.1.2标准曲线的制备
精密量取大黄素标准品溶液0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL于2 mL容量瓶中,甲醇定容至刻度,配成0.0086 g·L-1、0.0129 g·L-1、0.0172 g·L-1、0.0215 g·L-1、0.0258 g·L-1 5种浓度,按照上述色谱条件,分别进样20 μL测定。以峰面积为纵坐标,进样浓度为横坐标绘制标准曲线,见表1和图1,回归方程为Y=49.61X-2056.05(r=0.9986),结果表明大黄素在0.0086 g·L-1～0.0258 g·L-1范围内呈良好的线性关系。
2.2 正交实验
2.2.1正交设计方案
分别称取粉碎过20目筛后的干燥虎杖药材50 g 9份,以乙醇体积分数、乙醇用量、提取次数、提取时间为四因素,各取三水平做正交试验(见表2),每组试验均进行提取,趁热滤过,回收乙醇至无醇味,加水至500 mL,静置过夜,过滤,再加水至500 mL,静置2 h,过滤,以pH=4的80%乙醇:丙酮(1:1)混合溶液500 mL溶解,40度超声30 min, 然后过滤,滤液回收,干燥物以体积分数95%乙醇溶解,有黄色沉淀析出,离心,干燥,精密称取一定量定容,测定大黄素量,以大黄素的含量为考察指标,确定最佳提取工艺。
2.2.2正交实验结果
正交实验结果见表3、4
F 0.05(2.2)=19
直观分析表中极差值大小显示,各因素作用主次为A>C>B>D,方差分析结果表明: A因素的影响具有显著性意义, B2与B3,D2与D3差别不大,考虑生产成本与缩短生产周期,取B2、D2。因此,优选最佳组合为A3B2C3D2。即体积分数85%乙醇提取3次,每次8倍量溶剂,提取1.5 h。
2.2.3验证实验
分别称取粉碎过20目筛后的干燥虎杖药材50 g 3份,按照上述正交实验的优选条件,体积分数85%乙醇提取3次,每次8倍量溶剂,提取1.5 h,测定大黄素的含量,结果见表5,说明该工艺稳定。
2.3 样品的含量测定
取干燥粉碎过20目筛后的虎杖药材50g, 体积分数85%乙醇回流提取3次,每次8倍量乙醇,每次提取1.5 h。回收乙醇后得浸膏,加水至500 mL,静置过夜,过滤,再加水至500 mL,静置2 h,过滤,以pH=4的体积分数80%乙醇:丙酮(1:1)混合溶液500 mL溶解,40度超声30 min, 然后过滤,滤液回收,干燥物以体积分数95%乙醇溶解,过滤,沉淀干燥,精密称取一定量干燥提取物,用甲醇超声溶解定容至10 mL容量瓶中,0.45 μm滤膜过滤,续滤液按色谱条件,进样20 μL,测定大黄素的峰面积,用外标法代入线性回归方程,计算虎杖药材中大黄素的质量分数,结果见图2、3和表6。由表6可知,本品中大黄素的平均质量分数为11.49%,平均纯度为71.9%,故规定每克虎杖药材中大黄素的含量不得低于10.00%,提取物的纯度不低于70%。
3 讨论
本实验室长期进行大黄素的提取纯化工艺的研究,现在已经可以得到比较纯的化合物。在前期的细胞实验中所用的大黄素均为本实验室提取纯化的,质量分数可达95%以上,这种纯度进行细胞实验非常合适,但是在动物实验中发现其毒性较大。改变提取工艺后,纯度降低到70%,但是动物毒性大大降低,而疗效却没有改变,所以对大黄素提取工艺进行改进是非常必要的。
摘要：目的:为虎杖中大黄素的提取纯化工艺提供实验依据。方法:以乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数等条件为因素,分别设计了三个水平,对大黄素的提取工艺进行正交试验。结果:大黄素的最佳提取工艺为虎杖药材加85%的乙醇回流提取3次,每次8倍量的溶剂提取1.5 h。结论:应用该提取工艺得到的大黄素的质量分数不低于10%
