药物分离与纯化

药物分离与纯化（通用9篇）

药物分离与纯化 篇1

摘要：任课教师根据药物分离与纯化技术课程的地位和特点, 深入企业调研与行业专家共同开发课程, 将教学内容设计为四个学习情境、五个项目任务、十一个知识模块、二十二个子模块、六个案例分析。教学中采用项目教学法为主, 案例教学法、讲授法、任务驱动教学法、讨论法等为辅的多种教学方法, 充分调动学生的自主学习的积极性, 提高了学生的团队合作意识, 取得良好的教学效果。

关键词：药物分离与纯化,项目教学法,课程改革

药物的分离与纯化是化学合成法生产药物、从天然药物提取药物、微生物法生产药物等多种方法获得药物收率、纯度及进一步测定其结构、研究其药理作用和毒性的首要条件, 也是对药物进行化学结构改造、化学合成、研究化学结构与疗效关系的前提[1], 其分离与纯化技术的效率、安全性、环保、节能等又直接影响到药品生产的经济成本和企业的可持续发展, 是制药的关键环节之一, 因此该课程是化学制药专业学习领域的核心技能课程之一, 在我院化学制药专业人才培养方案中课时为60课时, 主要内容为药物分离与纯化技术的基本概念、原理、设备的操作及维护等知识和技能。

1 改革依据

2006年至2012年, 我国医药行业工业总产值的年复合增长率达到24.01%, “十二五”期间我国政府医药卫生体制改革投入力度和强度要高于2009年至2011年的改革投入, 随着人民健康意识的增强, 国内药品的需求量持续上升, 经济合作与发展组织预测到2020年我国药品市场规模将会达到全球第二, 仅次于美国[2]。未来的制药企业将需要大批的高素质、高技能型药品生产技术的专门人才。为适应社会对制药专业人才的需求, 高职院校在不断地进行专业教学改革、课程改革。对往届毕业生跟踪调查表明制药专业的学生多在中药企业、化学制药企业、生物制药企业就业。目前国内高职院校开设的药物分离与纯化课程多偏向于生物分离与纯化技术、天然药物化学的分离, 课程内容不能拓展学生多方面的就业能力。基于此, 笔者与教学团队对江、浙、沪的制药企业的药物分离与纯化岗位调查, 其调查结果图1是改革教学内容的重要依据。

2 合理选取教学内容, 建设动态化教学资源

课题组成员与企业一线工程技术人员一起以职业岗位所需素养、知识和技能为出发点, 将传统课程的教学内容进行整合, 编制了与制药企业职业岗位对接的“情境”、“知识模块”、“项目任务”、“案例分析”的理实一体化教材, 将教学内容设计成四个学习情境、五个项目任务、十一个知识模块、二十二个子模块、六个案例分析。为突出对高职学生的职业岗位技能的培养, 提高学生的就业竞争力, 根据药物分离、纯化岗位的要求, 体现教学内容与企业实际需求的对接, 知识模块及子模块遵循“知识够用, 强化技能”的原则, 重点学习典型仪器和设备的操作、维护、工艺参数的影响、常见问题的分析、判断和排除, 例如“色谱技术”模块重点介绍工业用制备色谱、“干燥技术”模块重点介绍冷冻干燥机等。药物分离与纯化技术是微生物学、化学工程学、药物化学、物理化学等多学科交叉渗透[3]的前沿性边缘学科与综合技术, 技术发展迅速、知识更新快, 一本教材难以涵盖所有的知识, 为适应教师教学与学生自主学习的需要, 教学团队利用信息化技术建设多形式、动态、共享的药物分离与纯化技术精品资源共享课程, 其内容主要一、药物分离与纯化的前沿技术和国内外学者研究的热点问题;二、新型药物分离与纯化设备;三、药品标准及其变化;四、药物制剂工、高级药物制剂工、药物检验工等职业考核信息、资格考试题库等。教学资源形式有名师讲课视频、授课教师课件、学术报告讲座、期刊文献、硕博论文、科技作品等。通过增加补充性、更新性和延伸性教辅资料, 使课程资源更加完善, 完成专业课程内容与职业标准对接, 学历证书与职业资格证书对接。 (表1)

3 采用多种教学方法强化学生技能、提高教学效果

药物分离与纯化技术课程还涉及大量的实验技能和操作, 传统的教学方法是把该课程分为理论课和实践课两个独立的教学环节, 容易造成理论和实践的脱节, 学生知识的连贯性和教学效果不佳。在课程改革后, 配备“双师”教师, 使用工业化生产设备、小型实验仪器和设备、精品资源共享课程等教学资源, 实施“计划、任务、方案、实施、检查、评估”的工作过程的项目教学法为主, 以案例教学法、讲授法、任务驱动教学法[4]、参观教学法、讨论法等为辅的多种教学方法。以“槐米中芸香苷的提取、分离与鉴定”为例, 具体实施步骤见表2, 在项目实施过程中将学生分组, 每组2~3人[5], 将项目任务书下发给学生团队, 学生在规定的时间内制定方案、完成项目、教师点评、学生互评、学生实际操作及技能提高, 完成整个项目任务 (表2) 。

以工作过程为导向, 工作任务为驱动力, 进行教学的项目教学法, 实行课堂翻转和角色转变, 改变了以往教师讲实验内容, 然后学生动手操作的被动学习过程, 体现了“教师为主导, 学生为主体”的教学原则, 完成教学过程与生产过程对接的教学过程, 充分发挥学生在学习过程中的主观能动性。

4 改革成效

药物分离与纯化技术课程经过三年的建设与改革, 取得了令人满意的成绩, 教学效果显著提高, 受到学生们的普遍欢迎, 校内督导、学生、同行、领导对本课题组成员主讲教师的教学综合评价得分均在良好以上。我院化学制药专业的毕业生受到扬农股份、扬农集团、扬州联博药业、南京红太阳等制药公司工作企业领导的好评、用人单位的高度认可。

参考文献

[1]陈秦娥, 梁金龙.中药制剂分离与纯化技术创新进展[J].过滤与分离, 2012 (2) :1-8.

[2]中国国内医药行业发展状况分析.中商情报网 (http://www.askci.com/) .

[3]刘爱玲, 粟挺.生物分离工程的课程教学改革与体会[J].现代农业科技, 2010 (17) :29-30.

[4]郭双华.任务驱动教学法在精细化工专业实践教学中的应用[J].广东化工, 2012, 39 (228) :241-243.

[5]郭双华, 秦建华.试析工作过程系统化课程体系中的项目开发, 2009 (10) 129-130.

药物分离与纯化 篇2

采用水提醇沉法提取虎舌红多糖,经DEAE-C32柱层析分离,Sephadex G-200进一步纯化,得到AⅠ和AⅡ二种虎舌红多糖,Sephadex G-200凝胶过滤法表明,AⅠ组分为均一组分,其相对分子质量为2.76×104,借助气相色谱技术,研究了粗多糖和AⅠ组分的.单糖组成.

作 者：凌育赵 曾满枝 LING Yu-zhao ZENG Man-zhi 作者单位：凌育赵,LING Yu-zhao(仲恺农业技术学院化学化工系,广州,510225)

曾满枝,ZENG Man-zhi(华南农业大学理学院应用化学系,广州,510642)

成人胰岛细胞的分离纯化与应用 篇3

1 材料与方法

1.1 胰腺来源

2006年3月～2007年5月，30例胰腺均取自自愿捐献者，年龄20～55岁，冷缺血时间2～19 h，腹部多器官原位灌注联合切取，置于预充氧气的全氟化碳(PFC)和威斯康星大学器官保存液(UW液)双层冷藏保存(图1)，立即送往实验室。

1.2 主要试剂及仪器

LiberaseHI酶(罗氏公司);RPMI1640、HEPES、CMRL1066等(美国MediaTech公司)，并以RP-MI1640为基础配制稀释液和洗液;密度梯度液Ficoll1.100,1.077(美国Biochrom公司)。COBE2991细胞纯化仪及相应的配件(美国GAMBROBCT公司)，消化罐(Ricordi chamber)(美国迈阿密大学)，低温水平离心机(美国Beckman公司)，二氧化碳培养箱，水浴箱，超净台以及手术器械若干套等。

1.3 胰岛细胞的分离纯化

胰岛细胞分离纯化参照美国迈阿密大学RI-CORDI自动分离纯化技术[3]做部分改良。超净台内，冰浴上进行修剪，去除外周脂肪组织、血管和附带的十二指肠、脾脏等，修剪干净的胰腺经聚维酮碘液、抗生素液消毒清洗处理，横断胰头，经胰导管插入18G留置针，将配制好的消化酶灌注入胰腺，使胰腺充分膨胀。将胰腺切成7～9段置入消化罐(Ricordi chamber)，迅速升温到37℃，机械震摇，并取样观察，当出现游离的大胰岛细胞团时，迅速用稀释液冷却稀释，终止消化，收集细胞悬液，280×g离心力、4℃离心1 min，用洗液洗涤细胞2、3次，加UW液制成细胞悬液。新型COBE2991细胞纯化仪中装载1.100、1.077Ficoll液建立连续密度梯度，泵入细胞悬液进行离心纯化，收集纯化的胰岛细胞，离心洗涤去掉Ficoll液，定容。

