甘蔗基因克隆研究

甘蔗基因克隆研究（精选9篇）

甘蔗基因克隆研究 篇1

大豆抗病基因 (Resistance gene, R基因) 的克隆一直被研究者所关注, 克隆抗病基因的经典方法主要是转座子标签法和图位克隆法。这对于基因组小, 且具有高分辨率物理图谱和遗传图谱的植物来说是可行的, 但大豆很难获得转座子突变体。大豆是古四倍体, 基因组复杂, 因此大豆抗病基因的克隆较其它植物发展慢。R基因保守区有助于对抗病基因克隆, 即利用R基因同源序列法来克隆抗病基因, 依此方法在大豆中获得了大量的抗病基因的同源片段。

Yu等 (1996) 根据烟草N基因和拟南芥RPS2基因的NBS区同源序列设计简并引物, 从大豆中扩增并克隆出11类含NBS序列的片段。同年Kanazin等根据烟草N基因、拟南芥RPS2基因和亚麻L6基因的NBS区同源序列设计简并引物, 从大豆中扩增并克隆出9类大豆抗病基因类似序列。定位分析表明, 这些同源片段成簇分布, 提供抗病基因的潜在位点, 有些还与已知抗病基因连锁。尽管这种方法对于鉴定潜在的基因位点是非常有效的, 但对于其功能的鉴定则是非常困难的。因为抗病基因家族的研究表明其中有些成员是无功能的。因而, 从中分离抗病基因同源序列则可以获得由功能的潜在抗病基因成员[1]。

贺超英等 (2001) 根据烟草抗花叶病毒N基因和拟南芥抗丁香假单胞杆菌RPS2基因设计兼并引物, 从大豆抗花叶病毒品种科丰1号的基因组中扩增获得358个克隆, 鉴定出4个通读的且与抗病基因NBS结构域同源的片段:KNBS1、KNBS2、KNBS3和KNBS4。构建了一个高质量的的大豆c DNA文库, 其滴度为4.2×107pfu/ml;并利用所获得的大豆抗病基因同源片段为混合探针, 进行文库筛选, 获得了两个阳性克隆KR1和KR2[2]。KR1长度为3672bp, 有一个完整的编码框, 编码1124个氨基酸的蛋白;KR2长度为1560bp, 为不完整编码框。KR1在结构上与烟草抗花叶病毒N基因具有较高的同源性。它具有TIR、NBS和LRR一系列抗病基因的分子特征, 因而它可能是大豆中具有功能的类似于N基因的一类抗病基因;同时KR1在羧基端具有两个潜在的跨膜区。从可能的细胞中分区上来看, KR1又是一类新的植物抗病基因。RT-PCR分析表明KR1受大豆花叶病毒 (SMV) Sa菌株接种和水杨酸处理的影响。跟N和L6一样, KR1也可通过不同的拼接形成两种m RNA。在正常情况下, 大片段 (KR1, 609bp) 在抗亲科丰1号中是唯一的转录本;而小片段 (NR1, 588bp) 在感亲南农1138-2中占优势, 大片段 (KR1, 609bp) 的丰度则相对较少。用大豆花叶病毒Sa株系分别接种抗感双亲, KR1和NR1均呈诱导表达。在科丰1号中仅有KR1;在南农1138-2中, KR1/NR1的比例随着SMV接种的时间而变化, 最终KR1占优势。此结果预示着KR1可能是一个新的抗花叶病毒基因, 它的表达受SMV的诱导。

利用所获得的大豆抗病基因同源片段为混合探针, 进行文库筛选, 又获得了两个阳性克隆KR3和KR4, 通过RACE方法获得了全长, 其中KR3长度为3672bp, 有一个完整的编码框, 编码1124个氨基酸的蛋白。KR3与烟草抗花叶病毒N基因具有较高的同源性 (相似度为28.1%) , 具有TIR和NBS等抗病基因具有的保守结构域。KR3的表达受水杨酸诱导, 因此可能是大豆中具有功能的类似N基因的一类抗病基因。KR4全序列为3818bp, 编码1211个氨基酸, 在GenBank中的注册号为AF502080。KR4在结构上与水稻抗白叶枯病基因Xa1有16.0%的相似性, 具有NBS、LRR等抗病基因的结构特征。Southern结果证明KR4在抗病材料科丰1号和南农1138-2中具有多态性, 连锁分析将KR4定位在E连锁群[3]。KR4的表达受水杨酸的诱导, 大豆花叶病毒株系Sa和N3的接种都能够诱导KR4的表达, 因此KR4可能参与大豆抗SMV的过程。

杨秀红 (2005) 根据拟南芥RPS2基因、烟草N基因和亚麻L6基因的保守结构域设计简并引物, 从大豆抗疫霉根腐病品种绥农10号的RNA中扩增获得了100个克隆, 从中鉴定了两个通读的且与抗病基因NBS结构域同源的序列RNEA-1和RNEA-2, 这两个序列长度均为513bp, 编码171个氨基酸, 编码产物在结构上均具有NBS结构域的P-环, Kinase-2a和Kinase-3a区及保守的疏水结构域HD[4]。序列与结构上的同源性表明RNEA-1和RNEA-2为大豆抗病基因同源片段。RNEA-1与从携带有抗疫霉根腐病基因 (Rps2) 的大豆近等基因系中获得的Class D类大豆同源序列在分类上比较近源, RNEA-1与Class D同源性高达91%。Class D被定位在大豆J连锁群上, 与大豆Rps2、rmd基因有关 (Yu, 1996) 。

以RNEA-1为靶序列, 采用RACE技术获得了全长3574bp的大豆抗病相关基因SR1, 该基因包括3411bp的开放读码框, 72bp的5′非翻译区, 68bp的3′非翻译区和20bp的多聚腺普酸尾。在73bp处有ATG起始密码子, 在3484bp处有TAA终止密码子, 编码1137个通读的蛋白质氨基酸序列。SR1基因是NBS-LRR类抗病基因:这类基因的共同特点是, 在它们编码蛋白的近氮端存在着NBS, 而在它们的近碳端则由LRR组成。SR1基因编码产物具有TIR、NBD、LRR等一系列抗病基因的保守结构。TIR结构域是高度同源于哺乳动物和果蝇的信号传导的受体, 可能与激活防卫基因的转录因子有关。与烟草的N基因、亚麻的L6基因及拟南芥的RPP5等基因类似, SR1基因N端有142个氨基酸序列为TIR结构, 可能在抗病反应中起着类似的作用。NBD结构域具有激酶活性, 此结构暗示着它们在发挥正常功能时有可能需要结合ATP或GTP可以激活其它的功能蛋白。LRR结构被认为在蛋白质的相互作用中起重要作用, 它不仅参与抗病反应的识别, 还与识别以后的抗病信号的传导有关。胞质LRR的保守序列模式为"Lxx Lxx Lxxxx CxxL", SR1基因的LRR区含有此保守序列, 可能位于胞质。

丁海等 (2003) 根据已知抗病基因的NBS保守序列区设计4对简并引物和1对特异引物, 以大豆农家种兴县灰布支黑豆为材料, 应用PCR方法获得了11条来自基因组DNA的RGA序列和2条来自c DNA的RGA序列, 序列长度在500-633bp之间, 其中8条来自基因组DNA和2条来自c DNA的RGA序列已在GenBank登录。这些序列都不同程度的含有NBS保守区的P-环 (GGVGKTT) , kinase-2 (VLDD) , kinase-3 (GSRII) 及跨膜区GLPL等特征结构的序列, 由此推导出的氨基酸序列同已知抗病基因L6, RPM1, RPS2, N编码的氨基酸序列表现出从25%~42%的同源性[5]。

Bhatta (2005) Rps1k位点, 克隆得到高同源性的四个基因Rps1k-1、Rps1k-2、Rps1k-3和Rps1k-4, 编码蛋白的保守结构域为CC-NBS-LRR[即卷曲结构 (Coiled Coil) 、和核苷酸结合位点 (Nucleotide Binding Site) 结构域、亮氨酸重复序列 (Leucine-Rich Repeat) ], 按照序列特征分类可分为两类:其中Rps1k-1, Rps1k-3和Rps1k-4为一类, Rps1k-2为第二类。经转基因验证Rps1k-1具有抗大豆疫霉根腐病功能[6]。

Lightfoot实验室从Forrest的BAC克隆73P6和100BI0中获得了Rhg1和Rhg4的全长c DNA序列, 随着这两个基因的克隆成功, 以及根据基因序列相应设计引物的合成, 相信会使人们对抗性机理有更深刻的理解和认识, 也会使抗大豆胞囊线虫病基因的分子标记辅助鉴定成为现实。

综上可知大豆中已有多个抗病基因被克隆, 为抗病机制研究奠定了基础。

面顶住工件, 增大摩擦力, 甚至把工件顶弯, 造成啃刀现象;过低, 则切削不宜排出, 车刀径向力的方向是工件中心, 加上横进丝杠与螺母间隙过大, 致使吃刀深度不断自动趋向加深, 从而把工件抬起, 出现啃刀。此时, 应及时调整车刀高度, 使其刀尖与工件的轴线等高 (可利用尾座顶尖对刀) 。在粗车和半精车时, 刀尖位置比工件的中心高出1%D左右 (D表示被加工工件直径) 。

2.2工件装夹不牢

工件本身的刚性不能承受车削时的车削力, 因而产生过大的挠度, 改变了车刀与工件的中心高度 (工件被抬高了) , 形成切削深度突增, 出现啃刀, 此时应把工件装夹牢固, 可使用尾座 (上接118页) 11751-11757.