关键词：大黄素,提取,纯化
参考文献
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辣椒素提取及初步分离纯化研究 篇8
辣椒素可促进肾上腺分泌儿茶酚胺, 并有抑制细菌的作用, 具有镇痛止痒、抗炎消肿[3]、调节食欲、促进脂肪代谢[4]、催泪催嚏、防治风湿与抗肿瘤[5]等作用, 在医药工业中已得到广泛应用。因辣椒素具有纯天然、低毒害、无污染、有多种生物功能等特点, 因而在食品工业和饲料工业中作为添加剂广泛使用。高纯度的辣椒素晶体在军事上是制造催泪弹、催泪枪和防卫武器的主要原料, 具有重要的研究价值[9]。因此研究从辣椒中有效提取分离辣椒素具有重要的意义。
1 材料与仪器
1.1 实验材料
干红辣椒 (购自山西省忻州市高城乡) , 辣椒碱标准品 (购自贵州五倍子公司, 其纯度≥98.5%) 、95%乙醇为药用级别、乙醇 (分析纯, 江苏强盛化工有限公司出品) 、木质颗粒活性炭、盐酸 (分析纯, 江苏强盛化工有限公司出品) 、乙醚 (分析纯, 天津市富宇来精细化工有限公司) 、甲醇 (色谱纯, 天津市四友精细化工有限公司) 、恒温水浴锅、TDL80-2B型台式离心机。
1.2 实验仪器
万能粉碎机 (30B型, 常州市苏力干燥设备有限公司) ;萃取浓缩设备 (型号YC-EC-30、YC-VC-10, 元成机械股份有限公司) ;UV-1800紫外分光光度计 (北京瑞利仪器有限公司) ;岛津UV-2350可见-紫外分光光度仪;日本岛津高效液相色谱仪 (LC-10ATVP溶剂输入泵, SPD-10AVP紫外检测器) ;HW-2000色谱工作站 (南京千谱软件有限公司) 。
2 方法与结果
2.1 辣椒素提取工艺
辣椒素的提取工艺流程见图2。
2.2 辣椒素分离纯化工艺
(1) 辣椒碱标准曲线的制备。取120μg/mL的辣椒碱乙醇溶液, 将此溶液以无水乙醇稀释成下列浓度:10、17、34、50、60μg/mg。在280nm波长下测定各溶液的吸光值 (A) , 处理得回归方程A=0.0093C+0.0123, R2=0.9992。见图3。
(2) 活性炭分离纯化工艺结果。见表1。
辣椒素粗提物经活性炭纯化后, 其溶液颜色由深红变成浅红色, 辣椒碱转移率为60.1%。
(3) pH法分离纯化工艺结果。根据辣椒素分子中含有酚羟基, 呈弱酸性, 可与强碱发生反应的原理, 进行纯化。比较加入碱液后, 辣椒素中辣椒碱在沉淀层及溶液层中含量的分布, 从而计算出辣椒碱的转移率, 验证该方法对辣椒碱的影响, 其紫外吸收值如表2。
辣椒素粗提物经pH法纯化后, 沉淀层颜色仍为深红色, 其中辣椒碱的转移率为55.7%。
(4) 萃取-结晶法结果。利用辣椒素物质均含有酚羟基的特点, 采用乙醚萃取、氢氧化钠溶液反萃辣椒素, 再结晶的方法分离制备辣椒素化合物, 比较萃取结晶前后, 辣椒素中辣椒碱的转移情况, 其紫外吸收值如表3。
辣椒素粗提物经萃取结晶后, 结晶物呈淡红色, 其中辣椒碱的转移率为87.1%。
2.3 HPLC法测定辣椒碱转移率
前述采用UV对不同纯化辣椒碱的工艺进行了探索, 在确定了乙醚-酸碱萃取分离辣椒素的工艺后, 为了准确检测在萃取过程辣椒碱的转移率, 选择HPLC[11]测定辣椒粗提物及萃取结晶后辣椒碱的含量。
(1) 色谱条件。仪器:岛津液相色谱仪LC-20A;色谱柱为ODS-C18柱 (4.6mm×150mm, 5mm) ;检测器:SPD-10A紫外检测器;柱温:40℃;流动相:甲醇-水 (60∶40) ;流速:1.0mL/min;检测波长:280nm。
(2) 辣椒碱对照品溶液的配制及HPLC图谱。见图4。
(3) 辣椒素结晶物溶液的配制及HPLC图谱。取0.8g萃取结晶物加乙醇至10mL, 取1mL加无水乙醇至10mL。取1mL加无水乙醇至30mL, 其高效液相色谱如图5。
