纯化鉴定（共9篇）
纯化鉴定 篇1
0 引言
SHN3是一种具有跨膜结构的树突细胞因子，我们前期研究发现shn3基因在没有分化的神经干细胞中高表达，而在分化终末的神经细胞中表达较低;随后的研究表明shn3基因可以维持神经干细胞的状态，与神经干细胞的分化有关，各种研究结果显示shn3在神经系统中起着重要作用[1]。
抗体是生物科学研究之中最为重要的科学研究工具之一，利用抗原抗体特异性结合的原理，在蛋白水平上，可以用于各类蛋白的免疫识别，利用免疫共沉淀的方法分离特定蛋白;在细胞水平上，可以应用流式细胞技术区分和鉴定细胞;在组织水平上，则可以分析待检测组织中表达的蛋白质或是显微镜下直接观察[2]。
抗体不仅在科学研究中占据重要地位，随着越来越多的研究转向人类疾病的研究与治疗，抗体的医用价值也备受人们关注。无论是在诱导癌细胞凋亡还是心血管疾病中利用“生物导弹”的导向治疗等，抗体作为新型的治疗手段和药物的医学价值日益显著[3]。
无论是抗体的科研价值还是医用价值的体现，都对抗体的免疫特异性要求越来越高。所以，本实验创新性的改进传统Ig G纯化技术，创新性的通过筛选免疫特异性肽段，并结合亲和层析纯化的方式改进出一种有效地提高抗体免疫特异性的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1实验材料
作者实验室自制SHN3多克隆抗体[4];HEK293T和U251细胞系购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心;Pmal-C2载体和BL21(DE3)表达宿主菌由作者实验室保存。
1.1.2 试剂
Bam HⅠ、SalⅠ限制性内切酶购于Fermanters公司;T4DNA连接酶、Tag酶连接酶购于Takara公司;羊抗兔、羊抗鼠红外标记二抗(Odyssey)购于Invitrogen公司;β-actin抗体购于Abcom公司;mbp抗体购于康为世纪公司;硝酸纤维素膜NC膜(Whatman);IPTG购于北京拜尔迪公司;引物合成于上海捷瑞公司。
1.1.3 引物设计
根据实验室前期所制备的鼠源shn3 c DNA中130～228位碱基序列，设计抗体纯化特异性片段复性引物。4条片段复性后分别用Bam HⅠ、SalⅠ限制性内切酶插入到Pmal-C2载体中，引物序列如下:
1.2 方法
1.2.1 重组表达载体的构建
将合成好的4对引物用灭菌后的dd H2O稀释到100μmol/L，再用1*Annealing Buffer稀释至10μmol/L，分别取上下游引物25μl混合后运行Anneal PCR程序。Anneal PCR程序为:先95℃预变性10min，再按从95℃至25℃每3min降低5℃复性，得到PCR产物回收，dd H2O溶解4℃保存。Pmal-C3载体Bam HⅠ、SalⅠ限制性内切酶双酶切过夜，割胶回收后分别与复性后4个片段T4DNA连接酶16℃连接过夜，构建PmalC2-Part-1、Pmal-C2-Part-2、Pmal-C2-Part-3、PmalC2-Part-4。利用热激法将构建好的载体转化入BL21(DE3)中，菌种PCR鉴定、测序[5]。
1.2.2 融合蛋白的原核表达
从平板上挑单菌落至装有4mL LB培养基的试管中，37℃、220r/min摇床摇约5h，测OD600为0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L进行诱导培养，37℃继续振荡培养4h后，取100μl菌液12 000r/min,5min离心后取上清，100μl 1*SDS-PAGE loading Buffer裂解，孵育器99℃煮蛋白10min,-20℃保存。
1.2.3 Western blotting筛选特异片段
取煮好的蛋白，经SDS-PAGE电泳转入硝酸纤维素膜后，分别用兔抗SHN3多克隆抗体抗体和鼠抗MBP多克隆抗体进行Western blotting，用Odyssey成像系统检测4段重组蛋白。
1.2.4 亲和层析纯化目的抗体
将人工合成筛选出的特异性片段与预先处理膨胀的Thiolsepharose 4B混合装载成柱，4℃旋转混合过夜。将实验室自制SHN3多克隆抗体PBS透析后稀释过柱，得到目的抗体，Western blotting检验亲和特异性[6]。
2 结果与分析
2.1 抗体特异性片段设计
原抗体免疫原为c DNA 130bp～228bp共99个碱基，为了增强抗体识别的特异性，避免杂带，将这99个碱基换分为4个等长且互相重叠的区段，分别为Part-1(112～159bp)、Part-2(142～186bp)、Part-3(172～219bp)、Part-4(202～249bp)四个片段。则片段示意图如图1。
2.2 4个抗体特异性片段阳性克隆PCR鉴定
连接产物经转化、抗性筛选后，挑取克隆菌种PCR鉴定，以每个片段的上游引物和设计的用于鉴定的Part-5下游引物进行PCR鉴定，理论目的片段长为514bp，鉴定结果如图2。
Note:1:Marker;2:control;3:Pmal-C2-Part-1;4:Pmal-C2-Part-2;5:Pmal-C2-Part-3;6:Pmal-C2-Part-4.
2.3 特异性片段的筛选
将鉴定正确的4个载体的克隆测序正确后，原核诱导后抽提蛋白，用抗体Western blotting检验特异性最强的片段，Pmal-C2载体上本身带有标签MBP(麦芽糖结合蛋白)，用MBP抗体作蛋白表达的阳性对照，筛选特性片段。结果表明，4个片段中，Part-3表达的肽段与抗体的特异性最强，则选取Part-3肽段序列人工合成肽段，作为纯化抗体的配基与抗体结合。
Note:1:Part-1;2:Part-2;3:Part-3;4:Part-4.
2.4 Western纯化后抗体特异性
HEK-293T细胞转染人源和鼠源SHN3后，培养48h抽提细胞蛋白，小鼠海马组织蛋白，人源胶质瘤细胞系U251细胞蛋白，Western检验纯化抗体特异性。结果表明，无论是在过表达HEK细胞中，还是在小鼠脑组织细胞人源胶质瘤细胞抽提蛋白中，纯化后抗体杂带减少，免疫特异性明显增强。
3 讨论
抗体不仅是现代生物科学研究的重要工具之一，更在医学治疗方面拥有巨大潜力[7]。然而，无论是科学研究还是医学应用[8]，对抗体的亲和特异性都越来越高。
传统的抗体纯化技术仅是以Ig G特异性蛋白protein A为结合蛋白，纯化得到单一的Ig G抗体，但并不能提高抗体本身的特异性。本研究则是创新的以本实验室自制SHN3多克隆抗体为基础，结合蛋白亲和层析原理[9]，将免疫原分割成更小的片段来减少由于过长的肽段结构而产生的非特异性，筛选并合成亲和特异性最高肽段，再用亲和层析的方法筛选获得与目的蛋白特异性结合的多克隆抗体。
Note:A:Expression of SHN3 in HEK293T cells(1:Murine;2:Humanized);B:The hippocampus of mice;C:U251.
