克隆纯化（精选6篇）
克隆纯化 篇1
摘要：为了研究猪磷酸酶和张力复合物 (PTEN) 在感染高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 (PRRSV) 后的表达量变化, 验证PTEN在PRRSV感染肺脏过程中引起的肺损伤和呼吸窘迫综合征的作用, 试验对猪的PTEN基因进行了克隆表达, 并对其蛋白进行了纯化。结果表明:成功地克隆并表达了猪PTEN基因。
关键词：猪,肺脏,PTEN基因,克隆,表达纯化
磷酸酶和张力复合物 (phosphatase and tensin homolog, PTEN) 在细胞的生命过程中发挥重要作用, 例如细胞存活、增殖、能量代谢和细胞结构。和p53相同, PTEN是最重要的肿瘤抑制子之一[1]。作为一种双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因, PTEN编码的双重特异磷酸酶活性蛋白可以反向调控PI3K/Akt信号传导途径, 是继p53之后又一个参与多肿瘤发生相关的抑癌基因, 在肿瘤方面研究广泛。目前, 对PTEN的研究已扩展到心力衰竭、动脉粥样硬化和神经系统疾病等。
PTEN基因在肺癌组织中的表达较正常肺组织有所降低, 其降低可能在肺癌的发生发展过程中起重要作用, 且该基因的表达与肺癌患者的性别无显著相关, 而与肺癌的病理类型、组织分化程度、临床分期, 以及有无淋巴结转移密切相关[2,3]。用放线菌素D处理后, 肺癌细胞PTEN m RNA降解速率比正常肺上皮细胞降解速率明显加快[4]。此外, 在哮喘病发病过程中也发现PTEN表达量上升, 表明其在呼吸道炎症中也发挥重要作用[5,6]。
高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 (PRRSV) 感染也可引起急性呼吸衰竭、哮喘等症状, 在感染PRRSV的猪肺脏蛋白质组学研究中, PTEN在感染14 d后表达量显著增加[7]。鉴于PTEN在体内发挥多重生物作用, 人们推测其可能参与肺脏中蛋白和脂质磷酸化的调控。为了验证蛋白质组学结果的可靠性, 研究PTEN在PRRSV感染肺脏过程中的作用, 试验对猪的PTEN基因进行了克隆表达, 并对其蛋白进行了纯化, 为制备猪PTEN抗体提供物质基础。
1 材料
1.1 质粒与菌体
大肠杆菌BL21和DH5α感受态, 购自南京金斯瑞生物技术有限公司;p MD19-T载体, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;原核表达载体p GEX-6p-1 (分子质量约为28 ku的GST蛋白谷胱甘肽S-巯基转移酶) , 杨凌职业技术学院动物传染病实验室保存。
1.2 试剂
T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶Eco RⅠ/XhoⅠ、Prime ScriptTM反转录试剂盒、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG) , 均购自Ta KaRa公司;TRIzol, 购自GIBCOBRL公司;质粒提取DNA胶回收试剂盒, 购自Omega公司;HRP标记的羊抗鼠二抗, 购自博奥森公司;ECL发光试剂盒, 购自Pierce公司;PVDF膜, 购自Millipore公司。
2 方法
2.1 猪PTEN基因的分子克隆
根据NCBI上猪PTEN基因序列 (Gen Bank登录号NM_001143696) , 用Premier Primer 5.0软件设计1对特异性引物 (由南京金斯瑞生物技术有限公司合成) , 预计扩增片段为543 bp, 序列为P1 5'-CG-GAATTCAAGATATATTCCTCCAATTCA-3';P2 5'-CCGCTCGAGAACTTTTGTAATTTGTG-3' (下画线处分别为Eco RⅠ/XhoⅠ的酶切位点) 。采用TRIzol法从猪肺脏中提取总RNA, 用Prime ScriptTM反转录试剂盒合成c DNA第1链。以c DNA为模板进行PCR扩增, 反应体系:反转录产物1μL, 上、下游引物各1μL, 10×Easy Taq Buffer 2.5μL, d NTPs 2μL, Easy Taq (5 U/μL) 0.5μL, 加灭菌纯化水至25μL。反应条件:95℃5 min;94℃45 s, 50℃45 s, 72℃2 min, 共32个循环;72℃延伸10 min。
用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 并用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段, 再与p MD19-T载体连接, 并转化大肠杆菌DH5α感受态;挑取阳性克隆, 摇菌, 采用菌液PCR进行鉴定, 将其命名为p MD19-PTEN;取阳性重组质粒送至南京金斯瑞生物技术有限公司测序。
2.2 PTEN原核表达载体的构建
测序正确后, 将回收的PCR产物进行Eco RⅠ/XhoⅠ双酶切, 回收产物后, 与经过同样双酶切处理的表达载体p GEX-6p-1在4℃下连接过夜;连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态, 筛选阳性克隆进行双酶切鉴定, 提取质粒后转化大肠杆菌BL21感受态, 筛选阳性克隆再次进行Eco RⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定, 将其命名为p GEX-PTEN。
2.3 PTEN原核表达载体的诱导表达与鉴定
将含有p GEX-PTEN重组质粒的BL21按照10 m L/L的接种量接种至含100μg/m L氨苄西林的LB液体培养基中, 37℃振荡培养2~3 h;当菌液OD600值达到0.5~0.6时, 加入IPTG诱导, 同时培养、诱导表达质粒p GEX-6p-1的空载体和未加诱导剂的受体菌, 分别将其作为空白和阴性对照。设IPTG终浓度分别为0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mmol/L, 依次取样, 处理上清液, 取沉淀用12.5%SDS-PAGE检测, 以获得最佳表达条件。
2.4 PTEN融合蛋白的Western-blot检测
将含有p GEX-PTEN重组质粒和p GEX-6p-1空白载体的BL21用浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导后, 处理样品进行SDS-PAGE, 蛋白转运至PVDF膜上, 用含5%脱脂奶粉的PBS液于4℃封闭过夜;用GST标签的单克隆抗体 (1∶3 000) 室温孵育2 h;PBST洗涤3次, 每次3 min;用HRP标记的羊抗鼠二抗 (1∶8 000) 室温孵育2 h;PBST洗涤3次, 每次3 min;用ECL显色试剂盒发光显色, 暗室中曝光, 然后显影、定影。
2.5 PTEN融合蛋白的纯化
电洗脱纯化法是用来纯化包涵体蛋白的一种常用方法。按照上述筛选的最佳诱导条件培养600 m L菌液, 4 000 r/min离心10 min;收集菌体, 凝胶电泳;将凝胶从胶板中取出, 置于预冷的3 mol/L KCl溶液中, 静置5~10 min;在预测的蛋白位置出现白色条带, 用干净刀片将目的条带小心切下, 置于注射器中于-20℃冰箱保存;待凝胶达到一定数量时进行电洗脱纯化;收集洗脱液至EP管中, 取样进行SDS-PAGE检测;其余样品分装, -80℃保存, 备用。
3 结果与分析
3.1 目的片段的扩增
以从猪肺脏中提取总RNA反转录获得的c DNA为模板进行PCR扩增, PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定, 在大约500 bp处出现目的条带, 见图1, 与预期大小相符。
M.DL-5 000 Marker;1.阴性对照;2.RT-PCR产物。
3.2 猪PTEN原核表达载体的酶切鉴定
将构建好的p GEX-PTEN转化至大肠杆菌BL21感受态, 筛选出阳性克隆, 提取的质粒经Eco RⅠ/XhoⅠ酶切鉴定产生了约500 bp和4 900 bp的条带, 见图2, 与预期大小完全相符, 证明PTEN基因已成功插入p GEX-6p-1表达载体。测序结果表明, PTEN基因大小、位置和读码框均正确。