1.4 胰岛细胞计数

纯化后定容的胰岛细胞悬液混匀取0.1 m L经双硫腙(DTZ)染色后计数。以50μm为直径的数量级，计数100～450μm各数量级胰岛细胞数，以直径150μm为基准系数1，计算胰岛当量(islet equivalent,IEQ)。IEQ=∑(各直径范围胰岛细胞数×相应的系数)×稀释倍数。

1.4.1 胰岛细胞活性的鉴定

另取0.1 m L胰岛细胞悬液，采用吖啶橙(acridin orange,AO)与碘丙啶(propidium iodide,PI)荧光染色，荧光显微镜下计数红绿染色的细胞数，计算细胞的活性。

1.4.2 胰岛细胞功能鉴定

采用胰岛刺激释放指数试验，分别取0.1 m L胰岛细胞悬液在1640无糖培养基中于37℃、二氧化碳浓度5%环境下孵育24 h，分别加入含有2.8 mmol/L葡萄糖的培养基和含有20 mmol/L葡萄糖的培养基2 m L进行培养各2 h，收集上清液，检测胰岛素含量。并计算胰岛素释放指数，即以胰岛细胞在含有20 mmol/L葡萄糖的培养基中分泌的胰岛素量除以在含2.8 mmol/L葡萄糖中的胰岛素分泌量。

1.4.3 安全性检查

移植输注前需要进行细菌学、内毒素等安全性检查。

1.4.4 胰岛细胞培养

根据计算的胰岛细胞IEQ数，按20 000 IEQ/瓶在175 cm2悬浮细胞培养瓶中于37℃、二氧化碳浓度5%环境下培养。做临床移植的通常在培养24 h内输注。超过24 h要将胰岛细胞移至22℃、二氧化碳浓度5%环境下培养。

1.4.5 输注移植和疗效判定

1型糖尿病患者，签署知情同意书，根据输血血型配对原则，按每千克体重8 000～10 000 IEQ，经门静脉肝内输注。疗效判定以国际上认可的胰岛素减量1/3以上为治疗有效[4,5]。

1.4.6 统计学分析

应用EXCEL 2003进行数据录入与整理，然后用SAS 8.1进行统计学处理，结果以(x±s)表示，两组间采用t检验，P<0.05视为差异有显著性。

2 结果

2.1 胰腺分离结果

本组共分离30个成人胰腺供体胰腺重量62.4～133.7 g，平均(95.1±17.9)g;收集的胰岛细胞经DTZ染色后在镜下观察，典型胰岛染成猩红色的圆形或椭圆形细胞团，包膜完整，轮廓清晰，大小不一，外分泌腺细胞则不着色(图2、3)。纯化后的胰岛数量为(69 269～799 733)IEQ，均(316 626±191972)IEQ，平均每克胰腺收获胰岛细胞3389IEQ，收获的胰岛纯度为64.50%～95.00%，均为(74.70±7.84)%。

a:染成猩红色的为胰岛细胞团;b:不染色为腺泡细胞,DTZ染色×40

a:染成猩红色的为胰岛细胞团;b:不染色为腺泡细胞DTZ染色×100

呈绿色荧光的为活的胰岛细胞,显示获得的胰岛细胞活性>95%

2.2 胰岛活性染色结果

经AO-PI染色在荧光显微镜下用490 nm激发光滤光片，510 nm光栅滤光片观察，见活的胰岛呈绿色荧光(图4)，凋亡的胰岛呈红色荧光(图5)。经AO-PI染色后检测胰岛的活度为90.00%～98.00%，平均为(94.10±2.19)%。

胰岛中间染成红色的为凋亡的胰岛AO/PI染色100×AO/PI染色×40

2.3 胰岛细胞功能测定结果

胰岛素释放实验结果显示胰岛细胞在20mmol/L高糖刺激下释放胰岛素平均为(427±74)IU/L，低糖刺激释放胰岛素平均为(117±19)IU/L，显示收获的胰岛细胞良好的分泌功能。

2.4 临床移植

分离的胰岛细胞进行了细菌学等生物安全性的检查，符合人体安全和病人自愿签署知情同意书的前提下，进行了7人12次临床移植输注，其中6例患者全部撤掉胰岛素注射，1例患者胰岛素减量达2/3，取得了较好的治疗效果[6]。

3 讨论

成人胰岛细胞分离纯化是一个复杂的、技术性强的过程。国内外许多实验室都在研究如何提高其分离的得率，但多数都不能达到临床移植要求的数量和纯度。国外也仅有少数实验室完全掌握了此项技术，达到临床移植的要求[2]。本实验室在RICORDI自动胰岛分离纯化技术的基础上，成功建立了改良的胰岛细胞分离纯化技术，成功获得了数量较多的高质量的胰岛细胞，平均每克胰腺收获胰岛细胞3389IEQ，较RICORDI报道的2279IEQ明显增加[3]，收获的胰岛细胞平均纯度为74.70%，满足临床移植的要求。

影响胰岛分离结果的因素很多，包括供者的年龄，冷缺血时间，胰腺的大小及重量，胰腺本身是否有病变以及胰腺切取的完整性，胰腺的保存和消化时间的掌握等[7,8,9]。本研究采用双层保护法运送胰腺：即下层的PFC和上层的UW液，再加入适量的胰蛋白酶抑制剂，并充氧半小时。实验证实分离效果明显优于单纯用UW液冷保存方式，更优于国内的HC-A液保存法[10]。国外学者的研究也证明这一点，通过双层法保存的胰腺分离结果较单纯用UW液保存的分离成功率高[11,12,13]。

胰岛细胞分离纯化技术的关键点在于消化。消化酶的选择非常重要，国内很多研究者选用胶原酶P、V等，所分离得到的胰岛数量和纯度有限，不能满足临床移植的要求。本组采用的是Liberase HI，它是一种新型的高度纯化混合酶，是由高纯度胶原酶Ⅰ、Ⅱ和中性蛋白酶混合而成，具有更高的稳定性和低毒性，在用于胰岛的分离中被证实能增加胰岛细胞的量及活性，是目前最适宜用于临床的胰岛分离酶。Liberase HI不但可以提高每克胰腺组织分离后的胰岛细胞获得率，增加胰岛的数量，而且可以保持胰岛作为一个胰腺内分泌单位的完整性，减少对胰岛细胞的破坏[14]。

胰腺消化后可能有很多组织碎片，如果直接进行移植，大量失去活性的组织碎片在门静脉内短时间内难以清除，甚至造成栓塞，所以胰岛的纯化是必要的，不仅是为了提高移植物效能，同时也是为了将混在其中的外分泌部成分分离出去，降低移植物的免疫原性[15]。本实验室采用COBE2991细胞淘洗仪和密度为1.077和1.100的Ficoll液组成的连续梯度密度离心法纯化胰岛细胞，可以获得高纯度的胰岛，最高可达98.00%，明显高于国内用手工不连续梯度密度离心法所得。

药物分离与纯化 篇4

酸性α-淀粉酶的分离纯化与酶学性质研究

纯化了枯草芽胞杆菌xm-1菌株酸性α-淀粉酶,并对其酶学性质进行了研究.通过硫酸铵沉淀和Sephadex G-75凝胶层析将酸性α-淀粉酶粗酶液纯化了32.5倍,活力回收率为10.0%.酶性质测定结果表明,该酸性α-淀粉酶分子量约为60 kD,最适反应温度为45℃、最适作用pH5 0,该酶在pH3 4-6 0下稳定,高温耐受性差.Cu~(2+)、Zn~(2+)、EDTA对酶有不同程度的抑制作用,Ca~(2+)和Mn~(2+)对酶具有较强的激活作用.

作 者：胡元森 潘涛 李翠香 Hu Yuansen Pan Tao Li Cuixiang 作者单位：河南工业大学生物工程学院,河南工业大学粮油重点实验室与工程中心,郑州,450052刊 名：生物技术通报 PKU英文刊名：BIOTECHNOLOGY BULLETIN年，卷(期)：“”(3)分类号：Q5关键词：酸性α-淀粉酶 蛋白纯化 酶学性质 Acid-stable α-amylase Protein purification Enzymatic properties

药物分离与纯化 篇5

目前,关于小鼠、大鼠和羊等［3 － 6］AEC Ⅱ的分离和原代培养的研究已有报道,但是在研究中发现,AECⅡ存在原代消化分离率低、因杂细胞多而纯化困难和在体外培养过程中易分化等问题而极大地限制了对AECⅡ的研究。并且极少有关于豚鼠AECⅡ的分离培养的研究报道; 而有研究表明,豚鼠的生理生化机制、病原入侵后的应答、炎性反应及病变过程与人类更为相似。因此,在研究人类相关的呼吸性疾病、肺脏相关疾病及免疫应答反应时利用豚鼠作为供体分离出的AECⅡ,将其作为试验模型更接近人类的反应机制［7 － 9］。因此,以豚鼠为研究对象,采用多酶联合全肺灌注法分离AECⅡ,使用免疫黏附法进行纯化,并通过ROCK抑制剂法进行AECⅡ传代培养来建立豚鼠AECⅡ的分离、纯化和传代培养技术,为进一步以豚鼠AECⅡ为模型来研究肺脏抗病原微生物入侵和肺脏损伤等奠定理论基础。