研究结果表明，在原免疫原中确实存在特异性更高更小的片段，以其为亲和层析的结合片段，不仅排除了冗余结构免疫的干扰，同时也将动物免疫过程中的非特异干扰除去。无论是细胞水平还是组织水平的蛋白特异性均获得显著提高。本研究不仅为SHN3的进一步研究提供了更为可靠的工具，也为各种实验室自制非商业性多克隆抗体的纯化提供了较为可行的方法。
参考文献
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纯化鉴定 篇2
唐鱼卵黄蛋白原的诱导、纯化与鉴定
摘要：为探讨利用雄性唐鱼(Tanichthys albonubes)卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vtg)作为生物标志物检测环境雌激素的可行性,采用浸浴法用50μ・L-117β-雌二醇(E2)对雄性唐鱼进行染毒,30d后将鱼体整体匀浆进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)以分析Vtg的`产生;并采用Mg2+-EDTA选择性沉淀和Q Sepharose阴离子交换层析对Vtg进行分离纯化.结果表明,E2诱导下,雄性唐鱼产生了雌性特异蛋白Vtg.并且可在体内积累;利用Mg2+-EDTA选择性沉淀和Q Sepharose阴离子交换层析的两步纯化方法可分离纯化唐鱼整体匀浆Vtg;经Native-PAGE鉴定,确定唐鱼Vtg的分子量为440kDa.以上结果提示,雄性唐鱼Vtg可以作为环境雌激素监测的有效生物学标记物.作 者：姚静 方展强 徐杰 YAO Jing FANG Zhan-qiang XU Jie 作者单位：华南师范大学生命科学学院,广东省高等学校生态与环境科学重点实验室,广州,510631期 刊：生态毒理学报 ISTIC Journal：ASIAN JOURNAL OF ECOTOXICOLOG年，卷(期)：2008,3(2)分类号：X17关键词：唐鱼 卵黄蛋白原 诱导 纯化 酶联免疫吸附法 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳
纯化鉴定 篇3
关键词：猪流感病毒,纯化,鉴定
2009年,甲型H1N1流感爆发,很快便波及全球,造成了数千人的死亡,带来了巨大的经济损失,这无疑给人类敲响了警钟。 要控制猪流感病毒就需要对其进化流行趋势和遗传变化机制进行研究,而病毒的纯化无疑是其前提和基础。在实际中,猪因为其“混合器”作用可能会感染不同的流感病毒,因此简单有效分离、纯化病毒是所有科研人员面临的一个问题。噬斑分离法虽然是一种有效的方法,但是此种方法需要很高的试验条件并且操作复杂及不能处理大批量的样品,在实际操作应用中具有一定的局限性[1,2]。而鸡胚终点稀释法结合特异血清中和法则对试验要求简单[1],且能同时大批量地平行处理样品[3,4],具有很高的实际应用价值。
试验对鸡胚终点稀释法结合特异血清中和法进行了相关的研究,旨在为混合感染或者交叉感染的猪流感病毒的纯化和鉴定提供了相关参考。
1 材料
1.1 病毒
低致病性毒株A/Swine/Guangdong/L3/09、A/Swine/Guangdong/B5/09和A/Swine/Guangdong/L1/09(分别代表H1N1、H3N2和H9N2,简称L3、B5和L1),华南农业大学兽医学院农业部养禽与禽病防治重点实验室分离、鉴定和保存。
1.2 鸡胚
SPF鸡胚,购自北京梅里亚维通公司,在华南农业大学兽医学院农业部养禽与禽病防治重点实验室孵化至10日龄,用于毒种传代和毒力测定。
1.3 试剂
MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、rTap DNA聚合酶、pMD18-T载体、dNTPs、DNA-2 000 Marker,均购自TaKaRa公司;Trizol Reagent,购自Invitrogen公司;氯仿和无水乙醇,购自华美生物工程有限公司;琼脂糖胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒,均购自OMGA公司。
1.4 标准阳性血清
H1N1亚型、H3N2亚型和H9N2亚型标准阳性血清,购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。
2 方法
2.1 猪流感病毒混合感染的人工制备和鉴定
按照Reed-Muench方法计算3株猪流感病毒鸡胚半数感染量(EID50)。将3株猪流感病毒的病毒效价调至1×106 EID50。第1组取L3和B5各0.2 mL均匀混合;第2组取L1和B5各0.2 mL均匀混合;第3组取L3、L1和B5各0.2 mL均匀混合。3组混合毒分别用PBS在无菌条件下作10倍倍比连续稀释,取1×10-3,1×10-4,1×10-5 3个稀释度各接种5枚9日龄SPF鸡胚尿囊腔。收取24～72 h死亡的鸡胚以及72 h未死亡的鸡胚尿囊液,选择最低稀释度的尿囊液用H1、H3的标准阳性血清进行HI试验,同时进行RT-PCR试验,以验证混合感染的人工制备结果。
2.2 鸡胚终点稀释法结合特异血清中和法纯化人工制备的混合猪流感病毒
分别取2.1制备的3组人工混合感染的样品0.2 mL,向第1组和第2组各加入标准阳性H3血清0.1 mL,第3组加入0.2 mL标准阳性H1血清,无菌条件下用PBS 10倍倍比连续稀释,取1×10-6,1×10-7,1×10-8,1×10-9 4个稀释度分别接种5枚9日龄SPF鸡胚的尿囊腔,每个鸡胚接种0.2 mL。收取24～72 h死亡的鸡胚以及72 h未死亡的鸡胚尿囊液,选取稀释度最高的含毒尿囊液按照相同的方法进行传代,每代尿囊液放于-70 ℃冰箱保存,并对其进行HI试验检测其纯度。
2.3 纯化和鉴定方法的实际应用
为了分析华南地区猪群中的猪流感分布情况,对自2010年来分离的14株猪流感病毒HI阳性样品进行纯化,并对纯化得到的猪流感病毒进行HI和RT-PCR鉴定。
3 结果
3.1 猪流感病毒混合感染的人工制备和鉴定结果
第1组接种1×10-3稀释度病毒的5枚鸡胚72 h内都没有死亡,收集尿囊液并保存;第2组接种1×10-3稀释度,有1枚鸡胚在24～72 h死亡,另外4枚存活,将存活的鸡胚放入4 ℃冻死(下同),然后收集5枚鸡胚的尿囊液,置-70 ℃保存;第3组接种1×10-3稀释度,有1枚鸡胚死亡,收集尿囊液并保存。从3组鸡胚中随机挑选1枚取尿囊液进行HI试验,结果表明,3组鸡胚尿囊液的血凝性均能被H1和H3阳性血清抑制。RT-PCR检测结果表明:在检测HA片段时,3组均在1 700 bp出现H1和H3亚型条带(见图1)。说明人工制备3组混合病毒感染模型成功。
M.DL-2 000 Marker;1,7.L3(H1N1)HA片段; 2,5,9.B5(H3N2)HA片段;3,6,10.阴性对照; 4,8.L1(H9N2)HA片段。
3.2 鸡胚终点稀释法结合特异血清中和法纯化及鉴定结果
按2.2的方法对3组混合病毒进行纯化,并用HI试验检测纯化效果,结果见表1。由表1可见,第1组样品中的L3在第4代即被纯化出来;第2组样品中的L1也在第4代被纯化出来;第3组样品中的B5在第5代被纯化出来。结果见表1。纯化后连续传代1次并进行鉴定,结果证明样品已经被纯化。
注:-表示效价小于4,为阴性,空白表示传代跳过,无结果。
为了进一步验证经过鸡胚终点稀释法结合特异血清中和法纯化过的病毒纯化情况,应用PT-PCR方法对3组纯化后的病毒HA片段进行特异性扩增,结果见图2。由图2可见,第1组和第2组中只分别含有L3和L1病毒的HA片段,两组之中都没有B5的HA片段;相反,第3组中只含有B5的HA片段(第8泳道出现长约1 700 bp的条带),没有L3和L1的HA片段。
M.DL-2 000 Marker;1.L3(H1N1)HA片段; 2,5.无B5(H3N2)HA片段;3,6,9.阴性对照; 4.L1(H9N2)HA片段;7.无L3、L1 HA片段; 8.B5(H3N2)HA片段。
3.3 纯化和鉴定方法的实际应用
应用本试验的方法对14株HI阳性猪流感病毒进行纯化,得到了H1N1 4株、H1N2 1株、H3N2 5株、H4N8 1株、H6N6 1株和H9N2 2株,其中H6N6亚型为世界上第1株从猪体内分离的H6亚型流感病毒[5];H4N8为国内从猪体内分离的第1株H4亚型流感病毒。这些分离的病毒经鸡胚终点稀释法结合特异血清中和法纯化后,经HI和RT-PCR鉴定都达到了纯化。
4 结论与讨论
长期以来,猪流感病毒对养猪业造成的危害并不是很明显,因此人们对其不是很关注。随着2009年甲型H1N1人流感病毒的爆发,给人们敲响了警钟。这就要求人们对猪流感病毒必须进行有效的分子流行病学调查,深入探究猪流感病毒的变异趋势,以便更好地做好防控措施。首先要做好病毒的纯化工作。日益增多的不同亚型猪流感病毒混合感染迫使人们寻找一条简单、有效的纯化方法。鸡胚终点稀释法是S.Ciappi等[6]在研究A型流感病毒的O→D相变异时所创立的,之后G.B.Sharp等[7]用特异血清中和优势毒株,使用鸡胚终点稀释法将掩盖的毒株纯化出来,目前已经被广泛地应用于流感病毒纯化和变异株的选择等工作。国内有关于鸡胚终点稀释法应用于禽流感病毒的报道[8,9],但是还没有猪流感病毒的相关报道。本研究对鸡胚终点稀释法结合特异血清中和法纯化猪流感病毒的工作进行了系统、全面的分析和研究。
在我国,猪主要感染H1N1和H3N2亚型流感病毒,因此本试验人工制备了这两种病毒混合感染的模型,最大程度地还原了实际感染的情况。此外,由于HI试验有交叉保护的情况存在,本试验又使用RT-PCR方法对纯化结果进行鉴定,有效地提高了鉴定结果的准确性。
单纯应用鸡胚终点稀释法对多种亚型流感病毒混合感染的样品进行纯化的结果往往都是毒力强的毒株被纯化出来,而且耗费的时间和精力也更多。此种方法也会造成强毒、弱毒混合感染后弱毒丢失的情况。而在实际情况中,猪这种“混合器”体内混合流感病毒的情况时有发生。为了增强对猪流感病毒纯化的针对性和目的性,研究对鸡胚终点稀释法结合特异血清中和法纯化猪流感病毒混合感染样品进行了探索。结果表明,可以使混合感染样品中任一期望获得的病毒被成功纯化出来。因此,同时设立针对不同亚型病毒的纯化组,可以使混合感染样品中的不同毒株逐一被纯化出来,特别是分离、纯化生长竞争能力弱、难以用鸡胚终点稀释法分离出来的猪流感病毒时,这种分离方法的优越性更能得以充分体现。
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纯化鉴定 篇4
报道了重组大肠杆菌表达的别藻蓝蛋白的下游生产工艺研究,并对产物进行了分析鉴定.工程菌株P1先在NBS BioFlo3000型5 L自动发酵罐进行高密度发酵,融合蛋白获得了高效表达,且主要在细胞内以可溶形式存在.纯化前先将获得的菌体超声破碎,然后经硫酸铵沉淀、疏水层析和离子交换层析三步纯化,接着对纯化的重组别藻蓝蛋白(rAPC)进行SDS-PAGE、PAGE、Western blot等电点分析.证明已获得纯度为96.4%的.rAPC,其等电点为6.0,并且具有与天然APC相似的抗原性.