M.DL-5 000 Marker;1.p GEX-PTEN双酶切产物。
3.3 原核表达的目的蛋白的SDS-PAGE检测
试验所选用的PTEN蛋白分子质量约为23 ku, 载体p GEX-6p-1的蛋白分子质量约为28 ku, 因此p GEX-PTEN的融合蛋白分子质量约为51 ku。将IPTG诱导的表达产物进行SDS-PAGE分析, 结果表明在约55 ku处出现外源蛋白条带, 与理论大小相符。IPTG浓度对诱导表达影响不大, 见图3, 其中1.0 mmol/L IPTG的表达量稍高于其他浓度。
3.4 PTEN融合蛋白的Western-blot检测 (结果见图4)
由图4可见, 重组质粒p GEX-PTEN的表达产物在约55 ku处出现特异性条带, 大小与理论值相符;p GEX-6p-1空白载体则出现1条约26 ku的条带, 与GST tag的大小相符。结果说明试验成功地表达了PTEN融合蛋白, 可以进行下一步的纯化。
1~5.p GEX-PTEN IPTG浓度分别为0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mmol/L;M.蛋白质分子质量标准;6.p GEX-PTEN无诱导剂;7, 8.p GEX-6p-1 IPTG浓度为1.0 mmol/L。
M.蛋白质分子质量标准;1.p GEX-PTEN诱导产物;2.p GEX-6p-1空载体诱导产物。
3.5 原核表达蛋白PTEN融合蛋白的纯化
将洗脱液做上样处理后进行SDS-PAGE, 结果表明, 纯化后的样品条带单一, 且蛋白含量很高, 见图5。
M.蛋白质分子质量标准;1.p GEX-PTEN纯化洗脱液。
4 讨论
高致病性猪繁殖与呼吸综合征是一种急性高致死性疫病, 严重危害养猪业。该病与甲型H1N1流感、SARS和西班牙流感等人类重大病毒病同为天然免疫应答过强的呼吸道RNA病毒病, 具体发病机制尚不清楚。PRRSV可感染肺泡Ⅱ型上皮细胞 (PAEC2) 造成损伤, 严重影响肺泡细胞更新并形成持续性感染。在感染后14天PTEN表达量升高的时候, 仔猪临床表现为食欲不振, 腹式呼吸。这些宏观表现和体内基因的异常表达可能存在相关性。
急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征造成多种炎性介质及效应细胞共同参与, 并呈级联放大的炎症继发性损伤与继发性弥漫性肺实质损伤[8], PI3K/Akt信号转导通路是一个促进细胞生长、存活、分化的信号通路。有研究证实, 激活该信号通路, 能保护氧化应激状态下的肺上皮细胞[9]。PTEN蛋白是PI3K/Akt通路主要的负性调节器, 通过磷脂酶活性使PIP3脱磷酸, 抑制PI3K/Akt信号通路[10]。研究发现, 在注射脂多糖之前使用PTEN的抑制剂特异性抑制PTEN, 活化PI3K/Akt信号转导通路能减轻肺实质损伤[11]。
目前, 关于PTEN的研究都集中在各种肿瘤方面, 在肿瘤的发生、肿瘤的各种信号通路中都能发现PTEN发挥的作用。一些病毒的感染过程也会造成与肿瘤类似的病变或者症状, 在这些过程中, PTEN的作用到底是什么还值得人们进一步研究。
参考文献
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SHN3多克隆抗体纯化与鉴定 篇2
SHN3是一种具有跨膜结构的树突细胞因子，我们前期研究发现shn3基因在没有分化的神经干细胞中高表达，而在分化终末的神经细胞中表达较低;随后的研究表明shn3基因可以维持神经干细胞的状态，与神经干细胞的分化有关，各种研究结果显示shn3在神经系统中起着重要作用[1]。
抗体是生物科学研究之中最为重要的科学研究工具之一，利用抗原抗体特异性结合的原理，在蛋白水平上，可以用于各类蛋白的免疫识别，利用免疫共沉淀的方法分离特定蛋白;在细胞水平上，可以应用流式细胞技术区分和鉴定细胞;在组织水平上，则可以分析待检测组织中表达的蛋白质或是显微镜下直接观察[2]。
抗体不仅在科学研究中占据重要地位，随着越来越多的研究转向人类疾病的研究与治疗，抗体的医用价值也备受人们关注。无论是在诱导癌细胞凋亡还是心血管疾病中利用“生物导弹”的导向治疗等，抗体作为新型的治疗手段和药物的医学价值日益显著[3]。
无论是抗体的科研价值还是医用价值的体现，都对抗体的免疫特异性要求越来越高。所以，本实验创新性的改进传统Ig G纯化技术，创新性的通过筛选免疫特异性肽段，并结合亲和层析纯化的方式改进出一种有效地提高抗体免疫特异性的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1实验材料
作者实验室自制SHN3多克隆抗体[4];HEK293T和U251细胞系购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心;Pmal-C2载体和BL21(DE3)表达宿主菌由作者实验室保存。
1.1.2 试剂
Bam HⅠ、SalⅠ限制性内切酶购于Fermanters公司;T4DNA连接酶、Tag酶连接酶购于Takara公司;羊抗兔、羊抗鼠红外标记二抗(Odyssey)购于Invitrogen公司;β-actin抗体购于Abcom公司;mbp抗体购于康为世纪公司;硝酸纤维素膜NC膜(Whatman);IPTG购于北京拜尔迪公司;引物合成于上海捷瑞公司。
1.1.3 引物设计
根据实验室前期所制备的鼠源shn3 c DNA中130～228位碱基序列，设计抗体纯化特异性片段复性引物。4条片段复性后分别用Bam HⅠ、SalⅠ限制性内切酶插入到Pmal-C2载体中，引物序列如下:
1.2 方法
1.2.1 重组表达载体的构建
将合成好的4对引物用灭菌后的dd H2O稀释到100μmol/L，再用1*Annealing Buffer稀释至10μmol/L，分别取上下游引物25μl混合后运行Anneal PCR程序。Anneal PCR程序为:先95℃预变性10min，再按从95℃至25℃每3min降低5℃复性，得到PCR产物回收，dd H2O溶解4℃保存。Pmal-C3载体Bam HⅠ、SalⅠ限制性内切酶双酶切过夜，割胶回收后分别与复性后4个片段T4DNA连接酶16℃连接过夜，构建PmalC2-Part-1、Pmal-C2-Part-2、Pmal-C2-Part-3、PmalC2-Part-4。利用热激法将构建好的载体转化入BL21(DE3)中，菌种PCR鉴定、测序[5]。
1.2.2 融合蛋白的原核表达
从平板上挑单菌落至装有4mL LB培养基的试管中，37℃、220r/min摇床摇约5h，测OD600为0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L进行诱导培养，37℃继续振荡培养4h后，取100μl菌液12 000r/min,5min离心后取上清，100μl 1*SDS-PAGE loading Buffer裂解，孵育器99℃煮蛋白10min,-20℃保存。
1.2.3 Western blotting筛选特异片段
取煮好的蛋白，经SDS-PAGE电泳转入硝酸纤维素膜后，分别用兔抗SHN3多克隆抗体抗体和鼠抗MBP多克隆抗体进行Western blotting，用Odyssey成像系统检测4段重组蛋白。
1.2.4 亲和层析纯化目的抗体
将人工合成筛选出的特异性片段与预先处理膨胀的Thiolsepharose 4B混合装载成柱，4℃旋转混合过夜。将实验室自制SHN3多克隆抗体PBS透析后稀释过柱，得到目的抗体，Western blotting检验亲和特异性[6]。
2 结果与分析
2.1 抗体特异性片段设计
原抗体免疫原为c DNA 130bp～228bp共99个碱基，为了增强抗体识别的特异性，避免杂带，将这99个碱基换分为4个等长且互相重叠的区段，分别为Part-1(112～159bp)、Part-2(142～186bp)、Part-3(172～219bp)、Part-4(202～249bp)四个片段。则片段示意图如图1。
2.2 4个抗体特异性片段阳性克隆PCR鉴定
连接产物经转化、抗性筛选后，挑取克隆菌种PCR鉴定，以每个片段的上游引物和设计的用于鉴定的Part-5下游引物进行PCR鉴定，理论目的片段长为514bp，鉴定结果如图2。
Note:1:Marker;2:control;3:Pmal-C2-Part-1;4:Pmal-C2-Part-2;5:Pmal-C2-Part-3;6:Pmal-C2-Part-4.