精密量取供试液, 进样20μL, 用外标法 (峰面积) 计算辣椒碱含量, 辣椒提取物萃取结晶过程中辣椒碱的转移率为81.1%。
3 讨论
本次实验主要解决的难点在于从辣椒粗提物中分离辣椒素, 共采取了3种不同方法, 结果分析如下:
活性炭分离纯化辣椒素方案:结果表明辣椒碱洗脱不完全, 辣椒碱转移率低。
pH法分离纯化辣椒素方案:该方法所得到的结晶物为深红色, 达不到分离辣椒素与辣椒色素的目的。其可能原因是辣椒色素有一部分可溶解于NaOH溶液中, 造成结晶物颜色呈深红色。
萃取-结晶法:该方案所得到的溶液呈浅红色, 其紫外分光光度图谱显示, 在400nm后基本无吸收, 说明辣椒素与辣椒色素得到初步分离, 辣椒碱的转移率为81.1%。该方案工艺成本低, 辣椒碱转移率高, 操作简单, 可作为分离纯化辣椒素的最终方案。
4 结语
从本实验结果来看, 相比活性炭纯化法及pH法, 乙醚萃取—结晶法分离纯化辣椒素的效果较好, 辣椒碱转移率高, 工艺成本低, 操作简单, 辣椒素物质得到初步分离, 有利于辣椒素类物质的精制, 可作为工业化分离纯化辣椒素的方案。
摘要：目的:从辣椒中提取并分离纯化辣椒素。方法:采用70%乙醇提取辣椒素;以辣椒碱的含量为指标, 运用紫外-可见分光光度法及高效液相色谱法比较活性炭法、pH法、乙醚萃取结晶法三种方法分离纯化辣椒素的效果。结果:采用乙醚萃取辣椒粗提物, 乙醚相用氢氧化钠水溶液萃取, 所得氢氧化钠萃取液调pH值后结晶, 得到辣椒素粗品, 辣椒碱总收率为81.1%。结论:乙醚萃取结晶工艺得到的辣椒素含量高, 回收率高, 工艺成本低, 可作为辣椒素的生产方案。
关键词：辣椒,辣椒素,活性炭法,pH法,乙醚萃取结晶法
参考文献
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花色苷提取纯化工艺的研究进展 篇9
1 花色苷的生理功能
花色苷是具有2-苯基苯并吡喃结构的一类糖苷衍生物, 大量的试验表明花色苷作为一种糖苷衍生物不但具有抗氧化、抗炎以及预防心血管疾病等多种功效, 其在一定程度上还能够改善人体内的糖脂代谢。
1.1 抗氧化及消除自由基的功能
近些年的研究发现, 多酚类化合物中的花色苷类物质也同样具有一定的抗氧化作用, 在一定程度上能够延缓人体组织细胞的衰老。
1.2 降低人体肝脏和血清中的脂肪含量
研究者通过大量的研究发现, 在消费者食用了含有锦葵色苷的高胆固醇的食物之后, 除了可以降低人体内三酰基甘油 (中性脂肪) 的含量之外, 锦葵色苷还能作用于人体中的胆固醇, 致使血清中总胆固醇的浓度维持在较低的水平。
1.3 抗变异及抗肿瘤的作用
大量的关于红色糯米中的天然花色苷类物质的对肝瘤的抑制作用的研究表明食用了含有花色苷类物质的食物能够使人体对不良物质的解毒和排泄功能得到一定的提高。
1.4 防止人体内过氧化作用
人体内的生化反应会各种各样的因素, 从而能够合成大量的活性氧, 使人体内发生过氧化作用。大量的研究结果表明, 这样的一种过氧化作用和人体的衰老和癌症等不良症状有关。
2 花色苷的提取方法
2.1 溶剂法提取
李知敏[1]等人在之前对蓝莓花色苷的提取工艺进行了大量的研究试验, 其试验的结果表明:采用浓度为75%酸化后的乙醇浸泡提取, 蓝莓质量和提取液的浓度之比 (m/c) 为1:10, 在50℃的温度下浸提60min后的蓝莓中的花色苷得率最高。霍琳琳提取桑葚色素的实验结果表明:使用浓度为30%的酸化乙醇, 控制桑葚鲜果的质量和提取液的浓度之比 (m/c) 为1:10, 在60℃的温度下浸提60min之后所得花色苷类糖苷衍生物的含量最高。
2.2 酶法提取