作 者：唐志红 李富超 吴少杰 葛保胜 林凡 任育红 秦松 TANG Zhi-hong LI Fu-chao WU Shao-jie GE Bao-sheng LIN Fan REN Yu-hong QIN Song 作者单位：唐志红,TANG Zhi-hong(中国科学院,海洋研究所,山东,青岛,266071;中国科学院,研究生院,北京,100039;烟台大学,海洋学院,山东,烟台,264005)李富超,吴少杰,葛保胜,林凡,任育红,LI Fu-chao,WU Shao-jie,GE Bao-sheng,LIN Fan,REN Yu-hong(中国科学院,海洋研究所,山东,青岛,266071;中国科学院,研究生院,北京,100039)
纯化鉴定 篇5
1 材料与方法
1.1 动物雄性SD大鼠, 体重250g~300g, 由山西医科大学实验动物中心提供。
1.2 试剂胶原酶P购自瑞士罗氏公司;双硫棕 (DTZ) 、HEPES、葡萄糖、多聚赖氨酸 (分子量15~30万) 购自美国Sig-ma公司;1640培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司;Dis-paseⅡ购自美国Amresco公司;青链霉素 (双抗) 购自北京索莱宝公司;AO-PI购自南京建成生物科技有限公司;大鼠胰岛素放射免疫试剂盒购自北京北方生物技术研究所。
1.3 主要仪器超净工作台 (北京世安科技林净化技术有限公司) ;CO２细胞培养箱 (北京博奥恒信生物科技有限公司) ;台式冷冻离心机 (长沙湘仪离心机仪器有限公司) ;奥林巴斯激光共聚焦显微镜IX81 (日本奥林巴斯IX51) 。
1.4 方法
1.4.1 原代大鼠胰岛及胰岛细胞分离培养无菌条件下, 大鼠断头处死, 迅速打开胸腹, 在胆总管汇入十二指肠的入口处用止血钳夹住, 经胆总管缓慢注入13mL 4 ℃的1mg/mL胶原酶P溶液, 38 ℃水浴消化11min, 取出立即加入20 mL 4℃ 培养液 (含10%胎牛血清) 终止消化, 剧烈振摇胰腺至细沙状, 用孔径350μm的滤网过滤, 1 200r/min, 离心2 min, 去上清, 加入10mL分离液Histopaque 1077至管中重悬组织, 将10mL 1640培养基慢慢顺管壁注入管中, 3 200r/min, 离心23min。收集界面间的悬浮胰岛, 在含10%胎牛血清, 100U/mL青霉素, 100μg/mL链霉素的1 640 培养基中培养, 并置于37℃, 5% CO２, 100%湿度的孵箱中培养［４］。将胰岛用含3 mmol/L EDTA的无钙镁PBS溶液脱钙后, 加入DispaseⅡ (5mg/mL) 酶液, 培养箱孵育6min, 用4℃培养液终止消化, 吹打使胰岛分散, 1 000r/min, 离心2min, 将胰岛细胞接种在培养皿中, 按胰岛培养条件培养［４］。
1.4.2 大鼠胰岛的DTZ纯度鉴定DTZ 10 mg溶于10 mL DMSO, 用Hanks液 (pH7.8) 1∶1 000稀释, 0.22μm孔径滤膜过滤, 与胰岛制备物混合, 室温10 min后镜检［５］;大鼠胰岛的AO/PI活性鉴定:用Hanks液配制储存液, AO:670μmol/L, PI:750μmol/L, 4 ℃避光保存, 使用前取0.01mL AO与1mL PI混合, 用Hanks液10倍稀释, 0.22μm孔径滤膜过滤, 与胰岛混合10min, 在荧光显微镜下采用490nm激发光, 510nm发射光镜检［６］。
1.4.3 胰岛素分泌实验配置葡萄糖浓度分别是2.8mM, 8.3mM, 16.7mM的KRBH孵育液。方法:1取6个Eppendorf管标号, 各加1mL 2.8mM葡萄糖的KRBH液, 每管挑入5个胰岛, 37℃孵育30 min后, 弃上清。2 每管再加入1 mL 2.8mM葡萄糖的KRBH液孵育, 37℃ 孵育30 min, 收集上清, 标号, -20℃保存待测。3依次给予8.3mM葡萄糖、16.7mM葡萄糖孵育, 方法同上, 收集上清, -20℃保存待测。用放射免疫法检测上述待测样品。
1.4.4 激光共聚焦检测细胞内部钙离子浓度胰岛用Fluo 4-AM (4μM) 染料在37℃的条件下孵育半小时, 孵育完用含2.8mM糖的Hanks液轻轻冲洗两遍, 防止染液残留影响之后的细胞内钙离子浓度的测定, 再加入2mL含2.8mM糖Hanks液。使用奥林巴斯激光共聚焦显微镜IX81观察, 设置激光波长494nm, 发射波长516nm。所得到的比值F/F0 (细胞荧光减去背景荧光和自身荧光) 反应细胞内钙离子浓度的变化［４］。
1.5统计学处理计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 统计分析用Sigmaplot 12.0统计软件, 采用两组t检验或配对t检验进行分析, P<0.05有统计学意义;激光共聚焦的数据用FV10-ASW 3.0软件 (日本奥林巴斯公司) 进行分析。
2 结果
2.1 原代大鼠胰岛一般只离体培养7d, 在体视显微镜下观察, 胰岛质地饱满, 呈椭圆形或圆形, 透光率较小, 直径在100~300μm;胰岛细胞在倒置显微镜下观察呈球形, 部分细胞之间相连成细胞团。胰岛中包含α, β, δ和pp细胞, 但是在体积上有明显差别, β细胞是α细胞的2~3倍, δ细胞比α细胞更小, β细胞直径11~13.5μm。
2.2 DTZ和AO/PI对胰岛纯度及活性鉴定分别在40 倍, 100倍的显微镜下观察, 可见全部胰岛被DTZ染成猩红色;在490nm激发光, 510nm发射光的荧光显微镜下观察, 培养过夜的胰岛97%以上可被AO/PI染成绿色。
2.3 胰岛素分泌实验胰岛分别在葡萄糖浓度为2.8mM (2.8G) , 8.3mM (8.3G) , 16.7mM (16.7G) 的KRBH溶液中孵育半小时后, 所测胰岛素值分别为: (11.7 ± 1.4) uIU/mL, (38.2 ± 8.7) uIU/mL, (86.3 ± 5.1) uIU/mL, 胰岛素分泌量随葡萄糖浓度增加而增加。
2.4 激光共聚焦技术检测胰岛细胞中钙离子浓度实验中, 在2.8mM葡萄糖 (n=10) 的基础上, 8.3mM葡萄糖 (n=10) 可以明显升高胰岛细胞内的钙离子浓度;16.7 mM葡萄糖 (n=10) 在8.3mM的葡萄糖的基础上进一步的升高了胰岛细胞中的钙离子浓度。2.8Gvs8.3G (P<0.0 5) ;2.8Gvs1 6.7G (P<0.001) ;8.3Gvs 16.7G (P<0.01) 。
3 讨论
胰岛细胞移植为治疗胰岛素依赖性糖尿病开辟了一条新的途径［７］。胰岛移植不仅可纠正糖代谢紊乱, 还能避免因血管病变引起的眼、肾、脑和心血管并发症, 但胰岛的分离纯化是一个较复杂的过程, 所获胰岛的产量和质量受很多因素影响, 稍有偏差即会直接影响治疗效果, 因此备受关注［８］。如何获得高纯度及高活性的胰岛仍是亟待解决的问题。
目前成年大鼠胰岛分离纯化多采用机械研磨与Ficoll密度梯度离心法［９］, 而本实验采用单一的Histopaque-1077是即用型的, 减少了Ficoll不同密度分离剂的配制及除菌的步骤。由于纯化时只有Histopaque-1077和1640培养基两个密度, 纯化梯度易于形成, 使得胰岛的纯化变得简便, 缩短了分离大鼠胰岛的时间。此法减少了多步分离过程中不确定的因素对胰岛质量的影响, 尽可能快的给予离体胰岛营养, 利于获得纯度高, 活性良好的胰岛。Histopaque-1077 较Ficoll等能提供一个更好的渗透环境, 能更好地保持胰岛的活性与功能。实验证实, 胶原酶P消化胰腺及利用Histopaque 1077分离得到的大鼠胰岛纯度高、活性、功能良好。同时我们总结了大鼠胰岛分离纯化过程中一些体会:1胰腺灌注的成功与否是分离纯化胰岛的关键, 文献报道多采用4.5号头皮针穿刺灌注, 为防止针尖过于锐利, 刺破胆管壁致胶原酶外溢, 我们采用与此针头同样粗细的细塑料管 (尖端较钝) 进行灌注。2灌注时用线结扎位置要在最低一支胆管与主干的汇合支以下, 以防止部分酶液倒流至肝内。3应采用4℃的胶原酶灌注, 因温度高时胶原酶过早消化胰管和腺泡, 灌注好的胰腺应置于0℃ 的冰袋上剔除非胰腺组织, 这些非胰腺组织无法消化且会黏附正常胰腺组织, 不利于过滤。4胰腺消化分散后, 应立即加入20mL 4℃培养液, 混匀终止消化。如果培养液用量太少, 则不能终止胶原酶的作用, 造成过度消化, 破坏胰岛完整性, 影响分离效果［１０］。
DTZ是一种螯合锌、铜、铅等的指示剂, 因为大鼠的胰岛β细胞含锌, DTZ染液可将胰岛染成猩红色, 所以DTZ对胰岛是特异性染色［５］;AO为浸润性染料 (膜通透性) , 可侵入活细胞与双链DNA结合发出绿色荧光;PI为排斥性染料 (膜不通透性) , 不能进入活细胞, 与死亡 (膜通透性改变) 细胞的核酸结合, 发出红色荧光［６］。实验中, 所有胰岛可被染成猩红色, 表明用此种实验方法分得的胰岛纯度较高;AO/PI可将97%以上胰岛染成绿色, 表明胰岛活性良好。葡萄糖依赖性的胰岛素分泌实验证实了胰岛功能良好。胰岛细胞中钙离子浓度会升高会促进胰岛素分泌。我们对胰岛细胞中钙离子浓度进行检测后发现, 利用高浓度葡萄糖刺激胰岛时, 可明显升高胰岛中钙离子浓度。利用胶原酶P消化胰腺及利用Histopaque 1077分离液离心纯化胰岛是一种较简单可靠的方法。