2.3 特异性片段的筛选
将鉴定正确的4个载体的克隆测序正确后，原核诱导后抽提蛋白，用抗体Western blotting检验特异性最强的片段，Pmal-C2载体上本身带有标签MBP(麦芽糖结合蛋白)，用MBP抗体作蛋白表达的阳性对照，筛选特性片段。结果表明，4个片段中，Part-3表达的肽段与抗体的特异性最强，则选取Part-3肽段序列人工合成肽段，作为纯化抗体的配基与抗体结合。
Note:1:Part-1;2:Part-2;3:Part-3;4:Part-4.
2.4 Western纯化后抗体特异性
HEK-293T细胞转染人源和鼠源SHN3后，培养48h抽提细胞蛋白，小鼠海马组织蛋白，人源胶质瘤细胞系U251细胞蛋白，Western检验纯化抗体特异性。结果表明，无论是在过表达HEK细胞中，还是在小鼠脑组织细胞人源胶质瘤细胞抽提蛋白中，纯化后抗体杂带减少，免疫特异性明显增强。
3 讨论
抗体不仅是现代生物科学研究的重要工具之一，更在医学治疗方面拥有巨大潜力[7]。然而，无论是科学研究还是医学应用[8]，对抗体的亲和特异性都越来越高。
传统的抗体纯化技术仅是以Ig G特异性蛋白protein A为结合蛋白，纯化得到单一的Ig G抗体，但并不能提高抗体本身的特异性。本研究则是创新的以本实验室自制SHN3多克隆抗体为基础，结合蛋白亲和层析原理[9]，将免疫原分割成更小的片段来减少由于过长的肽段结构而产生的非特异性，筛选并合成亲和特异性最高肽段，再用亲和层析的方法筛选获得与目的蛋白特异性结合的多克隆抗体。
Note:A:Expression of SHN3 in HEK293T cells(1:Murine;2:Humanized);B:The hippocampus of mice;C:U251.
研究结果表明，在原免疫原中确实存在特异性更高更小的片段，以其为亲和层析的结合片段，不仅排除了冗余结构免疫的干扰，同时也将动物免疫过程中的非特异干扰除去。无论是细胞水平还是组织水平的蛋白特异性均获得显著提高。本研究不仅为SHN3的进一步研究提供了更为可靠的工具，也为各种实验室自制非商业性多克隆抗体的纯化提供了较为可行的方法。
参考文献
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克隆纯化 篇3
研究通过对制备的3株水貂细小病毒进行生物学特性及亚类鉴定, 筛选出1株效价与生物学活性较高的单克隆抗体G2a-C9, 且亚类为Ig G2a。而对于Ig G2a类抗体, 最常用的纯化方法为辛酸-硫酸铵沉淀法与Protein A亲和层析法[10], 因此, 本研究对这两种纯化方法进行了比较, 并对Protein A亲和层析法进行了优化, 最终提高了抗体纯化率与回收率, 同时也为该株单克隆抗体抗原表位的鉴定以及后续临床产品的研究和开发奠定了基础。
1 材料
MEV-8Y2脏器毒、F81细胞与骨髓瘤细胞 (SP2/0) , 均由中国农业科学院特产研究所经济动物疫病研究实验室保存;6~8周龄、雄性、健康纯系Balb/c小鼠, 购于长春亿斯生物公司;胎牛血清、无血清培养基, 购于Gibco公司产品;弗氏佐剂、HT、HAT干粉, 购于Sigma公司;PEG-4000, 购于TBD生物公司;FITC标记的山羊抗小鼠Ig G、HRP标记的山羊抗小鼠Ig G, 均购于北京中杉金桥生物技术有限公司;DMEM培养基, 购于Hyclone生物公司;Hi Trap protein-A层析柱, 购于GE公司;单克隆抗体亚类检测试剂盒, 购于SBA公司;DNA提取试剂盒, 购于Ta KaRa公司。
2 方法
2.1 水貂细小病毒单克隆抗体的制备
2.1.1 抗原的制备
将病毒用氯仿抽提后经蔗糖密度梯度离心[11], 在透射电镜下观察病毒粒子结构并对其进行PCR检测[12]。用HI试验测定病毒的血凝效价, 测定病毒蛋白的含量后, -20℃冻存, 备用。
2.1.2小鼠的免疫
将纯化后的水貂细小病毒免疫6~8周龄雄性、健康、纯系Balb/c小鼠, 抗原剂量为100μg/只。一免采用弗氏完全佐剂抗原进行腹腔注射;间隔14 d后进行第2次免疫, 腹腔注射弗氏不完全佐剂抗原, 二免结束后检测抗体效价;三免、四免各间隔14 d, 免疫程序同二免;四免采用不加弗氏佐剂的免疫原进行小鼠腹腔与尾静脉注射。
2.1.3 杂交瘤细胞及小鼠腹水的制备
免疫结束后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞按常规方法进行细胞融合。筛选方法:用纯化的MEV做包被抗原, ELISA方法检测融合细胞上清液中的抗体, 筛选阳性杂交瘤细胞并扩大培养, 将稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株分别命名为G2a-C9、M-C1、M-A5, 于液氮中冻存, 备用。将上述3株杂交瘤细胞株稳定培养后, 分别取5×105个注射于Balb/c小鼠腹腔内诱生腹水[10]。
2.2 单克隆抗体的生物学特性鉴定
2.2.1 杂交瘤细胞的核型分析
对制备的3株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行细胞核型分析, 具体操作方法参照《免疫学常用试验方法》制备杂交瘤细胞染色体, 分别计算3株杂交瘤细胞株的染色体数目。
2.2.2 亚类的鉴定
采用SBA公司的免疫球蛋白标准亚类检测试剂盒对G2a-C9、M-C1、M-A5杂交瘤细胞培养上清液进行免疫球蛋白亚类的鉴定, 具体操作按照试剂盒说明进行。
2.2.3 单克隆抗体G2a-C9的间接免疫荧光鉴定
将MEV-8Y2接种F81细胞, 培养4 d后, 进行间接免疫荧光试验[13], 一抗为G2a-C9杂交瘤细胞上清液, 二抗为山羊抗鼠FITC-Ig G, 设SP2/0细胞培养上清液为阴性对照。
2.2.4 单克隆抗体G2a-C9效价的测定
采用已纯化的MEV-8Y2作为包被抗原, 用间接ELISA检测方法测定G2a-C9单克隆抗体的效价, 血凝抑制效价按常规方法进行。
2.2.5 单克隆抗体G2a-C9的Western-blot分析
取纯化后的MEV-8Y2进行SDS-PAGE检测, 转印至硝酸纤维素膜上, 用5%脱脂奶粉4℃封闭过夜;取一抗为G2a-C9杂交瘤细胞上清液于37℃孵育40 min;二抗为山羊抗鼠HRP-Ig G于室温下振荡1 h;用0.5%TBST洗膜3次后进行TMB显色。
2.3 单克隆抗体G2a-C9的纯化
2.3.1 辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体G2a-C9
将5 m L G2a-C9单克隆抗体小鼠腹水以5 000 r/min离心10 min, 采用辛酸-硫酸铵沉淀方法对其进行纯化, 操作方法参照《免疫学常用试验方法》进行。