王萍等人[2]通过多组单因素试验和多组正交试验, 从而确定了使用酶法提取法提取黑加仑果渣中花色苷类糖苷衍生物的最佳工艺条件。
2.3 超临界CO2提取
Va-tai等人[3]利用超临界CO2技术从葡萄渣以及接骨木果中提取到了花色苷, 其研究的结果显示, 使用超临界CO2提取技术可以有效地替代传统的溶剂浸提法, 使提取时间更短, 花色苷的得率更高。同时该方法由于CO2的廉价易得、安全无毒以及所得到产品易与溶剂分离等特点, 在食品工业中的应用也较广泛。
2.4 超声波辅助提取
李华等人使用超声波辅助提取技术对葡萄籽中总多酚的提取条件进行了大量的研究, 并且通过研究试验确定了超声波辅助提取葡萄籽中总多酚的最佳提取工艺参数。超声波辅助提取法的主要优点在于该法的提取时间短, 操作简单方便, 并且可以在一定程度上防止所提取的热敏性成分在高温下发生自动氧化分解。
2.5 微波辅助提取
张文等人[4]在对山楂中总黄酮类化合物的提取研究中也用到了微波辅助提取技术。相较于传统提取方法而言, 微波辅助提取法的显著优点就是其提取时间短、提取物质的得率较高、使用设备的能耗小等。
2.6 液态静高压法辅助提取
Corrales等人[5]用液态静高压辅助提取的技术方法从葡萄皮中提取其中的花色苷类糖苷衍生物, 并且通过多次试验, 分析得到了其最佳的提取工艺条件。液态静高压法辅助提取法的优点是其提取温度较低, 温度容易控制, 提取时间短, 并且不会破坏花色苷类天然色素的结构等, 但其在生产上应用还不多见。
2.7 高压脉冲电场辅助提取
张燕等人研究了高压脉冲电场辅助提取技术对红梅中花色苷类天然植物色素的提取过程的作用以及花色苷得率的影响, 其试验结果表明, 采用3.0k V/cm PEF对红梅进行了420个脉冲处理之后, 用酸化过的甲醇提取15min, 就可以使花色苷的提取率达到54.24%。高压脉冲电场辅助提取法的主要特点是提取所得产品的品质较好、提取温度低、提取温度容易控制、提取时间短、提取速率较快、但是提取率高等。
3 花色苷的纯化方法
3.1 凝胶柱层析
朱振宝等人在对紫甘蓝中的花色苷进行初步研究中, 同时研究了Sephadex LH-20凝胶层析柱上最佳的分离纯化条件[6], 其试验结果表明, 使用体积分数为30%乙醇作为洗脱液, 并且控制其洗脱的流速在1m L/min时, 紫甘蓝中花色苷的纯化效果最好, 杂质的含量最低, 花色苷的纯度最高。
3.2 高速逆流色谱
李佳银等在研究中使用了新鲜的紫雏菊花瓣作为原料, 用含有少量0.1%HCl的体积分数为60%的酸化乙醇作为溶剂并且对紫雏菊花瓣进行避光的冷浸提取, 经过乙酸乙酯萃取以及D101大孔吸附树脂分离纯化之后得到了质量为2.1g的花色苷提取物的干粉状样品。相交于传统的层析法, 该方法的优点主要是回收率高、高效、操作简单、快速、制备量大等, 因此被广泛的应用于食品原料的开发利用和天然产物的分离纯化等领域。
3.3 离子交换树脂层析
管娜娜等在对γ-氨基丁酸 (GABA) 的富集和纯化中使用了0.02mo L/L, 在使用了p H5.6的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液对γ-氨基丁酸 (GABA) 进行了富集之后, 再利用D001大孔强酸性的阳离子交换树脂对富集后的溶液进行纯化研究, 试验最终得到了纯度为61.25%γ-氨基丁酸。在食品生产加工工业中, 由于离子交换树脂具有脱色范围广、处理产品的能力大、并且可以反复再生使用、脱色容量高、工作寿命长、运行费用较低等诸多优点, 因此其应用也较广泛。
3.4 膜分离法
Patil首先使用了溶剂提取法并且提取得到了红萝卜花色苷之后再使用膜分离法, 这2种方法的结合, 不但能够有效地氧化脱醇, 而且还对红萝卜花色苷进行了高效地富集, 使花色苷的含量从之前的372.6mg/L提高到了625.8mg/L[7]。随后在常温常压下使用渗透膜蒸馏的方法对花色苷进行进一步的浓缩, 最后红萝卜花色苷的浓度高达4850mg/L。
