功能基因组学研究

功能基因组学研究（共8篇）

功能基因组学研究 篇1

氯吡格雷是心血管疾病中广泛用于抗血小板的药物。血小板激活、聚集是急性冠状动脉综合征和PCI术后引发动脉血栓形成的关键因素, 氯吡格雷联用阿司匹林抗血小板治疗对于急性冠状动脉综合征和PCI术后患者至关重要, 可以有效预防缺血事件的发生[1]。然而, 接受相应治疗后, 仍有约10%的患者发生支架内血栓、死亡、卒中等心血管事件[2], 主要由于不同个体对于氯吡格雷的反应存在差异, 其影响因素是多方面的, 包括年龄、吸烟、糖尿病、药物之间的相互作用、患者依从性、遗传因素等, 基因多态性在其中起着决定性作用, 氯吡格雷的疗效差异可能与下列基因多态性有关: (1) 决定药物代谢动力学, 如影响氯吡格雷在小肠的吸收受ABCB1 (MDR1) 基因, 编码药物代谢的基因CYPs、PON1。 (2) 影响药物效应动力学, 主要为编码药物作用的靶点功的基因, 如P2Y12基因。

1 氯吡格雷的代谢

氯吡格雷是药物前体, 在小肠的吸收受到ABCBl (MDR1) 基因编码的质子泵P糖蛋白调控, 然后经过两步氧化过程转化成活性成分, 第一步涉及CYP2C19 (约占45%) 、CYP1A2 (约占36%) 、CYP2B6 (约占19%) 同工酶, 第二步包括CYP2C19 (约占20%) 、CYP2C9 (约占7%) 、CYP2B6 (约占33%) 、CYP3A4 (约占40%) 同工酶, 约15%的氯吡格雷转化成活性代谢产物 (R130964) , 85%水解为无活性代谢产物。其中CYP2C19同工酶在转化过程中最为重要[3]。

2 CYP2C19基因型与代谢表型

CYP2C19基因位于人类10号染色体上 (10q24.1-q24.3) , 编码含450个氨基酸的CYP2C19同工酶[4]。现已发现CYP2C19至少含有25个等位基因, 其中CYP2C19*1为编码正常活性酶的基因, 等位基因编码的酶活性缺失的基因, 称为失功能等位基因[5]。CYP2C19*2由于5号外显子, 681位点G碱基突变为A, 导致所编码酶发生剪接缺陷, 丧失活性, 是最为常见的失功能等位基因, 在白种人群的基因频率约为0.13, 非洲人群0.18, 亚洲人群0.30[6]。CYP2C19*3由于4号外显子, 636位点G碱基突变为A, 编码酶时提前形成终止子, 酶活性缺失, 是第二常见的失功能等位基因, 在亚洲人群约10%, 其他人群<1%, 其余失功能等位基因, 如*4、*5、*6、*7、*8在人群中比较少见[7]。CYP2C19*17因为基因5’端侧翼序列, -806位点C碱基突变为T, 能够CYP2C19的表达和酶活性, 在白种人群的基因频率约为0.18, 非洲人群0.18, 亚洲人群0.04[8]。

3 CYP2C19基因多态性对氯吡格雷代谢及患者预后影响

3.1 CYP2C19失功能等位基因

Hulot等[9]在一项纳入28名男性健康志愿者的研究中, 首先证实CYP2C19基因变异与氯吡格雷抗血小板作用的关系, 携带CYP2C19失功能等位基因的志愿者, 血小板对氯吡格雷的反应显著降低。随后Mega JL[10]和varenhorst[11]分别研究了健康人群和冠心病患者, CYP基因多态性、氯吡格雷血浆活性代谢产物与血小板抑制作用的关系。在入选的162名接受氯吡格雷治疗的健康志愿者中, 发现携带至少一个CYP2C19失功能等位基因者, 血浆中可检测到的活性代谢产物与无此基因携带者相比下降32.4% (P<0.001) 。在抑制血小板聚集方面, 携带CYP2C19失功能等位基因者较无此基因型者下降9% (P<0.001) , 在包括98名接受氯吡格雷治疗的稳定型心绞痛患者, 同样表明了携带至少一个CYP2C19失功能等位基因者, 血浆中可检测到的活性代谢产物与无此基因携带者相比显著下降, 血小板抑制相比无此基因携带者也明显下降。近年来, 一系列随机前瞻性研究表明CYP2C19基因多态性与急性冠状动脉综合征支架术后, 服用氯吡格雷患者再发心脑血管事件及出血事件相关。在评估普拉格雷优化血小板治疗改善心肌梗死后预后的试验 (TRITON–TIMI 38) [12], CYP2C19失功能等位基因携带者发生再发缺血事件的概率明显高于未携带者 (危害比1.53, 95%置信区间1.07~2.19, P=0.01) , 支架内血栓风险 (危害比3.09, 95%置信区间1.19-8.00, P=0.02) 。Hulot等[13]在一项meta分析中, 发现携带CYP2C19*2等位基因者, 主要不良临床事件风险相比无携带此基因者增加30% (9.7%比7.8%, 比值比:1.29, 95%置信区间1.12-1.49, P<0.001) 。CYP2C19*2携带者死亡率提高 (1.8%比1.0%, 比值比:1.79, 95%置信区间:1.10-2.91, P=0.019) , 支架内血栓发生增加 (2.9%比0.9%, 比值比:3.45, 95%置信区间:2.14-5.57;P<0.001) 。然而, 最近的两个大型随机安慰剂对照研究 (CURE和ACTIVE A试验) [14]表明, 与安慰剂相比氯吡格雷的效用和安全性不受CYP2C19失功能等位基因的影响, 研究中, 根据代谢表型分类的患者, 接受氯吡格雷治疗时, 各组的反应和临床预后无明显差别, 造成与前面研究不同的原因, 可能是由于入选的患者支架植入者所占比率不同产生的, 在CURE试验中, 约14.5%的患者接受PCI, 而前面的研究中, 超过70%的患者接受过PCI。

