分离纯化

分离纯化（精选11篇）

分离纯化 篇1

糖尿病在中国发病率逐年增加, 本病可发生多种严重的并发症, 如视网膜病变、神经病变、肾脏病变、各种心血管事件等, 并严重影响患者的寿命[1]。对胰岛素缺乏的1型糖尿病及部分2型糖尿病患者必须使用胰岛素治疗。注射合成胰岛素可以出现低血糖、体重增加、水肿、眼屈光变化、注射部位硬结和脂肪萎缩等不良反应, 严重低血糖反应甚至可以危及生命。对部分合并难治性低血糖患者, 胰腺移植和胰岛移植能完全恢复患者生理功能, 是最理想的选择[2]。胰腺移植相对较成熟, 但存在需处理外分泌并发症的问题。胰岛移植是单纯的移植内分泌细胞, 技术难度较小, 并发症较少。但存在胰岛细胞难于分离纯化, 移植胰岛不能长期存活等问题[3]。我们通过实验探讨可靠的胰岛分离纯化技术, 并对胰岛功能进行鉴定。

资料与方法

30例胰腺取自健康成人尸体供者, 供体年龄20~40岁。两组之间的供体年龄、BMI及冷缺血时间等差异无统计学意义。无糖尿病及相关病史。书面签署器官捐献同意书。术前各项常规检查正常。

消化液和分离液的配制: (1) 胶原酶P消化液2 mg/m L (含BSA 20 mg/m L, STI2 mg/m L) :胶原酶P400 mg, Ca Cl2168.5mg, BSA FractionⅤ4 g, 依次完全溶解180 m L Hanks液中, 定容至190 m L, 加甘油10 m L, 混匀, 调p H至7.8, 0.22μm孔径过滤除菌, 分装至20 m L玻璃瓶中, -20℃冻存。 (2) 释放酶消化液1 mg/m L:释放酶100 mg, 完全溶解90 Ml Hanks液中, 定容至100 m L。调p H至7.8, 0.22μm孔径过滤除菌。 (3) Ficoll分离液配制方法:称取Ficoll 400, 11 g, 23 g, 25 g, 20 g, 分别用HC-A液75 m L完全溶解, 高压蒸汽灭菌, 4℃保存, 定容至100 m L。将密度1.100和1.077的Ficoll液缓慢混合用于用COBE2991连续密度梯度离心法分离胰岛。

实验方法:根据使用胶原酶种类不同, 随机将所获胰腺编入实验分组:A:释放酶组;B:胶原酶P组;并统计记录两组胰腺相关实验资料。供体胰腺到达实验室后, 坚持严格无菌操作, 找到主胰管, 插入自制胰腺插管, 直至胰尾部, 无菌丝线结扎固定, 防止导管脱出和漏液;经注射器注入预温至37℃酶消化液, 注入量 (m L) 约为两倍胰腺重量 (g) ;直至整体胰腺均匀膨胀、质地变硬, 灌注时间10~15 min。消化至消化室底部有较多泥沙样颗粒状物出现。立即加入约4倍体积的4℃Hanks液 (含10%小牛血清) 中止消化, 消化液用500μm不锈钢筛网过滤得到胰岛悬液。

分离后胰岛的纯化:采用Ficoll不连续密度梯度离心法, 弃去上清液, 将消化物充分混匀悬浮于10 m L质量浓度250 g/L (密度1.084 g/m L) 的Ficoll溶液中。在其上依次缓慢加入230 g/L (密度1.077 g/m L) , 110 g/L密度 (1.038 g/m L) 的Ficoll溶液各5m L。4℃, 1 000 r/min, 离心10 min。加入4℃RPMI 1640溶液, 1 000 r/min, 离心即得到纯化后的胰岛。用COBE2991连续密度梯度离心法分离胰岛按COBE2991标准操作流程进行。

胰岛活性、特异性鉴定及纯度估计:胰岛活性用AO/PI荧光染色法鉴定, 胰岛细胞存活率用胰岛活细胞占所有胰岛活细胞和死细胞总数的百分比表示。37℃孵育10 min。

生物学活性测定:用Hanks液分别配制浓度3.3 mmol/L的低糖培养液和16.7 mmol/L的高糖培养液。然后用高糖培养液置换低糖培养液, 分别收集上清液用放射免疫法测定胰岛素含量。

统计学方法:所有数据采用SPSS16.0进行统计分析, 计量资料用 (x±s) 表示, 采用t检验;计数资料采用χ2检验;P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

胰岛的分离与纯化:逆行注射胶原酶充分扩张胰腺后, 胰腺膨胀明显。经过胰管内胶原酶灌注水箱孵育消化后, DTZ染色, 胰岛细胞形态完好呈猩红色, 胰腺外分泌组织基本不着色, 纯化后细胞形态完好, 两组胰岛获得量, 见表1。

应用Ficoll不连续密度梯度离心法和应用COBE2991连续密度梯度离心法获得的胰岛纯度情况, 见表2。

双硫腙染色在40X显微镜下观察的情况: (1) 可见胰岛呈明显的猩红色, 周围有消化后的胰腺其他组织; (2) 经过纯化的胰岛呈猩红色, 纯化后非胰岛组织明显减少。两组胰岛经荧光染色后, 胰岛制备物存活率95%左右。两组之间无统计学差异。对胰岛进行AO/PI染色在10X的荧光显微镜下可见大部分胰岛发出绿色荧光。

纯化后胰岛细胞的功能活性测定:低糖情况下胰岛素分泌量 (2.63±0.67) m IU/L, 高糖情况下 (5.33±1.13) m IU/L, 两者差异有统计学意义 (P<0.05) 。

讨论

在胰岛的分离过程中, 大量的胰蛋白酶原及消化酶原会释放出来。胰蛋白酶原具有自我激活释放出胰蛋白酶的能力, 而胰蛋白酶对胰岛细胞具有强大的破坏作用。我们在制备胶原酶的时候加入了STI, 这是减少消化过程中胰岛组织破坏的重要措施。

在胰岛的分离过程中, 氧自由基的产生明显增加, 而氧自由基的过氧化物可造成细胞膜稳定性降低, 使胰腺细胞溶酶体酶释放、消化酶活化从而破坏胰岛。本实验在胶原酶P溶液中加入了牛血清白蛋白第5组分 (BSA-FractionⅤ) , 这一措施减少了氧自由基的产量, 可削弱对胰岛细胞的损害。这样就使得胰岛的获得量及存活率均较高。通过以上措施胰岛获得量明显提高。也有研究应用全氟己基正辛烷等其他抑制氧自由基反应的物质也被应用于胰岛的分离及纯化。

胰腺消化后往往会形成一种黏稠的胶状物, 其可影响胰岛的收获量。我们在实验中严格控制消化温度 (38.0±1.0) ℃及p H值 (7.8±0.1) , 至消化终点时立即加入大量预冷的Hanks液 (体积比约4:1) 。通过这些方法, 在我们的实验中基本避免了胶冻状物质的形成。

胰岛纯化后的活性与功能的测定可以评价分离的胰岛的功能。本实验中分离纯化后的胰岛经AO/PI染色显示胰岛活率>95%, 提示分离纯化后的胰岛具有良好的功能。经胰管内逆行灌注释放酶消化联合Cobe2991连续密度梯度离心法分离纯化胰岛, 可获得高产量、高纯度及活性良好的胰岛。

摘要：目的:探讨胶原酶P、释放酶分离及不连续密度梯度和连续密度梯度纯化方法对胰岛产量、纯度及活动度的影响。方法:分别采用胰管内注射胶原酶P及释放酶水浴消化以及分别采用COBE2991连续密度梯度离心法和Ficoll不连续密度梯度离心法纯化。用DTZ染色计算胰岛细胞的纯度;用AO/PI染色计算胰岛细胞存活率;通过体外葡萄糖刺激胰岛素分泌试验判定胰岛细胞功能。结果:两组活度均在95%左右, 两组之间差异无统计学意义 (P>0.05) 。应用Ficoll不连续密度梯度离心法可获得胰岛纯度 (77.5±13.4) %, 用胶原酶P组, 释放酶组可分别获得 (1 829±517) 和 (3129±893) 个胰岛/每克胰腺, 两者差异有统计学意义 (P<0.05) 。应用COBE2991连续密度梯度离心法可获得胰岛纯度 (92.8±7.4) %, 纯化后细胞形态完好, 两者差异有统计学意义 (P<0.05) 。体外葡萄糖刺激胰岛素分泌实验, 高糖情况下 (5.33±1.13) m IU/L, 两者差异有统计学意义 (P<0.05) , 低糖情况下胰岛素分泌量 (2.63±0.67) m IU/L。结论:用COBE2991连续密度梯度离心法纯化胰岛较Ficoll400不连续密度梯度法纯化可获得纯度更高的胰岛细胞。采用胰管内释放酶灌注进行人胰岛分离优于胶原酶P。

关键词：胰岛,分离,纯化,移植

参考文献

[1]李镒冲, 刘晓婷, 胡楠, 等.中国2010年糖尿病疾病负担[J].中华流行病学杂志, 2013, 34 (1) :33-36.

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分离纯化 篇2

抗体分离纯化技术的研究进展

制备高特异性、高效价的抗体是实验免疫学技术的基础,抗体质量的高低,将直接影响试验的成败.抗体的制备有两个途径:一是一般通用的方法,以纯化的抗原免疫动物,获得多克隆抗体;二是应用杂交瘤技术制备单克隆抗体.但不论用何种技术制备的.抗体都需要进行纯化.重要的是根据抗体的性质和来源选择一个合适的分离纯化方法.对当前的纯化方法进行了一个简要的综述.