3.5 固相萃取
陈亮等人在利用固相萃取的方法时, 采用Zorbax SB-18C色谱柱 (250mm×4.6mm, 5μm) , 使用甲醇-5%甲酸水溶液作为流动相来分离纯化桑葚中的花色苷[8], 试验结果表明, 固相萃取的优点是在其试验处理过程中试验对象不会发生乳化的现象, 并且不需要大量的互不相溶的萃取溶剂, 该法主要使用具有高选择性的吸附剂 (固定相) , 从而能够显著减少溶剂的用量, 节约了研究的成本, 同时在一定程度上简化了样品的处理过程。一般而言固相萃取所需的时间是液-液萃取的1/2, 所需的费用为液-液萃取的1/5, 在很大程度上促进这种方法的工业化。
4 花色苷的检测方法
4.1 利用高效液相色谱-电喷雾质谱技术检测桑葚花色苷的含量
在通常情况下, 研究者们研究桑葚中花色苷的含量和其所包含的种类时一般采用高效液相色谱-电喷雾质谱 (HPLC-ESI-MS) 法。Zorbax SB-C18色谱柱 (250nm×4.6nm, 5μm) , 流动相为乙腈-10%甲酸水溶液, 人为的控制其检测时的流速为1.0m L/min, 检测分析时的检测波波长为520nm, 随后使用矢车菊素-3-葡萄糖苷 (Cy-3-G) 标准品作为检测分析的标准, 采用外标法 (校正曲线法) 对桑葚中的花色苷进行定量研究以及分析;然后采用质谱法中的离子碎片技术对桑葚中的花色苷的类别进行定性的检测分析。检测的结果显示, 每200克的桑葚成熟果实中所含有的花色苷含量大约在 (1423.4±99) mg范围之内。
4.2 p H示差法
杨兆艳[9]利用p H示差法对桑葚中的花色苷的含量和进行检测, 其研究结果表明, 在检测波长为700nm, p H为4.5时, 选择平衡时间为80min, 所测得的桑葚中花色苷的含量最高。
4.3 近红外光谱技术
刘晓璐等[10]研究了近红外光谱技术快速无损的检测蓝莓中花色苷的含量, 其研究结果表明, 在光谱全波长 (400~2500nm) d的范围内使用偏最小二乘法 (PLS) 建立蓝莓花色苷含量的定标数学模型, 它的相关系数为0.7503, 校正标准误差 (SEC) 为4.688 mg/ (100g) 。实验结果说明, 近红反射技术可用于快速无损检测蓝莓中的花色苷含量。
5 前景与展望
“味”以及“色”是食物的主要感官要素。一般说来消费者首先通过眼睛观察, 从而引起食欲, 因此食品的色泽十分重要。天然的花色苷因其具有良好的色泽, 所以可以在食品生产工业中得到较为广泛的应用。但是, 由于花色苷了天然色素的的性质都比较不稳定, 容易受到光照、热、碱、贮藏或者其它因素的影响而发生褪色的现象, 花色苷了天然色素在食品生产加工中的应用也因此受到了一定的局限。花色苷现如今大部分用于一些呈酸性的食品的着色, 而调查显示, 国内市场中的大多数食品主要呈酸性, 由此可见未来花色苷类天然植物色素在食品生产加工中的应用的前景一片光明。
参考文献
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黑加仑多糖的提取及纯化工艺研究 篇10
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
黑加仑果实购于石河子市农贸市场;石油醚、三氯甲烷、正丁醇、无水乙醇、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、Folin-酚试剂、牛血清白蛋白、氢氧化钠、盐酸均为分析纯。
UV-1240分光光度计，日本岛津公司;RE-52旋转蒸发仪，上海爱朗有限公司;植物粉碎机，PHILIPS公司;真空冷冻干燥机，日本Eyela公司。