3.2 CYP2C19*17

最近研究人员发现CYP2C19*17等位基因, 能使CYP2C19转录增加, 提高CYP2C19酶的活性。Sibbing等[9]在一项包含1524名PCI术后患者的队列研究中, 探讨最近探讨了CYP2C19*17等位基因与氯吡格雷活性及出血风险的关系, 发现携带CYP2C19*17等位基因患者血小板活性被显著抑制, CYP2C19*17等位基因杂合子和纯合子出血风险分别是未携带者的1.85倍和3.41倍, 该试验没有对CYP2C19*17等位基因与缺血事件的关系进行观察。CURE试验中接受氯吡格雷治疗的患者, 携带CYP2C19*17等位基因与安慰剂组中, 同样携带CYP2C19*17等位基因比较, 可以显著减少缺血事件的发生, 但根据不同代谢表型所分的亚组中, 各组的主要出血事件无差别[15]。

4 其他基因多态性对氯吡格雷代谢及患者预后影响

4.1 ABCB1

氯吡格雷在小肠的吸收受ABCB1 (MDR1) 基因编码的P-糖蛋白调控, 根据ABCB1基因3435位点 (C→T) , 可分为CC、CT、TT三种基因型, PCI术前服用300或600mg氯吡格雷, 携带CT、TT基因型的患者相比CC基因型患者, 氯吡格雷生物利用度明显降低[16]。然而其他的一些试验研究, ABCB1基因多态性与氯吡格雷的抗血小板效果无关。在FAST-MI研究中, TT基因型携带者, 死亡、心肌梗死、卒中的风险比CC型携带者高 (15.5%比10.7%, 危害比1.72, 95%置信区间1.2-2.47, P=0.007) , TRITON–TIMI 38试验结果与之相似, TT基因型携带者, 死亡、心肌梗死、卒中的风险比CC型和CT型携带者高72% (12.9%比7.8%, 危害比1.72, 95%置信区间1.22-2.44, P=0.002) 。然而Wallentin L等[17]在PLATO试验的基因研究中, 发现携带CC等位基因型患者发生心血管事件是最高的, 与前面的研究相反, 因此ABCB1基因多态性对氯吡格雷的药理影响及临床预后, 需要更进一步研究。

4.2 CYP3A4

Angiolillo等[18]一项纳入82名心血管患者研究中, 发现CYP3A4 (IVS10+12A) 与氯吡格雷反应性相关。然而随后在一个包含94名健康志愿者的试验却表明, CYP3A4基因 (IVS10+12A) 与氯吡格雷的反应性无关[19], 造成结果不同的可能由于入选人群, 样本量小, 检验方法等不同原因, 需要更大规模的研究进行验证, 并需要对与预后相关性进行研究。CYP3A4的另一研究侧重点是与其他经CYP3A4酶代谢的药物的作用, 增加CYP3A4底物或CYP3A4抑制剂均可影响氯吡格雷第二步生物活性转化。如钙通道拮抗剂是一类CYP3A4底物和CYP3A4抑制剂。Siller-Matula等[20]在一项包含200名PCI术后患者中评估发现, 与接受氯吡格雷治疗同时服用钙通道拮抗剂患者相比, 氯吡格雷的反应性比未同时服用钙通道拮抗剂者差, 心血管事件 (心血管死亡、非致命性心肌梗死、支架内血栓、血管重建) 是未同时服用钙通道拮抗剂者的3.9倍。他们同时通过体外试验中发现, 在服用氯吡格雷患者的血浆中加入钙通道拮抗剂, 与未加入钙通道拮抗剂的对照组相比, 血小板的功能在两组之类并无差别, 因此推测出钙通道拮抗剂并不直接改变血小板功能, 而是在体内通过与氯吡格雷竞争CYP3A4酶发挥作用。

4.3 CYP2B6、CYP1A2、CYP2C9

氯吡格雷的活性转化涉及到CYP酶, 目前大部分研究主要集中于CYP2C19基因多态性与氯吡格雷抗血小板作用的联系。CYP2B6、CYP1A2、CYP2C9基因多态性在氯吡格雷的活性转化中同样起着重要作用。在TRITON–TIMI 38试验中, 携带CYP2C9和1A2失功能等位基因者与氯吡格雷的反应性不相关, CYP2B6失功能等位基因携带者, 氯吡格雷活性产物的血浆水平含量低、血小板聚集率高[17]。然而, Brandt等[21]对健康志愿者 (n=74) , 在服用300mg氯吡格雷后的研究中, 发现CYP2C9等位基因与活性代谢产物的浓度相关。Harmsze等[22]在428例择期PCI患者, 给予负荷剂量或维持计量氯吡格雷, 发现携带CYP2C9*3等位基因患者, 血小板活性比携带该基因者高。

4.4 PON1

PON1是最近发现参与氯吡格雷活性转化第二步过程的酶, Bouman等[23]研究发现PON1 192Q等位基因携带者氯吡格雷活性转化效率比192R携带者低, 紧接着他们在对PON1基因多态性对患者预后影响的队列研究中发现PON1 192QQ基因型携带者, 在有发生支架内血栓的41名患者中有27名患者携带该基因型, 没有发生支架内血栓的71名患者中, 有25名患者携带该基因型 (比值比:3.6, 95%置信区间1.6~7.9, P=0.003) 。然而接下来另外一项研究表明PON1 Q192R基因型携带者对经氯吡格雷治疗患者支架内血栓风险无影响[24]。因此, 需要对PON1基因多态性与氯吡格雷反应性及患者预后进行更进一步的研究。