摘要：目的 探讨成年大鼠胰岛分离、纯化的方法, 为成人胰岛的分离纯化奠定基础。方法 通过用胶原酶P消化胰腺及利用Histopaque 1077分离液离心分离纯化雄性SD大鼠胰岛, 用双硫棕 (DTZ) 染色, 吖啶橙-碘化丙啶 (AO/PI) 染色和胰岛素分泌实验来鉴定胰岛的纯度、活性和功能;利用激光共聚焦技术检测胰岛细胞中钙离子浓度。结果 分离获得的胰岛可被DTZ和AO/PI分别染成猩红色和绿色;体外刺激胰岛素分泌实验, 2.8mM、8.3mM、16.7mM葡萄糖情况下胰岛素分泌量分别是: (11.7±1.4) uIU/mL、 (38.2±8.7) uIU/mL、 (86.3±5.1) uIU/mL;在2.8mM葡萄糖基础上, 8.3mM葡萄糖明显增加胰岛细胞中钙离子浓度, 16.7mM葡萄糖在8.3mM葡萄糖基础上又进一步升高钙离子浓度。结论 采用胶原酶P消化法及Histopaque 1077分离液离心分得的胰岛纯度高, 活性、功能良好, 随着葡萄糖浓度的增加, 胰岛细胞中钙离子浓度明显增加。
关键词：胰岛,分离,钙离子,原代大鼠
参考文献
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纯化鉴定 篇6
目前全球约1/3人口持续感染结核分枝杆菌 (MTB) , 我国约有4亿MTB持续感染者, 其中5%—10%有可能发展为活动性结核病 (TB) , 是TB的重要来源和传染源[1,2]。MTB以休眠状态在体内长期存在是造成MTB持续感染的重要原因[3]。研究发现, MTB在休眠状态时, 其基因组中由MTB的休眠调节子DosR (dormancyregulon) 调控的48个编码基因被特异性的上调转录表达, 其特异性表达的蛋白称为持续感染期抗原 (latencyantigens) 或DosR抗原[4]。Rv2626c是上述MTB在休眠期特异表达的蛋白之一, 表达纯化该蛋白有助于进一步研究其生物学特性、免疫学特性及与MTB休眠的关系, 并将为TB的诊断和防治的靶抗原筛选奠定研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料
MTB毒株H 37Rv基因组DNA、E.coliDH 5α和pPro-EX HTb质粒均为本室保存;rTaqDNA聚合酶, dNTPs, T4DNA连接酶, HindⅢ, BamHI, DNA MarkerDL2000, pMD 18-T载体购自Takara公司;DNA片段胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒购自Omega公司;Ni-NTA亲和层析柱购自QIAGEN公司。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、6×His单克隆抗体购自北京天根公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计
根据Genebank公布的MTB Rv2626c全基因序列如下设计引物, 上游:5'-CG GGATCC ATG ACC ACCGCA CGC-3', 含BamHⅠ酶切位点;下游:5'-AGCAAGCTTCTAGCTGGCGAGGGC-3', 含HindⅢ酶切位点。均由北京鼎国公司合成。
1.2.2 Rv2626c基因的扩增、克隆及测序
以MTBH 37Rv菌株的基因组DNA为模板, 进行PCR扩增。PCR反应体系为:10×PCR buffer 5μL, dNTPs 2μL (2.5mmoL/L) , DNA模板1μL, 上下游引物各1μL及rTaq酶0.5μL, 加水至50μL。PCR条件:95℃变性5min, 94℃15s, 58℃30s, 72℃50s, 共30个循环, 72℃延伸5min。所获得PCR扩增片段经琼脂糖凝胶电泳回收后克隆入pMD 18-T载体, BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定, 阳性克隆命名为pMD 18-T-Rv2626c, 序列测定由北京奥科生物技术有限公司完成。
1.2.3 目的基因的原核表达载体构建
用BamHI和HindIII双酶切pMD 18-T-Rv2626c, 回收的目的片段与同样酶切的pProEXHTb载体连接, 转化E.ColiDH 5α感受态细胞。随机挑选2个菌落, 分别接种于5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液, 37℃振荡培养过夜。碱裂解法提取质粒DNA, 用BamHI和HindIII双酶切, 琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒, 阳性克隆命名为pPro-EX HTb-Rv2626c。
1.2.4 重组质粒的诱导表达
将含重组质粒pPro-EXHTb-Rv2626c的单个菌落接种于含氨苄青霉素 (100mg/L) 的LB培养液中, 37℃振荡培养过夜。次日取50μL加到5mL含氨苄青霉素的LB培养液中, 37℃振摇至A 600nm=1, 留下诱导前对照样本后, 加入IPTG至终浓度为1mmoL/L, 37℃诱导3h后集菌, 以2×凝胶加样缓冲液50μL悬浮, 煮沸10min, 离心后取10μL上清进行12%SDS-PAGE分析。
1.2.5 目的蛋白的Western-blot分析
将上述制备的样品进行12%SDS-PAGE后以0.15mA恒流电转2h转至硝酸纤维素膜上。用50g/L脱脂奶封闭2h, PBS洗涤后加抗His的单克隆抗体 (1∶5 000稀释) 4℃过夜, PBS洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体, 37℃孵育1h。PBS洗涤后DAB显色观察结果。
1.2.6 目的蛋白的可溶性分析及纯化
阳性重组菌的诱导表达方法按上述步骤进行, 体积扩大至100mL。取2mL诱导后的菌液集菌, PBS100μL重悬, 超声裂解后10 000r/min离心10min, 分别收集上清及沉淀制样, 进行12%SDS-PAGE分析目的蛋白的可溶性。根据目的蛋白的可溶性分析结果, 使用QIAGEN公司的Ni-NTA纯化试剂盒纯化目的蛋白。取诱导菌超声裂解的上清, 用Ni-NTA亲和色谱纯化, 洗脱液洗脱吸附蛋白。将收集的洗脱液用PBS 4℃透析后, -20℃保存备用。
2 结果
2.1 Rv2626c基因的扩增、克隆及测序
以MTBH 37Rv基因组DNA为模板, 用合成的Rv2626基因引物进行PCR扩增, 成功扩增出与预期一致的目的基因片段, 大小为432bp。将PCR扩增产物与pMD 18-T载体连接并进行测序 (图1) , 测序结果表明目的基因序列与GenBank公布的序列完全一致。
M—DNA makerDL2000;1—BamHⅠ和HindIII双酶切重组质粒pMD 18-T-Rv626c;2—Rv2626c基因的PCR产物
2.2 原核表达载体的构建及表达
将测序正确的阳性克隆质粒经酶切后与同样酶切的原核表达载体pPro-EXHTb连接, 转化E.ColiDH 5α感受态细胞, 随机挑选2个阳性克隆进行酶切鉴定, 结果均可切出与预期一致的432bp基因片段, 阳性重组质粒命名为pPro-EXHTb-Rv2626c (图2) 。用IPTG诱导蛋白表达, 含pPro-EXHTbRv2626c质粒的重组菌诱导后在蛋白分子量约16kD处有明显特异性蛋白条带, 与预期大小一致, 而空载体菌和未诱导菌均无此特异性表达条带 (图3) 。
2.3 目的蛋白的Western-blot分析
pPro-EX HTb是含有6×His的原核表达载体, 因此pPro-EX HTb-Rv2626c重组载体所表达的目的蛋白是含有6×His的融合蛋白。用鼠源性的6×His单克隆抗体为一抗, 羊抗鼠的IgG为二抗进行目的蛋白的Western-blot分析, 结果在蛋白分子质量约16kD处有特异性印迹条带 (图4) 。
2.4 目的蛋白的纯化
蛋白可溶性分析表明, 目的蛋白主要以可溶性形式存在于菌体上清中 (图5) 。用Ni-NTA亲和层柱在非变性条件下纯化目的蛋白, 经SDS-PAGE分析和凝胶薄层扫描显示, 纯化蛋白纯度达到90%以上 (图6) 。
M—蛋白分子量marker;1—空载体菌;2—诱导表达产物
3 讨论
有效控制长期处于持续感染状态的MTB是目前TB防治的关键, 而造成机体长期处于结核持续感染状态是由于MTB在体内长期以休眠菌状态存在[3]。MTB休眠菌可特异性表达与休眠相关的蛋白。Voskuil等人[4]研究发现, MTB在休眠状态时即微氧, 厌氧或低浓度的NO条件下, 其基因组中的48个编码基因被特异性的上调转录表达, 由MTB的休眠调节子DosR调控, 其特异性表达的48个蛋白称为持续感染期抗原或DosR抗原。Shi等人[5]研究也发现当MTB处于持续感染期或进入非增殖状态时, 其在感染早期或增殖期高度表达的一些抗原 (如Ag85B) 的表达是减少的, 而此时则出现一些与休眠相关的抗原的大量表达, 这些抗原即为前述的休眠相关抗原或称持续感染期抗原, 这些抗原对体内MTB休眠菌的存活是必须的。Leyten等人[6]以48个持续感染期抗原刺激MTB持续感染者的T细胞, 发现包括Rv2626c在内的8个抗原可强烈地刺激MTB持续感染者的T细胞增殖, 释放IFN-γ和IL-2。小鼠实验表明, MTB持续感染的小鼠对Rv2626c可产生强烈的Th1型的免疫应答[7]。因此, 筛选有效的持续感染期抗原作为TB新型疫苗的候选抗原将对控制持续性的MTB感染起着重要作用, 而Rv2626c等则是其中的主要免疫优势抗原。
因此, 克隆了Rv2626c基因构建了其原核表达载体, 并成功地在E.coli表达, 获得了纯度较高的纯化蛋白。Rv2626c蛋白的成功表达和纯化为下一步将之用于TB的的新型疫苗研究和诊断试剂等方面奠定了基础。