[2]贺超英, 张志永, 陈受宜.大豆NBS类抗病基因同源序列的分离与鉴定[J].科学通报, 2001

摘要：抗病基因是在植物抗病反应过程中起抵抗病菌侵染及扩展的有关基因, 其是Flor经典遗传学基因对基因 (gene-for-gene) 假说中与病原菌无毒基因相对应的一类基因。它存在于植物特定品种中, 在植物生长周期或其中某个阶段进行组成型表达。随着生物技术发展已成功克隆许多大豆抗病基因, 使抗病基因工程出现了质的飞跃。

关键词：大豆,抗病基因,克隆

参考文献

[1]Yu Y G, Buss G R, Saghai-Maroof M A.Isolation of a Supperfamily of Candidate Dis-ease-Resistance Genes in Soybean Based on a Conserved Nucleotide-Binding Site.Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:11751-11757.

[2]贺超英, 张志永, 陈受宜.大豆NBS类抗病基因同源序列的分离与鉴定[J].科学通报, 2001, 46 (12) :1017-1021.

[3]Wang Bang-jun, Zhang Zhi-Gang, Li Xue-Gang, et al.Cloning and Analysis of a Disease Resistance Gene Homolog from Soybean.Acta Botanica Sinica, 2003, 45 (7) :864-870.

[4]杨秀红, 陈庆山, 杨庆凯等.大豆NBS类抗病相关基因的克隆与序列分析[J].高技术通讯, 2005, 15 (2) :71-78.

[5]张文慧, 陈庆山, 杨庆凯.大豆灰斑病1号生理小种抗性基因的SSR标记分析[J].大豆科学, 2004, 23 (3) :169-173.

[6]Bhatta, Hongyu Gao, Narayanan N.Two Classes of Highly Similar Coiled Coil-Nu-cleotide-Binding Leucine-Rich-Repeat Genes Isolated from the Rps1-K Locus Encode Phy-tophthora Resistance in Soybean.MPMI, 2005, 10 (18) :1035-1045.

甘蔗基因克隆研究 篇2

水稻落粒性基因定位与克隆研究进展

水稻落粒性的丧失是水稻人工驯化中的重要事件.容易落粒是导致水稻减产的.主要因素之一,因此落粒性也是水稻育种项目中重点选择的性状.为了阐明落粒性的机理,许多研究者开展了水稻落粒性有关基因的定位和克隆研究.其中,2个控制水稻落粒性的基因(sh4,qSH1)已经被克隆.本文综述了水稻落粒性的基因定位、克隆及进化等方面的研究进展.

作 者：金亮 卢艳 包劲松 Jin Liang Lu Yan Bao Jinsong 作者单位：浙江大学原子核农业科学研究所,杭州,310029刊 名：分子植物育种英文刊名：MOLECULAR PLANT BREEDING年，卷(期)：7(2)分类号：S5关键词：水稻 落粒性 基因定位 克隆

甘蔗基因克隆研究 篇3

凡纳对虾(Litopenaeus vannamei)也被称为南美白对虾,原产于美洲太平洋沿岸水域;近20～30年,凡纳对虾被作为一种抗病力强的外来优良品种引入我国。目前,凡纳对虾已经成为了我国水产养殖业的主要经济品种之一。凡纳对虾的先天免疫系统包括细胞免疫和体液免疫,其中,抗菌肽分子作为一种主要的体液免疫的效应分子,在对抗外源性的病原微生物入侵和侵染的过程中,发挥着直接清除的作用[1]。因此,先天免疫系统中的抗菌肽分子在决定凡纳对虾具有较强抗病力的诸多因素中,具有重要的地位。本文以一种具有单个WAP结构域的抗菌肽基因作为研究对象,克隆该基因的序列,并且对基因序列的同源性、分子进化上的亲缘关系、结构预测等进行了分析;而且,关于该基因的克隆和性质研究未见相关报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

凡纳对虾(Litopenaeus vannamei)购买的是包头市友谊水产市场冷冻保存的冻虾。在实验室待虾体完全溶解之后,采集凡纳对虾的心脏、肝胰腺、鳃、胃、肠、肌肉等组织,快速置于液氮中用于提取总RNA。

1.1.2 主要试剂

总RNA提取试剂盒(TRizol Total RNA Reagent试剂盒)、cDNA第一链合成试剂盒、T-载体PCR产物克隆试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(普通离心柱型)、PCR产物DNA回收试剂盒(普通离心柱型)、DEPC、氨苄青霉素钠、DNA Marker DL2000,购自上海生工生物工程有限公司;其他有机试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取

参照使用说明书,利用TRizol总RNA提取试剂盒提取凡纳对虾的心脏、肝胰腺、鳃、胃、肠和肌肉等组织的总RNA。取适量的用DEPC水稀释后的总RNA样品,利用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量,于-80℃冰箱中保存备用[2]。

1.2.2 cDNA的合成

按照cDNA第一链合成试剂盒(M-MLV法)的操作说明,将总RNA逆转录为cDNA,反转录过程使用的前引物为5’PCR prime(5’-tacggctgcgagaagacgacagaa-3’),后引物为3’anchor R(5’-gaccacgcgtatcgatgtcgact16(a/c/g)-3’)[3]。

1.2.3 引物设计

根据Genbank中公布的凡纳对虾具有单个WAP结构域(single WAP domain)抗菌肽基因(Lv-SWD)的部分cDNA序列,设计目的基因特异的克隆引物F(5’-gcacgagctgattcccaag-3’)和R(5’-tgaaatttgtcctttttac-3’),用来扩增目的基因片段cDNA的完整序列;克隆引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.4 目的片段的PCR扩增

利用设计的基因特异性前引物F和反转录过程使用的后引物3’anchor R引物配对,来扩增目的基因的3’端序列;同时利用设计的基因特异性后引物R和反转录过程使用的前引物5’PCR primer引物配对,来扩增目的基因的5`端序列,以凡纳对虾中提取的各种RNA合成的cDNA为模板进行PCR扩增,PCR条件为:94℃ 3 min、94℃ 30 s、53℃ 45 s、72℃ 45 s、35个循环;72℃ 后延伸10 min[4]。

1.2.5 重组载体的构建与序列测定

使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测目的基因片段的PCR扩增结果,利用PCR产物DNA回收试剂盒(普通离心柱型)进行回收、纯化;之后,参照T-载体PCR产物克隆试剂盒的使用说明将基因片段克隆到T-载体中,通过热激法将重组子转化到DH5α宿主菌感受态细胞中,蓝白斑筛选之后,将阳性克隆子送往上海生工生物工程有限公司测序部,进行基因片段的序列测定[5]。

1.3 生物信息学分析方法

1.3.1 氨基酸序列比对

将克隆得到的凡纳对虾具有单个WAP结构域抗菌肽基因(Lv-SWD)的中间片段测序后获得的5’端和3’端序列进行拼接。将拼接得到的基因序列输入NCBI网络数据库,进行相关基因序列比对(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/)。用Expasy在线软件对这一基因的cDNA序列进行翻译,并对翻译的蛋白质序列进行结构和性质得预测(http://au.expasy.org)。蛋白质序列信号肽和结构域的预测在SMART(Simple Modular Architecture Research Toll)网站上进(http://smart.embl-heidelberg.de/)[6]。氨基酸序列比对利用分子生物学软件DNAMAN完成。

1.3.2 系统进化树的绘制

根据NCBI网络数据库中进行的凡纳对虾具有单个WAP结构域抗菌肽基因相关基因序列比对的结果,选择物种相近的一些生物的抗菌肽基因,进行氨基酸序列分析之后,利用分子生物学软件MEGA 4.0进行系统进化树的绘制[7]。

1.3.3 分子结构的预测

根据Expasy在线软件对凡纳对虾具有单个WAP结构域抗菌肽基因的cDNA序列进行翻译的结果,利用蛋白质分子初级结构域预测工具SMART网站进行分子结构的初步预测[8]。

2 结果与分析

2.1 基因克隆和序列分析结果

根据Genbank中公布的凡纳对虾具有single WAP domain的抗菌肽基因(Lv-SWD)的部分cDNA序列,设计特异的扩增引物。通过基因特异的引物F和3’ anchor 扩增到了完整的3’端,通过基因特异的引物R和5’ PCR primer扩增到了完整的5’端。结果显示:凡纳对虾具有single WAP domain的抗菌肽基因的cDNA序列全长为434bp,开放阅读框的长度为279bp,编码92个氨基酸;其中,N末端的24个氨基酸是信号肽序列,C末端的47个氨基酸形成了一个WAP结构域,当中包括8个保守存在的半胱氨酸残基。并且,在cDNA序列3’末端存在poly A序列,在它的上游21bp位置处存在加尾信号aataaa序列。