1.2 试验方法
1.2.1 试验流程
黑加仑果实→预处理→热水浸提→过滤→醇沉→复溶→脱蛋白→醇沉→黑加仑多糖粗产品→DEAE-纤维素柱
1.2.2 黑加仑果实的预处理
将市售黑加仑果实洗净、风干、粉碎。石油醚(60～90℃沸程)回流脱脂3次，每次2h;再用90%的乙醇回流2次，每次2h，以去除单糖和低聚糖，最后在80℃恒温干燥箱中干燥，过60目筛，备用。
1.2.3 黑加仑多糖的提取
黑加仑多糖的提取采用热水浸提法。准确称取一定量黑加仑果粉，按照不同的料液比、浸提温度、浸提时间和浸提次数对黑加仑多糖进行提取，过滤，将滤液加水定容至刻度，测定490nm吸光度，计算黑加仑多糖提取率。
式中：C为样品溶液的浓度，μg/mL;V为样品溶液的总体积，mL;M为果粉质量，g。
1.2.4 黑加仑多糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法，用葡萄糖制作标准曲线。
将标准葡萄糖在100℃条件下干燥至恒重，精确称取100mg置于1 000mL容量瓶中，加水至刻度，混匀备用。此溶液为质量浓度100μg/mL的葡萄糖标准溶液。分别吸取葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL，各加蒸馏水补充至2.0mL;以2.0mL蒸馏水作为空白对照。然后分别加入6%的苯酚溶液1mL，摇匀后加入5mL 98%的浓硫酸，静置20min后摇匀;在40℃恒温水浴锅里静置15min后，于490nm处测定吸光度。以吸光度为横坐标，糖浓度为纵坐标，绘制标准曲线。求得回归方程为Y=31.718X-0.746，其中X为吸光度值，Y为葡萄糖浓度，μg/mL，相关系数R2=0.99954。
1.2.5 乙醇沉淀黑加仑多糖
称取1.0g黑加仑果粉5份，在正交试验所确定的最佳提取工艺条件下浸提，过滤，滤液中分别加相同量的浓度为50%、60%、70%、80%、90%乙醇，于4℃条件下过夜，4 000r/min条件下离心30min，得粗多糖。将粗多糖复溶于蒸馏水中，苯酚-硫酸法测吸光度，根据多糖得率，确定乙醇的最佳用量。
1.2.6 脱蛋白
本试验采用Savag法去除黑加仑多糖中的杂蛋白，以Folin-酚法判定蛋白脱除效果。
将乙醇沉淀所得黑加仑粗多糖干燥至恒重，准确称取50mg的粗多糖溶解于100 mL水中，将三氯甲烷与正丁醇按比例配成Sevag试剂，Sevag试剂与样液体积比采取1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1六个水平，去蛋白次数采取1、2、3、4、5次5个水平，三氯甲烷与正丁醇体积比采取1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1 6个水平，多糖溶液与Sevag试剂混合后剧烈振荡30min,4 000r/min条件下离心20min，去除有机相层和蛋白质沉淀层，清液用Folin-酚法测蛋白质含量，根据蛋白脱除率确定Sevag法脱除黑加仑粗多糖蛋白的工艺参数。
式中：W1为多糖样液中蛋白总含量，μg/mL;W2为多糖样液经Sevag试剂处理后清液中蛋白质含量，μg/mL。
1.2.7 黑加仑多糖纯化
称取10 g DEAE-纤维素树脂，浸泡于200mL蒸馏水中24h，然后加0.5mol/L NaOH溶液，搅匀后静置30min，抽滤并反复用蒸馏水抽洗至pH值呈中性，再以0.5mol/L HCl同样操作过程处理，最后再以0.5mol/L NaOH再处理1次，蒸馏水洗至中性。把处理好的填充料浸泡在pH值6.0的磷酸盐缓冲液中，装柱(2.6cm×50cm)后缓冲溶液平衡3～5倍柱体积。