摘要：克隆结核分枝杆菌Rv2626c基因, 构建其原核表达载体, 并进行表达、纯化及鉴定。采用聚合酶链反应 (PCR) 方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv2626c基因片段, 克隆入pMD18-T载体, 序列测定正确后亚克隆入原核表达载体pPro-EXHTb, 转化入E.ColiDH5α, 经IPTG诱导表达, SDS-PAGE分析后与抗His单抗进行Western-blot, 以Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白。PCR扩增获得的目的基因为432bp, 与预期大小一致, 测序与Genebank公布的基因序列完全一致。成功构建原核表达载体pPro-EXHTb-2626c, 转化E.ColiDH5α后能特异性表达目的蛋白, 大小约16KD, 与理论值相一致。蛋白可溶性分析表明该蛋白主要以可溶性方式存在, 纯化蛋白经Western-blot鉴定有特异性反应条带。成功构建结核分枝杆菌Rv2626c原核表达载体pPro-EXHTb-2626c, 并获得纯化的目的蛋白, 为研究新型结核疫苗的靶抗原奠定了基础。
关键词：结核分枝杆菌,抗原,原核表达,纯化
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纯化鉴定 篇7
化疗是人们目前治疗肿瘤尤其是恶性肿瘤的主要方法,在化疗过程中出现的多药耐药(MDR)是肿瘤化疗的最主要障碍,其中P-gp过表达是引发肿瘤细胞MDR最主要的原因之一[1,2,3]。当正常组织恶变为肿瘤后,在外界化疗药物作用下P-gp表达上调,因此,在化疗前后检测病人肿瘤组织中P-gp的表达水平具有很大的意义。目前用于肿瘤多药耐药性检测和治疗的大多为完整IgG抗体,其组织穿透能力差,在血液和非瘤组织的清除速度较慢。而利用噬菌体展示技术制备的Fab抗体其分子量只有完整IgG抗体的1/3,体积小跨膜转运更灵活,没有Fc段也不会与正常细胞的Fc受体结合,减少了非特异性结合,应用于免疫组化和流式细胞术检测时其检测结果将更灵敏、更准确[4,5]。本研究通过构建抗人大肠癌P-gp Fab抗体的原核表达载体,制备纯化出了具有一定生物活性Fab抗体,该抗体的筛选有望为大肠癌等肿瘤细胞多药耐药性的检测和治疗提供新的选择。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
人大肠癌P-gp21为P-gp紧邻ATP结合区的跨膜肽段,分子量为21kDa。其mRNA来源于人大肠癌组织,氨基酸序列为784～986,利用PET28a(+)载体构建重组子经测序鉴定后转化入大肠杆菌BL21-DE3中诱导表达,经镍柱纯化后浓度为4.8μg/μL。根据在线软件分析P-gp21跨膜肽段包含3个抗原表位,其氨基酸序列分别为10肽:ANDAAQVKGAC、12肽:CSWFDDPKNTTGA、16肽:ALKDKKELEGSGKIATC,由上海强耀生物科技有限公司合成。噬菌体Fab抗体库的基因来自经人大肠癌组织免疫后的小鼠脾组织提取的总RNA。E.coil XL1-Blue菌为作者实验室保存菌株。
1.1.2 试剂
限制性内切酶SpeⅠ、NheⅠ、NotⅠ等为大连宝生物公司产品,T4 DNA连接酶为Fermentas公司产品;AP标记马抗小鼠IgG抗体、抗His tag标签抗体及HRP标记山羊抗鼠IgG抗体为Scicrest公司产品。FITC标记的山羊抗鼠IgG抗体为上海酶联生物科技有限公司产品。Protein L亲和柱为GE公司产品。
1.1.3 仪器
德国Thermo Biofuge Primo R台式高速冷冻离心机;BIO-RAD公司,PowerPac TM Basic核酸电泳仪;宁波新芝JY96-II超声细胞粉碎机;德国Thermo 354多功能酶标仪。
1.1.4 培养基
LB液体培养基、LB固体培养基按需要加入四环素(10mg/L)和氨苄青霉素(100mg/L)。
1.2 方法
1.2.1 可溶性Fab抗体表达质粒的构建
以人大肠癌P-gp21作为抗原经5轮淘选从噬菌体Fab抗体库中淘选出阳性克隆,测序鉴定后同时SpeⅠ和NheⅠ酶切,以去除噬菌体外壳蛋白gⅢ基因,纯化回收目的片段在T4 DNA连接酶作用下自身环化转化入E.coli XL1-Blue,并涂布LB/Amp/Tet平板,37℃过夜培养。随机挑取单个克隆,37℃过夜振荡培养提取质粒,经NotⅠ单酶切鉴定。
1.2.2 抗人大肠癌P-gp21 Fab抗体的优化表达及初步鉴定
将鉴定过的阳性菌株分区划线接种于LB/Amp/Tet平板,37℃孵育过夜。随机挑取单个克隆接种于5mL LB/Amp/Tet液体培养基37℃过夜振荡培养,次日1:100转接于200mLLB/Amp/Tet液体培养基,37℃震荡培养至OD600nm≈0.5,加入IPTG至终浓度1mmol/L,分别在25℃、30℃震荡培养诱导目的蛋白的表达,并分别于2h、4h、6h、8h、12h取样,菌液4 000r/min离心10min,收集菌体,PBS重悬超声裂解(40W,10min),离心收集裂菌上清。同时以IPTG诱导的空载体pComb3裂菌上清和未加IPTG诱导表达的阳性克隆菌裂菌上清为阴性对照,经10% SDS-PAGE电泳初步分析IPTG诱导重组蛋白的表达情况。
1.2.3 Protein L纯化Fab抗体及初步鉴定
将优化条件下(28℃表达8h)诱导表达的600mL菌液离心后收集菌体,PBS重悬超声裂解(80W,30min),离心收集裂菌上清,经Protein L柱纯化,10%SDS-PAGE监测纯化的效果。10% SDS-PAGE分离纯化的抗人大肠癌P-gp21Fab抗体,电转至PVDF膜;以HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体震荡孵育后;ECL化学发光显影,定影。
同时将人大肠癌P-gp21经10%SDS-PAGE电泳,电转至NC膜;纯化的Fab抗体作一抗,AP标记的马抗小鼠IgG抗体为二抗,BCIP/NBT显色。阴性对照为pComb3裂菌上清,阳性对照为抗His tag抗体。
1.2.4 抗人大肠癌P-gp21 Fab抗体的抗原表位筛选
用合成的P-gp21肽段10肽、12肽、16肽包被ELISA反应板;3% BSA 4℃封闭过夜;次日加入含Fab抗体的样品,阴性对照加pComb3裂菌上清,空白对照加TBS,37℃孵育2h;分别加入1:800稀释的FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体,37℃孵育2h;TBST洗板后,荧光酶标仪读值:激发波长为495nm,吸收波长为535nm。在同样条件下重复3次,最后对结果进行统计学处理。
2 结果与分析
2.1 可溶性Fab抗体表达载体的构建
阳性克隆经SpeⅠ和NheⅠ双酶切鉴定,可见2条电泳条带,分别为660bp的gⅢ蛋白基因片段和4 700bp的目的条带,纯化回收目的条带后在T4 DNA连接酶作用下自身环化转化入E.coli XL1-Blue,LB/A/T平板37℃过夜培养筛选阳性克隆。随机挑取单个克隆,增殖后提取重组质粒,经NotⅠ单酶切后,可见3 000bp和1 600bp的两条电泳带,说明gⅢ蛋白基因已被切除(图1)。
2.2 抗人大肠癌P-gp21 Fab抗体的优化表达及初步鉴定
阳性克隆裂菌上清经10% SDS-PAGE电泳,显示目的条带在约48kDa处(图2箭头所示),和预计的分子量一致。根据相关文献报道,温度对Fab抗体的表达影响较大[6],分别于25℃、30℃诱导表达,比较不同温度下蛋白表达量的差异,在25℃Fab抗体有较多的分泌性表达。一般细菌的生长曲线到达稳定期后,代谢有害物质在不断积累而目的蛋白不再增加,在加入IPTG诱导表达8h后蛋白表达量达到峰值,继续延长诱导时间蛋白表达量无明显增加(图2)。
2.3 Protein L亲和柱纯化Fab抗体及初步鉴定
因表达的Fab抗体轻链为Kappa型,利用Protein L和Kappa轻链特异性结合的特点选用Protein L亲和柱纯化该Fab抗体。裂菌上清经Protein L亲和柱,用pH2.3的柠檬酸钠缓冲液洗脱柱子,得到纯化的Fab抗体,蛋白定量浓度为150mg/L。10%SDS-PAGE凝胶显示目的条带为48kDa和纯化后Fab抗体直接作为抗原的Western Blot鉴定结果一致。(图3)。同时以P-gp21为抗原,纯化的Fab抗体作为一抗Western Blot鉴定,显示在21kDa出现条带(图4),这表明所得到的Fab抗体保持了与人大肠癌P-gp21结合的活性。
2.4 抗人大肠癌P-gp21 Fab抗体的抗原表位筛选
* P<0.05 vs 10肽。
对三次ELISA结果进行统计学分析:在10肽的鉴定中Fab抗体和阴性对照相比,*P<0.05;在12肽、16肽表位鉴定中,Fab抗体和阴性对照相比均无显著性差异(表1)。故确定该Fab抗体所识别的抗原表位为紧邻ATP结合区的跨膜肽段10肽,序列为:ANDAAQVKGA。
3 讨论
肿瘤在化疗过程中出现多药耐药性,已成为肿瘤治疗的主要障碍之一,因此及时检测肿瘤细胞的化疗药物敏感状况,可为肿瘤化疗药物及化疗方案的选择提供重要参考。传统的MTT(四甲基偶氮唑蓝)法在检测肿瘤细胞对化疗药物敏感性虽然具有形象直观的优点,但比较耗时,周期长,为随时观测肿瘤细胞的耐药状况带来不便;反转录PCR检测P-gp mRNA水平,具有快速、敏感等优点,可以辅助于临床观测肿瘤细胞对化疗药物的耐受情况,但mRNA水平有时并不能反映P-gp蛋白水平的高低;而且研究表明许多肿瘤原发性或获得性耐药均与P-gp糖蛋白高水平表达是密切相关的[7,8],因此配合一种P-gp蛋白水平检测的方法,可以对肿瘤细胞多药耐药性的预测更为准确。