作 者：侯越 罗奋华 吴应积 Hou Yue Luo Fenhua Wu Yingji 作者单位：内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室,呼和浩特,010021刊 名：生物技术通报 PKU英文刊名：BIOTECHNOLOGY BULLETIN年，卷(期)：2008“”(3)分类号：Q95关键词：抗体 分离 纯化

反胶团萃取分离纯化色氨酸的研究 篇3

关键词:色氨酸 反胶团 AOT 萃取

0 引言

色氨酸是人体内的必需氨基酸之一。色氨酸对人和动物的生长发育、新陈代谢起重要的作用,对预防糙皮病、抑郁症,改善睡眠和增强自信心有着很重要的作用,广泛应用于医药、食品和饲料行业。反胶团是针对于生物活性的氨基酸或蛋白质提出的一种液液萃取体系。同传统氨基酸分离纯化手段相比,它具有分离步骤少、易于放大、高选择性、低成本的特点。从20世纪70年代末反胶团概念的提出到现在,它一直是生化工程研究领域的热点。在研究利用反胶团从实际复杂体系(如发酵液中)分离纯化目标蛋白时,如果直接从复杂体系入手,盲目性很强,很难对萃取过程或出现的问题进行准确的分析和判断。而从模拟体系入手,在研究清楚萃取过程的主要规律后,再进行复杂体系的研究,是一种事半功倍的研究思路。作者通过正交实验分析方法,研究了反胶团体系中AOT浓度、萃取PH、萃取离子强度、反萃PH和反萃离子强度五个因素对色氨酸萃取的影响,从而推断出最优方案。

1 材料与方法

1.1 实验材料 AOT(丁二酸-2-乙基己基磺酸钠)购自嘉善巨枫化工厂,异辛烷购自天津市福晨化学试剂厂,其他试剂购自上海苏懿化学试剂有限公司,均为分析纯。水溶液均用去离子水配制,实验在室温下进行。

1.2 萃取与反萃实验 将适量的AOT加入到异辛烷溶液中摇匀,使其均匀分布于有机相,得到澄清透明稳定的反胶团系统。准确量取1mL色氨酸储备液于不同缓冲液中,稀释,由不同浓度的离子构成酸缓冲液,PHPI)的离子强度的缓冲液作为反萃取水相,与前萃取所得的有机相混合,放在振荡机上剧烈摇晃后20min,倾入离心管,进行离心。用滴管小心地将两相分开,下层水相即为纯化的色氨酸。

1.3 色氨酸含量分析 利用对二甲氨基苯甲醛法测量水相中色氨酸含量。在752紫外光栅分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)上测定600nm处的吸光度,对照标准浓度-吸收度曲线,以计算色氨酸的浓度。色氨酸测量范围为0-100μg/mL。

2 实验结果与讨论

反胶团体系影响因素很多,需要对各个条件进行优化,选择色氨酸萃取最佳条件,但是各个因素太复杂,如果每个因素都分开讨论,工作量很大,而且需要很长时间,因此在实际实验中采用正交实验的方法。正交试验设计是利用“正交表”进行科学地安排与分析多因素试验的方法。其主要优点是能在很多试验方案中挑选出代表性强的少数几个试验方案,并且通过这少数试验方案的试验结果的分析,推断出最优方案,同时还可以作进一步的分析,得到比试验结果本身给出的还要多的有关各因素的信息。

在本次实验中,对AOT浓度、萃取pH、萃取离子强度、反萃pH、反萃离子强度这五个因素进行考虑。

固定以下几个条件:

色氨酸储备液单位为1mg/ml;有机溶剂为异辛烷;表面活性剂为AOT;无助表面活性剂;萃取和反萃相比为1:1;萃取和反萃离子都为KCL;萃取时间15min;离心(3500r/min,5min);反萃时间为20min;离心(3500r/min,5min),萃取温度为室温。实验的各因素级水平如(表3-1):

取16个100mL的三角瓶,并依次编号,按照所述实验步骤进行操作,固定条件不变,但是对涉及正交的几个因素的种类和加入量按照表3-2进行试剂的正确加入,采用正交表进行实验,结果如下:

2.1 PH对萃取过程的影响 水相的PH值决定了色氨酸表面电荷的状态,从而对萃取过程造成影响,由于AOT为阴离子表面活性剂,在进行萃取过程中应该是PH

在进行反萃取过程中PH>PI,当PH值小于10时,萃取率较低;在PH>10.0时,随着PH的升高,萃取率明显升高,以PH值11.0的萃取效果为最好,但是当PH>12时,萃取效率降低。

2.2 离子强度对萃取过程的影响 离子强度对蛋白质萃取有几方面的影响:一是离子强度增大后,反胶束内表面的双电层变薄,减弱了蛋白质与反胶束内表面之间的静电吸引,从而减少蛋白质的溶解度;二是反胶束内表面的双电层变薄后,也减弱了表面活性剂极性头之间的斥力,使反胶束变小,从而使蛋白质不能进入其中;三是离子强度增强时,增大了离子向反胶束“水池”的迁移并取代其中蛋白质的倾向,使蛋白质从反胶束内被盐析出来;四是盐与蛋白质或表面活性剂的相互作用,可改变溶解性能,盐的浓度越高,其影响就越大。显示离子浓度在0.1mol/L左右时萃取率较高,随着浓度进一步的提高,萃取率会发现明显的降低。反萃离子强度在2mol/L左右回收率最高,高于或低于2mol/L回收率都会有明显的降低。

2.3 AOT浓度对萃取过程的影响 根据一些文献,AOT的最佳浓度适用范围对于不同的目的产物不同,对于不同的萃取物质,AOT浓度差别较大,故在本实验中AOT的浓度范围作为一个重要因素进行考虑。AOT浓度太低达不到临界胶束浓度,不会形成反胶团,对目的产物无萃取作用,但是AOT浓度太高,会造成其在有机相中不溶解,反胶团形成浑浊溶液,多余AOT进入水相,影响实验结果,还会造成试剂浪费。而对于我们本次用的实验药品,AOT浓度在80mmol/L以上会有一部分不溶于异辛烷中,因此对于后面的正交试验,选择AOT浓度分别为50、60、70、80mmol/L。AOT浓度对萃取效率也有较大的影响。从实验数据分析得,AOT浓度在60mmol/L左右最佳。

3 结论

AOT浓度60mmol/L;以异辛烷作为有机溶剂;萃取pH为2.0;离子强度为0.1mol/L;反萃取PH为10;离子强度为1mol/L;萃取离子和反萃离子都为氯化钾;萃取时间为15min;水浴振荡250r/min;反萃时间为20min;水浴振荡250r/min;有机相:水相=1:4(V:V);有机溶剂可以循环利用;萃取温度为室温;色氨酸回收率最高可以达到70%左右。

随着人们生活水平的进一步提高,色氨酸的需求量将会逐步增大。目前,在工业生产中大多采用的还是离子交换分离技术。但是,从相关报道的数量上来看,膜分离、液膜和反胶团萃取研究较为热门。可见,新方法在操作、分离效率和能力等方面已经显现出相当的优势,相信一定会有良好的应用前景。

参考文献:

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[10]苑艳辉,钱和.AOT/异辛烷反胶束体系萃取豆豉纤溶酶的前萃工艺初探.河南工业大学学报(自然科学版).2006.27(2):38～42.

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[12]于艳春,郑纯智等.AOT/异辛烷反胶团体系提取脂肪酶的研.淮海工学院学报(自然科学版).1998(9):49～50.

分离纯化 篇4

1.1 膜分离技术的特点

膜分离过程以选择透过性膜作为分离介质,通过在膜两侧施加某种推动力,使得原料侧组分有选择性地透过膜,从而达到分离、提纯和浓缩的目的。

传统氨基酸生产工艺:蛋白质水解液液→过滤或离心或大孔树脂吸附、萃取→浓缩→脱色→干燥→产品。

采用膜分离技术工艺可简化为:蛋白质水解液→超滤→纳滤→脱色→干燥→产品。

相对于传统工艺,膜分离技术具有设备简单、常温操作,无相变及化学变化,选择性高及能耗低,分离效率高,产品的收率和质量高等优点。

1.2 超滤膜和纳滤膜分离的原理

超滤膜属于非对称多孔膜,孔径在2~50nm,对蛋白质水解液各组分的分离依据筛分原理,根据膜的截留分子量不同进行分离。

纳滤膜具有纳米级孔径,截留分子量在100~1000Da之间,主要特征是表面带有电荷,蛋白质水解液中的氨基酸分子在不同的PH带有不同的电荷,纳滤膜通过空间位阻和电荷效应的共同作用就可对溶液中氨基酸进行分离。

2 膜分离技术在氨基酸分离纯化中应用

2.1 氨基酸的性质和传统方法分离纯化

氨基酸是一种既含有氨基又含有羧基两性官能团的物质,氨基和羧基的电离取决于溶液的p H值和氨基酸的等电点p I:在p H低于等电点p I时,氨基酸带正电荷;在p H值高于等电点p I时氨基酸带负电荷;在等电点时,氨基酸的溶解度最小,最易从溶液中析出。氨基酸的分离纯化就是利用其在不同PH值时所带电荷不同的特性。传统的氨基酸分离纯化方法有:离心法、沉淀法、离子交换法、萃取法、吸附法、和色谱法。由于目前,工业上氨基酸主要采用酶生化反应器对蛋白质进行水解制取。蛋白质水解液成分相当复杂,其中很多氨基酸分子分子量相近、性质相似,有的仅是净电荷数的不同。用这些传统的方法分离纯化氨基酸存在工艺复杂、耗时长、原料需求量大、能耗高、收率低、污染严重等问题,且产品在长时间提取过程中易变性失活。