将去蛋白后的黑加仑多糖用无水乙醇反复洗涤，真空冷冻干燥后，配制0.01g/mL黑加仑多糖溶液20mL，上样，依次用蒸馏水、0.1、0.3、0.5、1.0mol/L NaCl溶液分段洗脱，流速约0.5mL/min，每管5mL收集洗脱液，用苯酚-硫酸法跟踪检测，至无糖液流出。根据出峰情况分别收集各组分。
2 结果与讨论
2.1 热水浸提黑加仑多糖正交试验
由表1可知：试验设定的4个因素对黑加仑多糖提取率影响的主次顺序为：浸提温度>料液比>浸提时间>浸提次数。综合各因素K值和直观比较得出理论上最佳浸提条件为A2B3C3D2。即最佳工艺条件为：料液比1∶30，浸提温度80℃，浸提时间2h，浸提次数2次。经验证性试验测得，此条件下黑加仑多糖提取率为4.32%。
2.2 乙醇沉淀黑加仑多糖
由图1可知：随着黑加仑多糖提取液中加入的乙醇量的增加，多糖沉淀量增加，当乙醇浓度大于80%时增加趋势已不甚明显。考虑到减少沉淀剂用量能降低生产成本，沉淀黑加仑多糖的乙醇用量为80%，此条件下所得黑加仑粗多糖的得率为3.84%。
2.3 Sevag法去蛋白试验
经热水浸提法所得的黑加仑粗多糖中含有32.7%的蛋白质。
2.3.1 样液比对蛋白脱除率的影响
三氯甲烷与正丁醇4∶1、去蛋白3次条件不变下，改变Sevag试剂与多糖样液比，试验结果如图2所示。
随着Sevag试剂加入量的增加，多糖样液中蛋白质脱除率逐渐增大，当Sevag试剂与多糖样液比大于3∶1后，蛋白脱除率有所下降，考虑到试剂量的增加会增加生产成本，所以Sevag试剂与多糖样液比选择3∶1为最佳。
2.3.2 去蛋白次数对蛋白脱除率的影响
保持样液比3∶1、三氯甲烷与正丁醇4∶1不变条件，测得不同去蛋白次数的蛋白质含量及多糖含量如图3所示。
多糖中蛋白脱除率随着去蛋白次数的增加逐渐增大，4次之后已无太大变化，而且去蛋白次数的增加会造成多糖的损失，同时考虑到生产成本，去蛋白次数选择4次为佳。
2.3.3 Sevag试剂成分比对蛋白脱除率的影响
样液比3∶1、去蛋白3次条件不变，三氯甲烷与正丁醇的不同比例对样液中蛋白质含量及多糖含量的影响如图4所示。
随着三氯甲烷与正丁醇的比例的增大，蛋白脱除率逐渐增大，在Sebag试剂成分比为5∶1时达到最大，所以Sevag试剂成分比选择5∶1为佳。
Sevag试剂法去黑加仑多糖中蛋白质的最佳工艺条件为：Sevag试剂成分三氯甲烷与正丁醇比为5∶1,Sevag试剂与多糖样液比为3∶1，去蛋白次数为4次。在此条件下黑加仑多糖蛋白质脱除率可高达86.4%。
2.4 DEAE-纤维素层析法纯化黑加仑多糖
DEAE-纤维素层析法纯化黑加仑多糖的洗脱曲线如图5所示。经蒸馏水洗脱出现1个洗脱峰，命名为P1;依次用0.1、0.3、0.5、1.0 mol/L的NaCl溶液洗脱出现了4个洗脱峰，分别为P2、P3、P4、P5。其中洗脱峰P1、P3峰面积较大，为主要的黑加仑多糖组分;而P2、P4、P5峰较小，三者均较难以富集。因此分别收集洗脱峰P1、P3的组分，得到两种多糖，分别为经蒸馏水洗脱所得的中性多糖P1和经0.3 mol/L NaCl溶液洗脱所得的酸性多糖P3。
3 结论
黑加仑果实经预处理后，利用热水浸提法进行提取，最佳浸提工艺为：料液比1∶30、浸提温度80℃，浸提时间2h、浸提次数2次、醇沉黑加仑多糖乙醇浓度80%效果最好;Sevag法去除蛋白质的最佳条件为：Sevag试剂成分三氯甲烷与正丁醇比为5∶1,Sevag试剂与多糖样液比为3∶1、去蛋白次数为4次。在此条件下黑加仑多糖蛋白质脱除率可高达86.4%。去除蛋白质后的黑加仑多糖经DEAE-纤维素层析法纯化，不同浓度的NaCl溶液分段洗脱，可收集两种主要的黑加仑多糖组分P1和P3。
参考文献