目前,已有多种抗P-gp杂交瘤单克隆抗体制备并用于肿瘤多药耐药性检测[9,10],随着基因工程技术不断发展我们可以制备Fab抗体、单链抗体、及亚单位抗体等小分子抗体,与完整抗体相比它们不仅保留了IgG的抗原结合能力,还具有分子量小、穿透性强、结构简单、免疫原性低、生产成本低等优点,目前人们成功制备的抗P-gp ScFv抗体[11]、抗CD3/抗P-gp微型双功能抗体[12]经鉴定具有一定的抗原结合活性,在肿瘤的靶向诊断治疗中具有一定的应用前景。所以抗P-gp小分子抗体有望用于肿瘤多药耐药性的检测和治疗。
本研究利用噬菌体展示技术淘选阳性克隆,在此基础上通过原核表达成功获得了有活性的抗人大肠癌P-gp21 Fab抗体,并确定了该Fab抗体所识别的抗原表位。该Fab抗体的获得可望用于P-gp结构与功能的研究,以及P-gp诱导的肿瘤细胞多药耐药性的实时监测从而可及时调整恶性肿瘤的治疗方案。如结合免疫组化染色或流式细胞术可较准确的定性、定量分析产生多药耐药的肿瘤组织和肿瘤细胞,同时为后续展开的抗人P-gp21Fab抗体的人源化提供依据和支撑。
参考文献
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纯化鉴定 篇8
碱性磷酸酶(AP)是广泛分布于人体肝脏、肾和胎盘等组织的一种分泌酶[8]。由于AP具有排出细胞外的这一特性,由Flanagan and Leder两位教授发明了AP-tag技术,这项技术可以使c DNA序列连接在AP的碳端或者氮端,表达出的融合蛋白可以进行细胞表面受体与配体检测,分泌到细胞外的蛋白质通过过纯化可以获得高纯度的融合蛋白。目前将AP融合蛋白应用在类风湿性关节炎等自身免疫病发病机理研究上国内外尚无这样的报道。本研究中利用AP-tag技术,将TNFα基因克隆到AP-tag载体中,构建出具有AP标签的融合蛋白,经纯化得到高纯度AP-TNFα蛋白,根据配体-受体结合原理以及亲和性测试系统,可以测定AP-TNFα的生物学活性,具备生物学活性的重组TNFα蛋白为研究银屑病等疾病发病机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
p AP-Tag2质粒、大肠杆菌GH2感受态、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)购于Gen Hunter公司;p UC57-TNFα质粒由南京金斯瑞(Gen Script)生物科技有限公司合成;小鼠(6 w后用于实验)购于北京华阜康生物科技股份有限公司。
1.1.2 试剂
TNFα蛋白购自R&D公司;TNF-R2购自Enbrel和YSP;r Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶购自Takara公司;质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自Omega公司;氨甲喋呤(MTX)购自Sigma;胎牛血清(FBS)购自Bovogen公司;Fug ENE6购自Roche公司,其他试剂为国产分析纯。
1.1.3 仪器
冷冻离心机(Eppendorf公司);凝胶成像系统(Bio-Rad公司);电泳仪(北京JUNYI电泳仪公司);CO2恒温培养箱(Thermo Fisher公司);Octet检测系统(fortebio公司);PCR仪(Bio-Rad)。
1.1.4 培养基
IMDM培养基、SFM无血清培养基均购自Hyclone,4℃保存。
1.2 方法
1.2.1 AP-TNFα质粒的构建、鉴定
将得到的p UC57-TNFα质粒,经HindⅢ和BglⅡ双酶切将TNFα切除,并通过胶回收得到较纯的TNFα基因,将TNFα基因与经过同样双酶切的p AP-tag2质粒进行连接,然后将质粒转化到大肠杆菌感受态细胞,通过氨苄青霉素和四环素抗性筛选,经p AP-tag2质粒上特异引物L-AP(5'-GAAC-CCACTGCTTACTGGC-3')和R-AP(5'-GC-CTCGCGGTTCCAGAAG-3')进行菌落PCR挑选阳性克隆,并通过双酶切对质粒进行鉴定。
1.2.2 AP-TNFα蛋白表达
将筛选好的AP-TNFα单克隆在细胞培养板中扩大培养,待细胞单层长满后可开始无血清驯化,逐步降低血清浓度。收集细胞培养液并留1 m L。在细胞培养皿加入9 m L SFM。置于37℃、5%CO2恒温培养箱培养。次日观察悬浮起来的细胞数,收集9 m L细胞培养液至离心管中,取600μl细胞悬液至EP管中计数,原皿留1 m L,加入9 m L SFM,将培养皿放回37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。根据细胞计数仪计数结果调整细胞悬液密度(一般为0.25~0.5 million/m L),将6m L细胞悬液转移至50m L离心管,盖子需用大头针扎孔,放置摇床上,转速为180~220 r/min。当细胞数每天稳定翻倍时,进行蛋白生产,将细胞放置在摇床上培养,体积为30 m L。每天从锥形瓶中取500μl样品,5 000 r/min离心5min去除细胞后,将培养基置于-20℃冰箱中保存,待蛋白生产结束后将每天取的培养基进行SDS-PAGE检测。
1.2.3 亲和层析纯化AP-TNFα蛋白
将收集到的含有目的蛋白的SFM培养基,5 000r/min离心5 min去除培养基中的杂质。由于AP-TNFα重组蛋白含有AP标签,在纯化过程中可以利用AP的亲和性纯化。首先取1 m L AP beads,加入5m L的培养基,在室温混合摇动2 h,将混合的液体2 000 r/min离心2 min弃上清。加入2 m L 20mmol/L PB缓冲液清洗3次,2 000 r/min离心2 min弃上清。用缓冲液清洗完成后,加1 m L p H 3的柠檬酸进行洗脱,在2 000 r/min、2 min条件离心收集上清液,收集的上清液立刻用p H 10的Tris-HCl缓冲液将p H调整到7左右,洗脱2次。
1.2.4 配体-受体结合实验
由于TNFα是TNF-R2的配体,利用配体-受体结合的原理来检验TNFα的生物活性。我们将TNF-R2市场上两种药品各取20μg,分别用加巯基乙醇和不加巯基乙醇的蛋白样品缓冲液进行处理,沸水浴5 min,然后将加巯基乙醇和不加巯基乙醇的样品分别用10%蛋白凝胶进行电泳分离,然后80 V的条件下转膜。封闭完成后,分别用5 m L的AP-TNFα(5μg/m L)在室温中孵育60 min,然后用PBST缓冲清洗,每次5 min,最后用氯化硝基四氮唑兰(reagent S)进行显色。
1.2.5 亲和性常数测定实验
利用Octet检测系统中的亲和性检测模块[9],用天然TNFα作为标准品,PBS缓冲液作为负对照,检测融合蛋白中TNFα的生物活性。将1 mg/m L TNF-R2用PBS缓冲液稀释至10μg/m L,1 mg/m L TNFα用PBS缓冲液稀释至3μg/m L,180μg/m L AP-TNFα用PBS缓冲液稀释至3μg/m L。样品稀释好后,将样品加到做亲和性的96孔板中,每孔200μl,用protein A探针进行亲和性测试,最后用Fortebio数据处理软件得出配体与受体的亲和性常数。
1.2.6 AP-TNFα组织切片
取4只年龄体重相当的小鼠,2只正常小鼠为对照组,另外2只经过是处理患有银屑病的小鼠为实验组。取小鼠相同部位的皮肤组织,置于10%的甲醛溶液中固定24 h,经石蜡包埋获得小鼠皮肤组织切片,通过AP和AP-TNFα染色后观察小鼠皮肤组织中TNFα受体分布情况。
2 结果与分析
2.1 AP-TNFα重组质粒的构建及检定
利用HindⅢ和BglⅡ双酶切位点将合成的TNFα片段从p UC57质粒中切出,克隆到PAP-tag2真核表达载体上。然后随机挑取20个菌落克隆,利用特异性的引物进行菌落PCR,挑取含有目的基因的单克隆菌落。通过菌落PCR,挑取到含有目的基因的菌落,进行培养提取质粒。利用HindⅢ和BglⅡ双酶切鉴定重组质粒。质粒经过双酶切后,得到大小约5 400 bp和500 bp的两个片段,其大小与预测值大小相符合(图1),表明TNFα基因片段成功克隆到AP-tag2质粒中。
1:DL 5000 marker;2:p AP-TNFαplasmid;3:Double enzyme digestion of p AP-TNFα,the purpose objective strap size is 500 bp.
2.2 AP-TNFα重组蛋白表达
转化AP-TNFα质粒的CHO细胞,经过无血清SFM培养基在37℃、5%CO2恒温培养箱中培养后,对每天取得的样品进行SDS-PAGE电泳,经过电泳发现,在相对分子量为73 k Da处(图2),有一条随着培养天数增加,蛋白量也随着增加的特异性条带。经Western Blot验证,此条带为目的蛋白。
A:SDS-PAGE analysis of AP-TNFαexpression;Day0-Day8:protein sample per day.B:Western Blot analysis of AP-TNFα.
2.3 AP-TNFα重组蛋白纯化
由于表达的目的蛋白为分泌型蛋白,目的蛋白均在培养基中。将收集的培养经AP beads进行亲和层析(图3),得到单一条带,且分子量大小与AP-TNFα蛋白相符合,说明经过AP beads亲和纯化后得到了高纯度的蛋白。
1:Cleared soluble protein fluid;2:Flow-throμgh fraction from APbeads;3,4:Elution profile of AP-TNFα.AP-TNFα:73 k Da.