2.3.2 Protein A亲和层析法纯化单克隆抗体G2a-C9
先用10倍柱床体积的A液 (p H值调至6.0~7.0, 0.45μm微孔滤膜过滤, 超声除气) 平衡柱子, 上样时每次10 m L (样品与A液1∶1稀释后要先经过0.45μm微孔滤膜过滤) , 流速为1 m L/min, 然后换B液 (p H值调至3.0~4.0, 0.45μm微孔滤膜过滤) 洗脱, 每管收集样品加入200μL/m L中和缓冲液C (1 mol/L Tris-HCl, p H值为9.0) , 防止纯化后的抗体失去活性。
2.3.3 低温无水乙醇-Protein A亲和层析纯化单克隆抗体
G2a-C9先用低温无水乙醇处理小鼠腹水[14], 再经过Protein A亲和层析纯化, 方法同上。
2.4 单克隆抗体G2a-C9纯化后的生物学活性测定
按照常规方法进行HI试验、间接ELISA检测方法测定纯化后的抗体效价, 设SP2/0细胞注射小鼠获得的腹水为阴性对照, 纯化后的单克隆抗体为阳性对照。分别收集不同阶段的洗脱液测定蛋白含量;通过Bandscan软件定量分析电泳条带的百分含量[15], 计算纯化后的抗体纯度与回收率。
3 结果
3.1 抗原的制备结果
纯化后MEV-8Y2脏器毒血凝效价为215, 病毒蛋白浓度为4.8 mg/m L。经磷酸钨负染后, 在透射电镜下可观察到立体对称、无囊膜、直径为20~23 nm的细小病毒样粒子 (见图1) , PCR鉴定得到573 bp的目的条带 (见图2) 。
3.2 单克隆抗体生物学特性鉴定结果
3.2.1 染色体分析结果
取对数生长期的G2aC9、M-C1、M-A5杂交瘤细胞进行染色体制备, 在油镜下进行染色体计数, 每株各选8个细胞, 染色体的数目平均为105, 108, 103, 见257页彩图3。
3.2.2 单克隆抗体亚类的鉴定结果
用SBA生物公司的单克隆抗体亚类检测试剂盒检测3株MEV单克隆抗体, 结果 (见表1) 表明, G2a-C9抗体亚类为Ig G2a、κ链, M-C1、M-A5抗体亚类为Ig M、κ链。
3.2.3 间接免疫荧光鉴定结果
见257页彩图4。由257页彩图4可见, G2a-C9抗体组产生绿色的荧光, SP2/0组细胞培养上清液组没有绿色荧光, 说明G2a-C9抗体与病毒蛋白发生了特异性结合。
3.2.4 G2a-C9单克隆抗体效价的测定结果
G2a-C9杂交瘤细胞培养上清液与小鼠腹水的HI效价分别为29, 210, 经间接ELISA测定后效价分别为1∶2×104和1∶2×105。
3.2.5 Western-blot分析结果
Western-blot分析结果 (见图5) 表明, G2a-C9单克隆抗体组出现60 ku左右的特异性条带, 而SP2/0细胞上清液未见特异性条带, 此结果说明单克隆抗体G2a-C9能识别MEV蛋白上的线性抗原表位。
3.3 G2a-C9纯化后的生物学活性分析结果
单克隆抗体G2a-C9纯化后效价与蛋白含量的测定结果见表2。SDS-PAGE分析结果见图6。
从表2可知, 单克隆抗体经低温无水乙醇沉淀-Protein A亲和层析、Protein A亲和层析、辛酸-硫酸铵沉淀3种方法纯化后HI效价、ELISA效价均有降低, 蛋白含量也有下降, 说明纯化过程中有部分损失, 但结果表明经前者纯化后的抗体损失程度要小于后两者, 抗体纯度与回收率要高于后两者。
由图6可以看出:单克隆抗体G2a-C9纯化前有较多杂蛋白, 但经低温无水乙醇沉淀-Protein A亲和层析纯化后只有大小分别为55 ku和22 ku左右的2条带, 分别为Ig G2a的重链和轻链, 条带清晰无杂带;经Protein A亲和层析纯化后虽条带清晰, 但隐约有少量杂蛋白;辛酸-硫酸铵沉淀法也有55 ku和22 ku 2条带, 但条带相比较前两者清晰度很弱。
4 讨论
随着单克隆抗体技术的不断发展与完善以及其在临床诊断与预防中的重要性日渐突出[16,17], 制备并纯化优质的单克隆抗体显得尤为重要。单克隆抗体在用于抗原检测和抗原表位的分析中对纯度的要求较高;因此, 寻找具有便捷、高效的纯化单克隆抗体的方法具有重要的意义。
Protein A是金黄色葡萄球菌的表面蛋白, 有6个不同的Ig G结合位点, 其中5个位点对Fc片段显示出很强的特异性亲和力, 不同的位点独立地与抗体结合[18,19]。A蛋白对哺乳动物的Ig G2a类抗体具有较高的亲和力和特异性, 使之非常适合用于纯化、浓缩细胞培养上清液和经小鼠腹水生产的单克隆抗体。辛酸在偏酸性的条件下可以将除Ig G以外的蛋白质都沉淀下来, 再利用硫酸铵盐析法将Ig G进一步纯化, 此方法成本较低且较为常用。本研究鉴定的3株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞中, 有2株是Ig M类, 1株是Ig G2a类, 在动物机体免疫过程中Ig G类抗体占主要地位;因此, 采用以上两种方法对Ig G2a类抗体G2a-C9进行纯化, 结果表明:辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后的单克隆抗体回收率小于45%, 抗体纯度小于90%;用Protein A亲和层析法纯化时, 单克隆抗体的回收率大于58%, 抗体纯度大于90%, 且ELISA效价为1∶5×104 (大于辛酸-硫酸铵沉淀纯化后的ELISA效价1∶2×103) ;因此, Protein A亲和层析更适用于Ig G2a类单克隆抗体的纯化。
Protein A亲和层析虽然可以大量快速纯化单克隆抗体, 但由于培养杂交瘤细胞的胎牛血清含有各种类型的免疫球蛋白, 也有与层析柱结合的能力;因此, 纯化过程中会受到其他免疫球蛋白的干扰。为了减少抗体的损失和对亲和层析柱的损害, 本研究依据低温无水乙醇可以沉淀多种类型免疫球蛋白的原理, 先将各种免疫球蛋白沉淀下来, 再根据Ig A与Ig M的等电点, 调节缓冲液p H值为5.1, 使Ig A和Ig M类免疫球蛋白沉淀, 离心后上清液中保留了大部分Ig G类免疫球蛋白[20]。经过Protein A亲和层析柱即可获得高浓度、高纯度的Ig G2a。本研究结果表明, 经低温无水乙醇沉淀-Protein A亲和层析纯化后的单克隆抗体纯度达到95%, 回收率达到65%, 高于单纯的Protein A亲和层析法和辛酸-硫酸铵沉淀法。
克隆纯化 篇4
乙型肝炎病毒(hepatitis virus,HBV)的慢性感染是导致肝细胞癌(HCC)发生的主要原因之一,而HBV相关的HCC排名十大癌症之一[1]。目前,全世界HBV慢性感染患者有两亿人,因此,HBV对人类的健康仍然是严重的威胁。尽管HBV相关肝癌的致病机理仍然不清楚,但有证据表明,HBX蛋白在 HCC 的发生和发展过程中有重要的作用[2]。