2.2 氨基酸序列的同源性分析

将克隆得到的凡纳对虾SWD基因(Lv-SWD)的cDNA序列,在NCBI网上进行基因序列BLAST比对,我们选择了一些相近物种中基因cDNA序列同源性较高的SWD基因,进行氨基酸序列的同源性比对分析,我们发现:斑节对虾的SWD isoform 1基因、斑节对虾的SWD isoform 2基因、斑节对虾的SWD isoform 3基因与凡纳对虾SWD基因在相对应的氨基酸序列上具有较高的同源性。

从凡纳对虾SWD基因(Lv-SWD)与其他物种的SWD基因的氨基酸序列比对结果图中,可以发现:这一类的抗菌肽分子的氨基酸结构中,都包含有一段存在于氨基酸一级结构的N末端的长达24个氨基酸残基的信号肽序列,而且序列的保守程度较高。

2.3 系统进化树分析Lv-SWD与其他结构类似分子的亲缘关系

经过在NCBI网上进行凡纳对虾SWD基因(Lv-SWD)序列BLAST比对,选择一些物种相近的、cDNA序列同源性较高的SWD基因进行氨基酸序列的同源性比对分析之后,利用分子生物学软件MEGA 4.0进行系统进化树的绘制,如图3。在进化树上,Lv-SWD分子与Pm-SWD1分子的亲缘关系最近,分布在了进化树的同一支上。而且,在氨基酸序列方面,Lv-SWD分子与Pm-SWD1分子的相似性为80.65%,表现出了较高的相似性。

2.4 Lv-SWD分子的结构预测

利用Expasy在线软件将凡纳对虾SWD基因的cDNA序列翻译为对应的氨基酸序列,利用蛋白质分子初级结构域预测工具SMART网站进行分子结构的初步预测。初步预测的分子结构如图4,凡纳对虾SWD分子属于典型的具有单个WAP结构域的抗菌肽分子。

3 讨论

凡纳对虾作为一种重要的甲壳类动物,是无脊椎动物的重要代表;不仅是因为它本身具有独特的先天免疫系统,更重要的是,凡纳对虾是我国在对虾类养殖业受到细菌、病毒侵害而大规模爆发虾类疾病,养殖业受到巨大经济损失的情况下,从国外引进的具有优良抗病性状的对虾品种。因此,目前凡纳对虾已经成为了我国对虾类养殖业的主要养殖对象,同时,它的抗病的优良性状也受到广泛关注,尤其是凡纳对虾先天免疫系统中的抗菌肽基因,也是分子生物学研究的重点内容。本文研究的凡纳对虾的抗菌肽基因是一个新发现的具有单个WAP结构域的抗菌肽基因,其编码的蛋白质被称为SWD蛋白质;在基因的cDNA序列方面,Lv-SWD与中国对虾的SWD基因(Fc-SWD)以及斑节对虾的SWD基因(Pm-SWD1/2/3)存在的相似性[9],而且,存在一定的差异;尤其是在氨基酸序列方面,Lv-SWD分子与Fc-SWD分子以及Pm-SWD分子之间存在着异同点,例如,这一类SWD分子N末端都存在18—24个氨基酸残基形成的信号肽序列,C末端都存在由8个半胱氨酸残基组成的WAP结构域。但是,在Lv-SWD分子的信号肽与WAP结构域之间,还存在富含脯氨酸残基的序列(Pro-rich);而且,在Pm-SWD1分子、Pm-SWD2分子的一级结构中,也存在Pro-rich序列,但是,在Pm-SWD3分子中就没有发现Pro-rich序列[10]。此外,在淡水小龙虾中发现的Pc-SWD分子以及中国对虾的Fc-SWD分子的一级结构中,也没有发现Pro-rich序列,而且,经过抑菌实验检测发现,Pc-SWD、Fc-SWD分子没有抗菌活性[11],而且,Pm-SWD1分子、Pm-SWD2分子具有抑菌活性[12],那么,我们就可以推测,在这一类型的SWD分子中,决定抑菌活性的功能结构域不仅仅是具有4对二硫键的WAP结构域,比较重要或者是起到关键作用的是信号肽与WAP结构域之间的富含脯氨酸或者甘氨酸序列(在其他一些具有抑菌活性的SWD分子中存在Gly-rich序列)[13],所以,我们推测在凡纳对虾中新发现的Lv-SWD分子应该具有良好的抑菌活性,而且这些后续的实验结果,对于完善我们针对分子结构与分子功能之间的联系提出的假设具有很好的论证作用。

4 结论

在甲壳类无脊椎动物的先天免疫系统中,细胞免疫和体液免疫同样发挥着对抗病原微生物侵染的重要功能;其中,细胞免疫主要包括黑化作用、结节作用、包囊作用,而体液免疫的重要组成部分就是抗菌肽的产生。而且,在对抗病原微生物侵染的过程中,体液免疫和细胞免疫是同时发挥功能的。目前,对于凡纳对虾的抗菌肽基因研究的不多,而且研究的深度不够。因此本文将凡纳对虾SWD基因(Lv-SWD)作为研究对象,重点进行了凡纳对虾的抗菌肽基因cDNA序列的克隆,而且进行了氨基酸序列的比对分析,以及通过绘制系统进化树来分析研究各个抗菌肽分子与凡纳对虾SWD分子之间的亲缘关系的远近情况;之后,通过登陆蛋白质分子初级结构域预测工具SMART网站进行分子结构的初步预测;对凡纳对虾SWD蛋白质分子的性质与结构进行了详细的研究。我们发现Lv-SWD分子N末端存在由24个氨基酸残基形成的信号肽序列,C末端存在由8个半胱氨酸残基组成的WAP结构域;在Lv-SWD分子的信号肽与WAP结构域之间,还存在富含脯氨酸残基的序列(Pro-rich),推测其具有良好的抑菌活性;这些研究会为下一步的重组表达、抗体制备、基因功能的研究提供重要的研究基础。

摘要：目的:为了进一步探索抗菌肽分子的作用机制,我们以凡纳对虾具有单个WAP结构域的抗菌肽基因作为研究对象,进行分子生物学方面的分析。方法:通过cDNA全长序列的扩增,以及氨基酸序列的比较分析、系统进化树的分析以及分子结构的初步预测,我们对凡纳对虾SWD分子的结构进行了详细分析。结果:Lv-SWD的cDNA序列全长为434bp,编码92个氨基酸;Lv-SWD存在由24个氨基酸残基形成的信号肽序列,以及由8个保守存在的半胱氨酸残基形成的WAP结构域和一段富含脯氨酸的结构基序。结论:通过这些分子结构的研究,以及与其他SWD分子的比较,作者推测Lv-SWD分子是一种具有抑菌活性的抗菌肽分子,它在凡纳对虾的先天免疫系统中应该发挥着重要的免疫功能。

甘蔗基因克隆研究 篇4

人α-防御素基因克隆及其毕赤酵母表达的研究

为探讨人α-防御素(HNP2)酵母表达,根据HNP2氨基酸序列和巴斯德毕赤酵母密码偏爱性,设计HNP2基因序列片段,构建pGAPZαA-HNP2酵母表达载体,转化E.coliJM109,扩增重组子,经限制性核酸内切酶BlnI线性化,转毕赤酵母.PCR扩增挑选阳性转化子,SDS-PAGE分析酵母表达,利用阳离子交换树脂纯化HNP2,开展抗菌试验.结果显示转入巴斯德毕赤酵母HNP2基因得到表达,表达的HNP2具有显著的`抗菌作用.