1 材料

1. 1 试验动物及细胞

Hartley豚鼠,由国家啮齿类实验动物种子中心( 广东省医学动物实验中心) 提供; 3T3 - J2( 小鼠胎儿成纤维细胞系) ,由中国科学院上海细胞所提供。

1. 2 主要试剂

豚鼠Ig G( 参照参考文献[10 - 11]制备) 、碱性磷酸盐缓冲液( PBS缓冲液) 、红细胞裂解液、丝裂霉素C、DNaseⅠ、Y - 27632,DAB免疫组化试剂盒等,由Sigma - Aldrich公司生产; DMEM、F12 培养液,由Gibco公司生产; 胎牛血清,由Hyclone公司生产;SP - C抗体,由Millipore公司生产; HEPES、弹性蛋白酶、链酶蛋白酶、Ⅳ型胶原蛋白酶、胰蛋白酶、两性霉素B、氯霉素等,均由北京全式金生物技术有限公司生产。

1. 3 消化液

DMEM / F12 + Na HCO3+ 25 mmol / L HEPES +4 U / m L弹性蛋白酶1 mg / m L + 0. 1% 链霉蛋白酶+0. 125% 胰蛋白酶+ IV型胶原酶1 g / L + 100 μg / m LDnaseⅠ( p H值为7. 4) 。

1. 4 ROCK培养液( 100 m L)

ROCK培养液( 100 m L) : DMEM 74. 6 m L + F1225 m L + 氢化可的松/ EGF混合液0. 10 m L + 胰岛素0. 10 m L + 两性霉素B 0. 10 m L + 10 mg / m L庆大霉素0. 10 m L + 霍乱毒素1. 72 μL + Y - 27632( Rho激酶抑制剂) 100 μL。

1. 5 器皿( 无菌)

离心管、烧杯、三角瓶、滤纱( 200 目) 、玻璃漏斗、解剖器械、培养皿、注射器、针头、导管,均由宁夏大学西部生物资源保护与利用教育部重点实验室提供。

1. 6 主要仪器设备

培养箱( 型号为380) ,由Thermo公司生产; 倒置显微镜( 型号为IX71) ,由Olympus公司生产。

2 方法

2. 1 豚鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离

2. 1. 1 豚鼠Ig G的制备豚鼠Ig G溶液( 用PBS缓冲液溶解,p H值为9. 3) 按0. 15 ~ 0. 20 mg /cm2覆盖培养皿底部,37 ℃ 孵育3 ~ 4 h,吸出豚鼠Ig G溶液,10 m L PBS缓冲液缓慢冲洗培养皿2 次。

2. 1. 2 豚鼠AEC Ⅱ的分离脱颈法处死豚鼠,剪开皮肤,打开胸腔,剥离心脏血管组织,取出完整肺脏置于37 ℃的PBS缓冲液中清洗3 次; 以PBS缓冲液灌洗肺脏,待肺脏充盈时缓慢吸出灌洗液,重复3 ~5 次,目的是去除肺脏巨噬细胞; 向肺脏中缓慢灌注消化液至肺脏充盈,37 ℃水浴消化40 ~ 50 min; 然后去除气管、支气管,剪碎肺脏,目的是获得最大体积的消化液; 添加含10% FBS的DMEM培养液10 m L,终止消化; 肺脏组织消化液经过200 目滤纱后获得细胞悬液,1 000 r/min离心5 min,弃上清液,沉淀用红细胞裂解液裂解1 min; 1 000 r/min离心5 min,弃上清液,DMEM重悬细胞后,于37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养1 ~ 2 h,去除易于贴壁的成纤维细胞,重复2 次; 取上清液,1 000 r / min离心5 min,用含10%FBS的DMEM培养基重悬细胞。

2. 2 豚鼠AEC Ⅱ的纯化与培养

2. 2. 1 免疫吸附法纯化细胞将细胞悬液接种到豚鼠Ig G包被的培养皿中培养40 min,培养条件为37 ℃ 、5% CO2,饱和湿度,重复2 次,使没有冲洗干净的巨噬细胞通过黏附去除。 吸取细胞悬液,800 r / min离心5 min,弃上清液,沉淀用含10% FBS的DMEM培养基重悬,以1 × 106/ m L的细胞密度接种于直径为100 mm的培养皿中,37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养,24 h后换液,此后每2 ~ 3 d换液1 次,在倒置显微镜下观察并照相、记录。

2. 2. 2 ROCK抑制剂技术培养细胞消化P1 代细胞,用F培养基重悬,接种于用10 μg /m L的丝裂霉素C处理的3T3 - J2 细胞上,ROCK培养液,37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养。

2. 3 免疫细胞化学鉴定

将载玻片置于6 孔培养板内,10% 的多聚赖氨酸浸泡2 h后,晾干载玻片。消化细胞,以1 × 103/ m L接种于盖玻片,37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养48 h。取出盖玻片,4% 多聚甲醛固定1 h,封闭,加入SP - C一抗( 稀释浓度1∶100) ,按DAB免疫组化试剂盒说明书进行染色,苏木精复染,在倒置显微镜下观察SP - C阳性细胞即AEC Ⅱ。

3 结果与分析

3. 1 细胞的纯化与培养

经豚鼠肺脏灌注消化所获得的细胞悬液通过红细胞裂解液处理后主要存在2 种细胞,直径较大的细胞是巨噬细胞( MC) ,较小的是AECⅡ( 见294 页彩图1A) 。细胞悬液接种在豚鼠Ig G包被的培养皿中可使巨噬细胞较快地黏附于培养皿而AECⅡ游离于细胞悬液中。将纯化后的AECⅡ接种于新的培养皿中培养,培养2 ~ 3 d后可见细胞呈多角形岛状生长( 见294 页彩图1B) 。接种在以3T3 - J2 细胞为饲养层并添加ROCK培养液进行培养,培养第24 小时和第9 天时用倒置显微镜观察,可见细胞呈岛状生长,与作为饲养层的3T3 细胞有明显的形态差异( 见294页彩图1C、图1D) 。

3. 2 免疫细胞化学鉴定

将培养至第3 代时的AECⅡ用特异性标记物SP - C和苏木素染色,细胞浆被染为棕红色的为阳性细胞,即AECⅡ( 见294 页彩图2A) ,苏木素复染时细胞核被染为蓝色( 见294 页彩图2B) ; 而阴性对照组中SP - C染色结果显示细胞浆无着色,即阴性( 见294 页彩图2C) ,苏木素复染后细胞核呈现蓝紫色( 见294 页彩图2D) 。从试验结果可以看出,分离纯化的AECⅡ在传至第3 代时仍保持AECⅡ的性状特性; E为空白对照,即一抗用PBS代替的AECⅡ。

4 讨论

豚鼠作为科学研究的动物模型已有一百多年的历史［1］,近年来研究表明,豚鼠肺脏的生理结构、发育和肺脏疾病发生机制等方面与人类存在较多的相似,如豚鼠对结核分枝杆菌易感,且感染后产生与人类相似的进行性肺结核病变,这使得豚鼠成为抗结核病药物和疫苗筛选与致病机理研究的理想动物模型之一［7］,在人类肺脏疾病相关领域的研究中具有重要的潜在应用价值。另外,肺脏作为先天免疫与获得性免疫的桥梁,在机体抵御外源微生物入侵中发挥着重要的物理屏障和免疫调节作用,而肺脏上皮细胞是继肺泡巨噬细胞之外的一类重要免疫调控细胞［12］。肺脏上皮细胞位于机体与外界环境直接接触的表面,是抵御病原菌入侵的重要防线［13］。肺泡上皮细胞由AECⅠ和AECⅡ组成,AEC Ⅰ主要维持肺泡结构,受到损伤后可由AECⅡ增殖和分化为AECⅠ来修复。AECⅡ具有增殖潜能［14］,并能分泌肺脏表面活性物质,降低肺泡表面张力、防止肺泡萎陷,还参与维持正常肺水转运、机体的氧化代谢及免疫调节,同时还是某些激素的靶细胞［15］。因此,以AECⅡ为模型研究肺脏相关疾病具有一定的理论价值。这就使得以豚鼠为模型,分离AECⅡ来研究肺脏疾病发生与恢复中的免疫调控机制具有重要意义。

而肺脏AECⅡ的分离目前主要有二种方法,即经气管全肺灌注消化法和肺组织块消化法,试验中采用前一种方法。全肺灌注消化使酶溶液可充分接触肺泡组织,提高消化效率并减少细胞损伤。通常消化细胞所用的胰蛋白酶可以分解细胞间连接从而分散细胞,但对细胞的损伤较大,试验选用了弹性蛋白酶、链蛋白酶和胶原蛋白酶。弹性蛋白酶消化结缔组织中的弹性蛋白,并且对细胞的形态、生物学功能等几乎无损伤; 链蛋白酶能够溶解纤维蛋白、黏蛋白等; 胶原蛋白酶仅对细胞基质起消化作用,对细胞本身无影响。在消化过程中,由于酶对细胞的损伤,释放出的DNA与细胞外基质形成复合物能网罗聚集细胞,因此添加Dnase防止细胞聚集。试验中使用这几种酶的组合可在降低酶溶液对细胞损伤的同时缩短消化时间,提高消化分离的效率。