2.2 膜分离技术在分离纯化中应用

酶水解蛋白质是一个与水解程度有关的很复杂的过程,水解产物中可以是不同链长的多肽和氨基酸等,运用膜分离技术对各组分进行分离纯化,主要依据膜和溶液的界面处存在以下机理:由于亲水性等原因所引起的选择性透过效应;与分子尺寸有关的筛分效应;膜与氨基酸的电荷效应。在对蛋白水解液中多肽和氨基酸进行分离纯化时,首先可以用筛分原理的超滤将蛋白水解液中酶、多肽和大分子量的氨基酸截留并回收利用,透过液中氨基酸分子分子量相近、性质相似,有的仅是净电荷数的不同,此时再将透过液经纳滤[6]浓缩后,再通过等电点结晶获得高纯的氨基酸。运用这样的集成联用的膜分离技术,不仅提高了氨基酸的质量和收率,而且可降低酶的成本和分离的能耗。有文献报道过,将超滤、反渗透和等电点结晶技术结合从发酵液中回收谷氨酸。同时运用膜分离技术对蛋白水解液中废水进行处理,可以降低对环境的污染。

3 急需解决的问题和应用前景

3.1 面临的问题[7]

在运用超滤和纳滤膜分离过程,超滤和纳滤都是以压力差为推动力进行分离的,料液在压力的驱动下下透过膜,溶质被截留,造成膜界面区域浓度增高,易造成浓差极化还有就是分离过程也易造成膜污染问题。在膜分离纯化过程将面临膜材质的选择,膜的抗污力,膜的使用寿命和操作费用等问题。

3.2 需解决的问题

针对膜分离纯化中面对的问题,需开发耐有机溶剂、耐药品、高通量、高分离的选择性膜;优化膜分离的机理及操作过程;增强膜的抗污能力;采用不同的膜技术的优化组合。

3.3 应用前景

分离纯化技术是一项耗时长、消耗大、能耗高、产品回收率低的很复杂的操作过程,尤其是对一些生物药品的的分离纯化,成本较高。在这个必须需要一些生物产品的社会中,需将膜技术与传统工艺集成联用发展出了一些全新的膜分离过程,这些新的分离过程在不同程度上吸取了膜分离和传统分离方法的优点,而避免了两者原有的一些局限性,这将是膜分离技术发展的主要方向.将这些新技术应用在低分子量生物产品氨基酸类的分离纯化,并逐渐实现工业化,取代传统分离纯化这些单元操作,降低成本,减少环境的污染和提高产品质量和收率。

4 结论

将膜分离技术应用在氨基酸分离纯化中,不仅提高氨基酸的质量和收率,还能减少其废水的排放量,从而减轻对环境的污染,符合清洁工艺的要求。

参考文献

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[6]冯磊,王文.纳滤技术用于氨基酸溶液的提纯[J].食品与生物技术学报,2006,25(4):5-11.

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分离纯化 篇5

晚期氧化蛋白产物的分离纯化和鉴定

目的分离纯化以人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)为原料生成的晚期氧化蛋白产物(advanced oxidation protein products,AOPP),即AOPP-HSA,并对其进行鉴定,以寻求一种制备高纯度且具生物活性的`AOPP-HSA的方法.方法采用HSA-HOCl孵育法体外制备AOPP-HSA粗纯品,经凝胶层析和离子交换高压液相层析(high performance liquid chromatography,HPLC)两步层析分离纯化其中的AOPP-HSA,并经紫外和荧光光谱、SDS-PAGE、单核细胞TNF-α分泌实验鉴定其结构特征和生物学活性.结果分离的蛋白质纯度达99.4%,分子质量为700×103,是含有双酪氨酸的蛋白交联聚合物,能够显著刺激单核细胞TNF-α的分泌.结论采用上述两步层析方法能够由粗纯品中成功分离出高纯度并具生物活性的AOPP-HSA,为AOPP的进一步研究奠定了基础.

作 者：孙岩 吴雄飞 金锡御 SUN Yan WU Xiong-fei JIN Xi-yu 作者单位：第三军医大学西南医院肾科,重庆,400038刊 名：第三军医大学学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE年，卷(期)：28(10)分类号：Q503 Q51 Q591.2关键词：晚期氧化蛋白产物 尿毒症毒素 色谱法 凝胶 离子交换 单核细胞

分离纯化 篇6

关键词：康氏木霉；内切β-葡聚糖苷酶；分离纯化；酶学性质

中图分类号： Q556+.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0040-04

收稿日期：2014-03-27

项目基金：国家自然科学基金（编号：21276053）；广西壮族自治区生物炼制重点实验室培育基地开放课题（编号：GXBF11-04）。

作者简介：覃益民（1962—），男，广西贵港人，博士，副教授，主要从事生物加工与分离方面的研究。Tel：（0771）3233718；E-mail： qym6289@sina.com。植物纤维由纤维素、半纤维素和木质素三大部分组成并共同构成了植物细胞壁的主要成分，是最丰富的天然可再生生物资源，纤维素通过纤维素酶水解转化为可发酵性糖，继而转化为燃料乙醇及相关化学品的研究越来越引起人们的关注[1]。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，由内切β-葡聚糖苷酶 （EG） 、 外切β-葡聚糖苷酶 （CBH）和 β- 葡萄糖苷酶 3 类酶组成。尽管大量研究已表明，只有在这3种主要成分酶的协同作用下，纤维素分子最终才能被降解成葡萄糖。但是各成分酶是如何协同起作用的，学者们的看法还不尽相同[2]，近来人们还发现了一些不具有纤维素酶活性的蛋白也能与纤维素酶起协同作用，并最终促进纤维素的降解[3-5]。因此，无论是对纤维素酶系各成分酶的协同作用机理，还是对纤维素酶系与其他非酶蛋白的协同增效作用的更深入了解，都将会为提高纤维素酶的催化效率提供重要理论基础。康氏木霉GIMP 3.444是一株产纤维素酶系的真菌菌株[6]，笔者从该菌株中分离纯化出一种纤维素酶协同增效蛋白。为进一步研究该增效蛋白对纤维素酶各成分酶的协同作用机理，需获得该菌株产的纤维素酶系各组分纯酶。因此，本研究对康氏木霉GIMP3.444分泌的内切β-葡聚糖苷酶进行分离纯化，并研究其酶学性质。

1材料与方法

1.1菌株

康氏木霉（Trichoderma koningii）GIMP 3.444购于广东省微生物菌种保藏中心，现保存于广西大学化学化工学院生物化工实验室。

1.2培养基和试剂

（1）斜面活化培养基：200.0 g马铃薯、20.0 g 葡萄糖、30 g KH2PO4、1.5 g MgSO4·7H2O、20.0 g 琼脂粉，加自来水至1 000 mL，调 pH值至 6.0，121 ℃灭菌 20 m in。（2）摇瓶种子培养基：200.0 g 马铃薯、20.0 g 葡萄糖、30 g KH2PO4、1.5 g MgSO4·7H2O，加自来水至1 000 mL，调pH值至 6.0，121 ℃灭菌 20 m in。（3）液体发酵培养基：15.0 g 甘蔗渣（过80目筛）、8.0 g 麦麸粉、4.0 g （NH4）2SO4 、3.0 g KH2PO4 、1.5 g MgSO4·7H2O，加自来水至1 000 mL，调pH值至6.0，121 ℃灭菌 20 min。（4）DNS试剂：称取6.3 g 3，5-二硝基水杨酸、20.96 g NaOH、182.0 g酒石酸钾钠、5.0 g苯酚、5.0 g 亚硫酸钠，分别用去离子水溶解后混合，待混合液冷却至室温定容至 1 000 mL。保存在棕色瓶中，在室温下放置 7 d 即可使用。（5）考马斯亮蓝G-250溶液：称取考马斯亮蓝G-250 100 mg，溶于50 mL 95%乙醇中，再加入100 mL 85%磷酸，混合均匀后用去离子水定容至1 000 mL。

1.3菌种的培养

取保存的康氏木霉接种于斜面活化培养基，28 ℃条件下活化培养3～7 d，刮取平面孢子，用无菌水制成孢子悬浮液，按1%体积比（V/V）接种至种子培养液中，于180 r/min、28 ℃下培养30～36 h。将摇瓶种子按5%体积比（V/V）接种量接种至装有150 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，于 180 r/min、28 ℃下培养120 h。

1.4内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化

1.4.1发酵液的预处理取“1.3”节培养好的发酵液，用4层纱布过滤，在4 ℃、6 000 r/min条件下离心20 min，收集上清液，用截留分子量为10 000 Da的VIVAFLOW 200平板超滤膜浓缩20倍左右，得到粗酶液。粗酶液先用20%饱和度的硫酸铵沉淀，4 ℃下静置过夜；6 000 r/min离心20 min，取上清液继续加入硫酸铵至饱和度为80%，4 ℃下静置过夜；离心得沉淀，用0.05 mol/L pH值7.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液复溶，再次离心后，去除不溶物，复溶酶液4 ℃冰箱保存。