作 者：李再新 罗惠波 周键 左勇 刘达玉 LI Zai-xin LUO Hui-bo ZHOU Jian ZUO Yong LIU Da-yu 作者单位：四川理工学院生物工程系,四川,自贡,643000刊 名：分子科学学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCE年，卷(期)：200622(4)分类号：Q81关键词：人α-防御素 克隆 酵母表达 抗菌活性

甘蔗基因克隆研究 篇5

1材料

水牛,选自广西南宁市鲁班路屠宰场,采集其新鲜的生殖嵴、心脏、肝脏、颗粒细胞、肺脏、卵丘细胞、 肾脏、下丘脑、垂体、大脑、睾丸、皮肤、骨头、卵巢、肌肉等15种组织细胞。

TRIZol,购自Invitrogen公司; 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒,均购自天根生化科技有限公司; Reverse Transcriptase( AMV) 、LA Taq酶、 限制性内切酶、Oligo d( T) 18T、p MD18 - T载体,均购自Ta KaRa公司; Fast Start Universal SYBR Green Master( ROX) ,购自Roche公司; DH5α 感受态细胞,广西大学动物繁殖研究所提供。

2方法

2.1引物的设计

根据Gen Bank上已知的牛ALK5基因序列( NM_ 174621. 2) 和 β - actin( NM_001290932. 1 ) ,利用Oligo 6. 0软件分别设计了ALK5特异性引物、定量引物及 β - actin定量引物,引物序列见表1。引物由生工生物工程( 上海) 股份有限公司合成。

2.2总RNA的提取和cDNA第一链的合成

采用TRIZol法提取水牛生殖嵴、心脏、肝脏、颗粒细胞、肺脏、卵丘细胞、肾脏、下丘脑、垂体、大脑、睾丸、皮肤、骨头、卵巢、肌肉等15种组织细胞总RNA。 RNA提取后,通过分光光度计及电泳检测其纯度和完整性,并置于 - 80 ℃ 保存,备用。按照AMV反转录试剂盒 ( Ta KaRa公司) 进行反转 录,反应体系 ( 20 μL) : 总RNA 2 μg,Dnase Ⅰ1 μL,DNase Ⅰ Buffer 1. 3 μL,EDTA 1 μL,d NTP 1 μL,随机引物2 μL,5 × AMV Buffer 4 μL,RNase Inhibitor 0. 5 μL, AMV逆转录酶1 μL,用RNase Free H2O补至20 μL。 反应条件: 25 ℃ 5 min,42 ℃ 90 min,95 ℃ 10 min, 4 ℃ 终止。

2.3RT-PCR反应

以反转录产物作模板进行PCR反应。反应体系 ( 20 μL) : 模板1 μL,上、下游引物各0. 5 μL,10 × LA Buffer 2 μL,d NTP 1 μL,LA Taq 0. 3 μL,dd H2O补至20 μL。PCR反应条件: 94 ℃ 预变性4 min; 94 ℃ 变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃ 延伸2 min,共35个循环; 72 ℃ 延伸10 min; 4 ℃ 终止反应。PCR产物用1% 琼脂糖凝胶电泳检测并胶回收。

2.4PCR产物的连接与测序

PCR产物纯化回收后,将目的片段与克隆载体p MDl8 - T连接,然后转化 大肠杆菌 感受态细 胞DH5α,再将菌液涂布在含有氨苄西林( Amp+) 的LB固体培养基上,37 ℃ 培养过夜。通过挑取单克隆在Amp+LB液体培养基中培养,然后进行cracking鉴定并用天根普通质粒小提试剂盒提取重组质粒,将含有目的片段的重组质粒寄至生工生物工程( 上海) 股份有限公司进行测序。

2.5生物信息学分析

测定的结果用BLAST程序进行同源序列比对; 分子进化树构建用MEGA5. 0软件进行构建; 用ExPASy( http: / / web. expasy. org / protparam / ) 服务器分析水牛ALK5编码蛋白氨基酸组成、理论分子质量和等电点等; 利用SMART程序[8]( http: / /smart. embl heidelberg. de) 预测ALK5编码蛋白氨基酸序列可能存在的蛋白结构域; 利用Signl P程序[9]( www. cbs. dtu. dk / services / Signal P / ) 进行蛋白质N - 末端信号肽预测; 通过Softberry( http: / /linux1. softberry. com/ berry. phtml? topic = protcompan&group = programs& subgroup = proloc) 服务器分析ALK5蛋白的亚细胞定位; 利用DNAStar中的Protean程序预测ALK5蛋白质二级结构; 通过SWISS - MODEL程序[10]( http: / / swissmodel. expasy. org / interactive) 分析预测ALK5蛋白质三级结构。

2.6QRT-PCR反应

QRT - PCR反应体系 ( 20 μL) : RT - PCR产物50 ng,2 × Fast Start Universal SYBR Green Master ( ROX) 10 μL,引物F/R( 10 μmol/L) 各0. 3 μL,用RNase Free H2O补至20 μL。 反应条件: 95 ℃ 10 min; 95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,共40个循环。试验对每个样品进行4次重复,运用2- △△Ct的方法计算目的基因的相对表达量。用内参 β - actin对其进行标准化,将水牛卵巢组织作为对照品,其他为检测样品。

3结果与分析

3.1水牛ALK5基因的克隆与鉴定

通过TRIZol法纯化获得水牛组织的总RNA,电泳后可以观察到清晰的18S和28S条带,说明获得了高质量的RNA,可用于下一步的反转录试验。应用设计的特异性扩增引物ALK5 CDS,经RT - PCR扩增获得1 576 bp的特异性条带( 见图1 A) 。将PCR产物连接克隆到p MD18 - T载体,载体大小约为3 276 bp,与预期结果一致( 见图1 B) 。

3.2水牛ALK5基因的序列分析

对获得的阳性重组质粒进行测序分析,获得水牛ALK5基因序列。应用NCBI的ORF Finder程序分析,发现该基 因编码区 全长为1 512 bp,可编码503个氨基酸( 见图2) 。用BLAST软件进行相似性比对分析,结果表明,水牛ALK5核苷酸序列与牛、绵羊、猪、人和小鼠相应序列的相似性分别为99% 、 97% 、95% 、93% 和90% ,说明ALK5基因在不同哺乳动物中具有较高的序列保守性。

3.3水牛ALK5基因系统进化树的构建

选择所克隆得到的水牛ALK5基因序列与牛 ( NM _ 174621. 2 ) 、绵羊 ( XM _ 004004226. 1 ) 、猪 ( AB182259. 1) 、虎鲸( XM_004271476. 1) 、猫( XM_ 003995694. 1) 、大熊猫 ( XM _002914945. 1 ) 、非洲象 ( XM _ 003407567. 1 ) 、人 ( L11695. 1 ) 、马 ( XM _ 001494907. 2) 、中国仓鼠 ( XM _003500109. 1 ) 、小鼠 ( NM_009370. 2) 、大鼠( L26110. 1) 等进行了多重序列比较,结果见图3。

由图3可知,ALK5基因在不同物种中具有较高的保守性。应用MEGA5. 0软件,用NJ法构建系统进化树,结果见图4。

由图4可知,水牛与牛的相应序列聚为一支,与绵羊的遗传距离相对较近,进化树的形态与分类学保持了较高的一致性,进一步说明克隆的为水牛的ALK5基因。

3.4水牛ALK5蛋白质特性的生物信息分析

通过EXPASY服务器分析ALK5基因的氨基酸组成,该蛋白含有503个氨基酸,其中亮氨酸含量最高( 8. 9% ) ,其次是丙氨酸( 7. 8% ) ,色氨酸含量最低 ( 1. 6% ) 。ALK5蛋白理论分子质量为56. 11 ku,等电点为7. 51,为弱碱性蛋白。应用Sign IP程序对ALK5蛋白N - 末端信号肽进行预测,结果表明,水牛ALK5蛋白N - 末端氨基酸第29 ~ 30位存在潜在信号肽位点。通过Softberry服务器分析预测了水牛ALK5蛋白的亚细胞定位情况,结果表明,水牛ALK5蛋白位于细胞质膜上。进一步用SMART程序预测了ALK5基因的蛋白质结构域,结果表明,ALK5存在low complexity和GS结构,分别位于第12 ~ 23和175 ~ 205位氨基酸。随后又对水牛ALK5蛋白质的二级结构和高级结构进行了预测分析。用DNAStar中Protean程序进行蛋白质的二级结构分析,结果见图5。由图5可知,水牛ALK5蛋白质二级结构包含23个 α - 螺旋、15个 β - 折叠、37个转角、30个无规卷曲。应用SWISS - MODEL程序模拟了水牛、黄牛、 绵羊和人ALK5蛋白质高级结构,4个物种间ALK5蛋白结构相似性很高( 见246页彩图6) 。

3.5水牛不同组织中ALK5基因表达分析

以 β - actin为内参基因,应用QRT - PCR技术对水牛ALK5基因在大脑、卵巢、肝脏、皮肤、肌肉和肾脏等组织中的表达情况进行了研究,结果表明: 用于QRT - PCR检测基因表达的定量引物熔解曲线峰图单一( 见图7A、B) ; 水牛ALK5基因在肺脏、垂体和下丘脑3种组织中不表达,在其余12种组织均有表达,其中卵巢中表达量最高,心脏和肾脏次之,肌肉表达量最低( 见图7C) ; 电泳图没有杂带或引物二聚体 ( 见图7D) 。

4讨论

水牛是我国南方重要的肉、乳和役兼用畜种资源,而水牛繁殖性状影响的相关基因研究有关报道较少。本研究克隆得到了沼泽型水牛ALK5基因c DNA全长为1 576 bp,其中编码区全长为1 512 bp,共编码503个氨基酸。多重序列比较分析和核苷酸进化树分析结果表明: 水牛ALK5基因在不同的动物中具有较高的保守性; 通过生物信息学的方法对ALK5蛋白的一级、二级结构和高级结构进行分析预测发现, ALK5蛋白质呈弱碱性,有信号肽,细胞亚定位于胞膜上,存在low complexity和GS结构,其中GS结构含有31个氨基酸( TTLKDLIYDMTTSGSGSGLPLLVQRTIARTI) ,其核心区域为TTSGSGSG,易被磷酸化并传递信号,当核心区域发生2个或2个以上氨基酸突变时,不能被磷酸化; 该蛋白三级结构与牛、羊、人相似。