乙型肝炎病毒含4个编码病毒蛋白的开放读码框(ORF),其中X基因ORF编码HBV X蛋白(HBX),HBX蛋白是一种多功能的调节因子,它直接或间接地通过与宿主蛋白的相互作用参与调节转录、信号传导、细胞周期、蛋白降解、细胞凋亡和遗传稳定[3,4]。目前研究认为HBV中的最小标码阅读框HBX基因具有反式激活功能,在病毒的感染、宿主细胞的凋亡、肝癌的发生以及病毒与宿主细胞相互作用的过程中都起到十分重要的作用[1,5]。本研究主要通过表达、纯化HBX蛋白,为进一步研究HBX蛋白与宿主蛋白之间的关系奠定一定的实验基础。
1 材料与方法
1.1 菌株与质粒
E.coli BL21,JM109,DH5α由本实验室保存,乙肝病毒由第四军医大学微生物教研室提供。pMD18T购自大连TAKARA公司。
1.2 试剂
蛋白胨和酵母提取物购自Oxoid公司;氨苄青霉素和卡那霉素购自Sigma公司; Amylose Resin购自NEB公司;离子交换树脂购自Bio-Rad公司;质粒抽提试剂盒和凝胶回收试剂盒购自Omega公司;透析袋购自Minipore公司;Taq DNA聚合酶,T4 DNA连接酶,限制性内切酶及DL2000、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)均购自大连TAKARA公司。质粒小量抽提试剂盒和胶回收试剂盒购自BBI公司。IMAC纯化试剂盒购自Novagen公司。
1.3 含HBX基因重组质粒的构建、表达、纯化及筛选
1.3.1 HBX基因组DNA的提取
裂解液煮沸提取DNA,曲100 μL血清加50 μL裂解液(10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,15 mmol/L NaCl,0.5%SDS,pH8.0),沸水煮沸30 min,12 000 r/min离心15 min,吸取上清液,-20 ℃ 保存备用。
1.3.2 HBX重组质粒的构建
以获得的HBV基因组为模板,用Expand High Fidelity PCR System扩增HBV的全基因组,PCR产物用 1.0%的琼脂糖电泳后胶回收,用TOPO XL PCR Cloning 试剂盒构建pCR-XL-TOPO-HBV质粒(P1:5‘-CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTAATCA-3’;P2: 5-CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGG-3)。以pCR-XL-TOPO-HBV质粒为模板,用Expand High Fidelity PCR System扩增HBX基因,引物设计引物,HBX F:5’-TCGAAGCTTATGGCTGCTAGGCTGTGCTGC-3’含Hind III酶切位点 (下横线),HBX R:5’- TGAGAATTCCCCAAGCTTTTAGGCAGAGGTGAA￣A￣A￣A￣G￣ -3’含EcoR I酶切位点(下横线)。PCR反应条件:94 ℃预变性5 min,94 ℃50 s,55 ℃50 s,72 ℃1 min,共30个循环,72 ℃延伸3 min。将PCR产物与pMD18-T载体连接,标记为pMD18-HBX。Hind III、EcoR I双酶切鉴定,将筛选出的阳性克隆双向测序(由北京奥科生物技术有限公司完成测序)。Hind III、EcoR I双酶切pMD18-HBX及pProExHTa空载体,凝胶回收HBX目的片段及pProExHTa酶切载体,利用T4 DNA连接酶连接并转化到E.coli BL21,阳性克隆接种于5 mL含100 mg·L-1 氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养液,37 ℃振荡培养过夜,将过夜培养物以1:100的比例转接与100 mL新鲜的LB培养基,37 ℃振荡培养2 h,待细菌密度达到A600=0.6 ～0.8时,加入诱导剂IPTG至终浓度1 mmol·L-1,37 ℃诱导4 h,12 000 r·min-1离心5 min收获菌体,重悬于100 μL 1×SDS加样缓冲液中,煮沸使菌体蛋白变性,离心后取上清12 μL进行12 %的SDS-PAGE,观察HBX蛋白的表达量。
1.3.3 表达产物HBX的纯化
将pProExHTa-HBX重组质粒IPTG诱导,收集诱导的菌体并用PBS洗涤2次,而后Native Binding buffer,12 000 r/min,5 min弃上清。沉淀用1×wash buffer连续洗3次,根据菌体重量按Novagen试剂盒溶解包涵体液体,并与菌体充分反应后12 000 r/min离心5 min,上清透析12 h。后取IMAC介质2 mL 500 g/min离心5 min弃上清,Binding buffer洗涤3次加入样品,结合孵育(1—2) h。离心弃上清,用0.5 mL的Elution buffer 洗洗3次,收集洗脱液。
1.3.4 表达产物HBX的鉴定
将纯化的表达产物HBX,利用Western blot 鉴定其生物学活性,HBX表达产物12%SDS-凝胶电泳后,100 V恒压电转1 h,转至硝酸纤维素膜上后用丽春红染色,观察电转是否成功,而后蒸馏水洗涤至无色,10%脱脂奶粉封闭过夜,按1:1 000稀释一抗,二抗用2.5%封闭液稀释与膜孵育1 h。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG,显色并观察结果。
2 结果
2.1 HBX基因的克隆及序列分析
应用所设计的引物进行PCR扩增,从HBV基因组DNA中获得特异性的DNA片段,其大小与文献报道相符,约为465 bp(见图1),将扩增的片段连接入pMD18-T载体,送由北京奥科生物技术有限公司进行DNA测序,测序结果与GenBank数据库所收录的HBX基因的CDS序列一致。
1—核酸Maker DL2000,2—HBX基因PCR产物,3—EcoR I、Hind III双酶切p MD18-HBX重组质粒,4—EcoR I,Hind III双酶切p ProE xHTa-HBX重组质粒
2.2 重组质粒的构建及鉴定
经过EcoR、Hind III双酶切含有目的片段的pMD18-HBX,证实有465 bp的片段插入载体,重组的pProExHTa-HBX表达载体也证实插入了465 bp的目的DNA片段(见图1)。
2.3 重组菌的诱导表达及产物鉴定
将重组子pProExHTa-HBX转化E.coli BL21,37 ℃培养过夜,IPTG诱导表达,对重组子产物进行12%的SDS-PAGE分析,与重组子未诱导菌比较,诱导菌在17 kDa附近有表达条带(见图2)。Western blot结果证明表达蛋白可与HBX mAb特异结合,表明其有一定的生物学活性,同时与病人血清反应也具有相应的生物学活性(见图3)。