4.5 P2Y12

P2Y12受体是氯吡格雷活性代谢产物的作用靶点。Fontana等[25]在对健康志愿者进行基因检测时发先H2基因型携带者可能对氯吡格雷无反应。然而对P2Y12基因多态性与氯吡格雷反应性的研究存在矛盾, 总而言之大部分研究都观点都认为P2Y12受体基因多态性和氯吡格雷的反应无太大相关性。

5 问题与展望

综上所述, 与氯吡格雷吸收、代谢有关的基因多态性, 在一定程度上影响氯吡格雷的药效及心血管患者的预后, 但有些研究结论有所不同, 仍需大量研究验证。根据氯吡格雷基因多态性, 优化个体抗血小板治疗还面临着一些问题待以解决, 到目前为止, 尚无关于根据基因型或代谢表型情况改变抗血小板治疗 (增加氯吡格雷剂量、加用其他抗血小板药物等) 的安全性及有效性的试验;快速准确、性价比高检测仪器的研发, 才能使基因检测得以普及。总之, 随着以后研究的深入, 根据基因型分析指导个体抗血小板治疗将成为现实。

摘要：氯吡格雷通过抑制血小板可以有效预防动脉血栓及PCI术后患者心脑血管事件的发生, 然而由于不同个体对于氯吡格雷的反应具有较大差异性, 仍有部分患者发生心血管事件, 众多响氯吡格雷疗效的因素中, 其中基因多态性发挥着重要作用。

关键词：氯吡格雷,药物基因组学

功能基因组学研究 篇2

关键词：XET/XTH基因家族；功能；表达模式

中图分类号：S792.11 文献标识码：A文章编号：1674-0432（2011）-03-0065-3

木葡聚糖转葡糖苷酶XET，是糖苷水解酶GH16家族的亚族[1-3]。糖苷水解酶GH16家族具有未在高等植物中发现的硫酸角质素β-1,4糖苷键内切酶、葡聚糖1,3-β-d 糖苷键内切酶和琼胶酶等酶活性。XET/XTH中一系列内葡聚糖和吡喃半乳糖XET/XTH的酶活性具体表现为：①木葡聚糖转移酶的活性。②木葡聚糖β-1,4糖苷键内切酶活性[4]。XET/XTH家族在植物中进化，意味着XET/XTH基因家族在植物细胞壁形成以及植物生长、发育过程中具有特殊的意义[5]。

1 XET/XTH简介

1.1 XET/XTH结构简介

XET/XTH具有催化酶触反应的特征结构域DEIDFEFLG，并且在XET催化中心附近丝氨酸或苏氨酸具有典型的N糖基化修饰[6, 7]，将拟南芥AtXTH22的N糖基化修饰基团除去，酶活性降低98%，表明DEIDFEFLG中第一个谷氨酸残基在酶触反应中必不可少，同时证明DEIDFEFLG结构域是酶活性的关键[8]。此外，XET还具有分泌到质体外的信号肽。

1.2 XET/XTH在细胞壁扩张过程中的作用

植物细胞的伸长和扩张是一个高度协调的复杂过程。在细胞伸长过程中，细胞形态受由纤维素结晶、半纤维素和纤维素微纤丝等多聚物组成的细胞壁控制。细胞壁生化特性改变使膨压驱动细胞扩张。XET/XTH活性需要以基本的葡聚糖结构为前提如β-1,4糖苷键。一般认为在细胞壁的扩张过程中木葡聚糖的断裂和再生发挥着重要作用，木葡聚糖是基本多聚物的重要组成部分[9]，如木葡聚糖与纤维素微纤丝表面结合，介导形成纤维素微纤丝-木葡聚糖交联网络系统。长久以来XET/XTH被认为是参与细胞壁松弛过程的一种重要的酶[10]。XET/XTH在细胞壁伸长和细胞体积膨大等过程中发挥的重要作用，体现在XET/XTH催化的两个过程：①内切木葡聚糖分子②将新产生的木葡聚糖分子交联到另一木葡聚糖分子的非还原端。有报道表明XET/XTH表达的空间分布与细胞伸长、非伸长区和细胞壁的二次生成有关，而且XET/XTH能调节插入细胞壁中的木葡聚糖长度，从而调节细胞的延展性[9]。

图1 细胞分化过程中细胞壁结构改变的四种方式，引自Kazuhiko Nishitani et.al.[11]

在细胞生长分化过程中，XET参与了细胞壁结构改变的四种方式[11]（图1）。XG 代表木葡聚糖分子，CM代表纤维素微纤丝分子。A和B过程显示细胞壁扩张：A过程单纯由水解酶水解承重木葡聚糖交联，B过程由转移酶介导细胞壁结构间交联。C和D过程显示细胞壁沉积：C过程由转移酶催化但未引起细胞壁扩张，木葡聚糖分子在已有的和新合成的细胞壁结构间交联导致细胞壁结构物质的增加，D过程由转移酶催化并引起细胞壁扩张，新合成细胞壁物质与原有胞壁成分交联导致细胞壁扩张。