ALK5作为TGF - β 超家族Ⅰ型受体中的一员, 在传导其配体的功能上发挥着重要的功能,参与心脏发育、骨骼形成、牙齿形成、血管生成和繁殖调控等方面。有学者通过Tie2 - Cre、Nkx2. 5 - Cre、Gata5 Cre介导心外膜、心肌、心内膜条件性敲除ALK5,其中心肌介导的ALK5条件性敲除小鼠心脏发育正常, 但是心内膜介导的ALK5条件性敲除小鼠心脏发育则显著异常,主要表现在上皮细胞转变为间充质细胞异常,即EMT过程异常; 心外膜介导的条件性敲除ALK5小鼠则表现出心外膜与心肌细胞间的连接出现干扰致心 肌较薄[11]。M. E. Mercado - Pimentel等[12]的研究也表明,ALK5在鸡的EMT过程中发挥重要的功能。T. Mercado等[13]通过Dermo1 - Cre介导产生条件性敲除小鼠,发现ALK5对于软骨的形成与功能、成骨细胞的分化有重要的作用。2008年, W. Y. Li等[14]研究发现,Nes - Cre生产的条件性敲除小鼠,由于软骨发育不全而导致唇裂的发生。通过Wnt1 - Cre介导产生的条件性敲除小鼠,新生鼠的牙齿发育推迟,上颚发育受阻,Msx1、Bmp4、Bmp2、 Pax9、Gsc等基因表达规律发生改变[15]。研究表明, ALK5敲除小鼠,后肠内胶原 Ⅰ 型蛋白表达减少,导致原始生殖细胞快速迁移至生殖嵴[16]。此外,有研究表明,ALK5在血管生 成过程中 发挥重要 的功能[17,18,19]。本研究应用QRT - PCR技术检测了ALK5基因在水牛不同组织中mRNA的表达情况,结果表明,水牛ALK5基因在肺脏、垂体、下丘脑3种组织中不表达,在其余12种组织中均有表达,其中卵巢中表达量最高,心脏和肾脏次之,肌肉表达量最低,与其参与机体的繁殖调控、心脏发育等功能相一致。ALK5基因在不同组织中表达差异的分子调控机制仍需要进一步研究。本研究克隆了水牛ALK5基因及分析了其组织表达规律,为后续进一步根据其序列设计TALEN / SiRNA位点研究其功能、探索其配体以及转基因动物的制备等提供一定理论基础。

摘要：为了阐明水牛ALK5基因在水牛卵泡发生过程中的作用,了解其在水牛不同组织中的表达模式,试验采用了RT-PCR及QRT-PCR方法对ALK5基因进行了研究,参考已公布的Gen Bank中牛ALK5基因序列,设计特异性引物应用RT-PCR方法扩增克隆获得目的基因片段;应用生物信息学方法,系统分析和预测了水牛ALK5基因的遗传进化、蛋白质的理化性质、二级和三级结构,并应用QRT-PCR技术对ALK5基因在水牛组织的表达进行了差异分析。结果表明:水牛ALK5基因的编码区全长为1 512 bp,共编码503个氨基酸;水牛ALK5核苷酸序列与牛、绵羊、猪、人和小鼠相应序列的相似性分别为99%、97%、95%、93%和90%,结合系统进化树分析结果推测ALK5基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性;该蛋白呈弱碱性,有信号肽,细胞亚定位于胞膜上,存在low complexity和GS结构,呈典型跨膜蛋白结构;水牛ALK5基因在肺脏、垂体、下丘脑组织中不表达,在水牛大脑、肝脏、骨骼、卵巢、肌肉和心脏等12个组织细胞中具有不同程度的表达,其中卵巢中表达量最高,心脏和肾脏次之,肌肉表达量最低。说明试验成功地克隆了沼泽型水牛ALK5基因,其具备典型的TGF-β受体家族结构,表达具有一定的组织特异性。

甘蔗基因克隆研究 篇6

IFN蛋白家族基于它们的基因序列、染色体定位和受体特异性[2]分为3型,即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型干扰素,Ⅰ型包括IFN - α、IFN - β、IFN - ω、IFN - ε、 IFN - κ[3]、IFN - δ、IFN - τ、IFN - ζ[4]等,但IFN - δ、 IFN - τ、IFN - ζ 只在牛等反刍动物和鼠体内能检测到,在哺乳动物中IFN - α /IFN - β 是多基因家族, IFN - α 包括25个以上的亚型[5],其中IFN - α 基因无内含子。

IFN是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等活性的细胞因子,能通过多种机制影响肿瘤细胞功能,促进免疫细胞的活性[6,7]。IFN本身并非直接抗病毒物质,其抗病毒作用体现在多方面。IFN对于病毒复制的任何阶段都具有靶向作用,包括穿入、转录、 RNA稳定性、翻译起始、成熟、装配和释放过程[8]。 基因工程干扰已广泛地应用于病毒和肿瘤性疾病的临床治疗,取得了明显疗效[9,10,11]。

1材料与方法

1.1食蟹猴鲜血和试剂

p MD18 - T载体、d NTPs( 2. 5 mmol / L) 、Tris - Cl ( p H值为8. 0) 饱和酚、EDTA、DNA细胞裂解液、蛋白酶K、异戊醇、乙醇、琼脂粉、酵母提取物、胰蛋白胨、EX Taq DNA聚合酶、限制性核酸内切酶( EcoRⅠ 和XhoⅠ) ,均购自宝生物工程( 大连) 有限公司; T4 DNA连接酶,购自天根生化科技( 北京) 有限公司; DNA凝胶回收试剂盒、p ET32a载体、Trans1T1感受态细胞以及BL21感受态细胞,自制; 胶回收试剂盒、 质粒提取试剂盒,购自Omega公司。食蟹猴血液,永福县新桂野生动物养殖有限公司提供。

1.2食蟹猴IFN-α基因的提取

取EDTA抗凝外周血液2 m L,加入去离子水裂解8 min; 离心,弃去上清液,取沉淀加入0. 5 m L DNA细胞裂解液悬浮白细胞沉淀并添加蛋白酶K 20 μL, 65 ℃ 水浴0. 5 h; 在室温下,添加0. 5 m L的苯酚 / 氯仿/异戊醇混合抽提液,剧烈地振荡混合10 min; 然后8 000 r / min离心10 min; 将水相移至新的离心管中, 添加1 m L无水乙醇到水相中,混匀,离心3 min; 取沉淀用70% 乙醇洗涤2次,干燥,用50 μL去离子水溶解,保存。

1.3食蟹猴IFN-α基因的引物设计和PCR扩增

参考Gen Bank中松鼠猴( 登录号为AF294759) 、 棉顶狨猴( 登录号为AJ250196) 、人( 登录号为HUMINTAZ) 基因序列设计简并引物,扩增出包含完整ORF序列的引物,上游引物5' - ATGG ( A ) CCTTGACCTTTC( G) CTTT - 3',下游引物5' - CCCTCATTT ( C) CTTACTTCTTAAAC - 3',以血液中DNA为模板进行PCR反应。PCR反应体系( 25 μL) 为: 10 × PCR Buffer 2. 5 μL,d NTP 3. 5 μL,Ex Taq 0. 5 μL,dd H2O 14. 5 μL,模板DNA 2 μL,上、下游引物( 10 μmol / L) 各1 μL。PCR扩增条件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30个循环; 72 ℃ 5 min。扩增后产物经过1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定,按照DNA凝胶回收试剂盒的说明回收扩增后的目的片段。

1.4食蟹猴IFN-α基因的克隆

按照T载体说明将PCR扩增产物与p MD18 - T载体连接,转化到Trans1T1感受态细胞中,经过LB培养基培养12 h,挑取菌落振荡培养8 h,对菌液进行PCR鉴定。选择经鉴定为阳性的菌液提取质粒,取1 μL用EcoRⅠ和XhoⅠ酶各0. 5 μL以及10 × Buffer 1 μL于37 ℃ 双酶切2 h,取酶切产物经过1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定,选择结果为阳性的质粒p MD18 - T Mac - IFN - α 送至哈尔滨博仕生物技术有限公司进行测序。

1.5序列分析

将测序结果利用DNAStar软件进行序列分析和二级结构预测; 用Signal IP4. 1工具预测信号肽,用Net Phos分析磷酸化位点; 用Swiss - Model等工具在线预测三级结构; 用Meg Align软件采用Clustal W法将测得序列与Gen Bank中的IFN - α 基因序列进行多重比对和同源性分析,并构建进化树。