虽然在消化前用PBS缓冲液灌洗了肺脏,但试验中发现消化获得的原代细胞仍然含有大量的肺泡巨噬细胞,这就需要再对分离的AECⅡ进行纯化。常用于AECⅡ的纯化方法有贴壁选择法、差速离心法、密度梯度离心法和流式细胞仪分选法等,但这些方法大多操作复杂、特异性较低、对细胞损伤较大或需要昂贵的仪器。近年研究发现,细胞免疫黏附法是一种较好的AECⅡ纯化方法［16 － 17］。免疫黏附的纯化机制是依据不同细胞膜表面含有不同的免疫活性物质从而对细胞进行纯化。在消化得到的细胞混合液中,巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞等细胞表面有Ig G的Fc受体能与Ig G结合,可快速黏附于包被有Ig G的培养皿底部,而AECⅡ无此受体,不能与之结合,悬浮于溶液中,从而收集悬浮细胞达到提纯的目的［18］。试验用豚鼠Ig G是参考血清中Ig G提取方法分离豚鼠血清获得［10 － 11］。免疫黏附法获得的AECⅡ纯度高且相对简便易行［17］。

许多研究表明［19 － 21］,AECⅡ在体外培养时容易分化,而最新的研究表明［22］,ROCK抑制剂培养法,即以纤维母细胞( 3T3 - J2) 作为饲养层,添加Rho激酶抑制剂( Y - 27632) 的培养环境能够诱导许多组织的上皮细胞在体外无限增殖,而不需要通过其他方法( 如转导外源原癌基因) 就可以保持细胞的增殖活力,且不改变细胞的生物学特性。Rho激酶( Rho as-sociated kinase,ROCK) 是参与细胞有丝分裂黏附和移动、细胞骨架调整、肌肉细胞收缩、肿瘤细胞浸润等一系列细胞生命活动的重要酶［23］。Y - 27632 是最早发现的ROCK抑制剂,可以抑制细胞分化等过程,纤维母细胞可以为上皮细胞提供生长所必须的细胞因子,两者联合使用可以为上皮细胞的体外培养提供与体内相似的环境。因此,可以采用ROCK培养法培养纯化后的AECⅡ细胞。

综上所述,试验建立了豚鼠AECⅡ的分离、纯化及ROCK抑制剂培养法的培养体系,为进一步研究AECⅡ在肺脏功能和疾病发生中的免疫调控机制奠定了基础。

摘要：为了建立豚鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)分离、纯化和ROCK抑制剂培养的方法,进一步以AECⅡ为模型研究其在抗结核分枝杆菌中的免疫调控作用奠定基础,试验利用混合酶溶液全肺灌注法消化、分离含有豚鼠AECⅡ的混合细胞,经过红细胞裂解液处理与免疫黏附法纯化获得AECⅡ。以3T3细胞为饲养层,并添加Rho激酶抑制剂的方法进行AECⅡ的传代培养。结果表明:混合酶溶液灌注消化法能充分消化肺脏上皮细胞,通过Ig G免疫黏附能有效去除巨噬细胞而纯化AECⅡ,并且在3T3细胞饲养层与ROCK抑制剂培养条件下促进了AECⅡ的体外增殖而抑制其分化。

药物分离与纯化 篇6

刺参(Apostichopus japonicus)属于棘皮动物门海参纲(Holothuroidea)木盾手目(Aspidochirota)刺参科(Stichopodidae)仿刺参属(Apostichopus),为温带种。刺参无适应性免疫,依靠体壁、体腔细胞和体液中的免疫因子来抵御外来侵犯。凝集素作为一种它的免疫因子,在体内起着重要的作用[3]。

我国从20世纪80年代开始进行刺参养殖以来相继出现一系列病害问题。其中"烂皮病"因其高传染性、高死亡率而成为刺参养殖病害研究的重点[4]。作者采用了实验室已成功分离的2株"烂皮病"致病菌对健康刺参进行致病感染,分离纯化其体内凝集素,并进行凝集活性检测和性质研究,与健康个体的凝集素的性质相比较,以期探索刺参免疫机制并为其药用价值提供科学的依据和参考。迄今为止,有关患病刺参凝集素的研究鲜见报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

实验用健康刺参购于青岛某刺参养殖厂;实验兔购于青岛大学医学院实验动物中心。

1.1.2 试剂

DEAE-Sepharose FF、Sephadex G-100等购自Pharmacia LKB Biotechnology。牛甲状腺球蛋白、鼠李糖、蔗糖均为分析纯,Sigma公司;其它为国产分析纯或生化试剂。

1.1.3 仪器

ALPHAPHOT-2型光学显微镜:Nikon;血球计数板:江苏丹阳市光学仪器厂;立式压力蒸汽灭菌锅YXQ-LS-50SⅡ:上海博迅实业有限公司医疗设备厂;台式离心机TGL-16G:上海安亭科学仪器厂;高速冷冻离心机GL-20G-Ⅱ:上海安亭科学仪器厂;HZQ-X100振荡培养箱:哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;DS-1型高速组织捣碎机:上海标本模型厂;YC-1型层析实验冷柜:北京博医康实验仪器有限公司;SBS-100型数字记滴自动部分收集器、HD-1型核酸蛋白检测仪、TH-300梯度混合器:上海沪西分析仪器厂;DHL-B型电脑定时恒流泵:上海康华仪器制造厂;Amicon Ultra-4离心超滤管:Millipore;DYCZ-26电泳槽:北京六一仪器厂;TS-1型脱色摇床:江苏海门市麒麟医用仪器厂;96孔V形底板:杭州维特洁生化技术有限公司。

1.1.4 培养基

2216E培养基(1L):酵母膏1.0g;蛋白胨5.0g;磷酸高铁0.1g;琼脂20.532g;陈海水1000mL;pH 7.6。

1.2 方法

1.2.1 致病菌感染刺参个体

制备菌悬液:将Tenacibaculum属的一种菌(代号C6) 和Vibrionales属的一种菌(代号TB)分别划平板,28℃下培养48h,用过滤灭菌海水冲洗菌落制成菌悬液,每株菌菌液为3ml。分别取1ml,梯度稀释后用血球计数板计数。

准备感染场所:将4 000ml塑料盆用酒精消毒并用过滤灭菌海水冲洗3遍。向每个盆中分别注入2 000ml过滤灭菌海水,用充气阀通气。

刺参的前处理:将购回的刺参先在实验室环境中用过滤灭菌海水驯养3d,去除死亡或孱弱个体。挑选大小相近、健康的个体,用灭菌海水冲洗2次。然后用经火焰加热过的手术刀片在刺参背部和腹部分别划2道长度0.5cm的划痕,放于盆中饲养。每个盆中5～6头。

加入菌悬液:分别向盆中注入不同菌株的菌液,最终浓度均为108CFU/ml。空白对照组中加入与最大菌悬液注入量同剂量的过滤灭菌海水。

得到患病个体:每天观察各个盆中刺参的状况,记录并拍照。

1.2.2 刺参凝集素(AJL)的分离纯化

1.2.2.1 AJL粗提液的制备:

将患病个体捞出洗净,在冰块上解剖,用高速组织捣碎机捣碎,加2倍重量的0.15mol/L NaCl的PBS缓冲液[0.015mol/L Na2HPO4-NaH2PO4, (1:20), pH 7.2],4℃、16h,离心(4℃、4 500r/min、60min),取上清,即为粗提液。

1.2.2.2 硫酸铵分级:

冰水浴下,向粗提液中加入研磨好的的固体硫酸铵至20%饱和度,4℃过夜,离心(4℃、4 500r/min、60min),弃沉淀取上清液。向上清液中加硫酸铵至75%饱和度,搅拌过夜(4℃),离心(条件同上),弃上清,收集沉淀于适量蒸馏水中溶解,用浓缩离心管脱盐至无SO42-(10%的BaCl2检验)。

1.2.2.3 DEAE-离子交换层析:

将上步所得的浓缩液上DEAE-纤维素柱(2.0cm×16cm),0～1 mol/L NaCl连续盐度梯度洗脱,缓冲液为0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液,流速为30ml/h,3ml/tube,自动收集器收集,考马斯亮蓝法TU-1800型分光光度计测A595,洗脱至A595<0.01。检测每管的凝集活性,收集合并活力峰。

1.2.2.4 Sephadex G-100分子筛凝胶层析:

层析柱为2.0cm×75cm,洗脱液为生理盐水,流速20ml/h,3ml/tube,样品为经过浓缩并脱盐的离子交换层析得到的活力峰。检测每管的凝集活性,A595测定蛋白含量。

1.2.3 刺参凝集素性质

1.2.3.1 蛋白含量的测定:

以A595表示,以牛血清清蛋白作对照。

1.2.3.2 亚基分子量的测定:

采用SDS-PAGE方法,从标准蛋白质和刺参凝集素的迁移率来求得相对分子量[5]。

1.2.3.3 血凝活性的测定:

制备2%的红细胞悬液[6]。在96孔V型板上,40μL凝集素溶液与等量生理盐水系列倍比稀释,加入红细胞悬液40μL,振匀,室温下静置1.5～2h,肉眼观察。无凝集现象时红细胞沉积在V型孔底部呈一小圆点,有凝集现象时血球不下沉相互集聚成一片网络。血凝活性以产生凝集现象时的最小凝集素的量或凝集素最大稀释倍数表示[7]。比较3组凝集素(健康组、C6组和TB组)的活性。