1.4.2Sephacryl S-200凝胶过滤层析取2.0 mL的盐析复溶液，上样于Sephacryl S-200 HR凝胶过滤柱（10 mm×700 mm）中，用0.05 mol/L pH值 7.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（含NaCl 0.2 mol/L）洗脱，用自动收集器按 2.0 mL/（管·10 min） 收集组分，测定每管内切β-葡聚糖酶活力，收集有内切β- 葡聚糖酶活性洗脱峰，4 ℃保存备用。

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1.4.3DEAE Sepharose FF离子交换层析取“1.4.2”节收集的蛋白样，用VIVAFLOW 50平板超滤膜浓缩，并用 0.05 mol/L pH值 7.0磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液置换，上样至DEAE Sepharose FF阴离子交换柱（16 mm×200 mm）中，0～0.8 mol/L NaCl浓度梯度洗脱，自动收集器 5 mL/（管·5min） 收集组分，测定各峰的内切β-葡聚糖酶活力，收集内切β- 葡聚糖酶活性峰，4 ℃条件保存备用。

1.4.4Octrl Separose CL-4B疏水层析取“1.4.3”节中收集的内切β-葡聚糖酶活性峰，超滤浓缩并用含（NH4）2SO4 2.0 mol/L的0.05 mol/L pH值 7.0磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液置换，上样至Octrl Separose CL-4B疏水层析柱（10 mm×400 mm）中，2.0～0 mol/L （NH4）2SO4 浓度梯度洗脱，自动收集器3 mL/（管·10 min） 收集组分，测定各峰的内切β- 葡聚糖酶活力，收集内切β-葡聚糖酶活性峰，4 ℃条件保存备用。

1.5测定方法

1.5.1蛋白浓度的测定以牛血清白蛋白为标准，用考马斯亮蓝G-250法[7]测蛋白液浓度。

1.5.2内切β-葡聚糖苷酶活力（EG）测定采用DNS法[8]测定内切酶活性。向试管中加入1.5 mL 10 g/L的羧甲基纤维素钠柠檬酸-柠檬酸钠溶液（0.1 mol/L，pH值 4.8）及 0.5 mL 酶液，50 ℃水浴中保温30 min，取出后加入 3.0 mL DNS试剂终止反应，沸水浴5 min，取出流水冷却，定容至 25 mL，在540 nm波长处测定吸光度。以每分钟催化底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个活力单位，单位用IU/mL表示。

1.5.3蛋白质纯度鉴定及相对分子量测定采用SDS-PAGE法[9]。聚丙烯酰胺凝胶质量分数为12%，蛋白标准品的分子质量范围1.44×104～9.74×104 ku。

1.5.4最适反应温度测定将纯酶稀释后，在pH值 4.8条件下，于不同温度（25 ℃～80 ℃）水浴中与底物保温30 min，测定内切β-葡聚糖苷酶活力，以最大酶活力为100%，确定酶的最适反应温度。

1.5.5最适反应pH值测定分别用不同pH值（2.6～8.0）的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配置1%的羧甲基纤维素钠悬浮液，作为不同pH值条件下的酶作用底物，加入用相应pH值缓冲液稀释的纯酶，在50 ℃水浴中保温30 min，测定不同pH值下的内切β-葡聚糖苷酶活力，以最大酶活力为100%，确定酶的最适反应温度。

1.5.6底物动力学参数测定分别配置浓度为0.1%、015%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%的羧甲基纤维素钠悬浮液（pH值 4.8），加入适当稀释纯酶液，在50 ℃水浴中保温30 min，DNS法测定各不同浓度底物时产生的还原糖，然后按照Lineweaver-Burk双倒数作图法[10]作图，计算出该酶作用于羧甲基纤维素钠时的Km值和Vmax值。

2结果与分析

2.1内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及分析

康氏木霉发酵液经20～80%硫酸铵分级沉淀，上样至Sephacryl S-200 HR凝胶过滤层析柱，洗脱流速为 0.2 mL/min，洗脱结果如图1所示，共有3个蛋白峰。酶活测定发现第3个蛋白峰没有纤维素酶活性，为杂蛋白，而峰Ⅰ、峰Ⅱ均具有较高的内切β-葡聚糖苷酶活性，说明康氏木霉的发酵液中至少含有2种内切酶。本研究仅介绍对第1个蛋白峰的分离纯化。

收集图1中的峰Ⅰ蛋白，超滤法浓缩并进行缓冲液置换后，上样至用0.05 mol/L pH值 7.0磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液平衡的DEAE Sepharose FF离子交换层析柱，分别用3倍柱体积的含NaCl 0.1、0.2、0.3、0.8 mol/L的缓冲液进行洗脱，流速为1.0 mL/min，结果如图2所示，共有5个蛋白吸收峰，经测定内切酶活主要集中在峰3中。

合并图2峰3蛋白，超滤浓缩用含（NH4）2SO4 2.0 mol/L 的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液置换，上样至平衡的Octrl Separose CL-4B疏水层析柱，分别用3倍柱体积的含 1.0 mol/L （NH4）2SO4缓冲液和无（NH4）2SO4的缓冲液洗脱，流速为0.3 mL/min，如图3所示，得到3个蛋白峰，经酶活测定，发现只有第3个峰具有内切酶活性（图中记为EG）。

取经硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-200 HR凝胶过滤层析、DEAE Sepharose FF离子交换层析、Octrl Separose CL-4B疏水层析纯化的内切β- 葡聚糖酶进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，结果见图4。图4表明，通过以上4步纯化过程，内切β-葡聚糖酶的纯度逐步提高，且经疏水层析后的酶组分在SDS-PAGE电泳胶上显示为单一条带，表明该组分已达电泳纯，凝胶成像系统分析内切β-葡聚糖酶的相对分子量约为61.8 ku，比文献[11-14]报道的康氏木霉内切葡聚糖酶大，也偏大于里氏木霉[15-16]内切葡聚糖酶，而与绿色木霉[17]和拟康氏木霉[18]中的内切葡聚糖酶相近。

内切β-葡聚糖酶的分离纯化过程如表1。表1表明硫酸铵分级沉淀除去了部分的非酶杂蛋白，纯度提高了132倍。而Sephacryl S-200 HR凝胶过滤层析对内切β-葡聚糖

酶的提纯效果不太理想，在盐析的基础上内切酶只被纯化了1.34倍，这是因为在盐析样中有多种内切酶共存，此时测得的内切酶活力会高于凝胶过滤层析后得到的内切β- 葡聚糖酶活力。DEAE Sepharose FF离子交换层析也能去除较多的杂蛋白和多糖物质，内切β-葡聚糖酶的比活力达到 983 IU/mL，纯化了2.98倍。经过Octrl Separose CL-4B疏水层析，内切葡聚糖酶最终达到电泳纯，此时比活力为 24.91 IU/mg，与粗酶液相比，提高了7.55倍，回收率为3.72%。

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表1康氏木霉内切β- 葡聚糖酶的分离纯化

纯化过程总蛋白

（mg）总活力

（IU）比活力

（IU/mg）回收率

（%）纯化

倍数粗酶液496.721 639.183.30100.001.0020%～80%（NH4）2SO4 332.801 451.014.3688.521.32Sephacryl S-200 HR162.93953.145.8558.151.77DEAE Sepharose FF 24.82243.989.8314.882.98Octrl Separose CL-4B 2.4561.0324.913.727.55

2.2内切β-葡聚糖苷酶的酶学性质

2.2.1内切酶的最适反应温度为了测定反应温度对内切β-葡聚糖苷酶活性的影响，确定酶的最适反应温度，在同一pH值条件下，分别测定不同反应温度时的酶活力，以最大酶活力为100%，计算相对酶活力，结果如图5。图5表明，在 25～55 ℃ 范围内，内切酶活力随着温度升高而增加，在55 ℃时酶活力最大，说明内切酶的最适反应温度为55 ℃；温度继续升高，内切酶活力逐渐降低，80 ℃时，酶活力仅有最高活力的16.3%。在55～75 ℃范围内，酶活力随温度升高而降低的斜率的绝对值大于低温范围内酶活力随着温度升高而增加的斜率，说明该内切酶对高温更敏感。

2.2.2内切酶的最适反应pH值用不同pH值的缓冲液配置酶反应底物，测定pH值对内切β-葡聚糖苷酶活性的影响，以确定酶的最适反应pH值，分别将该酶与上述底物在 50 ℃ 条件下反应，测定内切β-葡聚糖苷酶活力，以最大酶活力为100%，计算相对酶活力，结果如图6。可见，当pH值小于4.4时，内切酶活力随着pH值的增大而增加，至pH值 4.4时酶活力达最大值，故该内切酶的最适最适pH值为44；pH值 4.4～8.0范围内，内切酶活力随着pH值的继续增大而降低，但在pH值为6.2时，酶活力仍有最大值的758%，这可能是因为该内切酶在pH值 4.4～6.2之间活性较稳定。

2.2.3内切酶的底物动力学性质将稀释的纯酶液分别与不同浓度底物反应，测定生成的还原糖量，然后按照Lineweaver-Burk双倒数作图法作图，结果如图7。回归得出标准方程为1/v=1.942 1（1/[S]）+0.403 9，求得以羧甲基纤维素钠为底物时，内切β-葡聚糖苷酶的Km值为 4.81 mg/mL，Vmax值为2.48 mg/（min·mL）。