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提取纯化 篇11
从桦树皮中提取桦皮素的方法很多,本文应用乙醇提取法和乙醇与氯仿重结晶法,从桦树皮中提取桦皮素,纯度达到95%以上,该方法工艺简单、溶液普通、成本廉价、结晶容易、收率较高。同时利用高效液相色谱法测定桦木醇含量,准确快捷。本研究为桦皮素的工业化生产提供理论依据和参考。
1 实验材料与方法
1.1 仪器和药品
玻璃回流提取仪,恒温水浴,RE5205旋转蒸发器,粉碎机,LC-6A高效液相色谱仪(日本SHIMADZU)。对照品桦木醇为上海复旦大学生命科学院张教授提供。分析用试剂均购于promega公司。
1.2 方法
1.2.1 白桦树皮的预处理
干燥的白桦树皮粉碎至40目,取100g粉末用p H=12的蒸馏水浸泡,加热至100℃,保持40min,冷却并淋洗至中性,干燥备用。
1.2.2 桦木醇提取方法
以干燥的桦树皮为材料,分别以95%乙醇、苯、氯仿、甲醇作为提取溶剂,75℃回流提取2h,收集滤液,重复提取一次,合并提取液。用旋转蒸发器回收提取溶剂,至1/20体积,热过滤,4℃结晶,滤出结晶,减压干燥,得到粗品。
1.2.3 桦木醇结晶方法
粗品用8倍体积的的氯仿:乙醇(1:20)溶解,待完全溶解后,滤出杂质,溶液在4℃,重结晶,滤出结晶,减压干燥,得到结晶品,称重。
1.2.4 桦木醇含量的测定方法
应用高效液相色谱法测定桦木醇含量,色谱柱为ODSC18;流动相为甲醇:水(88:12),紫外检测波长为210nm,柱温30℃;柱压6.4MPa,流速1m L/min。测定样品用0.45μm微孔滤膜过滤,待高效液相基线平稳后,用微量注射器吸取10μl进样(排除注射器中小气泡),每一样品连续进样三次取平均值,得出峰面积,计算出含量[9,10]。
2 结果与讨论
2.1 不同提取方法对桦木醇收率的影响
对不同提取溶剂筛选,结果表明见表1,用甲醇和乙醇作为提取溶剂,收率相同且高于其他溶剂,乙醇对人体健康危害低,所以选用乙醇作为提取溶剂较为理想。以乙醇为提取溶剂获得桦木醇粗提取物,样品的纯度用HPLC方法测定,结果如表2和图1所示。粗提取的桦木醇纯度在50%~70%之间。虽然热回流法提取收率较高,但杂质较多,对检测有一定干扰,故采用本方法之前,应先用碱性纯水加热煮沸10~30min,然后过滤,再用乙醇溶液正常热回流提取桦木醇,该方法使产品的收率与纯度均有所提高。图中箭头指桦木醇峰。
2.2 不同溶剂体系对桦木醇重结晶效果的影响
提取的桦木醇粗品用不同的溶剂体系进行重结晶处理,结果发现不同溶剂体系对结晶效果有显著影响,结果见表3,从表3数据可见,氯仿:乙醇(1:20)溶剂体系得到的重结晶桦木醇的纯度与结晶收率最高,是理想的重结晶溶剂体系。利用该溶剂体系,溶解粗提取的桦木醇,完全溶解后,滤除杂质,溶液在4℃重结晶,滤出结晶,减压干燥,得到结晶品。重结晶桦木醇,经HPLC测定结果如图2所示。箭头指出重结晶桦木醇峰。
2.3 桦木醇含量测定
高效液相色谱法测定白桦树皮中桦木醇含量,结果如图1,2,3所示。本方法的线性范围为15.0~300.0ug/m L,平均回收率为93.93%,提取收率为85%~90%,粗品纯度为60%~70%,重结晶纯度大于95%。高效液相色谱法测定白桦树皮中桦木醇和木桦酸含量的方法,保留时间合适,峰形好,适合定量分析。箭头指出重结晶桦木醇峰。
3 结论
通过对桦木醇不同提取试剂的筛选以及桦木醇重结晶不同溶剂体系的优化,结果显示:以干燥的桦树皮为材料,乙醇作为提取溶剂,获得桦木醇粗提取物收率最高23%;桦木醇粗体物经氯仿:乙醇(1:20)重结晶后,桦木醇的纯度达到95.07%,结晶收率34.05%。
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