1.2.3.4 热稳定性试验:

健康组、C6组、TB组凝集素浓度分别为24.2g/L、23.5g/L、24.0 g/L,将3组凝集素分成若干份,每份0.5ml,分别在25～90℃的不同条件下温育,于10min、30min不同时间取样,冷却后测定血凝活性[6]。比较3组凝集素的热稳定性。

1.2.3.5 pH对血凝活性的影响:

参照李丹彤[6]方法配制pH 4.0～10.14的系列缓冲液。健康组、C6组、TB组凝集素浓度分别为24.2g/L、23.5g/L、24.0g/L。pH 4.0～6.0采用0.015mol/L的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液;pH 6.50～7.50采用0.015mol/L的磷酸盐缓冲液;pH 8.0～9.0采用0.015mol/L的Tris-HCl缓冲液;pH 9.5～10.14采用0.015mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液。比较3组凝集素在不同pH条件下的血凝活性。

1.2.3.6 EDTA及二价金属离子对血凝活性的影响:

40μL EDTA、CaCl2、MgCl2溶液分别用生理盐水倍比稀释,加入40μL能凝集兔红细胞的最小浓度2倍的凝集素(健康组、C6组、TB组浓度分别为3.03mol/L、2.94mol/L、3.0mol/L),室温下静置15min,再加入40μL兔红细胞悬液,振匀,静置1.5～2h,比较3组凝集素的活性。

1.2.3.7 糖抑制实验:

糖或糖蛋白溶液40μL用生理盐水倍比稀释,加入40μL能凝集兔红细胞的最小浓度2倍的凝集素(健康组、C6组、TB组浓度分别为3.03g/L、2.94g/L、3.0g/L),室温下静置15min,再加入40μL兔红细胞悬液振匀,静置1.5～2h,比较3组凝集素的凝集结果。

2 结果

2.1 致病菌感染刺参个体

C6组、TB组刺参均在6～11d内出现预期病症,如体刺回收、腹部体色变浅,口部肿大,触手不能闭合,活动能力变差;接着口部、体表、体刺处出现大面积蓝白色溃烂斑。

2.2 刺参凝集素的分离纯化

组织捣碎后用PBS浸泡,离心得墨绿色粗提液;20%～75%硫酸铵分级沉淀得到黄绿色硫酸铵分级液;经DEAE-离子交换层析,初步得到活性物质,收集合并活力峰,浓缩脱盐;经Sephadex G-100分子筛凝胶层析,得到进一步纯化的活性物质,收集合并活力峰,浓缩脱盐,冷冻干燥的白色样品。纯化结果有关数据见表1、图1-6。

2.3 亚基分子量

在SDS-PAGE上显示一条带,与标准蛋白质比较,可计算出刺参凝集素亚基分子量为31 000Da(图7)。

1.标准蛋白; 2.健康组凝集素; 3.C6组凝集素; 4.TB组凝集素。

2.4 3组凝集素的血凝活性

健康组、C6组、TB组凝集素浓度分别为1.39g/L、1.34g/L、1.40g/L,用兔红细胞悬液进行血凝活性试验(表2)。

结果表明C6组刺参不仅凝集素含量高,而且活性较健康组和TB组强。

2.5 热稳定性

健康组、C6组、TB组凝集素浓度分别为1.39g/L、1.34g/L、1.40g/L,结果图7表明:在90℃、30min热处理后,均对兔红细胞显示出凝集活性,但活性下降50%。在25～70℃温育30min,活性均未见改变(表3)。

2.6 pH对3组凝集素血凝活性的影响

健康组、C6组、TB组凝集素浓度分别为1.39g/L、1.34g/L、1.40g/L,结果表明:当4.0≤pH≤7.5时,活性均无变化;当pH≥8.0时,活性均下降了50%(表4)。

2.7 EDTA及金属离子对3组凝集素血凝活性的抑制作用

健康组、C6组、TB组凝集素浓度分别为0.18g/L、0.17g/L、0.18g/L,结果表明3组凝集素对兔红细胞的凝集活性保持不变,未出现凝集抑制现象。

2.8 糖抑制试验

健康组、C6组、TB组凝集素浓度分别为0.18g/L、0.17g/L、0.18g/L,兔红细胞进行检测,结果表明3组凝集素不被所测试的单糖、二糖、三糖、聚糖所抑制,仅被牛甲状腺球蛋白抑制,最小抑制浓度分别为1.55mg/ml、1.45mg/ml、1.55mg/ml(表5)。

注:-表示无抑制作用。

3 讨论

用20%～75%饱和度的硫酸铵分级沉淀3组粗提液,得到的分级液纯化倍数均为粗提液的3倍,总活力回收率均超过95%,与李丹彤的结果一致[6]。分析其原因可能是粗提液中含有抑制剂,像多聚糖,它可以抑制凝集素的活性或阻碍凝集素与血红细胞的结合,抢占红细胞膜上凝集素的结合位点等[8,9]。因硫酸铵分级沉淀纯化倍数不高,所以有研究认为动物凝集素的纯化可不经硫酸铵分级沉淀[10],直接采用离子层析和分子筛凝胶过滤等方法。

用DEAE-Sepharose F.F.和Sephadex G-100凝胶层析进行纯化后,所得蛋白收获率(平均值为0.39%)及活性收获率(平均值为7.7%)都较小,一次处理样品量小。活力峰均在蛋白峰之前,说明凝集素在刺参体内蛋白质中属于离子强度偏小、分子量偏小的生物大分子。

凝集素亚基分子量测定用SDS-PAGE方法,测得结果为31 000Da,根据李丹彤结果[6],推断刺参凝集素含有两个相同亚基单位。

从血凝活性的结果看,表明C6组刺参不仅凝集素含量高,而且活性较健康组和TB组强。

3组凝集素在25～70℃活力保持不变,在80～90℃温育30min后均保留50%的血凝活性,表现出强的热稳定性。

当4.0≤pH≤7.5时,3组凝集素活性均无变化,当pH≥8.0时,活性均下降了50%,具有广泛的pH作用范围。

EDTA及二价金属离子Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+对3组刺参凝集素的血凝活性均无影响。因此可推断刺参凝集素在进行凝集活动时,不需要二价离子的参与[6]。

糖抑制实验表明,3组凝集素均不被所测试的糖类所抑制,而仅被牛甲状腺球蛋白抑制,其中C6组凝集素活性更易受到牛甲状腺球蛋白的影响,与李丹彤的结果一致[6]。

推断菌株C6(Tenacibaculum属的一种菌)可诱导刺参体内产生大量的凝集素,但产生的大量凝集素更易受到牛甲状腺球蛋白的抑制,此结论有待进一步证实。

摘要：目的:研究刺参免疫机制,探寻其发病机理。方法:刺参(Apostichopus japonicus)经磷酸盐缓冲溶液抽提、2075%硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose F.F.和Sephadex G-100柱层析,得到刺参凝集素(AJL)。结果:经SDS-PAGE显示单一条带,亚基相对其分子量为31000。分别提取感染Tenacibaculum属和Vibrionales属两种刺参烂皮病病原菌的刺参凝集素,感染Tenacibaculum属病菌刺参的凝集素产量较大,但凝集兔红细胞的作用均不被所测试的单糖和寡糖所抑制,而仅被牛甲状腺球蛋白所抑制。凝集兔红细胞的作用均不被二价金属离子Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+及EDTA所抑制。在pH4.010.14系列缓冲液中均有活性,其中在pH4.07.5时活性最大。该凝集活性在90℃加热30min后凝集活性仅损失50%。结论:推断菌株Tenacibaculum可诱导刺参体内产生大量的凝集素。

关键词：刺参,病原菌,凝集素,纯化,性质

参考文献

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[9]王长法,张士璀,王昌留.水生无脊椎动物凝集素研究概述[J].海洋科学,2005,29(4):63-67.