2.4 表达蛋白的纯化
成功纯化了HBX蛋白,大小为17 kDa(见图2)。
1—低分子量蛋白Maker,2—BL21中未诱导的重组表达载体pProExHTa-HBX,3、4、5—诱导重组表达载体,6—纯化的HBX蛋白产物
1—蛋白Marker,2—空质粒pProExHTa的阴性对照,3—纯化产物与HBX mA b的特异性结合带,4—纯化产物与HBV病人血清特异性反应条带
3 讨论
近年来,研究发现乙型肝炎病毒X蛋白与乙肝和肝癌的发生与发展有密切关系。HBX蛋白在细胞核内参与乙型肝炎发生相关的转录过程,在细胞质内参与细胞乙型肝炎发生的信号转导[6]。在细胞核内主要参与调控NF-КB、AP-1、CREB和基础转录元件TATA结合蛋白等一系列转录因子的活性,从而参与多种基因转录效应[7]。它既可以反式激活HBV增强子及核心启动子、S基因启动子、SV40 增强子及早期启动子等,还可以激活哺乳类IL-1β和IL-6 重复序列(LTR)及人类免疫缺陷性病毒Ⅰ型(HIV-1)的启动子[8]等。在细胞质内HBV X 蛋白与细胞转导因子ERK、p38、MAPK、Src、Jskl、PI-3k、PSMA1、PS、MA7、TL2 等相互作用,参与细胞的信号转导。如HBV X 蛋白能够与p53 在胞浆内结合,破坏了p53 的负调控,抑制p53 的转录和介导凋亡的活性。
根据最新研究推测,HBX蛋白可能通过3个方面的效应导致肝癌的形成[9]:其一,HBX蛋白可能通过反式激活细胞内与生长、增殖相关的基因,影响DNA的正常复制和转录过程;另一方面,HBV X 蛋白与细胞内的信号转导因子相互作用,促进细胞增殖,并增强细胞的抗凋亡能力;此外,体外实验表明,HBX蛋白还能上调端粒酶活性,这可能是HBV诱发肝癌的另一机制。HBV X 蛋白还能促进肝癌组织血管内皮生长因子的表达。
HBX蛋白至今没有晶体结构,这与HBX的表达有至关重要的作用,已有的研究表明HBX蛋白无论是在大肠杆菌中表达还是在杆状病毒中表达,均会以包涵体形式存在,然后通过变性复性来纯化HBX蛋白。这种表达纯化HBX的方法对HBX蛋白结构有很大的影响,为了能表达出可溶性的HBX蛋白。本研究通过扩增HBX基因,筛选了pET 32a、pQE30 和pProExHTa三个不同的表达载体,结果发现,在pProExHTa表达载体中能可溶性表达的含量相对较高,为进一步开展HBX蛋白与宿主蛋白之间的相互作用奠定实验基础。
摘要：克隆乙肝病毒X基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。用PCR方法从结乙肝病毒基因组扩增出HBX基因片段,克隆至pMD18-T载体中。序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pProExHTa并在大肠杆菌BL21中表达。表达蛋白经SDS-PAG及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。结果成功克隆了HBX基因,并对其在E.coli中进行了表达。SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过IMAC纯化系统获得17 kD纯化蛋白,与文献报道相符。结果成功获得了纯化的HBX蛋白,为进一步研究HBX蛋白与宿主蛋白之间的相互作用奠定基础。
关键词：乙肝病毒,HBX,表达,纯化
参考文献
[1] Keasler V V,Hodgson A J,Madden C R,et al.Hepatitis B virusHBx protein localized to the nucleus restores HBx-deficient virus rep-lication in HepG2 cells and in vivo in hydrodynamically-injectedmice.Virology,2009;390(1):122—129
[2] Hodgson A A,Hyser J M,Keasler V V,et al.Hepatitis B virus reg-ulatory HBx protein binding to DDB1 is required but is not sufficientfor maximal HBV replication.Virology,2012;25;426(1):73—82
[3] Garcia-Saez I, Lacroix F B, Blot D, et al. Structural characterization of HBXIP: the protein that interacts with the anti-apoptotic protein survivin and the oncogenic viral protein HBx. J Mol Biol,2011;405(2):331—340
[4] Clippinger A J,Bouchard M J.Hepatitis B virus HBx protein locali-zes to mitochondria in primary rat hepatocytes and modulates mito-chondrial membrane potential.J Virol,2008;82(14):6798—6811
[5] Lim W,Kwon S H,Cho H,et al.HBx targeting to mitochondria andROS generation are necessary but insufficient for HBV-induced cy-clooxygenase-2 expression.J Mol Med(Berl),2010;88(4):359—369
[6] Kumar M,Jung S Y,Hodgson A J,et al.Hepatitis B virus regulato-ry HBx protein binds to adaptor protein IPS-1 and inhibits the activa-tion of beta interferon.J Virol,2011;85(2):987—995
[7] Xia L M,Huang W J,Wu J G,et al.HBx protein induces expres-sion of MIG and increases migration of leukocytes through activation ofNF-kappaB.Virology,2009;385(2):335—342