3结论

本研究从康氏木霉液态摇瓶发酵液中分离纯化得到一种电泳纯的内切β-葡聚糖苷酶，比活力为24.91 IU/mg，相对分子量为61.8 ku。酶学性质测定结果显示，纯化的内切β-葡聚糖苷酶无外切β-葡聚糖苷酶及β- 葡萄糖苷酶活性，作用于羧甲基纤维素钠时，Km为4.81 mg/mL，Vmax为 2.48 mg/（min·mL），最适反应温度为55 ℃，最适反应pH值为4.4，可用来分析纤维素酶系蛋白之间的协同水解作用。

本研究结果还表明，康氏木霉分泌的内切β-葡聚糖苷酶不止一种，因此，在研究纤维素酶系各成分酶的协同作用机理或研究纤维素酶系与其他非酶蛋白的协同增效作用时，须考虑同功酶存在的影响。

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植物细胞核分离纯化的探讨 篇7

关键词：植物,细胞核,分离,纯化

植物细胞非对称融合、染色体杂交育种、大片段基因组文库构建、DNA纤维制备、细胞核中DNA、RNA、蛋白质含量的分析及染色质结构分析等, 需要分离纯化出较多个体完整, 分散较好的细胞核。学者们曾尝试用不同方法进行植物细胞核的分离, 比如大豆、玉米、水稻、烟草、小麦、棉花、长春花、杉木等细胞核的分离或纯化近来又有过报道[1,2,3,4,5,6,7], 但由于不同植物材料由于结构和组分的不同, 所以适合一种植物的细胞核制备方法并不适合于其它植物。本文就一些分离纯化植物细胞核的方法进行探讨。

对动物细胞核的分离纯化已经有了比较好的方案可查, 然而对植物细胞却不尽然。主要是由于植物细胞在结构与内含物等方面显著不同于动物细胞, 植物细胞除了具有细胞壁外, 还含有胞间连丝和次生代谢物, 这就给细胞核的制备增加了难度。分离纯化细胞核需要在材料选择、预处理、提取液选择、细胞的破碎方法及纯化方法上做综合考虑。

1 材料选择

制备植物细胞核一般可以选择愈伤组织、下胚轴、子叶、悬浮培养细胞和叶片等材料, 其中选择后者居多。然而, 愈伤组织和悬浮培养细胞有着自身的优越性。愈伤组织和悬浮培养细胞取材方便, 本身就是无菌材料更便于做融合、杂交试验。离体培养的植物细胞更易于进行同步化处理, 且黑暗下培养的细胞基本不含叶绿体, 这些都便于核的纯化。

2 预处理

处于不同细胞周期的细胞核的大小是不同的, 体积可相差几倍之多, 为了便于纯化、提高收率, 可先将用于制备细胞核的植物材料进行同步化处理。通常可采用低温 (用冰水混合物) 培养12h-48h的物理方法;也可采用使用羟基脲、8-羟基喹啉 (0.001M-0.004M) 或秋水仙素 (0.01%-0.5%) 的化学方法, 处理时间在4h-24h。对于离体培养材料, 还可以尽量缩短继代的周期使得细胞经常处于对数增殖期的办法使细胞核尽可能均匀一致。对于悬浮培养细胞还应在破碎细胞之前去除漂浮的已自溶的细胞碎片等杂质。

3 细胞破碎方法

主要有研磨法、刀切法、酸解法和酶解法。研磨法提取植物细胞核, 在研磨过程中酚类等物质易氧化, 不可避免的对提取细胞核产生影响, 细胞核提取质量不高。研磨时间长短和力度大小难以掌握, 致使很多细胞核被破坏, 产率较低。刀切法, 一种是用剪刀将叶片快速剪碎, 另一种是用锋利刀片在放置于冰上的培养皿中于将叶片切碎至尽量细小的匀浆状。刀切法的操作手法也不容易保持一致, 不适用于愈伤组织、悬浮细胞和根茎尖等材料。酸解法一般采用1M-3M盐酸解离细胞。酸解法效果不稳定。酶解法是利用纤维素酶、果胶酶和/或半纤维素酶等处理细胞。酶浓度在0.5%-2%, 纤维素酶浓度高于果胶酶, 半纤维素酶有助于纯化过程, 不添加也可。使用蜗牛酶没有看到更好的结果。酶解时间为4h-24h。酶解法可以先得到原生质体, 再通过挤压低渗涨破质膜或添加表面活性剂溶膜而释放细胞核, 也可以不收集原生质体, 一步实现收获细胞核, 而且不必使用表面活性剂, 这时需要延长酶解时间 (12h左右) 并使材料处于震荡当中。利用酶解法制备植物细胞核收获量较大, 当然收获量的大小还与所用的提取液 (酶解液) 的其它成分密切相关。

4 提取液

可以使用缓冲盐或非缓冲盐。缓冲盐常被选用的包括Tris、MES、HEPES、MOPS和柠檬酸等, 浓度在0.015-0.2M, p H7.0-8.0居多, 也有使用p H2.0-3.0的。提取液中可选择添加的成分比较多, 比如Mg2+、K+、Na+、精胺、Triton X-100、Tween20、EDTA、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、甘油、PVP、β-巯基乙醇、DTT、PMSF、抗坏血酸等。这些成份能够稳定核染色质 (体) 、提供一定的离子强度、维持渗透压、促进细胞核释放, 移走细胞质, 分散叶绿体, 减少核粘连、防止细胞核被氧化、减轻酚类等次生物质的干扰, 提高细胞核质量。这些成份用量在0.1m M-0.6M, 其中糖类物质用量大。

5 分离纯化方法

过滤、差速离心和密度梯度离心是最常用的方法。细胞破碎以后通常需要过滤。过滤常利用不锈钢、尼龙网 (120目-400目) 和过滤棉等。差速离心需多次反复沉淀和再悬浮, 容易使核破裂。沉淀核的离心速度很低即可, 如果离心时间过长和速度过高, 虽然会提高核的产量, 但也会增加其他非核材料的沾染。密度梯度溶液多用蔗糖、甘露醇和Percoll。浓度高的蔗糖溶液是非常粘的, 而且这种溶液的粘度受蔗糖含量的增加影响大, 浓度高的蔗糖溶液浓度的小的改变对核的沉淀速度会产生很大的影响, 所以用蔗糖作梯度离心纯化细胞核需格外小心。甘露醇溶液用粘度没有蔗糖高, 但同密度情况下, 甘露醇溶液的渗透压要高于蔗糖溶液的, 这也是需要注意的, 以免核皱缩。Percoll是较好的介质, 只是价格偏高。低速离心 (500×g左右) , 细胞核集中30%、35%的蔗糖界面较多。

6 存在主要问题及解决措施

植物细胞核提取遇到的主要问题有杂质多、核与内质网等粘连成网、容易破裂。杂质主要来自细胞壁、膜碎片和细胞质成分。过滤可以去除一些杂质, 但严重降低核的收率, 一方面网筛的大小不好选择, 另一方面导致细胞核破裂, 特别是使用抽滤。图1告诉我们植物细胞核膜连着一些网状的细胞成分, 筛孔小了, 它过不去, 筛孔大了, 大的杂质就会多。如果将通过化学的方法将与膜连接的成分尽量去除, 发现核又非常容易破损, 即使是盖玻片轻轻的一压 (见图2) 。因此, 对于与核膜连接的成分, 既要去除, 又要不能伤及核膜。减轻核与其它细胞成分粘连方法, 可以考虑使用偏酸性的提取液、酶, 不建议使用表面活性剂。低速离心甚至静止片刻 (相当于1×g的离心) 是较好的初步去除杂质的方法, 精细去除杂质则需要进行梯度离心了。对于核容易破裂的问题, 可以考虑使用一些膜的保护试剂, 特别是在纯化的后期, 比如葡聚糖硫酸钾、葡聚糖、蔗聚糖、2- (N-吗啉) -乙烷磺酸、氯化钙、磷酸二氢钾等, 同时注意提取纯化过程中溶液酸碱度的稳定, 离心时尽量不使细胞核沉到离心管底部, 而用蔗糖等溶液托住更好。

总之, 植物细胞核的提取纯化目前还没有普遍适用的方法, 探索适用不同植物、不同材料的核提取纯化方法还是需要研究的工作。

A被盖玻片压破的细胞核 (箭头指处, 棒状影像是由盖玻片造成的) , B是未加盖玻片观察到的细胞核

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《药物分离与纯化技术》课程改革 篇8

关键词：药物分离与纯化,项目教学法,课程改革

药物的分离与纯化是化学合成法生产药物、从天然药物提取药物、微生物法生产药物等多种方法获得药物收率、纯度及进一步测定其结构、研究其药理作用和毒性的首要条件, 也是对药物进行化学结构改造、化学合成、研究化学结构与疗效关系的前提[1], 其分离与纯化技术的效率、安全性、环保、节能等又直接影响到药品生产的经济成本和企业的可持续发展, 是制药的关键环节之一, 因此该课程是化学制药专业学习领域的核心技能课程之一, 在我院化学制药专业人才培养方案中课时为60课时, 主要内容为药物分离与纯化技术的基本概念、原理、设备的操作及维护等知识和技能。