2 拟南芥XET/XTH基因家族表达模式

XET/XTH由一个很大的基因家族编码。拟南芥XTH基因家族由33个成员组成[12]。编码序列分析和酶学分析表明不同的XTH成员结构相似但具不同属性[12-14]。不同成员组成的XTH基因家族，可能参与组织器官发育，具有器官、组织和细胞表达特异性或受环境等刺激的調控。故单一XTH基因家族成员或成员间的组合表达，具有时空特异性。有报道表明单一XTH成员突变能导致明显的发育改变[15]。在细胞壁构建过程中特定成员在特定部位发挥重要作用[16, 17]。利用RT-PCR和基因芯片数据库对XTH基因家族成员进行分析可以清晰得到XTH基因家族各成员在生长发育不同时期在不同的组织器官的表达情况[17-21]。

利用Genevestigator分析拟南芥XTH基因家族各成员在植株发育不同时期的表达情况[22]（图2）。整个生长发育过程中，在细胞分裂旺盛的阶段0、阶段1、阶段1b和阶段1c，XTH表达相应活跃，这与XTH功能相符。具体到各个成员，XTH4、XTH9、XTH22、XTH24和XTH27几乎在各个阶段都有较高的表达量，XTH2、XTH21在生长发育的各个阶段表达丰度均比较低。具体到各个阶段：在阶段0，XTH10表达丰度最低，XTH25表达丰度最高；阶段1，XTH2 表达丰度最低，XTH4表达丰度最高；阶段1b，XTH2表达丰度低，XTH24 表达丰度最高；阶段1c，XTH2表达丰度最低，XTH4 表达丰度最高；阶段1d，XTH21表达丰度最低，XTH9 表达丰度最高；阶段5，XTH21表达丰度最低，XTH24表达丰度最高；阶段6，XTH2表达丰度最低，XTH4表达丰度最高；阶段6b，XTH26表达丰度最低，XTH24表达丰度最高；阶段8，XTH21表达丰最度低，XTH25表达丰度最高。

利用Genevestigator分析拟南芥XTH基因家族各主要成员在植物各个组织器官中的分布情况[22]（图3）。XTH广泛分布在拟南芥各个组织器官中，大部分成员在根、侧根和根系伸长区均具有较高的表达量。具体到各个成员：XTH2仅在花粉中具有较高的表达丰度，在其他组织器官中表达丰度均低，推测XTH2可能具有花粉特性启动子。XTH29在雄蕊、花粉表达丰度较高，其他组织器官表达丰度较低，结合图2的结果推测XTH29可能具有花粉、雄蕊特性启动子，且在雄蕊、花粉形成过程中挥着重要的作用。XTH30在子房、茎尖表达丰度略低，在花粉、雄蕊花瓣中表达丰度高。XTH3在花序、花、雄蕊、茎表达丰度较高，其他组织器官表达丰度均较低，结合图2结果推测XTH3可能具有花特异性启动子。XTH11在茎叶中表达丰度低，在种子、角果、花序等器官中表达丰度高，结合图2结果推测XTH11可能具有种子特异性启动子。XTH25在花柄中表达丰度低，在种子中表达丰度高，据图2结果推测XTH25可能具有种子特异性启动子。XTH5在种子、胚根、幼苗、根等部位表达丰度较高，其他组织器官表达丰度较低。XTH20在胚根、幼苗、根等部位表达丰度较高，其他组织器官表达丰度均较低。XTH15在胚轴、胚根、幼苗、花序、花、心皮、种子、茎、茎节、根系表达丰度较高，其他组织器官表达丰度相似。XTH14在根系、种子、幼苗、胚根中表达丰度较高，其他组织器官表达丰度均较低，结合图2推测XTH14可能在幼苗根系生长过程中具有重要作用。XTH26在根系、幼苗中表达丰度较高，其他组织器官表达丰度低，XTH26与XTH14相似但表达高峰时间段更短。XTH17在幼苗、胚根、叶柄、根系表达丰度较高，其他组织器官表达丰度低表达情况与XTH14相似。XTH21在胚根、根系表达丰度较高，其他组织器官表达丰度均低，结合图2结果推测XTH21具有根特异性启动子。XTH31胚轴、侧根、伸长区表达丰度较高，种子、莲座、幼叶、成叶、叶柄表达丰度较高，其他组织器官表达丰度相差不大。XTH33在柱头、侧根、伸长区表达丰度较高，其他组织器官表达丰度较低。XTH23在愈伤组织、悬浮细胞、幼苗、子叶、胚轴、胚根、莲座、幼叶、成叶、根系表达丰度较高，其他组织器官表达丰度较低。XTH22 在子房、柱头、花粉中表达丰度低，其他组织器官表达丰度均较高。XTH1 在雄蕊、花粉、角果、侧根、伸长区表达丰度相对较高，其他组织器官表达丰度较低。XTH16在柱头、花粉、茎叶、老叶中表达丰度较低，其他组织器官表达丰度较高。XTH9仅在花粉中表达丰度低，其他组织器官表达丰度均较高。XTH28在花粉中表达丰度较低，其他组织器官表达丰度较高。XTH32在愈伤组织、柱头、花瓣、萼片、雄蕊、花粉、老叶中表达丰度较低，其他组织器官表达丰度较高。XTH4在柱头、老叶中表达丰度较低，其他组织器官表达丰度较高。XTH7在愈伤组织、柱头、花柄、老叶、伸长区表达丰度较低，其他组织器官表达丰度较高。XTH8在柱头、老叶表达丰度低，其他组织器官表达丰度均较高。XTH27 仅在花粉中表达丰度低，其他组织器官表达丰度均较高。XTH24仅在花粉中表达丰度低，其他组织器官表达丰度均较高。XTH10 在萼片、老叶中表达丰度较高，其他组织器官表达丰度均较低。XTH6在愈伤组织、胚根、花粉、种子、老叶、侧根、伸长区表达丰度低，其他组织器官表达丰度较高。