药物分离与纯化 篇7

作为为数不多的能够实现规模化量产的纳米材料——纳米金刚石近年来引起了人们广泛的关注和研究热情[1]。这种材料兼具金刚石和纳米材料的所有性能特征,同时具有超强的化学稳定性和生物相容性,使其在高强、耐磨纳米复合材料、高精密研磨抛光、纳米流体、纳米润滑、生物成像、生物制药等领域具有无以替代的应用前景[2]。纳米金刚石是在冰或惰性气体介质保护下,通过炸药爆轰时所产生的瞬时高温(2000～3000K)和高压(20～30 GPa)作用,使炸药分子中不能完全被氧化的游离碳原子经过重新排列、聚集和晶化后形成的。爆轰产物中SP3金刚石相的含量从15%到75%不等,其余则由大量SP2石墨碳、无定形碳及少量由爆炸辅材和容器壁产生的各种金属及其氧化物杂质组成[3]。由于大量石墨碳的存在,所以爆轰产物表观上是黑色粉末,俗称爆轰灰(denomination soot)。

如何对爆轰灰进行高效纯化,去除其中大量的非金刚石碳(25%～85%)、少量的金属及其氧化物和无机物杂质(1%～8%),得到高纯度的纳米金刚石是其应用的重要前提。分离和提纯工艺的优劣直接影响最终产品的纯度和品质,也会对纳米金刚石的生产成本造成重要影响,继而对其应用推广造成重要影响[3]。目前纳米金刚石的纯化方法按照所用氧化介质的不同主要可分为液相氧化法和气相氧化法两类。非金刚石碳的去除主要是利用其与金刚石碳化学稳定性的不同,在特定的氧化条件下将SP2碳进行选择性氧化分解,金属及无机物杂质可能包裹于纳米金刚石聚集体中,也可能吸附在金刚石聚集体或是非金刚石碳的表面,一般通过酸洗的方法去除,但强酸溶解只能去除表面吸附的杂质,要想彻底清除需要将团聚体打散将杂质彻底暴露才能实现[3]。因此要得到高纯度的纳米金刚石并非易事。近年来,国内外科研工作者围绕纳米金刚石的高效分离和纯化开展了卓有成效的研究工作,取得了一些重要的研究成果。本文旨在对当前纳米金刚石分离和纯化技术的研究现状进行评述,分析各种方法的优缺点,并对未来工艺的发展方向进行展望,从而为相关领域科研人员探索适合纳米金刚石在不同领域应用的高效、低毒、低成本提纯工艺提供一些理论参考。

2 液相纯化方法

液相氧化因其可以同时实现金属杂质的溶解和非金刚石碳的氧化分解,是工业上应用最为广泛的化学纯化方法。文献报道的液相氧化方法常用的强氧化物主要有高氯酸、硝酸、浓硫酸+硝酸、浓硫酸+高锰酸钾、浓硫酸+铬酸酐或重铬酸盐、硝酸+过氧化氢等。Gubarevich等人[4]用铬酸酐或重铬酸盐+浓硫酸作为强氧化剂,使用普通的玻璃装置,在120℃～150℃、常压条件下对纳米金刚石进行氧化纯化,这种方法反应温度较低,反应时间也较短,对非金刚石碳的氧化分解效果非常显著,产物中非金刚石碳含量小于0.2%。然而反应废水中大量铬离子对环境会造成严重污染,需要进行特殊的处理,而且其反应温度的控制较严格,如果温度控制不适当,容易有不溶性的铬盐生成,给纳米金刚石造成二次污染,用这种方法得到的最终产物中无机物杂质含量常常高达1%～3%。同时由于铬酸酐及其盐的爆炸危险性,所以在工业上很难推广应用。与铬酸及其盐作为氧化剂相比,高氯酸是相对比较温和的一种强氧化剂,文献报道[5]在较低的温度和常压条件下用50%～75%的高氯酸水溶液在常规的玻璃装置中可以实现纳米金刚石的高效纯化,纯化后的产品中非金刚石碳含量为0.5%～1%,无机杂质含量为0.5%～1%,这种方法可以在较低的温度(80℃～100℃)和氧化剂用量条件下获得较好的纯化效果,同时也不会因为氧化剂的残留引入大量的无机污染物。然而HC104提纯时高腐蚀性的废酸以及产生的大量有毒气体Cl2对环境的污染较大,需要进行特殊的处理,另外HCl04由于氧化性很强,在氧化非金刚石相的同时也将部分金刚石氧化,使得纳米金刚石的收取率降低,而且HC104酸性强,酸洗时需要大量的去离子水,沉降时间也较长[6],这就为工业应用带来了影响。

在爆轰灰纯化研究中,浓硝酸+浓硫酸因其原料易得、工艺操作简单是最早被广泛工业应用的液相氧化体系。由于浓硝酸是相对较弱的氧化剂,所以使用这种氧化体系,一般需要在高于200℃的温度下才能得到较好的氧化效果。在如此高的温度下,高挥发性的硝酸会分解出NO、NO2等大量的污染气体,因此工业化应用中必须要对这些有害气体进行回收处理,而后处理的工艺复杂程度和需要付出的成本要远高于纯化本身。为了降低硝酸分解造成的危害,Sushchev等人[7]采用50%～67%的硝酸水溶液,在8～10MPa的高压密闭的钛合金容器中对纳米金刚石进行纯化处理,这种方法得到的产物,非金刚石碳含量极低,同时由于硝酸与金属杂质形成可溶性的盐而不会造成硝酸的分解和无机物在产物中的残留。这种方法对环境污染较小,自动化程度较高,已经在工业化生产中得到了成功的应用[8]。尽管如此,8～10MPa的高压条件所带来的对设备强度和密封性能的要求都使得这种纯化工艺可操作难度大,需要复杂的耐高压和抗腐蚀性的设备,投资较大,成本偏高。也有人尝试用过氧化氢+少量硝酸做氧化剂,在150℃～260℃,3～10MPa高压条件下进行纯化,也取得了较好的效果,但是这种方法与硝酸高压反应相比,复杂程度更高,而且还有一定的危险[9]。

酸性高锰酸钾具有较强的氧化能力,也可用来作为液相氧化的氧化剂。陈鹏万等人[6]对浓硫酸+高锰酸钾、浓硫酸+重铬酸钾及高氯酸这三种氧化体系进行了比较研究。结果表明,浓硫酸+高锰酸钾与另外两种氧化剂相比,提纯时反应温度低、反应平稳,操作安全,同时浓硫酸用量少也不挥发,所以没有有毒气体产生,对环境的污染较小。纯化后的产物中非金刚石碳含量很低。浓硫酸也可将其中的金属杂质溶解而除去。然而这种方法也会像铬酸酐及其盐一样,会因为锰盐及其氧化物的生成,对纳米金刚石造成较大程度的二次污染。

液相氧化的方法可以在非金刚石碳氧化去除的同时,溶解其中的金属及其氧化物以及部分可溶的无机物杂质,因此在工业上较多采用。然而液相氧化因氧化物的分解、二次污染和强腐蚀性,会带来操作安全和环境污染的重大隐患,同时复杂的后处理工序和氧化剂的大量使用会增大纯化成本。对于液相纯化如何选择氧化剂是个重要的难题,能够挥发、分解的液相氧化剂不会在产品中残留,纯化后产物的纳米金刚石含量较高,但是会造成环境污染,需要复杂的气体回收装置来满足环保要求,不能挥发和分解的一些氧化剂氧化效率较高,不会生成有害气体,但是反应废水中会有大量重金属离子残留,同时会生成一些不溶的无机盐对纳米金刚石造成二次污染。因此单纯的液相氧化提纯方法并非理想之选,探索更加绿色、高效、低成本的纯化方法一直是学术和工业界追求的目标。

3 气相纯化方法

为了避免液相氧化方法所带来的各种缺点和不足,人们尝试用气相热空气和臭氧作为氧化剂来纯化纳米金刚石[10],空气是最简单、常用的气相氧化剂,利用非金刚石碳更容易与氧气发生氧化反应生成CO2的特征,控制一定的反应温度可以实现纳米金刚石的纯化。这种方法的主要优点是操作简单方便、零污染和低成本,然而要实现非金刚石碳的选择性氧化却并不简单,不同的原料来源导致的成分组成差异会影响氧化条件的选择。当氧化温度超过400℃时,不可避免地会引起金刚石碳的部分氧化,从而造成纳米金刚石收取率的下降。为此研究人员在气相氧化体系加入适当的催化剂,如镁、铁、硼酐或乙酰乙酮铬等[11],通过控制催化剂的用量可以显著降低非金刚石碳氧化所需要的温度,从而实现选择性氧化的目的。催化剂的加入降低了氧化温度,使非金刚石碳的选择性氧化成为可能,然而却无法去除其中的非燃烧型无机杂质,同时还会因催化剂的加入增加最终产品中无机污染物的含量。因此空气或其他形式的气相氧化方法,都需要通过进一步的处理来除去其中的无机杂质。为了避免催化剂的使用带来的二次污染,Pichot等人[12]尝试用一种无催化剂的高温空气氧化方法来纯化纳米金刚石,他们首先用HNO3–HF混合酸对爆轰灰进行纯化预处理,可以降低其中的无机杂质含量至1%以下,然后在420℃的空气中氧化100 h以上,用Raman和XRD对产物进行表征,结果表明产物中SP2碳低于0.2%,而且纯化后的纳米金刚石可以在水溶液中较好地分散,形成长时间稳定的胶体溶液。Shenderova等人[13]也发现经过热空气氧化处理的纳米金刚石与液相氧化相比在水溶液中能够更好地分散。

臭氧作为一种常用的氧化剂也被用来进行纳米金刚石的气相氧化纯化[14],这种氧化方法最大的优点就是其对非金刚石碳的选择性氧化。氧化所需的臭氧可以通过电晕放电的方式生成,通过控制氧化条件如温度、气流量等可以实现纳米金刚石的高效纯化,而且一旦条件确定,对于任何组成的原料都适用。这种方法是目前所知纯化方法中纯化效果最好的方法。研究人员通过对臭氧氧化的纳米金刚石表面化学组成进行了详细的研究,发现与其他的氧化方法相比,臭氧氧化不仅可以高效去除SP2碳,同时可以赋予纳米金刚石表面丰富的含氧基团,这就为纳米金刚石的表面再修饰提供了可能[15,16,17]。然而复杂的工艺条件、昂贵的反应设备和高的能耗等导致的操作难度和高成本却限制了这种纯化方法的工业化应用。尽管如此,这种方法所得到的高纯度和纳米金刚石表面的化学修饰,是其他方法所无法比拟的。