2结果与分析

2.1食蟹猴基因的PCR扩增结果

将得到的PCR扩增产物用1% 琼脂糖凝胶电泳, 结果见图1。

M. DNA Ladder Marker; 1. PCR 产物; 2. 空白对照。

结果表明,得到大小约为550 bp的片段,与理论值相符。

2.2测序结果及序列分析

测序结果表明: 得到1条长为567 bp的条带,编码188个氨基酸,前23个为信号肽( 见296页彩图2) 。成熟蛋白含165个氨基酸( 成熟蛋白的理论分子质量为22 ku,等电点为8. 240) ,有7个潜在的磷酸化位点( 15,91,96,112,159,175,183 aa,见296页彩图3) ; 1个N糖基化位点( 129 aa,见296页彩图4) 。信号肽区和成熟肽后部主要为疏水区,其余肽链多数为亲水区。绝大部分抗原位点在肽链亲水区, 二级、三级结构预测结果表明,该蛋白由5段 α - 螺旋组成,β - 折叠少( 见296页彩图5) 。

2.3食蟹猴与其他物种的同源进化分析

食蟹猴与苏门答腊猩猩的IFN - α 基因同源性最高,为95. 8% ; 与灵长目动物差异不是很明显,但与鸡和鱼类差异较大,为44. 5% 和43. 0% 。在系统进化树中,食蟹猴与苏门答腊猩猩和白颊长臂猿在同一分支里,遗传距离最为接近,而与禽类和鱼类距离较远,见图6。

3结论和讨论

试验成功克隆获得食蟹猴IFN - α 基因并进行序列分析,发现食蟹猴IFN - α 基因ORF为567 bp, 共编码188个氨基酸残基,前23个为信号肽; 成熟蛋白的理论分子质量为22 ku,等电点为8. 240,亲水区占多数。二级、三级结构预测结果表明,该蛋白主要由5段 α - 螺旋组成。将食蟹猴IFN - α 基因进行同源性比较分析,发现其与苏门答腊猩猩的IFN - α 基因同源性 最高,在进化树 中处于同 一分支,为95. 8% ; 与鸡和鱼类差异较大,为44. 5% 和43. 0% 。 这与物种之间的进化亲缘关系一致。

由于目前食蟹猴IFN - α 基因没有被克隆,试验根据3个同源性比较高的物种,即松鼠猴( 登录号为AF294759) 、棉顶狨猴( 登录号为AJ250196 ) 、人( 登录号为HUMINTAZ) 基因序列中设计简并引物,扩增出完整ORF序列,为以后的表达和活性研究奠定基础。

经软件分析,所得基因序列内部无EcoR Ⅰ 和XhoⅠ酶切位点,p MD18 - T - Mac - IFN - α 经上述两种酶切后,不会影响基因序列编码区的内部结构。

目前,在非人灵长类动物疾病防控过程中主要应用人源IFN。对于食蟹猴的IFN - α 基因,国内外的研究报道较少。本研究拟获得食蟹猴的IFN - α 基因片段,并与其他种属的IFN - α 基因序列进行比较,为常用实验猕猴IFN - α 的基因工程研究指出了一条重要方向。

近年来,随着食蟹猴的需求量越来越大,食蟹猴感染的疾病( 尤其是病毒病) 的发病率不断增高,常给养殖户 带来不小 的经济损 失。通过对食 蟹猴IFN - α 的研究,为以后食蟹猴IFN - α 的应用开辟了道路。但动物体内的IFN含量极少,用传统的方法难以制备纯化。本研究克隆了食蟹猴IFN基因,并在大肠杆菌中成功表达了食蟹猴重组IFN蛋白,为重组食蟹猴干扰素的临床应用打下了基础。

摘要：为了提取食蟹猴外周血液中的DNA,利用PCR法扩增IFN-α基因,将扩增的IFN-α目的片段产物克隆到p MD18-T载体上构建重组质粒,经PCR和双酶切鉴定后进行基因序列的测定,对测定的结果用DNAStar软件进行序列分析。结果表明:食蟹猴的IFN-α基因ORF为567 bp,共编码188个氨基酸,前23个为信号肽;成熟蛋白的理论分子质量为22 ku,等电点为8.240,亲水区占多数;该蛋白主要由5段α-螺旋组成,其IFN-α基因与苏门答腊猩猩的同源性最高,在进化树中处于同一分支,为95.8%。

甘蔗基因克隆研究 篇7

胸苷激酶在几种抗病毒药物前体以及抗癌药物的激活方面有重要作用[4]。另外, 近期研究[5,6,7,8,9]表明, 胸苷激酶是细胞增殖的标志物, 被证实在肿瘤的普查筛选、对进程为肿瘤疾病的患者区分检测、评价治疗是否成功、监测治疗效果、病程发展的预后指示、评估癌症复发风险等方面都具有重要意义。

胸苷酸是合成胸苷三磷酸的重要前体, 后者参与DNA的合成。它可由传统的化学方法合成, 但过程繁杂、污染环境。细胞内胸苷酸可以在胸苷酸合成酶作用下, 由尿嘧啶脱氧核苷酸甲基化而合成。以此途径在实验室合成胸苷酸极其繁琐。本文为得到胸苷酸, 构建可表达胸苷激酶的重组菌株, 以胸苷为底物, ATP为磷酸基团供体, 高效地合成胸苷酸。该方法较之传统方法, 简单、有效同时无污染。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒

大肠杆菌 (Escherichia coli) BL21 (DE3) 、DH5α、p ET-28a (+) 载体为作者实验室保存;p MD-18T载体购自Ta KaRa生物技术公司。

1.1.2 试剂

限制性内切酶、T4DNA连接酶购自TAKARA生物公司;DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司;2×Taq PCR Master Mix购自天根生化科技有限公司;由上海捷瑞生物工程有限公司合成PCR引物;由上海美吉医药科技有限公司完成测序。其它试剂药品均为市售分析纯。

1.1.3 仪器

Agilent Technologies 1200series高效液相色谱仪;TechneTC412PCR仪;DYCZ-24D电泳仪;DYCP-31水平电泳槽;DYCZ-24D垂直板电泳槽;752紫外光栅分光光度计;JY92-Ⅱ超声破碎仪。

1.1.4 培养基

LB培养基 (g/L) :胰蛋白胨10g, 酵母粉5g, Na Cl 10g, p H7.0, 固体培养基中添加1.5%的琼脂。使用固体、液体LB培养基时, 按抗性添加硫酸卡那霉素或羧苄青霉素 (卡那霉素终浓度50μg/m L, 羧苄青霉素终浓度为100μg/m L) 。诱导时IPTG终浓度为1mmol/L。

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增tdk基因

抽取大肠杆菌基因组, 并以其为模板, PCR扩增tdk基因。根据Gen Bank中报道的大肠杆菌胸苷激酶基因 (tdk) 序列, 设计PCR引物, PCR引物为:5’-CGGGATCCATGGCACAGC-TATATTTC, 3’-GCGAGCTCTTAATCGTGGCGA TGC。其中下划线标注部分分别为Bam HⅠ和SacⅠ限制性内切酶酶切位点。PCR条件为:94℃预变性5min;94℃变性30s, 63℃退火30s, 72℃延伸1min, 共30个循环, 最后72℃延伸5min。PCR产物经0.9% (W/V) 的琼脂糖凝胶电泳后, 用DNA回收试剂盒回收。

1.2.2 表达载体的构建

将回收的PCR产物按比例与克隆载体p MD-18T连接, 把连接产物转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞, 经过阳性克隆筛选、酶切鉴定等步骤, 得到克隆载体p MD-18T-tdk, 把连有目的基因的重组菌株进行测序, 然后将测序正确的基因片段连接到p ET-28a (+) 上以构成表达载体p ET-28atdk。最后将表达载体p ET-28a-tdk转化入宿主菌BL21 (DE3) 中得到重组菌株DTK。

1.2.3 tdk的诱导表达及SDS-PAGE检测

将带有目的基因 (tdk) 的重组菌株 (DTK) 在37℃、200r/min条件下, 培养到OD值为0.6左右, 加入1mmol/L的IPTG作为诱导剂, 37℃诱导4~5h。将所得的菌液12 000r/min离心1min, 用50mmol/L Tris-HCl (p H 7.1) 重悬菌体, 并超声破碎, 将所得样品的各成分进行SDS-PAGE检测。

1.2.4 胸苷激酶的酶活测定[10,11]

1m L反应液 (30μL的破碎菌液为粗酶, 5mmol/L的ATP, 5mmol/L的TR, 5mmol/L的Mg Cl2, 5mmol/L的DTT, 7mmol/L的Na F, 0.2mg/m L的BSA, 50mmol/L p H 8.0的Tris-HCl缓冲液) , 45℃下反应10min, 沸水浴加热5min终止反应, 反应后将反应液稀释100倍, HPLC检测TMP的生成量。酶活力单位定义为:一个酶活单位 (U) 即一定温度和p H条件下每分钟催化产1μg TMP所需的酶量。计算公式如下:

S1和S2分别为样品和标准品峰面积;P1和P2分别为样品和标准品的稀释倍数;M为标准品的浓度 (mg/m L) ;V为反应液的体积 (m L) ;K为常数 (103) ;t为反应时间 (min) ;m为粗酶的量 (m L) 。

按照上述方法和步骤, 测定胸苷激酶的酶活, 并探究不同温度 (25、30、37、45、50、55、65、75℃) 和p H (6.0、6.6、7.0、7.6、8.0、8.6、9.0) 对酶活性的影响。