自上世紀70年代以来，对XET/XTH基因家族的研究有了长足的发展，研究物种涵盖拟南芥、水稻、苹果、奇异果、杨树、苔藓等诸多物种，且从单个或几个基因的分析到整个基因家族、蛋白质家族的分析[23-26]。如火如荼的研究预示着XET/XTH具有广阔的研究前景和广泛的应用范围，如何利用XET调控细胞增值、分裂、体积扩张，基因家族间各个成员的互做，以及调控基因表达的激素信号、信号转导等，成为更具挑战性的研究课题。

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药物基因组学的研究进展概述 篇3

1 药物基因组学的研究内容

1.1 药物代谢

在药物代谢酶谱系方面, 人类超过30个, 同时, 几乎所有的谱系都产生了遗传变异, 并且相当一部分遗传变异可以转译为被编码蛋白的功能改变。对于最易发生显著性个体差异的CYP450酶系来说, 目前, 已经有53个CYP基因和24个假基因被发现, 还发现了若干遗传多态性酶, 例如CYP3A4、CYP2D6、CYP2C19、CYP1A2、CYP2E。此外, 还发现了基因差异会影响药物疗效和不良反应的药物代谢酶, 如:TPMT, 即硫嘌呤甲基转移酶;NAT, 即N-乙酰基转移酶;GST, 即谷胱甘肽S-转移酶等参与代谢的催化药物结合的酶。其中, CYP2C19中有缺陷的等位基因已经确定了6种, 一旦CYP2C19的多态性基因存在于个体基因中, 那么血药浓度会随着代谢奥美拉唑而升高。如果CYP2C19第5外显子上的单个基因突变 (A→G) 往往导致对于甲妥因、环己巴比妥等的敏感度提高, 也就是说其功能丧失。对于TPMT基因, 它具有的等位基因的变异体超过4种, 使得药物代谢呈现出多样性。高TPMT活力的人占89.00%, 中等活力的人占11.00%, 极低活力或者缺失的人占0.33% (数据来自《中国医药报》) 。TPMP是治疗白血病的6-巯基嘌呤的主要代谢酶, 因而, 为了保证血药浓度与治疗要求相符合, 并避免药物中毒情况的产生, 药物剂量的调整便是以治疗时的TPMP的活性为依据的。

1.2 药物转运蛋白

在对多种药物的吸收、分布、排泄的调节方面, 转运蛋白的作用至关重要。目前, 最广泛研究的涉及药物特性和疗效的转运蛋白便是膜转运蛋白中三磷酸腺苷 (ATP) 结合序列盒谱系的成员, 其中的P-糖蛋白的编码便是由人类ABCB1基因进行的。通过依赖能量, P-糖蛋白泵出细胞内的胆红素、几种抗癌药物、强心苷、免疫抑制剂、糖皮质激素、1型人类免疫缺陷病毒 (HIV-1) 蛋白酶抑制剂和多种其他药物等底物, 这是P-糖蛋白的主要功能。

P-糖蛋白在许多正常组织中表达, 提示它对生物异源物质和代谢产物排入尿液、胆汁及肠腔起作用。在血-脑屏障中, 脉络丛中的P-糖蛋白限制多种药物在脑中蓄积, 这些药物包括地高辛、伊维菌素、长春碱、地塞米松、环孢素、多潘立酮及洛哌丁胺。外显子26 (3435C→T) 上的一个同义单核苷酸多态性 (即一个不改变被编码氨基酸的单核苷酸多态性) 与十二指肠内P-糖蛋白的易变表达相关;在T等位基因纯合子患者中, 十二指肠中P-糖蛋白的表达低于CC基因型患者的一半。3435C纯合子者的CD56+自然杀伤细胞显示, P-糖蛋白的作用底物罗丹明出现先体外后体内潴留的显著降低 (即P-糖蛋白功能较强) 。另一个P-糖蛋白的作用底物地高辛在3435TT基因型者中有较高的生物利用度。正如许多药物遗传学特性所经常见到的那样, 3435C→T单核苷酸多态性的发生率存在相当大的人种变异。

2 药物基因组学应用

2.1 药物基因组学与新药研发

在药物基因组学中, 对功能基因的分类是以药物效应的不同为依据的, 以先进的生物信息学为手段, 以人类基因组计划的研究结果、DNA阵列技术、高通量筛选技术为支撑, 从而使新药的开发速度大为提高。通过研究药物基因组学, 更多更有效的药物靶标为新药的研制提供了更多的新化学实体在新药临床研究中参与到其中。在选择临床受试对象时以基因特性为依据, 使一些原认为无效的药物重新成为临床实验的对象, 而那些由于毒性反应较大而被淘汰或减少的药物也会根据不同的基因而重新使用。

此外, 对相应基因型作用最好的药物便可以很快地筛选出来, 从而不再使受试者服用低效、无效、甚至有毒的药物, 使临床试验的风险得到了极大的降低, 因为在受试药品和特定基因之间的关系已经建立了。研发药物的个性化是未来制药业发展的一个方向, 也就是说, 在进行药物的设计时以基因特性为依据进行划分, 甚至是针对每一个人, 然而作用的靶位和作用的个体才是真正的药物作用的专一性。

2.2 药物基因组学与临床合理用药

目前, 药代学原理和患者生理指标参数是判断合理用药的依据, 在制订个体化的治疗方案时, 以公式计算为依据对药物剂量和给药间隔进行调整, 对于血药浓度与药效一致, 这种方法是极为实用的, 然而, 如果患者不一致, 那么便不再适用。产生这种情况是由药物相关基因的多态性和患者个体基因的差异导致的, 因而在考虑问题时要从药物基因组学为出发点。在基于药物基因组学的药物靶向治疗中, 为患者开的处方是以患者的基因特异性为依据的, 即根据患者的个体特点进行给药, 不仅使药物的有效性最大程度地增加, 还使药物不良反应最大程度地减少了, 既使医疗费用得到了节约, 还使临床合理用药的最终目标得以实现。