[8] Hu L, Chen L, Yang G, et al. HBx sensitizes cells to oxidative stress-induced apoptosis by accelerating the loss of Mcl—1 protein via caspase-3 cascade. Mol Cancer,2011;10:43:1—16
克隆纯化 篇5
关键词：牛AsiaⅠ型口蹄疫,克隆纯化,疫苗,免疫效果
我国近年来奶牛养殖业突飞猛进，全国奶牛存栏近800万头左右，肉用牛、羊等各类优良种畜数量也不断增加，迫切需要优质的牛羊用口蹄疫疫苗。我国自1999年暴发第五次口蹄疫大流行以来，至今仍未能有效地控制口蹄疫疫情，各省区散发和区域性流行现象不断出现，疫情形势异常严峻。我国现行口蹄疫灭活疫苗，由于毒株型别单一，生产工艺相对简单落后，导致疫苗免疫效力低，副反应大，对口蹄疫疾病的预防性较差。对现行口蹄疫灭活疫苗进行生产工艺改进，进一步提高抗原纯度，研制口蹄疫克隆纯化灭活疫苗已变得十分必要和迫切。新研制的克隆纯化疫苗必须进行系统的检验才能推广应用。
一、材料
1. 口蹄疫疫苗
普通牛AsiaⅠ型口蹄疫油乳剂灭活疫苗、克隆纯化的牛AsiaⅠ型口蹄疫油乳剂灭活疫苗均由内蒙古生物制药厂六车间提供。
2. 黄牛、豚鼠和小白鼠
黄牛购自锡盟蓝旗非疫区，豚鼠和小白鼠由内蒙古生物药品厂动物养殖厂提供。
3. 试剂
口蹄疫阳性血清、阴性血清、细胞营养液、中性红、氯化钠、氯化镁谷氨酰胺、硫代硫酸钠、硫柳汞、1%萘黑蓝、PBS液等由内蒙古金宇集团生物制药厂六车间提供。
4. 器材
CO2培养箱、克氏瓶、6孔板、96孔细胞培养板、8孔道可调移液器及尖头、单孔道移液器及尖头、离心机等由内蒙古金宇集团生物制药厂六车间提供。
二、方法
1. 物理性状检验
外观检验：用肉眼观察牛AsiaⅠ型口蹄疫配制成品疫苗的颜色。剂型检验：将双相油乳剂成品疫苗(W/O/W)滴于冷水中观察其扩散情况。稳定性检验：取疫苗10毫升加入离心管中，以3000转/分钟离心15分钟，观察水相与油相的分层情况。粘稠度检验：用1毫升吸管(出口内径1.2mm)，吸取25℃左右的疫苗1毫升，令其垂直自然流出，记录0.4ml所需的时间。
2. 无菌检验
按《兽医生物制品制造和检验规程》(2000版附录448页)进行。
3. 安全检验
用体重350～450克的豚鼠2只，每只皮下注射疫苗2毫升;用体重18～22克的小白鼠5只，每只皮下注射疫苗0.5毫升。连续观察7天，均不得出现因注射疫苗引起的死亡或明显的不良反应。
4. 效力检验
(1）实验牛免疫前采血及血清抗体检测
按中华人民共和国农业部畜牧兽医司翻译的世界动物卫生组织(OIE)口蹄疫诊断试验和疫苗标准手册上的方法进行。首先从试验用牛静脉采血，分离血清，56℃30分钟灭活，在96孔细胞培养板上从1:4开始纵向作2倍系列稀释，每孔50ul,然后每孔加入事先滴定好的病毒，每50μl单位体积的病毒悬液应含大约100TCID50(或35～350 TCID50这个可接受的范围内)，同时设对照。包括已知滴度的阳性血清、阴性血清、细胞对照和病毒对照。盖上培养板，置于37℃的CO2(5%)培养箱中和1小时。然后用细胞营养液将细胞制成每毫升106个细胞的细胞悬液，每孔加50μl细胞悬液，置于37℃的CO2(5%)培养箱中培养2～3天。48小时后，显微镜下判读结果，第3天，将板染色(用1%萘黑蓝)30～60分钟，然后，用自来水冲洗。
判定标准：细胞层染成蓝色是阳性(病毒被中和)，不着色是阴性(病毒没被中和)。以血清/病毒混合物的50%终点表示血清的最终滴度，当每孔使用的病毒量在l克1.5～l克2.5TCID50范围内时，且阳性血清在预期滴度的2倍以内，试验有效。
关于终点的确定，不同实验室，解释不尽相同。各个实验室可用从OIE/FAO的WRL获得的口蹄疫标准试剂建立起自己的标准。在WRL，血清最终滴度为1:45或更高者被认为是阳性，滴度1:16～1:32为可疑，需要进一步采样作试验。如果第二次样品滴度为1:16或高于1:16判为阳性，滴度为1:8判为阴性。
(2）疫苗免疫黄牛
用6月龄以上的健康敏感牛(细胞中和抗体效价滴度≤1:8，或鼠中和抗体滴度≤1:4)35头，分为7组，每组5头，分别按1/1头份(2毫升)、1/3头份(0.67毫升)、1/9头份(0.22毫升)颈部肌肉注射普通牛AsiaⅠ型口蹄疫油乳剂灭活疫苗和克隆纯化的牛AsiaⅠ型口蹄疫油乳剂灭活疫苗，第7组设为对照。接种后21睦，连同条件相同的对照牛5头，采血分离血清测定血清抗体。同时每头牛舌上表面两侧分两点皮内注射牛口蹄疫AsiaⅠ型强毒，每点0.1毫升(共0.2毫升，含104个ID50)，连续观察10天。
判定标准：对照牛均应至少3蹄出现水疱或溃疡，免疫牛仅在舌面出现水疱或溃疡，而其它部位无病变时判为保护，除舌面以外任一部位出现典型口蹄疫水疱或溃疡时判为不保护。根据免疫牛的保护数，按Karber法计算被检疫苗的PD50。
三、结果
1. 物理性状检验结果
外观检验结果。成品疫苗为淡粉白色略带粘滞性乳状液。
剂型检验结果。成品疫苗为双相油乳剂(W/O/W)，滴于冷水中呈云雾状扩散。
稳定性检验结果。成品疫苗以3000转/分钟离心15分钟，水相析出不超过0.5毫升。
粘稠度检验结果用1毫升吸管(出口内径1.2毫米)，吸取25℃左右的疫苗1毫升，令其垂直自然流出0.4毫升所需的时间在3～8秒内。
2. 无菌检验结果
成品疫苗经接种4种细菌培养基，48小时后均无细菌生长。
3. 安全检验结果
成品疫苗2毫升皮下注射豚鼠，0.5毫升皮下注射小白鼠。连续观察7天，均不出现因注射疫苗引起的死亡或明显的不良反应。
4. 免疫效力测定结果
(1）试验用黄牛免疫前血清抗体检测结果
试验用黄牛免疫前血清抗体检测结果如表1。
(2）免疫后21天血清抗体检测结果
免疫后21天血清抗体检测结果如表2。
(3）免疫后21天攻毒实验结果
免疫后21天攻毒实验结果如表3
四、讨论与小结
1. 展望血清学方法在疫苗研制中的应用
为了更好的评价疫苗的免疫效果，还应该引进ELISA的方法检测疫苗产生的抗体，同时还可以用流行毒株作中和试验检测疫苗产生的抗体，再用统计学的方法计算抗体滴度的相关性(r)。根据报告，一个毒株免疫产生的抗体，用另外的毒株(如流行毒株)进行中和试验测抗体滴度，如果测得的抗体滴度和本病毒测得的抗体滴度相关性好的话，那么在动物实验中该毒株能很好的保护另外一个毒株(流行毒株)的攻击。
2. 克隆疫苗的免疫效力比普通疫苗明显提高。
3. 克隆口蹄疫AsiaⅠ_AKT03毒株疫苗的PD50比普通疫苗提高2.4倍。
参考文献
[1]谢庆阁主编,口蹄疫[M]109-110.
[2]中华人民共和国农业部主编.中华人民共和国兽用生物制品质量标准[M].1993,140-141.
[3]中华人民共和国农业部主编.中华人民共和国兽用生物制品规程.2000,143-144.
[4]农业部畜牧兽医局译OIE.诊断试验和疫苗标准手册.2002:76-77.