HPLC条件为:Hypersil SAX 5μm (4.6mm×250mm) , 50mmol/L p H 3.0磷酸-磷酸二氢铵缓冲液为流动相, 流速1m L/min, 检测波长254nm, 柱温25℃。

1.2.5 不同条件对胸苷酸合成的影响

反应体系如1.2.4, 探究不同条件 (反应时间、酶量、ATP浓度、底物浓度) 对胸苷酸转化率的影响。由HPLC图谱计算出不同条件下的胸苷酸的生成量, 并根据以下公式, 计算其转化率。

TR转化率=TMP生成量/TR加入量×100%

2 结果与分析

2.1 重组菌株的构建与诱导表达

以大肠杆菌K-12基因组为模板, PCR扩增tdk基因, 得到一条610 bp左右

的条带, 与理论预期相符。将tdk片段先后与克隆载体p MD18-T和表达载体p ET-28a连接, 用Bam HⅠ和SacⅠ双酶切鉴定克隆载体p MD18-T-tdk和表达载体p ET-28atdk, 可分别得到大小为2 700bp左右的p MD18-T载体和600bp左右的tdk条带以及5 300bp的p ET-28a载体和600bp左右的tdk条带, 并且基因测序与Gen Bank中序列一致, 由此得到重组菌株DTK。

SDS-PAGE结果表明, 经IPTG诱导后, 胸苷激酶在重组菌DTK中表达明显 (如图1) , 由于胸苷激酶蛋白分子大小约为23k D, 加上p ET-28a自身表达的His Tag, 所以表达的蛋白分子量在26 k D左右, 与图1正好相吻合, 可断定该蛋白正是胸苷激酶蛋白。另外, 由图2可知, 表达的蛋白绝大部分为可溶性蛋白, 破碎沉淀中基本无蛋白存在。

2.3 胸苷激酶的酶活测定

分别测定含空载质粒的大肠杆菌和重组菌株的酶活, 结果表明:含空载质粒的大肠杆菌酶比活力为40.8U/mg, 而重组菌株的酶比活力为1 639U/mg, 相对于宿主菌, 酶活力提高了40倍。

2.3.1 p H对胸苷激酶活力的影响

按照1.2.4所示方法, 在45℃下, 反应10min, 测定胸苷酶在不同p H下的酶活, 缓冲液分别为磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液 (p H 6.0、6.6、7.0) 、Tris-HCl缓冲液 (p H 7.0、7.6、8.0、8.6、9.0) , 结果如图2。

由图2可知, 酶的活力在p H 8.0时达到最大, 此时, 酶比活力为1 654U/mg, 当溶液过酸或过碱时, 其酶活迅速降低。

2.3.2 温度对胸苷激酶活力的影响

按照1.2.4所示方法, 在p H 8.0的Tris-HCl缓冲液下, 反应10min, 分别测定其在不同温度条件下的酶活, 结果如图3。

由图3可以看出, 在45℃之前, 酶活力随着温度的增加而不断增大, 在45℃时活力达到最大, 比活力为1 579U/mg。再升高温度, 酶活力降低, 由于部分酶已开始失活, 当达到55℃时, 迅速降低, 当温度升高到75℃时, 绝大部分酶已失活。

M:protein marker;1:p ET-28a空载诱导;2:诱导前破碎;3:诱导后破碎;4:离心后培养基;5:破碎沉淀;6:破碎上清。M:Protein marker;1:Empty vector plasmid of p ET-28a after inducing;2:Sample of proteins before inducing;3:Sample of proteins after inducing;4:Medium after centrifugation;5:Precipitate of resuspended cells after sonication;6:Supernatant of resuspended cells after sonication.

■-磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液 (p H 6.0、6.6、7.0) ;●-Tris-HCl缓冲液 (p H 7.0、7.6、8.0、8.6、9.0) 。■-buffer solution of Na2HPO4-KH2PO4 (p H 6.0、6.6、7.0) ;●-buffer solution of Tris-HCl (p H 7.0、7.6、8.0、8.6、9.0) .

2.4 不同条件对胸苷酸合成的影响

2.4.1 反应时间对胸苷转化率的影响

以DTK破碎菌液为粗酶, 添加量为30U, 在45℃、50mmol/L、p H 8.0的Tris-HCl缓冲液中反应, 测定不同时间TR的转化率, 结果如图4。

随着反应的进行, TR转化率也逐渐增加, 当反应时间到100min后, TR转化率达到60.8%, 此后伴随时间的增加, TR转化率有缓慢增加, 基本已达到平衡。考虑到时间和效益, 把反应的时间定为100min, 此时TR的转化率可达到60%左右。

2.4.2 酶量对TR转化率的影响

以DTK破碎菌液为粗酶, 在45℃、50mmol/L、p H 8.0的Tris-HCl缓冲液中反应, 酶添加量依次为5U、10U、15U、20U、25U、30U、35U、40U和45U, 反应时间均为100min, 测定结果如图5所示。

由图5可见, TR的转化率随酶量的增多而增加, 当酶添加量达到30U时, 转化率趋于稳定, 再增加酶量, 转化率基本不变, 可达到61%。

2.4.3 ATP浓度对TR转化率的影响

以DTK破碎菌液为粗酶, 酶添加量为30U, 底物TR添加量为5mmol/L, ATP添加量分别为5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L和25mmol/L, 在45℃、50mmol/L、p H 8.0的Tris-HCl缓冲液中反应, 随着时间进行定点取样, 探究随着时间变化, ATP浓度对TR转化率的影响, 结果如图6。

由图6可知, 随着时间进行, TR转化率逐渐增大, 最大可达到65%左右, ATP浓度为5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L时, TR转化率相差不大, 但当增加至20mmol/L时, TR转化率骤减为30%, 当增加至25mmol/L时, 基本没有反应。

2.4.4 底物浓度对TR转化率的影响

以DTK破碎菌液为粗酶, 酶添加量为30U, 底物浓度按照TR:ATP=1:1等比例增加, 添加量分别为1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L和20mmol/L, 在45℃50mmol/L p H 8.0的Tris-HCl缓冲液中反应, 随着时间进行定点取样, 探究随着时间变化, 不同底物浓度对TR转化率的影响, 结果如图7。

由图7可知, 当TR和ATP浓度均为1mmol/L时, TR转化率为30%左右;当TR和ATP浓度均5mmol/L时, TR转化率为60%左右;当TR和ATP浓度为10mmol/L时, TR转化率为50%左右;当TR和ATP浓度为15mmol/L时, TR转化率为25%左右;当TR和ATP浓度均为25mmol/L时, 基本没反应。由此可得, TR和ATP最适浓度均为5mmol/L, 此时, TR转化率可达到60%。

3 讨论

本研究主要是针对胸苷激酶, 目前关于胸苷激酶方面的研究很少, 主要是在病毒中, 它也主要应用于癌症、肿瘤的检测过程中。而在大肠杆菌中, 曾有人研究过胸苷激酶的活性与胸苷转移的关系。另外, 关于胸苷酸的合成的研究也很少, 传统方法主要是化学合成, 步骤繁杂、污染环境, 本研究主要是构建带胸苷激酶基因的重组菌株, 经诱导可表达胸苷激酶蛋白, 并利用它来高效地合成胸苷酸。较之传统方法, 更有效、环保、简洁。

结论主要如下:胸苷激酶的最适p H为8.0;最适温度为45℃左右。以胸苷激酶作为催化剂合成胸苷酸时, 每毫升反应液加入30U胸苷激酶, 胸苷和ATP浓度可控制在5mmol/L, 反应时间约为100min, 胸苷的转化率可达到60%以上。反应中提高ATP的浓度并不能增加胸苷的转化率, 相反过高浓度的ATP抑制了反应的进行。

参考文献

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[4]Michael P.B.Sandrini, Jure Piskur.Deoxyribonucleoside kinases:two enzyme families catalyze the same reaction[J].Trends in Biochemical Sciences, 2005, 30:225-228.