近年来两阶段气相石墨化氧化的纯化方法得到了广泛的关注和应用[12],Xu等人[18]利用这种方法首先在氮气等惰性气体中1000℃的高温下使非金刚石碳在金刚石表面石墨化,接着在450℃进行空气氧化以除去石墨化碳。纯化产物经FTIR、TGA、XRD和Raman光谱表征,SP2碳几乎被完全除去[12,14]。这种纯化方法不仅能够有效地氧化除去SP2非金刚石碳,更重要的是通过石墨化氧化过程可以有效打破纳米金刚石的团聚体,得到较小颗粒的分散,这对于纳米金刚石综合性能的发挥是非常重要的。

由上可知,气相纯化的氧化剂主要有空气和臭氧两种形式,空气氧化简单、高效、环保和低成本,是非常值得提倡的一种纯化方法,然而如何实现非金刚石碳的选择性氧化是个难题,氧化温度低非金刚石碳无法高效去除,温度过高会引起金刚石碳的氧化。加入金属催化剂可以降低非金刚石碳的氧化分解温度,增大选择性,却会引入大量的无机杂质。另外空气氧化不能消除原料中的无机不燃物,这就造成了纯化后的产品中大量的无机物残留。臭氧气相氧化是目前公认的非常高效的一种纯化方法,这种方法不仅能够高效去除非金刚石碳,同时在纳米金刚石表面会引入丰富的含氧官能团,为纳米金刚石表面再修饰提供了可能。然而臭氧反应装置相对复杂,价格昂贵,这就造成了纯化成本的上升,限制了其在工业上的推广应用。先高温石墨化再空气氧化的两步气相纯化法是近年来广为推崇的一种方法,这种方法不仅能够高效去除非金刚石碳,而且纯化的同时可以有效减小纳米金刚石的团聚尺寸,得到小颗粒的纳米金刚石,这就为纳米金刚石的后续应用提供了方便。

4 结语及展望

综上所述,分离和纯化作为纳米金刚石整个生产过程中最重要的一个工艺环节,直接影响最终产品的纯度、表面化学组成和生产成本,并对最终应用效果和应用领域的拓展造成重要影响。探索简单、高效、环境友好、低成本和能够赋予纳米金刚石表面特定化学组成的纯化方法,是纳米金刚石在各种潜在应用领域得到真正推广应用的重要前提。液相和气相氧化作为两类主要的纯化方法,各有优缺点,任何一种方法单独使用都不能达到最佳的效果,唯有两种方法有机结合在一起,探索最优的工艺条件,方能取得最佳的纯化效果。

根据目前的研究进展,个人认为未来纳米金刚石的分离和纯化研究可以围绕以下几个方面的问题展开,一是非金刚石碳的去除。爆轰灰中大量的成分是非金刚石碳,如果采用液相氧化的方法去除,会消耗大量的氧化剂,一方面会造成环境的污染,另一方面会引入二次污染。因此空气气相氧化是去除非金刚石碳的最佳选择,研究的重点和难点是如何控制氧化参数,实现非金刚石碳选择性氧化,而最大程度保留金刚石碳不受影响。二是金属和无机杂质的去除。爆轰灰中的少量金属及其氧化物和一些无机杂质不能通过气相氧化的方法去除,但可以通过酸洗的方法去除,酸的种类和浓度选择是影响纯化效果的重要因素,微量难以通过酸溶的无机杂质是需要重点关注的问题,这会影响纳米金刚石在生物成像、药物传递等对纯度要求极高的高端领域的应用。三是纳米金刚石表面化学组成均一化和可控设计问题。这是关系纳米金刚石能否成功应用的一个重要问题,因为纳米金刚石表面化学组成会影响其在不同介质中的分散和加工性能。气相氧化特别是臭氧氧化可以赋予纳米金刚石表面丰富的含氧基团,使其在水相中可以较好地分散,为纳米金刚石的后续修饰提供了可能性。但是这种表面化学组成是杂乱无章且不可控的,如何实现纳米金刚石表面化学组成均一化且可以控制不同化学组成是需要深入研究的一个重要课题。

相信在研究人员的共同努力下,随着研究的深入,在不远的将来,一种高效、绿色、低成本的纳米金刚石纯化方法一定可以实现,到那时纳米金刚石这种性能优异的新材料定会在不同的应用领域中大放异彩。

摘要：纳米金刚石因其优异的性能在众多领域具有诱人的应用前景,通过高效分离和纯化获得高纯度纳米金刚石是其应用得以实现的重要前提,分离和纯化技术的优劣直接关系产品的纯度和成本,并对最终应用有重要的影响。文章对当前纳米金刚石分离和纯化技术的研究现状进行了较为详尽的评述,分析了各种方法的优缺点,并对未来工艺的发展方向进行了展望。

药物分离与纯化 篇8

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

10只6周龄生殖系统发育健全的雄性昆明小白鼠,西安交通大学医学院实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂

胶原酶Ⅳ、DMEM培养基,Gibco公司生产;胰蛋白酶、Percoll细胞分离液(A.P)、Hepes,Amresco公司生产;胎牛血清,Hyclone公司生产;辅酶Ⅰ,Genview公司生产;四唑氮蓝、脱氢表雄酮、台盼蓝、苏木精,Sigma公司生产。

1.2 方法

1.2.1 小鼠睾丸间质细胞的分离

取10只6周龄生殖系统发育健全的雄性昆明小白鼠,采用颈椎脱臼法处死,在无菌条件下切开阴囊,取出睾丸,去除睾丸被膜和血管,暴露生精小管,用Hank’s液反复冲洗。用吸管轻轻吹打,尽量使间质组织与曲精细管分散,用小剪刀将生精小管剪成1～4 mm3的碎块,加入1 mg/mL胶原酶溶液,于37 ℃、5% CO2条件下孵育10 min,1 000 r/min离心5 min;弃去上清液,加入0.25%胰蛋白酶和1.5 mg/mL的透明质酸酶溶液作用10～15 min;加入适量的胎牛血清终止消化,用孔径为200目的尼龙网过滤悬液,收集滤液,以1 000 r/min离心5 min;弃上清液,将沉淀的细胞用少量Hank’s液吹起摇匀,制成细胞悬液。

1.2.2 小鼠睾丸间质细胞的Percoll分离

用PBS将Percoll配制成45%、50%、 55%、60%、65%、70%的梯度液;将制备好的各级Percoll梯度液按密度从高到低逐层轻轻放置到10 mL离心管中,将细胞悬液置于最上层,每层1 000 μL,于4 ℃、800 g离心40 min会出现多条模糊的带;用吸管将55%～65%之间的细胞带小心转移至事先标记好的10 mL离心管中,用培养液洗涤2次,最后用少量的培养液重悬沉淀制成细胞悬液,分别用台盼蓝和3β-HSD进行染色[2]。

1.2.3 小鼠睾丸间质细胞的培养

将纯化后的细胞用培养液调整浓度至1×105个/mL,加入培养液(DMEM +10%胎牛血清+1%L谷氨酰胺+非必需氨基酸),置于34 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养,每24 h观察细胞生长状况;分别在细胞培养24,48,72小时将爬有间质细胞的盖玻片取出进行H.E.染色;待细胞长至培养皿底层90%左右开始传代,采用柠檬酸钠和KCl的混合盐溶液或胶原酶Ⅳ+0.25%胰蛋白酶进行消化或以物理方法进行细胞的传代处理。

1.2.4 数据处理

采用SPSS11.0软件对所得数据进行处理和分析。

2 结果

2.1 细胞存活率与纯度的测定结果

消化分离出的睾丸间质细胞悬液经0.4%台盼蓝溶液染色后在光镜下观察,死细胞被染成淡蓝色,活细胞拒染,计数200个细胞,统计4次,细胞存活率为(90.72±0.50)%。Percoll梯度液纯化后的间质细胞经3β-HSD染色后计数100个细胞,统计4次,纯度为(86.00±0.82)%。

2.2 细胞的形态学观察结果(见图1,2)

刚分离的睾丸间质细胞为圆形细胞,培养至10小时时细胞的形状即开始发生变化。H.E.染色后可见细胞的胞质轮廊为多角形或不规则形状,被染成红色,有3～4个突起伸出;细胞核呈圆形或卵圆形,被染成蓝色或蓝紫色,位于胞质中央;有1个或2个核仁,位于核的边缘,清晰可见。

2.3 不同处理方法对睾丸间质细胞消化传代的影响(见表1)

由表1可见:以物理方法处理的细胞死亡率低,更容易贴壁,但此种方法费用高;采用柠檬酸钠和KCl的混合盐溶液进行消化的细胞也较容易贴壁,但是细胞的死亡率较高。

注:同行数据肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05),不同表示差异显著(P<0.05)。