1 改革依据

2006年至2012年, 我国医药行业工业总产值的年复合增长率达到24.01%, “十二五”期间我国政府医药卫生体制改革投入力度和强度要高于2009年至2011年的改革投入, 随着人民健康意识的增强, 国内药品的需求量持续上升, 经济合作与发展组织预测到2020年我国药品市场规模将会达到全球第二, 仅次于美国[2]。未来的制药企业将需要大批的高素质、高技能型药品生产技术的专门人才。为适应社会对制药专业人才的需求, 高职院校在不断地进行专业教学改革、课程改革。对往届毕业生跟踪调查表明制药专业的学生多在中药企业、化学制药企业、生物制药企业就业。目前国内高职院校开设的药物分离与纯化课程多偏向于生物分离与纯化技术、天然药物化学的分离, 课程内容不能拓展学生多方面的就业能力。基于此, 笔者与教学团队对江、浙、沪的制药企业的药物分离与纯化岗位调查, 其调查结果图1是改革教学内容的重要依据。

2 合理选取教学内容, 建设动态化教学资源

课题组成员与企业一线工程技术人员一起以职业岗位所需素养、知识和技能为出发点, 将传统课程的教学内容进行整合, 编制了与制药企业职业岗位对接的“情境”、“知识模块”、“项目任务”、“案例分析”的理实一体化教材, 将教学内容设计成四个学习情境、五个项目任务、十一个知识模块、二十二个子模块、六个案例分析。为突出对高职学生的职业岗位技能的培养, 提高学生的就业竞争力, 根据药物分离、纯化岗位的要求, 体现教学内容与企业实际需求的对接, 知识模块及子模块遵循“知识够用, 强化技能”的原则, 重点学习典型仪器和设备的操作、维护、工艺参数的影响、常见问题的分析、判断和排除, 例如“色谱技术”模块重点介绍工业用制备色谱、“干燥技术”模块重点介绍冷冻干燥机等。药物分离与纯化技术是微生物学、化学工程学、药物化学、物理化学等多学科交叉渗透[3]的前沿性边缘学科与综合技术, 技术发展迅速、知识更新快, 一本教材难以涵盖所有的知识, 为适应教师教学与学生自主学习的需要, 教学团队利用信息化技术建设多形式、动态、共享的药物分离与纯化技术精品资源共享课程, 其内容主要一、药物分离与纯化的前沿技术和国内外学者研究的热点问题;二、新型药物分离与纯化设备;三、药品标准及其变化;四、药物制剂工、高级药物制剂工、药物检验工等职业考核信息、资格考试题库等。教学资源形式有名师讲课视频、授课教师课件、学术报告讲座、期刊文献、硕博论文、科技作品等。通过增加补充性、更新性和延伸性教辅资料, 使课程资源更加完善, 完成专业课程内容与职业标准对接, 学历证书与职业资格证书对接。 (表1)

3 采用多种教学方法强化学生技能、提高教学效果

药物分离与纯化技术课程还涉及大量的实验技能和操作, 传统的教学方法是把该课程分为理论课和实践课两个独立的教学环节, 容易造成理论和实践的脱节, 学生知识的连贯性和教学效果不佳。在课程改革后, 配备“双师”教师, 使用工业化生产设备、小型实验仪器和设备、精品资源共享课程等教学资源, 实施“计划、任务、方案、实施、检查、评估”的工作过程的项目教学法为主, 以案例教学法、讲授法、任务驱动教学法[4]、参观教学法、讨论法等为辅的多种教学方法。以“槐米中芸香苷的提取、分离与鉴定”为例, 具体实施步骤见表2, 在项目实施过程中将学生分组, 每组2~3人[5], 将项目任务书下发给学生团队, 学生在规定的时间内制定方案、完成项目、教师点评、学生互评、学生实际操作及技能提高, 完成整个项目任务 (表2) 。

以工作过程为导向, 工作任务为驱动力, 进行教学的项目教学法, 实行课堂翻转和角色转变, 改变了以往教师讲实验内容, 然后学生动手操作的被动学习过程, 体现了“教师为主导, 学生为主体”的教学原则, 完成教学过程与生产过程对接的教学过程, 充分发挥学生在学习过程中的主观能动性。

4 改革成效

药物分离与纯化技术课程经过三年的建设与改革, 取得了令人满意的成绩, 教学效果显著提高, 受到学生们的普遍欢迎, 校内督导、学生、同行、领导对本课题组成员主讲教师的教学综合评价得分均在良好以上。我院化学制药专业的毕业生受到扬农股份、扬农集团、扬州联博药业、南京红太阳等制药公司工作企业领导的好评、用人单位的高度认可。

参考文献

[1]陈秦娥, 梁金龙.中药制剂分离与纯化技术创新进展[J].过滤与分离, 2012 (2) :1-8.

[2]中国国内医药行业发展状况分析.中商情报网 (http://www.askci.com/) .

[3]刘爱玲, 粟挺.生物分离工程的课程教学改革与体会[J].现代农业科技, 2010 (17) :29-30.

[4]郭双华.任务驱动教学法在精细化工专业实践教学中的应用[J].广东化工, 2012, 39 (228) :241-243.

蛹虫草子实体多糖的分离纯化 篇9

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

蛹虫草(Cordyceps militaris L.Link)C19子实体由深圳澎源生物科技有限公司提供。

1.1.2 试剂:

木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白为Sigma试剂;Sephadex G-100 为Pharmacia进口分装试剂;其它试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器:

5810R高速冷冻离心机,MP502B电子天平,2×60cm层析柱。

1.1.4 培养基:

大米培养基。

1.2 方法

1.2.1 多糖测定:

苯酚-硫酸法。多糖总量的测定根据文献[6,7]进行。多糖得率(%)=0.9×(总糖百分含量-还原糖百分含量)×100 %,其中0.9为葡萄糖换算为多糖的系数。

1.2.2 多糖除色素实验:

扫描粗多糖溶液的紫外-可见吸收光谱,结果表明溶液没有最大吸收波长,在445 nm有较高吸收值,且溶液脱色前后均为橙黄色,故从互补色考虑选取445 nm作为检测波长。

1.2.3 多糖醇析实验:

多糖浓缩后用乙醇沉淀。选定影响多糖得率的3个主要因素进行正交实验(表1)。于4℃醇析,以10 000r/mim离心10min,挥发干乙醇,溶解沉淀,测定多糖得率,确定最佳醇析条件。

1.2.4 多糖除蛋白实验:

粗多糖溶液经95 %乙醇沉淀、无水乙醇洗涤后,用丙酮搅拌洗涤30min,以3 500r/min 离心10min,沉淀再用乙醚搅拌洗涤30min,除去乙醚,沉淀溶于适量的纯水配成多糖溶液后,进行除蛋白处理。采用考马斯亮蓝G250法测蛋白质,以牛血清白蛋白为标准蛋白。

1.2.4.1 Sevag法:

将氯仿:正丁醇配按4:1(V/V)混合,即为Sevag试剂。法Ⅰ:将粗多糖溶液与Sevag试剂按3:1(V/V)混合,充分振荡抽提30min,10 000r/min离心10min,上层为脱蛋白的多糖溶液。重复3～7次,分别取上清液测蛋白质和多糖含量。法Ⅱ:充分振荡抽提1h,11 000r/min离心20min,其它操作同前。

1.2.4.2 蛋白酶法

(1)单因素实验

将木瓜蛋白酶与粗多糖溶液按体积比1:15混合,于60℃分别酶解1h、2h、3h、4h,沸水浴5min灭活,用95%乙醇于4℃醇析24h,测定蛋白质和多糖含量。

将酶与激活剂等体积混合,室温激活25min,测蛋白质含量;将酶与多糖溶液按1:10混合,于60℃分别酶解0.25h 、0.5h、1h 、2h、3h、4h、6h,其它操作同前。

(2)正交实验

选定影响蛋白去除率的三个因素进行正交实验(表2)。

1.2.4.3 蛋白酶法结合Sevag法

粗多糖经激活15min的木瓜蛋白酶于55℃、1:15、处理2h后,再经Sevag法处理2次,分析脱蛋白率与多糖损失率。

1.2.5 乙醇分级沉淀

透析后的样品加无水乙醇至终浓度为50%,于4℃醇析3.5h,10 000r/min离心10min,收集沉淀,为50%醇析样品;离心后收集的上清液加无水乙醇至终浓度为80%,于4℃醇析27h,10 000r/inm离心20min,收集沉淀,为80%醇析样品。

1.2.6 Sephadex G100 柱层析法

50%醇析样品复溶,上样,流速为4ml/10min/管;80%醇析样品复溶,上样,流速为4ml/10min/管;样品全部进入柱后开始洗脱并收集。

2 结果与分析

2.1 多糖除色素实验结果

多糖溶液经201×7树脂脱色后颜色变淡,吸光值降低。同一温度下保温时间越长脱色率越高,60℃脱色9h脱色率最高(表3)。

2.2 多糖醇析实验结果

多糖醇析正交实验结果见表4。影响多糖得率的因子顺序为:乙醇浓度A>乙醇与样品比例C>醇析时间B。最优条件为A2B2C2(无水乙醇、24h、4倍乙醇)。考虑后者到成本问题,追加了95 %乙醇的实验。结果表明,两者多糖得率接近且更高,故醇析可选定95%乙醇、24h、4倍乙醇进行。

2.3 多糖除蛋白实验结果

2.3.1 Sevag法除蛋白结果

Sevag试剂振荡抽提30min结果表明(图1),操作6次除蛋白率可达84.09%,但多糖损失率在第3次已达44.77%。Sevag试剂振荡抽提1h 结果表明(图2),操作3次除蛋白率即可达到81.14%,之后除蛋白效果不明显,操作6次除蛋白率达到84.47%;抽提3次多糖损失率为27.03%,抽提6次多糖损失率达到43.16%。Sevag法除蛋白较彻底,但多糖损失率也高,操作3次后除蛋白效果不明显,可能溶液中Pr量太微,沉淀离心后极易再次进入溶液;振荡30min与60min差别不大。比较表明,用Sevag试剂振荡抽提1h,除蛋白3次即可。