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甘蔗基因克隆研究 篇8

1 材料和方法

1.1 毒株

菌种、质粒和Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒DHV1-R株由华南农业大学兽医学院禽病教研室保存、提供。大肠杆菌DH-5、RossetaⅡ(DE3)由本课题组保存;质粒pET-32a(+)、pMDl8-T购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 试剂

AMV反转录酶，dNTP, TaqDNA聚合酶，XholⅠ、EcoRⅤ限制性内切酶、PCR扩增试剂等均购自宝生物工程(大连)有限公司;辣根过氧化物酶标记羊抗鼠Ⅱ等购自Promega公司;Ⅰ型鸭病毒性肝炎阳性血清由本院实验室收集、保存;其他常规试剂均为分析纯。

1.3 3D基因的克隆及其诱导表达

1.3.1 目的基因获得

根据GenBank中报道的I型鸭肝炎病毒(DHV1)全基因序列，设计了针对3D基因片段的引物，扩增片段大小为1362bp左右。在上游引物中加入EcoR V酶切位点，在下游引物中加入Xhol I酶切位点，引物由上海生物工程有限公司合成 (部分为酶切位点) 。

上游引物3D-F:5-GATAT CGGGAAATAGTAAGCAAGCAA TAT-3 (EcoR V);下游引物3D-R:5-CTCGAGTCAGATCTCAT-GCAAGCTGTATA-3 (Xhol I)。

取鸭胚尿囊液，按Invitrogen公司TRIzol LS Reagent RNA提取试剂盒的使用说明，提取病毒RNA，反转录得到cDNA，以cDNA为模板，进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.3.2 重组质粒的构建

回收扩增的DNA片段，与pMD18-T载体连接后，转化，经酶切、PCR、测序鉴定。鉴定正确的阳性重组质粒命名pMD18-3D，将pMD18-3D与p ET32a空载体分别经XholⅠ、EcoRⅤ双酶切，回收后连接过夜，转化大肠杆菌RossetaⅡ(DE3)，经酶切、测序和PCR鉴定正确后，命名为pET32a-3D。

1.3.3 重组菌的诱导表达

将阳性菌种pET32a-3D接种在含氨苄(Amp 100μg/mL)的LB液体培养基中培养至OD450值达0.5左右时，加入终浓度为1mol/mL IPTG进行诱导表达。取不同时间表达的菌液留样，诱导4 h后，用SDS-PAGE电泳鉴定表达情况。

1.3.4 重组蛋白免疫印记检测

用Ⅰ型鸭病毒性肝炎阳性血清对表达的融合蛋白用蛋白质印迹法进行检测。经SDS-PAGE电泳分离蛋白后，用电转移仪低温稳压转移30 min后，取下NC膜，以PBST (p H7.4的PBS+0.5 m L Tween-20)冲洗后用封闭液(10 mL PBST+0.5 mg脱脂奶粉)封闭过夜。用PBST冲洗后与Ⅰ型鸭病毒性肝炎阳性血清37℃孵育1 h，洗涤后加入辣根过氧化物酶(HRP)酶标的羊抗鼠IgG, 37℃温育1 h后冲洗，加入底物(TMB)显色。

1.3.5 重组蛋白可溶性分析试验

以终浓度为1 mol/mL IPTG进行诱导4 h后，取5 mL菌液10 000 r/min离心2 min，弃上清，沉淀重悬于200μL PBS后进行超声裂解，10 000 r/min离心1 min后分离上清与沉淀。以SDS-PAGE电泳鉴定可溶性情况。

2 结果

2.1 目的基因扩增

提取的RNA反转录后的cDNA经PCR扩增出约1 362 bp的特异性条带，与预期目的片段大小一致(见图1)。

1.3D基因扩增片段;2.阴性对照

2.2 重组质粒的构建

构建的重组质粒pMD18-3D经XholⅠ、EcoRⅤ双酶切鉴定，切下约1 362 bp的目的条带与质粒载体带(见图2)。

1:3D基因酶切产物;2:阴性对照

2.3 重组质粒的诱导表达

重组质粒pET32a-3D以终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达，表达产物分子质量约为70 Ku，与预期结果相符合，4 h左右表达蛋白量达到高峰(见图3和图4)。

2.4 重组蛋白的Weasten blot-ing鉴定

重组蛋白经Weastenbloting鉴定, 结果出现有大小相符的目的条带 (见图5) 。

M:蛋白质分子质量标准;1:未诱导pET32a-3D表达产物;2、3、4、5:终浓度为1 mmol/L IPTG时诱导2、3、4、5 h p ET32a-3D的表达产物

M:蛋白质分子质量标准;1:未诱导pET32a-3D产物2、3、4:分别为0.5、1.0、1.5 mmol/L IPTG浓度诱导pET32a-3D的表达产物

M:蛋白质分子质量标准;1:3D蛋白表达产物;2:阴性对照

2.5 重组蛋白可溶性分析

重组蛋白可溶性分析试验表明，诱导表达的蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中(见图6)。

M:蛋白质分子质量标准;1:裂解菌体上清收集物;2:裂解菌体沉淀收集物

3 讨论

3.1 p ET表达系统是目前应用最为广泛的原核表达系统, 已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。

pET系统可表达可溶性蛋白, 表达的融合蛋白带个组氨酸, 其肠激酶酶切位点可用于切除融合部分, 方便纯化和研究。载体可以通过以下三种方式来改善目的蛋白的溶解性或正确折叠:第一, 与本身溶解性高的多肽序列融合表达;第二, 与催化二硫键形成的酶融合表达;第三, 与信号序列融合表达, 输出到细胞间质。本研究用pET作为表达载体, 表达的蛋白经可溶性分析表明其主要以包涵体的形式存在于菌体中, 表达出的蛋白带有6个组氨酸标签, 可用Ni离子层析柱纯化表达出的蛋白。

3.2 3D蛋白为RNA依赖的RNA聚合酶, 又称病毒相关抗原 (VIAA) , 催化病毒RNA的合成。

Plotch S J等认为其催化作用概括起来包括:VPg的尿苷化;RNA聚合酶;末端腺苷转移酶;与3′UTR和3AB形成RNP复合物。3D编码区相对比较保守。

甘蔗基因克隆研究 篇9

1 材料与方法

1.1 材料来源

2009年4月在青海省可可西里国家级自然保护区 (海拔4300m) 捕获雄性藏系绵羊10只, 捕捉后立即运至格尔木市 (海拔2800m) 解剖取藏系绵羊各组织, 迅速投入液氮容器中, 低温保存并运回西宁。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取及鉴定

按照Trizol试剂盒说明提取藏系绵羊肺组织总RNA, 溶于20μL DEPC水中, 并用DU800核酸蛋白含量检测仪测定A260/A280值及浓度, 并进行1%甲醛变性凝胶电泳检测其质量, 置-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 目的基因扩增及序列测定

引物设计:利用GenBank中人、小鼠、大鼠、牛和牦牛的EPAS1c DNA序列用ClustalW进行同源性对比。

目的基因的扩增:取总RNA 2.0μg, 按照AMV逆转录酶试剂盒逆转录合成cDNA第一链。PCR反应体系:模板cDNA 1μL, PCR Master Mix 15μL, EPAS1上下游引物各1μL, 加水补足至25μL;扩增条件为:95℃预变性5min后进行35个循环, 每循环95℃30s, 55℃1min, 72℃1min, 循环结束后72℃延伸10min。取PCR产物10μL进行1.2%的琼脂糖凝胶电泳, 采用紫外凝胶成像分析系统记录电泳结果。

PCR产物的回收、纯化及序列测定:用QIAquick Gel回收试剂盒回收纯化456bp PCR扩增片段并连接到pGEM-T Easy载体上。通过蓝白斑筛选实验挑取白斑单克隆, 接种后37℃摇床过夜, 然后提取质粒, 用EcoRⅠ酶切电泳, 选出含有目的片段的阳性克隆送上海英俊生物生物技术有限公司进行序列测定。将获得的基因序列在GenBank上进行Blast初步比较分析和在ClustalX上进行物种同源性比较。

1.2.3 荧光定量PCR

采用CluxtalW软件对人、大鼠、小鼠、牛的Beta-actin, EPAS1, EPO的序列进行同源性比对。定量PCR由iCycler定时定量PCR仪来完成。结果显示溶解曲线只出现一个主波峰, 说明PCR扩增的特异性较高, 符合实时荧光定量的技术要求。

2 结果

2.1 目的基因的PCR扩增及测序结果分析

用DNAMAN软件, 将藏系绵羊EPAS1基因测序序列与其他物种进行同源性比较分析, 结果显示与人、大鼠、小鼠、牛的EPAS1基因的同源性分别达到了94%、91%、92%、98%的同源性。

2.2 荧光定量PCR (ΔΔCt方法) 检测结果

以β-actin为内参基因, 计算藏系绵羊各个组织的EPAS1的ΔCt。可以看出EPAS1基因mRNA的表达量在心脏中最高, 约是肺脏的1.8倍, 在肝脏中表达量的2.5倍, 约是在肾中表达量的7.57倍。

3 讨论

本研究应用RT-PCR技术首次从草地藏系绵羊肝脏中获得了EPAS1基因的部分编码区序列, 为进一步研究藏系绵羊EPAS1的表达及其与高原地区获得性习服机制的研究提供了基础。我们进行了EPAS1mRNA在藏系绵羊的心、肾、肝、肺组织中的表达, 发现EPAS1基因mRNA在藏系绵羊心脏组织中表达量最高。故可认为在藏系绵羊中EPAS1基因的在心脏中的高表达可能与其在低氧环境下藏系绵羊的心脏保护性改变有着重要的关系。

综上所述长期适应高海拔低氧的获得性习服物种藏系绵羊, 对低氧已经形成了部分适应性改变, 且在分子水平, 生理水平, 形态水平已经有了一定的改变, 这对青藏高原移居物种在低氧习服机制的研究有着重要的价值。通过对藏系绵羊EPAS基因的研究, 可以有助于对慢性高原病的发病机制的研究提供理论依据。

参考文献

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