高通量、高灵敏度、高特异性的基因检测技术是实现在临床上应用药物基因组学的基础和重要前提。目前, SNP是分析药物反应性相关基因关联的主要工具。美国食品和药品管理局早在2004年12月就批准了第一个以遗传学检验法为主的实验室。检测CYP2D6的基因变异是“Amplichip细胞色素P450基因分型试验”的检验方法的主要目的。目前, 该基因的某些变异与患者对某些药物的反应速度具有关联性已经被证实了, 通常, 对于代谢快的患者, 应该对其使用大药量, 对于代谢慢的患者应该使用小药量。在检测中, 患者的β受体阻滞剂、一些抗抑郁药、抗精神病药和化疗药物等与CYP2D6相关的代谢能力被掌握, 以便对临床药量更好地掌握。目前, 抗肿瘤药物是主要的运用于临床的以药物基因组学的靶向性为基础的药物, 其他药物还非常少。

关键词：药物基因组学,研究,内容,应用

参考文献

[1]Evans WE, Johnson JA.Pharmacogenomics:the inherited basis for in-terindividual differences in drug response[J].Annu Rev Genomics HumGenet, 2001, 2:9-39.

[2]史道华, 陈鹭.药物基因组学与制药用药个体化[J].海峡药学, 2002, 14 (6) :1-3.

[3]张惠娟.药物基因组学及其在合理用药中的应用[J].中国现代应用药学杂志, 2003, 20 (1) :20-21.

猪脂肪性状相关功能基因的研究 篇4

1瘦素(Leptin)基因

Leptin由肥胖基因编码,是一种主要由白色脂肪细胞分泌的反馈性抑制脂肪的激素,由167个氨基酸组成,相对分子质量16 ku[6]。Leptin具有广泛的生物学效应,可调节摄食、能量利用、生长、繁殖和免疫等生物学过程[7],其中最突出的功能是作用于下丘脑的体重调节中枢,引起食欲降低、能量消耗增加,从而降低脂肪沉积、抑制体增重[8,9,10]。

Leptin作为一种脂肪细胞分泌的激素主要在调节机体能量平衡及脂肪沉积方面发挥重要作用[11]。 在人类和鼠上发现,血清Leptin水平及脂肪组织中Leptin的m RNA量与肥胖程度呈正相关,肥胖者表现出Leptin抵抗[12,13,14]。在猪的研究上得出相似结论,肥胖型猪的血清Leptin水平和脂肪组织中Leptin m RNA的表达量均高于瘦肉型猪或较瘦的杂交猪[15], 而且血清Leptin水平与胴体背膘厚度呈高度正相关,与胴体瘦肉率或眼肌面积呈强负相关,而与主观大理石评分相关性较弱[16,17]。脂肪组织中Leptin m RNA的表达量 与背膘厚 度呈正相 关[18]。 血清Leptin水平与脂肪组织Leptin m RNA的表达量也呈正相关[19]。另有研究结果发现,随着猪前体脂肪细胞的增殖和脂肪细胞的肥大,脂肪细胞中Leptin m RNA的表达量也随之升高,说明Leptin可能作为一种脂肪生成反馈剂去除多余脂肪[20,21]。猪的脂肪沉积能力愈强,脂肪组织分泌和表达的Leptin就愈多,而且Leptin的分泌量和表达量与猪胴体品质具有紧密相关关系[22]。

2解偶联蛋白3(Uncouplingprotein3,UCP3)基因

猪解偶联蛋白3基因属于UCP基因家族,位于9号染色体上,其开放阅读框长度为936 bp,编码331个氨基酸的蛋白质。猪UCP3具有6个跨膜功能域和一个嘌呤核苷酸结合区[23,24]。UCP3是分布于线粒体内膜的质子转运载体,介导内膜外侧的质子内流形成质子漏,降低内膜两侧H+电化学梯度,造成氧化过程与ADP磷酸化过程解偶联,质子所带有的能量以热的形式释放,是机体耗能产热的重要方式[25]。在骨骼肌和脂肪组织中表达的UCP3具有显著影响肌肉和脂肪能量转换的基因效应,可能是肉质性状的主效基因或与主效基因紧密连锁的标记基因。

对猪UCP3基因的部分编码区进行了测序,在395 bp处发现了1个c SNP位点[26],该c SNP位点发生G-A突变,并导致相应编码氨基酸由Gly-Arg的改变。该位点可以被限制性内切酶SmaⅠ识别。利用PCR-RFLP方法,发现AA、AB和BB 3种基因型,其中A等位基因频率0.56,B等位基因频率0.44。UCP3 SmaⅠ位点主要表现为加性效应,基因型AA降低膘厚,提高系水力和降低失水率,但同时也降低肌内脂肪含量。猪UCP3基因5'调控区序列的AvaⅠ酶切位点与肌肉和脂肪的能量转化显著相关[27]。在基因调控区序列发现一个AvaⅠ酶切位点,该酶切位点与猪的不同能量代谢类型极显著相关[28]。通过PCR-SSCP方法,证实基因与胸腰椎间膘厚、系水力和失水率呈显著相关[29]。因此,UCP3基因的遗传变异,有可能导致机体能量消耗程度的差异,从而可能导致个体间的体脂代谢、体脂含量乃至脂肪沉积性状的改变。寻找UCP3基因的多态性,研究其对脂肪沉积和肉质性状的遗传效应,有可能为今后猪的遗传品质改良提供一定的遗传学依据。