3 讨论

3.1 睾丸间质细胞的分离培养

睾丸既是产生精子的器官,又是分泌雄性激素的内分泌器官。目前,对睾丸生殖细胞的分离培养以组织块培养法和胰蛋白酶消化接种法为主,而其他分离方法如曲细精管培养法[8]、钢网过滤筛选法[9]也有报道。一般组织块培养法操作简便,但对杂细胞的污染不容易控制;胰蛋白酶消化法利用酶对组织间质的作用使细胞团分散成单个细胞,使用此法能获得大量的活细胞,能较快地建立细胞系,但胰酶会作用于细胞膜,长时间的胰酶环境会使细胞受到损伤;而对睾丸间质细胞的分离应采取胶原酶、胰蛋白酶联合限时消化,能避免消化时间过长而损伤睾丸间质细胞和避免精原细胞的污染,消化后的混合液再用200目的钢筛过滤,以除去筋膜和大量的成纤维细胞,从而能提高睾丸间质细胞的纯度。

3.2 睾丸间质细胞的Percoll分离及3β-HSD的染色鉴定

Percoll是一种经聚乙烯吡咯烷酮(PVP)处理的硅胶颗粒,无毒,惰性,且与生物膜不发生黏附,利用它分离的细胞能保留完整的生物学活性。刘建中等[3]利用Percoll法对小鼠睾丸间质细胞进行分离并取得较高的纯度,而Yang J M等[10]报道的试验结果却相反。此试验根据睾丸间质细胞处于55%～65%的Percoll层内来获取间质细胞,在此浓度范围内取得的睾丸间质细胞的纯度较高,形态典型,且体外培养细胞的特征与前人报道的一致[11]。3β-HSD是甾体类激素合成的关键酶之一,在睾丸间质细胞中表达,是公认的睾丸间质细胞的鉴定指标。3β-HSD是睾丸间质细胞的重要标志,仅见于睾丸间质细胞光面内质网内,而不存在于睾丸的其他细胞中。在3β-HSD染色液的作用下,细胞质被染成蓝色的即为睾丸间质细胞。试验就是基于这一特征进行了3β-HSD染色鉴定。

3.3 睾丸间质细胞的消化传代方法

试验从6周龄小鼠的睾丸中分离睾丸间质细胞,以胶原酶Ⅳ+0.25%胰蛋白酶消化、物理方法(梯度密度离心法)和柠檬酸钠+KCl消化分离、纯化细胞。采用的培养液是DMEM,传代时以不同的处理方法进行分离细胞。结果发现以物理方法处理的细胞死亡率低、更容易贴壁,而且容易操作,但是这种方法费用高。采用柠檬酸钠和KCl的混合盐溶液进行消化的细胞也较容易贴壁,但这种方法费时,细胞的死亡率较高,可能是盐溶液处理的时间过长所致。用0.25%的胰蛋白酶消化细胞,虽然对细胞有一定的损伤,但是只要控制好时间,适合于进行大量细胞传代培养,因为这种方法省时。不同的消化传代方法各有优缺点,应根据试验方法和具体条件而定。

4 结论

从本试验结果看,采用胶原酶Ⅳ和0.25%胰蛋白酶限时消化和物理方法相结合,不仅使睾丸间质细胞完全分离,提高细胞的收获率,而且减轻了酶对睾丸间质细胞的损伤;同时对分离得到的细胞悬液进行Percoll密度梯度离心,有效地去除了消化的组织碎片和避免了杂细胞的污染,提高了细胞的纯度。但是,使用此种方法是否对睾丸间质细胞的功能造成影响还有待进一步的研究验证。

参考文献

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药物分离与纯化 篇9

1 材料、仪器与试剂

1.1 材料

研究中所用黄芪均为荚膜黄芪, 产地为宁夏回族自治区金山地区。

1.2 仪器

研究中使用的仪器有:红外光谱分析仪PE-580、722型可见分光光度计、30~400 mm砂芯层析仪、索氏提取器、水浴锅、粉碎机FW-100型等。

1.3 试剂

黄芪甲甙标准品购自国家标准物质中心, AB-8树脂购自拿开大学化工厂, 溴化钾 (KBr) 为优级纯试剂, 其余试剂均为国产分析纯试剂。

2 实验

2.1 提取

2.1.1 索氏提取[3]

对黄芪进行粉碎, 完全过30目标准筛后充分混匀。取3 g黄芪粉碎物置于含有50 m L甲醇的索氏提取器中, 过夜。79℃水浴浸提6 h后, 彻底回收甲醇, 少量蒸馏水溶解浸提产物, 转至分液漏斗中采用乙醚进行脱脂, 直至无色, 挥发尽乙醚后, 采用树脂吸附法纯化产物。

2.1.2 回流提取

对黄芪进行粉碎, 完全过30目标准筛后充分混匀。取8 g黄芪粉碎物, 74℃下用甲醇回流提取3次, 3次提取的中的甲醇用量和提取时间分别为:第一次甲醇, 黄芪 (v∶m) =10∶1, 过夜浸泡后回流提取2 h;第二、三次方法相同, 甲醇:黄芪 (v∶m) =8∶1, 回流提取1.5h, 合并第二、三次的提取液, 彻底回收甲醇, 少量蒸馏水溶解浸提产物, 转至分液漏斗中采用乙醚进行脱脂3次, 乙醚用量分别为20、20、10 m L, 挥发尽乙醚后, 分别采用萃取法和树脂吸附法纯化产物。

2.2 纯化

2.2.1 萃取法

用饱和的正丁醇在分液漏斗中萃取提取液, 共3次, 正丁醇用量分别为20、20、15 m L, 合并3次萃取的溶液, 彻底回收正丁醇, 即得黄芪皂甙粗品。

2.2.2 树脂吸附法

将提取液通过树脂柱, 采用蒸馏水冲洗树脂柱, 再采用80%乙醇溶液洗脱, 将乙醇洗脱溶液收集并彻底挥发乙醇, 即得黄芪皂甙粗品。

3 红外光谱分析

采用红外光谱分析仪对得到的粗品进行检测, 具体方法为:用优级纯溴化钾 (KBr) 试剂将提取到的黄芪皂甙粗品和黄芪甲甙标准品分别压制成片状, 用红外光谱分析仪对压片进行分析, 检测粗品中黄芪皂甙的含量。结果显示, 通过树脂吸附获得的黄芪皂甙粗品的红外光谱吸收峰与黄芪甲甙标准品的吸收峰更为接近, 这也说明提取得到的产物是黄芪皂甙, 同时树脂吸附法的提取纯化效果更好。

4 黄芪皂甙分析方法

4.1 制备黄芪甲甙标准曲线

于1/100 000天平上称取黄芪甲甙标准品, 精确到0.005 1 g, 无损失转移至10 m L容量瓶中, 无水乙醇溶解并定容。向带塞的反应管中分别加入0.00、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 m L黄芪甲甙无水乙醇溶液, 补充无水乙醇到0.75 m L, 加入0.75 m L 8%香兰素 (w/v) , 冰浴状态下加入7.50 m L 72% (v/v) 硫酸, 混匀后62℃水浴20min, 冷却并混匀后在分光光度计上进行测定。取不含黄芪甲甙的试管作参比, 在λ=544 nm下测定吸光值, 得浓度与吸光值的回归方程, A=2.1389×C-0.0015, R2=0.9998, 所有测定需在30 min内完成。

4.2 皂甙含量的测定

取黄芪皂甙粗品于250 m L容量瓶中, 无水乙醇溶解并定容, 混匀后吸取0.05 m L于具塞刻度试管中, 加入0.75 m L的8%香兰素 (w/v) , 冰浴状态下加入7.50 m L72% (v/v) 硫酸, 混匀后62℃水浴20 min, 冷却并混匀后在分光光度计上进行测定。取不含黄芪甲甙的试管作参比, 在λ=544nm下测定吸光值, 按照标准曲线回归方程计算黄芪皂甙含量。索氏提取联合树脂吸附法得到的黄芪皂甙的含量为1.25%, 回流法提取联合正丁醇萃取得到的黄芪皂甙的含量为1.46%, 回流法提取联合树脂吸附法得到的黄芪皂甙的含量为1.17%, 三者差异不大。

5 结语

目前, 使用的黄芪皂甙方法有很多, 主要应用的有水浸提取法和醇提取法, 后者较前者更为有效。本研究发现, 索氏提取法和回流提取法2种方法对黄芪皂甙的提取差异不大, 可按需选择。树脂吸附法较萃取法的纯化效果更佳, 另外树脂具有再生能力, 可经适当处理后再次使用。因此, 建议提取黄芪皂甙时可先采用索氏提取法进行粗提取, 再通过树脂吸附纯化, 这样可以得到纯度较高的黄芪皂甙且节约成本。

摘要：通过4步骤实现黄芪中黄芪皂甙的提取分离和纯化, 4步骤分别为索氏醇提、回流醇提、萃取纯化、树脂吸附纯化法对黄芪皂甙进行了提取分离。利用红外光谱分析仪对提取和纯化产物进行检测分析。

关键词：黄芪皂甙,黄芪,提取分离,纯化,工艺研究

参考文献

[1]姚美村, 齐莹, 毕开顺, 等.黄芪药效物质基础研究[J].中国野生植物资源, 2000, 19 (2) :33-36.

[2]阎巧娟, 韩鲁佳, 江正强, 等.黄芪皂甙的提取方法[J].中国农业大学学报, 2000, 5 (6) :61-65.