2.3.2 蛋白酶法

单因素实验中,木瓜蛋白酶不激活(图3)或采用激活剂激活(图4)除蛋白率都不高,但后者多糖提取率远高于前者。

正交实验结果表明(表5),最优条件A3B3C2(70 ℃、1:10、2h);影响因素顺序为:反应温度>酶与样品比例>处理时间。

2.3.3 蛋白酶法结合Sevag法

样品经木瓜蛋白酶处理后再用Sevag法处理,除蛋白率比单独采用酶法高但比单独采用Sevag法低(图5)。

2.4 多糖柱层析结果

50%醇析样品经Sephadex G100柱层析后得到两个多糖吸收峰,其中第一个吸收峰多糖含量高,且与蛋白质吸收峰重叠,说明多糖与蛋白可能没有完全分开,需进一步纯化;亦可能为含蛋白多糖;第二吸收峰多糖含量低,且在280nm没有吸收峰,不含蛋白质,可收集进行后续实验。80%醇析样品经Sephadex G100柱层析后得到一个多糖吸收峰,与蛋白质峰有部分重叠,说明多糖与蛋白可能没有完全分开,需进一步纯化,亦可能为含蛋白多糖。

3 讨论

蛹虫草粗多糖含色素、蛋白质、脂质等杂质,要对多糖特性、药理等进行研究首先要除掉上述杂质,并进行精制纯化。文献报道以DEAE纤维素纯化[4,9,10]或将DEAE纤维素与Sephacryl S-100 HR、 Sephacryl S-400柱层析法结合纯化[3,8],均得到较好纯化效果。Rongmin Yu,et al[2]将蛹虫草多糖经50%乙醇沉淀、Sephadex G100柱层析分离得到4种成分。本研究先经50%、80%乙醇分级沉淀得2种粗多糖成分,再分别采用Sephadex G100柱层析,可将粗多糖纯化为较纯的3种成分,方法简便易行,纯化效果较好,纯化周期缩短、成本相对降低。而分离出的3个峰具体成分及性质有待进一步研究。

参考文献

[1]Shonkor Kumar Das,Mina Masuda,Akihiko Sakurai,et al.Medicinal u-ses of the mushroom Cordyceps militaris:Current state and prospects[J].Fitoterapia,2010,81(8):961-968.

[2]Rongmin Yu,Lei Wang,Hui Zhang,et al.Isolation,purification and i-dentification of polysaccharides from cultured Cordyceps militaris[J].Fitot-erapia,2004,75(7-8):662-666.

[3]Wu Guang-Hao,Wang Min.Separation,purification and the immuno-regulation effect of polysaccharides in cultured Cordyceps militaris[J].Chin J Nat Med,2007,5(1):73-76.

[4]Hui Yan,Dongjie Zhu,Dabao Xu,et al.A study on Cordyceps militarispolysaccharide purification,composition and activity analysis[J].AfricanJournal of Biotechnology,2008,7(22):4004-4009.

[5]Jong Seok Lee,Jeong Seok Kwon,Jong Seok Yun,et al.Structural char-acterization of immunostimulating polysaccharide from cultured mycelia ofCordyceps militaris[J].Carbohydrate Polymers,2010,80(4):1011-1017.

[6]董群,郑丽伊,方积年.改良的苯酚-硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究[J].中国药学杂志,1996,31(9):550-553.

[7]Kim GY,Park H S,Nam B H,et al.Purification and characterization ofacidic proteo-hetero-glycan from the fruiting body of Phellinus linteus(Berk.&M.A.Curtis)Teng[J].Bior Technol,2003,89(1):81-87.

[8]Rongmin Yu,Wei Yang,Liyan Song,et al.Structural characterizationand antioxidant activity of a polysaccharide from the fruiting bodies of cul-tured Cordyceps militaris[J].Carbohydrate Polymers,2007,70(4):430-436.

[9]江明珠,颜辉,闻燕,等.家蚕蛹虫草子实体及大米培养基多糖的提取和纯化[J].安徽农业科学,2010,38(18):9538-9539,9563

小鼠外周血单个核细胞分离、纯化 篇10

1材料和方法

1.1材料与分组

BALB/c小鼠18只,5~6月龄,体重23~25g,雌雄不限;小鼠外周血单核细胞分离液试剂(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)。

1.2方法

1.2.1取血与离心

摘除眼球取血:抓取小鼠,侧卧位,食指按压眼部皮肤致眼球突出。眼科弯镊迅速摘除眼球,倒立鼠,接取滴流血液。采血完毕纱布压迫止血[2]。每次采血量0.7~1m L。按乙二胺四乙酸盐(EDTA-K2)抗凝、肝素抗凝、枸橼酸钠抗凝,将抗凝血标本分为3个实验组,每组6例,相互对照[3]。

Ficoll密度梯度离心:首先取抗凝血与RP-MI1640培养液等体积混匀,再加相当于抗凝血2倍体积的淋巴细胞分离液,于400~600×g离心20~30min,谨慎吸取单核细胞层,RPMI1640培养液洗两遍备用[4,5,6,7]。

因细胞获得率与纯度关系到实验效果,一般根据血液样本量确定离心条件,血液样本量越多,离心力越大,其离心时间越长,最终目的是达到最佳分离效果,对于小鼠本实验依据离心力、离心时间等设置优化梯度,因细胞获得率的高低与室温还有关,室温设置3个优化梯度[8]。

1.2.2 PBMC的差异贴壁法纯化

将获取的PBMC计数后,用单核细胞完全培养基以4×106个/m L的密度重悬细胞,将细胞铺于24孔培养板,每孔2×106细胞,放于37℃5%CO2培养箱中进行贴壁培养。2~4h内贴壁的为巨噬细胞前体(俗称为单核细胞),吸去培养液上清,用RP-MI1640培养液轻轻洗涤培养孔3次,去除非贴壁细胞。收集贴壁细胞即获得贴壁法纯化的PBMC。

1.2.3 PBMCs纯度

收集贴壁细胞,用含有10%小牛血清的RP-MI1640重悬后,涂片进行瑞氏(美蓝-伊红Y)染料,计数100个细胞,计算单个核细胞纯度,单个核细胞纯度=(淋巴细胞数+单核细胞数)/总细胞数×100%。

1.2.4计数PBMCs

洗涤1.2.2获得的PBMCs 2次,即加适量PBS或RPMI1640培养液、混匀、600g离心5min弃上清,重复2次。加PBS悬浮细胞,台盼蓝染液染色,死的细胞可被染成蓝色,活细胞不着色。倒置显微镜10×物镜下计数200个PBMCs活细胞百分率和细胞总数(存活率=活细胞数/总细胞数×100%)。

1.2.5统计学方法

采用SPSS13.0软件统计分析。数据采用±s表示,组间数据采用t检验,组内数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA),P<0.05差异具有显著意义。

2结果

2.1抗凝剂分离的PBMC细胞获得率、纯度、存活率

PBMC获得率:EDTA-K2组与肝素组比较差异显著(P<0.05),EDTA-K2组获得率较高,而枸橼酸钠组与肝素组获得率比较,差异不显著,无统计学意义(P>0.05)。PBMC纯度:EDTA-K2组与肝素组比较差异显著(P<0.05),肝素组PBMC纯度较高,而枸橼酸钠组与EDTA-K2组比较,纯度则差异不显著,无统计学意义(P>0.05)。PBMC存活率:EDTA-K2组、肝素组和枸橼酸钠组比较,细胞存活率差异不显著,无统计学意义(P>0.05),见表1。

注:*P<0.05。

2.2不同离心力、离心时间的PBMC细胞获得率

在相同离心时间不同的离心力下,500g离心力下效果好于400g和600g;在相同离心力下时间越长收集的PBMCs细胞获得率越高,但不同时间下差异不显著,无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3不同环境温度下PBMC获得率

比较20℃、25℃和30℃三个环境温度下PBMC获得率,如表3可知,环境温度20℃时PBMC获得率最高,25℃次之和30℃最低,环境温度30℃PBMC获得率较20℃差异显著(P<0.05)。20℃与25℃下差异不显著,无统计学意义(P>0.05)。见表3。

注:*P<0.05。

3讨论

分离PBMC是一项实验和临床时常要做的工作,比如外周血单个核细胞培养的上清液中细胞因子等对基础医学和临床疾病有一定实用价值[9,10,11,12,13,14]。传统方法采用Ficoll-hypaque密度梯度离心,小鼠外周血单核细胞分离液比重为1.080,因血液中各组成成分的沉降系数存在差异Ficoll在一定离心力的作用下离心时,血液中各组成成分将按密度的梯度重新聚集[15]。密度较低的血小板和血浆悬于分层液上部;密度较大的红细胞与粒细胞沉于分层液下部;由于PBMC密度稍低于分层液,则位于分层液界面上,小心吸取该层即可获得PBMC。该法操作需将抗凝血作适当稀释,比较适用于小鼠等血液量少的分离。特别说明,单核细胞分离液,在分离人PBMC时,其比重为1.077;而分离小鼠单个核细胞时比重为1.080。用本法分离PBMC,经条件优化后纯度可达85%,细胞获得率最高可达80%以上,活细胞百分率在92%以上。