3叉头转录因子O亚家族1(ForkheadtranscriptionfactorgroupO1,FoxO1)基因

叉头(forkhead box, Fox)转录因子是对异常头果蝇突变体的研究中发现的,在众多的家族成员中,研究最深入的是叉头转录因子O亚家族(forkhead transcription factor group O, Fox O)[30]。 Fox O在哺乳动 物中的成 员包括Fox Ol、 Fox O2、 Fox O3和Fox O4,主要参与细胞周期调控、DNA修复等。利用RT-PCR方法,以提取猪脂肪组织总RNA为模板,在成功扩增得到长度为414 bp的猪Fox Ol基因c DNA部分序列的基础上,运用RACE技术成功得到了猪Fox Ol基因c DNA全长[31]。

利用RT-PCR法检测6月龄八眉、长白和长×八杂交猪后腿部比目鱼肌、腓肠肌和趾长伸肌中Fox Ol基因的表达量[32],结果发现,Fox Ol基因在八眉猪和杂交组合猪骨骼肌中的表达量均显著高于长白猪, 表明Fox O1很可能对猪骨骼肌的含量进行负调控, 此基因很可能是导致不同经济类型猪肌肉发育过程产生差异的主要基因之一[33],同时还发现在以IIb型纤维为主的趾长伸肌中表达丰度远远高于以I型纤维为主的比目鱼肌,表明Fox Ol基因的表达与I型肌纤维的含量成反比,Fox Ol基因调控不同经济类型猪品种骨骼肌的发育。同年,又研究发现Fox Ol和成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen, Myo D)基因m RNA的表达在不同经济类型猪肌肉发育中存在负相关,相关系数为0.728[34]。利用RT-PCR、Western blotting等检测在猪成肌细胞分化过程中Fox O1早期和晚期Myo D及肌细胞生成素 (myogenin, Myo G)的表达变化,结果发现,尽管Fox O1 m RNA表达量显著增加,但总蛋白量变化不显著,显著上调了其磷酸化水平[35];同时,高表达Fox O1的猪成肌细胞中,Myo D蛋白变化不显著, Myo G水平却明显降低,表明猪成肌细胞的分化时间推迟及被抑制分化很可能是因为Fox O1作用的结果。Fox O1在180日龄大白猪比目鱼肌、趾长伸肌、 腓肠肌和背最长肌中的表达差异均不显著,其蛋白表达与My HC各亚型呈显著相关,用青霉素(wortmannin)处理原代培养的猪骨骼肌成肌细胞的第3和5天时,Fox O1蛋白与My HC I、My HC IIa和肌细胞增强因子2c(MEF2c)表达均呈显著负相关[36],表明Fox O1很可能是通过抑制My HC I的表达来调控肌纤维类型。Fox O1很可能是通过抑制神经钙蛋白(calicineurinm, Ca N)/活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NEAT)信号通路或Ca N/ MEF2信号通路对I型肌纤维的表达进行负调控[37]; 2、5月龄民猪和长白猪的肾周脂肪中Fox Ol基因表达量极显著高于1、6、8月龄,并发现Fox O1可能通过抑制PPARγ、 CCAAT区/增强子结 合蛋白 α (CCAAT/ enhancer binding protein α, C/EBPα) 基因的表达来减少脂肪沉积[38]。

4钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin,CAST)基因

钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin, CAST)基因是一种特定的、内源性的、需钙激活的蛋白酶抑制剂,被定位于猪的2号染色体上[39]。CAST基因与肌肉嫩度存在极其紧密的联系,其产物对于肌肉生长过程中蛋白质的更新具有重要作用。在细胞内普遍存在着需钙蛋白酶(calpain)的蛋白水解系统,大量参与到生长和代谢过程。钙蛋白酶系统主要包括钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白。钙蛋白酶根据其表现半最高活性所需的Ca2 +浓度分为2类,钙蛋白酶1 (u-calpain)和钙蛋白酶2(m-calpain)。活体屠宰后较低浓度的Ca2+就可以激活u-calpain,使其表现出蛋白水解酶活性。如果附近有CAST,就可迅速与u-calpain结合,抑制蛋白酶的活性,从而抑制肌肉内蛋白质的降解,促进蛋白质的合成,提高肌细胞生长速度[40]。猪肉的嫩度与CAST/u-calpain的活性比值有密切的联系,活性比值越大,CAST的量相对越大,钙蛋白酶抑制蛋白对钙蛋白酶的抑制作用越强,肉的嫩度越好[41]。对125头杂交猪进行多态位点研究并分析其对猪的肉质和背膘的影响时发现, 其中A、B 2个位点均对肌内脂肪含量有显著影响, B、C、D 3个位点均对背膘厚有显著影响[42]。对3个猪品种钙蛋白酶抑制蛋白基因多态性进行了研究,结果发现钙蛋白酶抑制蛋白基因的一定基因型与猪肉的嫩度存在相关性。由此看来,钙蛋白酶抑制蛋白主要通过影响猪肉的嫩度来改变猪肉的肉质性状[43]。

5促黑激素皮质素4受体(Melanocortin-4receptor,MC4R)基因

促黑激素皮质素4受体(melanocortin- 4 receptor, MC4R),由332个氨基酸残基组成,是跨膜G-蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors, GPCRs)超家族的成员之一[44]。MC4R能够通过中枢神经系统调节体重,主要表现为抑制摄食,导致血糖、胰岛素和瘦素水平降低,从而减少体脂、降低体重,在动物的体重、能量稳态和采食量的调控中具有重 要作用[45]。 猪MC4R基因位于1号染色体q22-27处,与猪1号染色体上的数个标记明显连锁,用两点连锁分析得到的两个离MC4R基因最近的连锁标 记是SO3113(0, 17.76)和S0082(0.05, 14.74)[46]。