克隆纯化 篇6
1 材料
猪繁殖与呼吸综合征单克隆抗体3D6, 吉林农业大学动物科技学院细胞生物技术实验室制备;医用灭菌石蜡油, Sigma公司产品;15 nm胶体金溶液, 长春优博胜生物公司提供;二氯二甲基硅烷, 瑞典Fluka公司产品;牛血清白蛋白 (BSA) , Roche公司产品;其他试剂均为国产分析纯。
2 方法与结果
2.1 单克隆抗体腹水的制备与纯化
2.1.1 单克隆抗体细胞上清液效价的测定
采用已建立的间接ELISA法。结果表明, 单克隆抗体3D6培养上清液的效价为1∶256, 达到制备腹水所要求的水平。
2.1.2 腹水的制备
取5只10周龄健康的经产Balb/c小鼠, 每只腹腔内注射灭菌液体石蜡0.5 mL, 1周后每只小鼠腹腔注射单克隆抗体杂交瘤细胞1×106个/mL;7~10 d可见小鼠腹腔膨大明显, 此时收集腹水, 3 000 r/min离心10 min;收集上清液再以0.45 μm的小滤器除菌, 用ELISA法测定效价, 用饱和硫酸铵方法纯化抗体后进行分装, -20 ℃保存, 备用。
2.1.3 单克隆抗体腹水的纯化
采用免疫亲和层析法 (应用商品化的蛋白G柱) 对小鼠腹水进行纯化:取腹水10 000 r/min离心20 min, 去除沉淀;用等体积起始缓冲液稀释腹水, 以获得适当的pH值和离子强度;上样, 将缓冲好的样品液2 mL加到亲和柱内, 即2倍溶胀介质的体积 (洗脱前用10倍体积的起始缓冲液洗柱) ;用5~10倍体积的0.1 mol/L glycine-HCl (pH值为2.5) 缓冲液洗脱结合的抗体;洗脱液经核酸蛋白检测仪检测, 接留其值﹥10的组分;亲和柱用5倍体积的0.1 mol/L glycine-HCl (pH值为2.5) 洗脱液再次洗脱后, 用10倍体积的起始缓冲液平衡后即可再次使用 [2] 。
2.1.4 腹水中抗体含量的测定
采用夹心ELISA法。取OD490值在标准曲线性范围内的点计算腹水中抗体浓度, 结果腹水3D6的抗体浓度为1.58 mg/mL, 稀释至1 mg/mL, 小包装分装后-20 ℃保存, 备用[3]。
2.2 胶体金探针的制备与纯化最适条件的确定
2.2.1 玻璃容器的硅化
将玻璃容器洗净, 晾干, 经干热灭菌处理, 将硅烷化试剂 (含5%二氯二甲基硅烷的氯仿) 加入玻璃容器中, 轻轻晃动, 使试剂充分覆盖容器内壁, 室温干燥后备用。专用的清洁器皿用15 nm的胶体金稳定其表面, 然后以超纯水淋洗后备用[4]。
2.2.2 抗体与胶体金结合的最适pH值的确定
目测法:取1.5 mL离心管或硅化的试管5支;在每支试管中加入1 mL规格为15 nm的胶体金溶液;用0.1 mol/L K2CO3将pH值调至6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5;在每支试管中加入50 μL单克隆抗体溶液, 振荡20 min, 静置10 min;在每支试管中加入10%NaCl溶液100 μL, 振荡10 min, 静置10 min;记录仍保持红色的pH值 (为8.0) ;将胶体金溶液的pH值调为8.0-0.4, 8.0-0.2, 8.0-0, 8.0+0.2, 8.0+0.4, 重复上述试验步骤;记录仍保持红色的pH值 (8.0-0.2=7.8) ;确定抗体与金结合的最适pH值 (为7.8) 。
OD值法:根据胶体金颗粒的大小, 在500~560 nm之间测定OD值。以pH值为横坐标、OD值为纵坐标绘制曲线, 曲线最先与横轴相接近点的pH值为7.8, 见图1。故胶体金标记蛋白最适合的pH值为7.8。
2.2.3 抗体与胶体金结合的最佳浓度的确定
目测法:分别取0.5 mL pH值为7.8的胶体金加入到1.5 mL离心管中, 加入单克隆抗体3D6溶液, 使其终浓度分别为5, 10, 15, 20, 25, 30 μL/mL, 振荡混合20 min, 室温放置10 min;然后每管加入100 μL 10%NaCl, 振荡混合10 min, 室温放置10 min;溶液仍保持红色的抗体浓度即为抗体与胶体金结合的最佳浓度, 工作浓度为最佳结合浓度的120%~130%。结果显示, 在胶体金中单抗浓度为20 μL/mL时, 胶体金溶液仍为红色, 即抗体与胶体金结合的最佳浓度为20 μL/mL。
OD值法:根据胶体金颗粒的大小选择不同的波长测定OD值。以抗体浓度为横坐标、OD值为纵坐标绘制曲线, 曲线中抗体浓度为20 μg/mL的点最先与横轴接近, 见图2。故抗体结合最佳浓度为20 μg/mL。
2.3 胶体金探针的制备与纯化及结果
2.3.1 胶体金探针的制备
取5 mL离心管, 加入3 mL胶体金, 用0.1 mol/L K2CO3调pH值至7.8;逐滴加入单克隆抗体3D6 (5 min加完) , 摇动20 min, 室温放置15 min;加入10% BSA至终浓度为1.5%。
2.3.2 胶体金探针的纯化
采用差速离心法将标记的胶体金溶液以4 ℃、3 500 r/min离心20 min;弃去沉淀, 以4 ℃、13 500 r/min离心50 min;吸弃上清液, 加入1/10体积的TBS, 待沉淀充分溶解后重复离心2~3次, 再转到1.5 mL离心管中;将纯化好的胶体金探针用等量的TBS溶液溶解, 电镜下观测标记情况;加入叠氮钠, 置4 ℃保存, 有效期6个月。
2.3.3 胶体金针稳定性试验
影响探针稳定性的因素有很多, 如pH值、温度、盐离子浓度及稳定剂的选择等。分别选择BSA、脱脂奶粉、PEG20000等不同稳定剂进行稳定性试验, 并优化pH值、温度、盐离子浓度等条件, 确定用1%BSA作为稳定剂可以保持胶体金溶液处于稳定的状态[5]。
3 讨论
试验利用现有的猪繁殖与呼吸综合征单克隆抗体与15 nm胶体金结合, 制备了能够应用于快速检测的胶体金探针, 为组装检测猪繁殖与呼吸综合征的试纸条提供了重要的物质基础。试验所选用的原料来源容易, 操作简单, 制成的试纸条可作为监测和诊断PRRSV的常规手段, 利于广泛推广使用。笔者认为, 用该技术实现用PRRSV抗体检测PRRSV抗原, 相对于其他很多类似的试验单纯用抗原检测抗体或者抗体检测抗体而言, 反应更加灵敏。虽然该方法目前只能作为初筛诊断试剂用于PRRSV感染的辅助诊断, 但是在胶体金诊断试纸条技术广泛应用于动物疫病检测方面的现状下, 这种方便、快捷的疫病检测技术将会在猪繁殖与呼吸综合征的诊断和辅助治疗等方面发挥作用。
参考文献
[1]ROPP S L, WEES C E, FANG Y, et al.Characterization of emer-ging European-like porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in the United States[J].J Virol, 2004, 78 (7) :3684-7031.
[2]朱立平, 陈学清.免疫学常用实验方法[M].北京:人民军医出版社, 2000:441-442.
[3]陈义平.猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的高效可溶性表达和检测血清抗体的间接ELISA方法的建立[D].扬州:扬州大学, 2003.
[4]TIMO K, FRAN K, GHANS B, et al.Immunochromatographic assay for determination of botulinum neurotoxin type D[J].Sensors and Actuators B:Chemical, 2006, 113 (2) :582-589.