PBMC的差异贴壁法纯化时,收集2~4h内贴壁贴壁细胞为巨噬细胞前体(俗称为单核细胞),而10~24h内贴壁的细胞为内皮细胞、内皮祖细胞、干细胞,不贴壁的则为淋巴细胞[16]。总之,EDTA-K2组PBMC获得率较肝素组高,而肝素组PBMCs纯度较高,PBMC存活率三组细胞存活率差异不显著。另外据报道,枸橼酸钠对细胞损伤小些。环境温度在30℃PBMC获得率较20℃差异显著,超过25℃时会影响细胞获得率。综上所述,再考虑到细胞纯度、细胞回收率、细胞存活率以及操作的难易等因素,我们认为Ficoll密度梯度离心法在优化条件下可有效地分离PBMC,对后续分子生物学实验无影响。

摘要：目的:探讨小鼠外周血单个核细胞(PBMC)最佳分离条件,提高细胞获得率与纯度,以便后续分子生物学实验。方法:小鼠摘除眼球取血,设置离心力、离心时间、实验环境温度等梯度优化,分别采用EDTA-K2、肝素、枸橼酸钠抗凝,Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞,直接进行贴壁培养和分析获得率、纯度,计数存活率。结果:Ficoll密度梯度离心法经条件优化后分离的PBMC纯度可达85%,细胞获得率最高可达80%以上,活细胞百分率在92%以上。结论:Ficoll密度梯度离心法在优化条件下可有效地分离PBMC,对后续分子生物学实验无影响。

分离纯化 篇11

近年来,从自然资源中提取具有生物活性化合物的研究日益引起了人们的广泛关注。源于植物中的抗肿瘤药物紫杉醇及抗疟活性成分青蒿素的发现促使人们特别是工业界人士开展更广泛的研究。研究人员竭力研究高效的分离筛选方法,试图从植物、海洋生物及微生物等自然资源中发现新的有效化合物,同时也需要一个快速、有效的分离方法以分离目标化合物。因此,学术界及工业界都需要有效的制备分离技术及其应用经验。

高压制备液相色谱是一种使用高压、大流量输送系统在高分辨率、大内径、高载量分离柱上进行样品高纯度分离的液相色谱制备方法。应用该方法分离的产品在纯度、回收率、分离效率等方面远远优于传统的制备方法,因此在生物制品、药物研究和生产领域都得到了广泛应用。

在对高压制备液相色谱分离纯化过程进行优化时,影响分离纯化效果的因素有很多,包括填料尺寸大小,色谱柱的柱径、柱长、上样量以及流动相的组成、流速等。将分析系统放大到制备型液相色谱意味着需要使用更大的制备柱、更高的流速和根据色谱柱的长度增加进样量,在分析型液相色谱中,研究者已广泛研究过填料尺寸、柱尺寸大小以及上样方式等对分离效率的影响,但对制备型液相色谱分离纯化过程进行优化的研究却鲜有报道。

本文利用自行生产的高压制备液相色谱装备,对千层塔中的石杉碱甲的制备分离过程进行了实验研究,着重考察了填料大小、柱尺寸大小以及上样方式对柱效和分离度的影响。

1实验部分

1.1仪器和试剂

DASIO C18填料(dp=10、20、30、40 μm,苏州麦可旺志生物技术有限公司);高压制备液相色谱柱(ID 50 mm× 650 mm、ID 50 mm×1 000 mm、ID 150 mm×650 mm); 动态轴向加压液压站(聊城万合工业制造有限公司); 制备高压输液泵:GLP3250;紫外—可见检测器:UC-3292; Rheodyne3725i六通进样阀;色谱工作软件及电脑。此外,还有高效液相色谱仪、高速离心机、旋转蒸发仪。

氯仿、甲醇、氨水、硫酸、氢氧化钠、纯水均为分析纯,石杉碱甲对照品(99.1%含量)。千层塔来源于重庆, 经鉴定符合中华人民共和国药典(2010版)规定,均为分析纯试剂,使用前先经过整流处理再用孔径为0.45 μm的微孔滤膜过滤。

1.2工艺流程及方法

本文所建立的高压制备液相色谱装备分离工艺流程如图1所示。样品被注入色谱柱后,通过高压制备输液泵的压力使洗脱液带动样品在固定相中移动,样品组分依据两相间作用能力的差别达到分离的目的,分离后的各组分经检测器检测,再经过工作站软件和数据处理系统的运算处理以图谱的形式呈现,最后通过馏分收集器分通道收集。

注:理论塔板高度值越大,柱效越低。

2结果与讨论

2.1填料大小的影响

在高效液相色谱中,分离过程中的柱效、负荷能力及压降受到填料尺寸的影响。在分析液相色谱中,研究者已广泛研究过填料大小对分离效果的影响。但在制备液相色谱中,对填料尺寸进行优化研究却少有报道。 Eisenbeib等对不同填料大小的制备液相色谱过程进行了研究,认为在制备液相色谱中,使用大颗粒填料并适当增加柱长,可使分离效果基本不下降。从目前的研究现状来看,有关制备液相色谱的色谱填料尺寸优化问题还没有得到很好的解决。本文利用自行设计的高压制备液相色谱分离装备,通过千层塔中石杉碱甲的分离纯化,对填料尺寸对分离性能的影响进行了研究。过程分离性能以石杉碱甲的分离度及柱效来表示。

为考察填料大小对制备分离效果的影响,本文采用不同大小的色谱填料,对高压制备液相色谱过程进行了研究。图2给出了不同粒径下流动相流速对柱效的影响。结果表明,当其他条件相同时,柱效随填料粒径的增大而降低。

对于高压制备液相色谱,在超载程度不是很高的情况下,分析型液相色谱的分离度公式仍可使用:

式中R———分离度;

a——— 相对保留值;

R' ——— 容量因子;

L——— 柱长, mm;

H———塔板高度,mm。

由以上公式可以看出,分离度与理论塔板高度的平方根成反比,与柱效则成正比。由于柱效随填料粒径的增大而降低,则分离度随填料粒径的增大而下降。 图3给出了不同粒径下流动相流速对石杉碱甲分离度的影响,结果表明,当其他条件相同时,石杉碱甲的分离度随填料粒径的增加而下降。

从上可以看出,采用小颗粒色谱填料可以提高柱效和分离度,但是,颗粒越小,柱压就越大。图4是在不同粒径下柱压与流速的关系曲线,结果表明,粒径减小时柱压增大,且会受到泵能力的影响。

综上,高压制备液相色谱分离过程使用小颗粒填料,可获得良好的分离性能,柱效高,分离效果好。但是,小颗粒填料价格较贵,并且对泵的要求会提高,从而增加成本。故在可以满足分离要求的前提下,尽量使用大颗粒填料,以提高生产能力,并且价格较低,节省成本。

2.2柱尺寸大小的影响

迄今为止,在制备液相色谱中,Godbile等研究了分离过程中柱尺寸大小对制备量的影响,Knox等发现大直径柱可获得较高的柱效,但是对柱尺寸对分离性能的影响研究还不够完善,需要进一步深入研究,这是制备液相色谱技术能否大规模应用于工业分离过程的关键所在。本文利用自行设计的高压制备液相色谱分离装备,通过对千层塔中石杉碱甲的分离纯化,研究了柱尺寸对分离性能的影响。

2.2.1柱长的影响

为考察柱长对制备分离效果的影响,本文采用ID 50 mm×650 mm、ID 50 mm×1 000 mm这2种不同柱长的柱子,对高压制备液相色谱分离过程进行了研究。图5给出了不同柱长下流动相流速对柱效的影响,结果表明,当其他条件相同时,柱效随柱长的增大而降低;图6是不同柱长下流动相流速对分离度的影响,结果表明, 当其他条件相同时,柱长增大,可显著提高分离度。

图7是不同柱长下流动相流速对压力降的影响,可以看出,虽然增加柱长可以显著提高分离度,但是也使柱压明显提高,对泵要求也相应提高。因此,在高压制备液相色谱分离过程中,为了提高分离效率,获得较高的分离度,对于较难分开的化合物,可以采取增加柱长的办法;但若在可以满足分离要求的前提下,考虑到成本,要尽可能采用短柱来进行分离。

2.2.2柱径的影响

为考察柱径对制备分离效果的影响,本文采用ID 50 mm ×650 mm、ID 150 mm ×650 mm这2种不同柱径的柱子,对高压制备液相色谱分离过程进行了研究。图8给出了不同柱径下流动相流速对柱效的影响, 结果表明,当其他条件相同时,柱效随柱径的增大而降低。图9是不同柱径下流动相流速对分离度的影响,结果表明,当其他条件相同时,柱径增大,分离度下降。可见增大柱径,会使总的分离性能下降,但大柱径可以提高柱容量,增加制备量。故在可以满足分离要求的前提下,要尽可能地采用大柱径柱子来进行分离。

2.3上样方式的影响

在高压制备液相色谱中,厂家为节省成本,必然要尽可能地提高分离效率并增加产量。为提高产量,可采用柱超载的上样方式,柱超载分为2种:质量超载(使用较小的样品注入体积,增加样品浓度)和体积超载(保持较低的样品浓度,增加样品的注入体积)。高压制备液相色谱中,在满足分离要求的前提下,尽可能采用质量超载的方式进样,可以显著提高进样量。当一次需要处理的上样量太大,导致浓度过高或分离效果达不到要求时,宜采用体积超载的方式进样。

3结语