2.4 AP-TNFα蛋白生物活性检测
根据受体与配体结合的原理,将纯化后的AP-TNFα蛋白作为一抗孵育1h后,最后用Reagent S进行显色。结果发现不加巯基乙醇的样品能够显色,而加巯基乙醇的样品却不显色(图4)。由于TNF-R2为二聚体,TNFα只能识别二聚体结构的受体,而样品经过含有巯基乙醇的样品缓冲液处理后,二聚体的TNF-R2被还原成单体结构,不能够被TNFα识别。同时也说明表达的AP-TNFα重组蛋白具有生物活性。
2.5 亲和性常数测定
为了检测AP-TNFα与TNF-R2的亲和性,用Octet检测系统Qke模块进行检测,比较AP-TNFα以及天然TNFα与TNF-R2亲和性的差异,如表1,发现TNFα与TNF-R2的亲和性常数KD=5.35×10-10M,AP-TNFα与TNF-R2的亲和性常数KD=3.14×10-10M。根据结果发现,AP对TNFα的生物功能影响较小,与天然的TNFα功能结构基本相同。
2.6 组织切片原位染色
经AP和AP-TNFα染色实验观察,如图5所示,正常小鼠皮肤组织TNFα受体表达水平正常,皮肤表皮细胞分布均匀且表皮组织厚度均匀,而患病小鼠皮肤组织TNFα受体表达量过多,相比于正常小鼠,其表皮组织增厚且分布不均匀。这一结果说明了TNFα受体表达量异常与自身免疫性疾病发病机制有关。
1:enbrel;2:YSP AP-TNFαcan respectively identify TNF-R2,the AP binding make the target protein to generate visible violet.
A:Staining of normal tissues by AP;B:Staining of normal tissues by AP-TNFα;C:Staining of diseased tissues by AP;D:Staining of diseased tissues by AP-TNFα.
3 讨论
已知类风湿性关节炎和银屑病等自身免疫性疾病,通常认为与T细胞免疫反应和B细胞产生自身抗体均有关,该病全球发病率为0.5~1.0%[10],寻找该疾病的发病机制尤为重要。已有研究表明,自身免疫性疾病发病的过程中,细胞因子TNFα起着重要作用[11]。TNFα能够激活巨噬细胞、滑膜细胞及白细胞介素-1等炎症因子,同时能够促进破骨细胞的活化,导致炎症反应持续发生。也有研究表明,白细胞介素-20(IL-20)包含很多亚型的细胞因子,与银屑病等自身免疫疾病的发生有密切的联系,在银屑病患者皮肤中发现过表达的IL-20细胞因子,IL-20家族细胞因子可以诱导与自身免疫性疾病相关的促炎症因子、趋化因子的表达[12,13]。根据动物模型实验发现特异性的抑制IL-20信号通路可以改变关节炎、银屑病等疾病症状[14]。目前对自身免疫性疾病的发病具体机制仍不清楚,发现病人体内TNFα细胞因子表达量均过高[15]。由于TNF受体对TNFα具有负调节作用,可以通过中和作用抑制TNFα活性,我们认为这可能与细胞表面TNF-R2受体表达量有关系,因此构建AP-TNFα质粒,表达得到纯度较高的AP-TNFα蛋白,用它作为配体探针,通过免疫组化发现,相比于正常人,患者组织表面TNFα受体表达量过高,这可能与自身免疫疾病的发生有直接的联系,为发病机制的研究提供新的方向。
4 结论
纯化鉴定 篇9
C57BL /6小鼠是继人类之后第2个开始并完成基因组测序的哺乳类动物,广泛应用于小鼠的遗传工程、肿瘤学和生理学研究。C57BL/6小鼠的MEF细胞越来越多地应用于遗传发育、组织工程和基因功能[8,9,10]等科学研究。MEF细胞依据不同试验用途, 对其细胞活力与细胞纯度也有相应严格的要求[11]。 C57BL /6小鼠的MEF细胞是开展上述相关试验的前提和保证; 因此,选择一种合适的MEF细胞取材时机与方法对获得高纯度、高细胞活力MEF细胞具有重要意义。本试验以C57BL/6小鼠孕12. 5 d( E12. 5) 胎鼠作为取材对象,采用组织块培养法建立了一种经济实用、稳定可靠 且能够获 得高活力、高纯度C57BL /6小鼠MEF细胞的分离培养体系,为相关后续研究的开展提供优质、充足的试验材料。
1材料
1.1试验动物
C57BL /6小鼠[生产许可 证号为SCXK ( 苏 ) 2008 - 0010,使用许可 证号为SYXK ( 苏 ) 2007-0021],由南通大学实验动物中心提供,饲养于SPF级屏障环境内,温度为 ( 23 ± 2) ℃,湿度为 ( 55 ± 5) % ,饲喂60Co辐照灭菌的双狮牌饲料,自由饮水和采食,室内以14 h∶10 h明暗交替照明。
1.2试剂和仪器
DMEM ( 高糖) 培养基、胎牛血清,美国Hyclone公司生产; 青霉素/链霉素、0. 25% 胰蛋白酶 - EDTA, 北京Solarbio科技有限公司生产; 细胞培养皿、24孔板,美国Corning公司生产; Hoechst 33342,美国Sigma公司生产; 兔抗小鼠Vimentin、Keratin单克隆抗体,美国Abcam公司生产; 荧光素标记羊抗兔二抗,北京博奥森生物技术有限公司生产; Western - blot扫膜二抗,美国Odyssey公司生产; 免疫荧光 封片液、 Western - blot试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒,江苏碧云天生物科技有限公司生产; Complete Lysis - M,瑞氏Roche公司生产。1 × PBS ( 不含Ca2 +、Mg2 +) 、 0. 01 mol / L PBS磷酸缓冲液、0. 1 mol / L PB磷酸缓冲液、4% 多聚甲醛,均为实验室自配。
2方法
2.1C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞组织块培养法
将C57BL/6小鼠以雌雄1∶1配对( 均两月龄) , 每天7: 00检栓,检到栓时记为孕0. 5 d( E 0. 5) ; 取E12. 5胎鼠,脱颈椎处死,加75% 乙醇浸泡5 min; 于超净工作台中行剖宫产取胎鼠,1 × PBS充分清洗去血,在体视显微镜下去其头部、四肢、尾巴以及内脏, 取背部皮肤于50 m L离心管中 ( 盛有30 m L 1 × PBS) ,用磷酸盐缓冲液中反复清洗,重复2次; 将冲洗去血的皮肤倒入细胞培养皿,剪成1 mm2大小的组织块,均匀铺于培养皿中,用含10% 胎牛血清、1% 双抗的DMEM高糖培养基( 即DMEM完全培养基) 培养,以刚好浸过组织块表面为宜( 易于组织块贴壁) ,24 h后加入足量的培养基于37 ℃、5% CO2连续培养96 h( 72 h换液1次) ; 待细胞爬出长满全皿后, 以0. 25% 胰蛋白酶 - EDTA消化2 ~ 3 min; 加入等体积DMEM完全培养基终止消化,经200目筛网过滤, 1 200 r / min离心6 min; 培养基重悬后进行细胞计数,以一定比例细胞数量接种,此后每2 ~ 3 d传代1次。
2.2小鼠胚胎MEF细胞的传代、冻存与复苏
2. 2. 1传代当P1代MEF细胞生长至80% ~ 90% 汇合时进行传代,吸去培养皿中的培养基,用1 × PBS冲洗2次,加入预热的0. 25% 胰蛋白酶 - EDTA至覆盖皿底细胞,放入培养箱中消化2 min左右; 至大部分细胞缩短变圆,立刻加入等体积的DMEM完全培养基终止消化,用枪头轻轻反复吹打形成细胞悬液, 移入离心管中,1 200 r/min离心6 min; 弃上清液后加入1 × PBS重悬,再次离心后弃上清液,以DMEM完全培养基重悬,按1∶2 ~ 1∶3浓度传代,此后根据细胞生长情况,每2 ~ 3 d传代1次。
2. 2. 2冻存将处于对数生长期、80% ~ 90% 汇合的MEF细胞进行冻存,消化方法同上,离心后弃上清液,加入1 × PBS清洗1次,离心,弃上清液,而后用含10% DMSO 、20% 胎牛血清的DMEM完全培养基重悬,以适当细胞密度分装于冻存管中,放入梯度程序降温,置于 - 80 ℃ 冰箱,此后可转入液氮中长期冻存,备用。
2. 2. 3复苏取出冻存细胞后,应迅速置于37 ℃ 水中,并不停搅动,直至溶解。加入等体积DMEM完全培养基后,1 200 r/min离心6 min; 弃上清液后加入适量1 × PBS重悬,再次离心,以DEME完全培养液重悬,进行细胞计数,以合适的细胞浓度接种,于37 ℃ 、5% CO2培养箱培养。
2.3目的细胞波形蛋白、角蛋白的免疫荧光鉴定
吸去培养基,用1 × PBS轻洗( 5 min × 3次) ; 吸尽1 × PBS,加入预冷4% 多聚甲醛固定20 min; 加入1 × PBS轻洗( 5 min × 3次) ; 吸尽1 × PBS,加免疫荧光封闭液,室温封闭1 h; 吸尽封闭液,孵育一抗( Vimentin、Keratin用0. 01 mol / L PBS分别稀释100倍与200倍) ,4 ℃ 过夜; 弃去一抗,1 × PBS轻洗( 5 min × 3次) ; 吸尽PBS,加孵育二抗( 用0. 01 mol / L PBS稀释200倍) ,37 ℃ 孵育1 h; 吸尽二抗,用1 × PBS轻洗5min; 吸尽PBS,染核,Hoechst孵育5 min ( 用0. 01 mol / L PBS稀释5 000倍) ; 加入1 × PBS轻洗 ( 5 min × 4次) ; 吸尽1 × PBS,加荧光封片剂,荧光显微镜下观察拍照并保存。
2.4目的细胞波形蛋白表达水平的Western-blot检测
按相关试剂盒要求分别提取目的细胞、NIH3T3和角质形成性细胞蛋白; 用碧云天BCA蛋白定量试剂盒测定提取总蛋白含量,调整蛋白上样量; SDS-PAGE电泳,初始电压80 V,待样品跑至分离胶处调整电压至100 V,目的蛋白条带处跑开即可停止电泳; 以300 m A恒压转膜1. 5 h; 加5% 脱脂奶粉室温封闭2 h; 孵育一抗( 1∶10 000) ,4 ℃ 过夜; 用PBST洗膜( 5 min × 3次) ; 孵育Odyssey扫膜二抗( 1∶5 000) ; 用PBST洗膜( 10 min × 4次) ; 于Odyssey扫膜仪分析成像,以GAPDH作为内参,对目的蛋白的表达进行统计分析。
2.5数据的统计学分析
Western - blot检测结果 经灰度值 转换后,用SPSS 18. 0软件进行统计,生成柱状统计图。试验数据用± sd表示,样本均数比较采用配对t检验,以P < 0. 05为差异有统计学意义。
3结果
3.1C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞组织块培养结果
组织块培养24小时即可见成纤维细胞从组织块中向四周爬出,此时爬出的细胞多呈不规则多角形 ( 见233页彩图1A、E) ; 培养48小时可见组织块变薄、透亮,有更多的成纤维细胞从组织块爬出,远离组织块处可见典型梭状成纤维细胞游离生长( 见233页彩图1B、F) ; 组织块培养至72小时需换液1次,此时大量的成纤维细胞从组织块中爬出,围绕组织块向四周呈辐射状长出,几乎占满视野( 见233页彩图1C、G) ; 培养至96小时,成纤维细胞爬出长满全皿, 组织块中细胞几乎全部爬出,可见少许组织块残留, 而此时远离组织块中心处多为梭状成纤维细胞,组织块中心成纤维细胞多呈不规则多角形( 见233页彩图1D、H) 。
组织块培养96 h后可见成纤维细胞长满全皿, 弃去培养基,以0. 25% 胰蛋白酶 - EDTA消化2 ~ 3 min; 加入等体积DMEM完全培养基终止消化,经200目筛网过滤、1 200 r / min离心6 min; 培养基重悬后细胞计数,以一定比例细胞数量接种,即为P1代MEF细胞。P1代细胞呈典型梭状,细胞长势较好,活力旺盛( 见233页彩图2) ,符合成纤维细胞形态学特征。
3.2C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞Vimentin与Keratin蛋白免疫荧光鉴定结果
角质形成性细胞和成纤维细胞是皮肤的主要组成成分,而通过组织块培养法分离MEF细胞很容易出现角质细胞“污染”,其中Keratin和Vimentin分别是角质形成性细胞与MEF细胞的特征蛋白; 因此,通过免疫荧光鉴定波形蛋白及角蛋白的表达情况来鉴定所分离细胞及其纯度,结果表明: 通过C57BL/6小鼠胚胎皮肤组织块培养分离目的细胞100% 表达成纤维细胞特征蛋白Vimentin,呈绿色荧光,Hoechst染核呈蓝色,细胞呈典型梭状,符合成纤维细胞特征 ( 见233页彩图3A、B、C) ; 与此同时,试验所分离培养的目的细胞Keratin表达阳性率为0,只能被Hoechst染色,呈深蓝色( 见233页图3D、E、F) ; 而作为对照培养的角质形成性细胞Keratin表达阳性率则为100% ,呈绿色荧光,细胞形态扁团,呈“铺路石”状 ( 见233页彩图G、H、I) 。以上结果说明组织块培养法所分离培养的目的细胞纯度极高,全部为成纤维细胞,没有角质形成细胞“污染”。
3.3C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞Vimentin蛋白Western-blot检测结果
Vimentin是MEF细胞的特征蛋白,而NIH3T3是小鼠胚胎成纤维细胞系,试验以NIH3T3作为阳性对照,角质形成性细胞作为阴性对照,采用Western-blot检测波形蛋白在各细胞中的表达水平,以此鉴定所分离培养的细胞,结果见图4、图5。
1. MEF 细胞; 2. NIH3T3 细胞; 3. 角质形成性细胞。
细胞免疫荧光是一种高灵敏性检测目的蛋白表达、分布的技术方法,一般用于初步、广泛的定性研究; 而Western - blot则是一种蛋白表达相对定量手段。因此,本试验在利用免疫荧光检测的基础上,以Western - blot检测Vimentin蛋白在各细胞中表达水平。由图4、图5可知,与阴性对照组角质形成性细胞相比,MEF细胞与阳性对照组小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3细胞Vimentin蛋白均处于高表达水平, 而角质形成性细胞Vimentin蛋白表达水平较低,差异极显著( P < 0. 001) ,有统计学意义。综合细胞形态学特征、免疫荧光、Western - blot检测结果,可判定以E12. 5胎鼠皮肤经组织块培养所分离培养的细胞为成纤维细胞,且具有极高的细胞纯度。
1. MEF细胞; 2. NIH3T3细胞; 3. 角质形成性细胞。 注: 与阴性对照组角质形成性细胞相比,***表示差异极显著( P < 0. 001) 。
4讨论
MEF细胞具有广泛的生物学应用,既是ES细胞理想的天然饲养层细胞,又是良好的核移植供体细胞,同时还是肿瘤体外模拟微环境建立以及组织工程皮肤构建所必需的试验材料和种子细胞; 因此,分离培养高纯度、高活力的MEF细胞是相关后续试验顺利开展的前提和保证。目前,实验室取材是获得成纤维细胞的主要途径。MEF细胞具有取材容易、成本较低等独特的优势,是开展相关科学实验的理想生物材料。
然而,通过不同的取材方法所获得的成纤维细胞的纯度及活力差别较大。纯度高、活力好的成纤维细胞是保证相关后续试验结果准确、灵敏、可重复的关键。目前,小鼠成纤维细胞的取材方法主要有组织块培养法与消化法两种[12,13]。与胰酶直接消化皮肤获得成纤维细胞相比,组织块培养法要求将皮肤剪成较小组织碎块后直接铺板培养,待细胞爬出长满全皿后,胰酶短暂消化经筛网过滤获得成纤维细胞。而胰酶直接消化法是在将皮肤剪碎的基础上加胰酶消化至单细胞悬液,该方法消化时间很难掌握。消化时间过短,则不能消化完全,无法获得足量细胞; 而消化时间过长则严重损伤细胞,影响细胞活力。因此,相比之下,组织块培养法更易掌握,效果较好。此外,与从新生小鼠皮肤分离成纤维细胞相比,从E12. 5胎鼠皮肤分离的成纤维细胞纯度更好,细胞活力更强。胡素贤等[14]报道了新生小鼠皮肤成纤维细胞分离方法,能够获得一定纯度的Balb /c小鼠MEF细胞。然而,小鼠胚胎从发育至出生过程中,由原始的单层细胞逐渐分化,逐步形成具有完整结构的皮肤; 因此,新生小鼠的皮肤结构与细胞组成更加复杂,以此取材所获得的成纤维细胞活力相对较弱,也更容易混有角质细胞等其他类型的细胞。值得注意的是,并不是胚胎期越小的胎鼠越符合MEF的分离培养要求,E11. 5之前的胚胎发育尚未成型,无法准确分离胎鼠皮肤; 而E12. 5的胚胎发育形成较为完整的胎鼠,能够明显地分清其头部、尾巴、四肢以及较为简单的内脏,此时取材能够获得纯度较高、活力旺盛的成纤维细胞。
本研究采用C57BL/6小鼠E12. 5胎鼠作为取材对象,以组织块培养法建立了一种经济实用、稳定可靠以及能够获得高活力、高纯度C57BL/6小鼠MEF细胞的分离培养体系,为相关后续试验的顺利开展提供优质、充足的试验材料奠定了基础。
A�E.组织块培养24 h光镜观察结果�A 100 x , E 200 x ) ;B,F. 组织块培养48 h光镜观察结果(B 100x,F 200 x)� C,G.组织72 h光镜观察结果(C 100 x,G 200 x );I),H.为组织块72 h光镜观察结果�D 100 x ,H 200 x )0
A. 40 x ; B. 100 x ;C.200 x。
Vimen!in 染 MF1F 细胞;B�E�H. Hoechst 染核;丨).Keratin 染 MEF 细胞;G. Keratin 染;C�F�I.分别为A和B�D和E�G和hi的合成图像。
摘要：为了建立一种易于操作,能够获得高纯度、高活力C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养体系,并对分离提取的细胞进行纯化鉴定,试验在无菌环境下取E12.5胎鼠皮肤,剪碎至1 mm2大小,均匀铺于皿中,用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基连续培养4 d,以胰蛋白酶消化-再贴壁法分离纯化目的细胞,分别以NIH3T3、角质形成性细胞作为阳性与阴性对照,采用免疫荧光、Western-blot检测Vimentin及Keratin的表达情况,以鉴定所分离的细胞及其纯度。结果表明:组织块培养24 h即可见成纤维样细胞爬出,培养96 h细胞生长爬满全皿,经胰酶消化、筛网过滤再贴壁接种后能够获得形态均一、活力旺盛、具有成纤维细胞形态学特征的目的细胞;所分离细胞Vimentin表达阳性率为100%,而Keratin表达阳性率为0;与阴性对照角质形成性细胞相比,C57BL/6分离成纤维细胞和NIH3T3细胞均高表达Vimentin,且差异极显著,有统计学意义。说明以E12.5胎鼠皮肤为材料建立成纤维细胞分离培养体系,所分离培养的成纤维细胞具有更高的细胞活力和细胞纯度。