MC4R基因型与背膘厚和生长率以及采食量呈强相关,AA基因型背膘比BB基因型薄9%,BB基因型比AA基因型日增重高37 g/d,且差异显著[47]。不同的MC4R基因型间肉质指数、最后肋骨处背膘厚、腰部背膘厚、平均背膘厚、平均日增重、肌肉中乳酸的集中差异显著[48]。猪MC4R基因第7跨膜结构功能区域的一个高度保守区存在G-A错义突变,产生Taq I酶切位点的改变,这一突变使MC4R蛋白第298位氨基酸天冬氨酸被天冬酰胺代替[49]。对不同品系猪该位点的多态与生产性能关系的研究,证实了MC4R基因型与背膘厚、生长率和采食量呈强相关[50]。猪MC4R基因存在一个氨基酸编码的错义突变,可导致猪胴体重和采食量显著变化[51]。

综上所述,Leptin、UCP3、Fox O1、CAST、MC4R基因对猪的脂肪沉积与代谢均起重要作用。尽管对这些基因的结构和表达调控规律有了一些认识,但具体调控机理和分子机制还有待于从细胞水平和分子水平上作进一步研究[52]。另外,希望在不久的将来能利用这些猪肉质性状主要功能基因进行肉质改良等育种工作,为优质肉质性状的猪品种的育种实践提供依据,从而获得更高品质的猪肉来满足人们的需求[53]。

摘要：猪肉品质性状改良是当今遗传育种界的研究热点之一,脂肪性状是肉质的一项重要指标。本文综述了影响猪脂肪性状的几个功能基因,即瘦素(Leptin)基因、解偶联蛋白3(UCP3)基因、叉头转录因子O亚家族1(Fox O1)基因、钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因、促黑激素皮质素4受体(MC4R)基因的研究进展,以期为改善猪脂肪性状提供参考。

功能基因组学研究 篇5

1 反转录转座子的类型与结构

反转录转座子是真核生物中最为广泛的转座因子,在植物基因组中占有极大的比例,在水稻中占18%,在玉米中占50%~80%,在小麦中达90%[1]。反转录转座子根据其5′端和3′端是否有重复序列首先可被分为两类:长末端重复反转录转座子(long terminal repeats,LTRs)和非长末端重复反转录转座子(non-long terminal repeats,non-LTRs)。LTR反转录转座子又可分为Ty1-copia与Ty3-gypsy两个亚类。而非长末端重复反转录转座子根据长度和组成的不同又分为LINEs(long interspersed nuclear elements)和SINEs(short interspersed nuclear elements)两种类型[2](见图1)。

长末端重复反转录转座子在转座子的5′端和3′端有一对同向高度相似的序列,长度从几百bp到几千bp不等。重复序列中通常含有一些调控元件,主要包括反转录转座子转录需要的启动子和终止子,长末端反转录转座子通常由RNA聚合酶II转录,从5′端开始,结束于3′端。Ty1-copia与Ty3-gypsy两类反转录转座子都编码一个多聚蛋白(polyprotein),该蛋白可被蛋白酶切割形成有功能的多肽,称为gag和pol。其中gag编码结构蛋白负责包涵反转录转座时的RNA中间体,而pol则编码反转录转座子生活周期中的一些酶类。Ty1-copia与Ty3-gypsy中这些酶在pol中的顺序并不一样[3]。目前已发现的具有活性或潜在转座活性的植物LTR类反转录转座子见表1。

非长末端重复反转录转座子没有两端的LTR序列,在3′端以poly(A)结尾(见图1)。LINEs和长末端重复反转录转座子类似,也是RNA聚合酶Ⅱ转录而来,具有gap和pol等机构蛋白。通常认为LINE是长末端重复反转录转座子的前体。SINEs是RNA聚合酶Ⅲ转录而来,不具备编码任何蛋白的功能,通常只存在于被子植物中[4]。

2 LTR反转录转座子的活性调节

LTR反转录转座子通常在植物基因组中以多拷贝的形式存在,并占有极高的比例,例如大麦中的Ty1-,BARE-1以及玉米中的Opie-1和Huck2通常都有20 000~200 000个拷贝。植物为了防止这些反转录转座子频率过高的转座而造成基因突变以及基因组的不稳定性,进化出很多机制抑制反转录转座子转座的机制,其中,基因沉默(gene silencing)是最普遍和有效的方法。基因沉默分为转录后水平的基因沉默(Posttranscriptional gene silencing,PTGS)和转录水平的基因沉默(Transcriptional gene silencing ,TGS)。目前研究表明,TGS是植物抑制反转录转座子的转座的主要方式,在此过程中,在宿主中表达与目标序列多个拷贝是介导TGS沉默的关键因素[5]。例如,通过表达多个拷贝的果蝇LINE类型的反转录转座子“Drosophila I”的部分序列,能够强烈抑制该反转录转座子的活性。同时,研究表明,植株体内的干扰性小分子RNA(short interfering RNA,siRNA)也能介导TGS从而导致反转录转座子的沉默[6]。

3 LTR类反转录转子在植物基因组学研究中的应用

3.1 LTR类反转录转座子在植物基因组进化研究中的应用

LTR类反转录转座子在植物进化中具有重要的研究价值,LTR类反转录转座子可以像反转录病毒一样,以RNA为中间载体,以通过“复制-粘贴”的方式反复插入基因组,导致宿主基因组被扩增而自身在宿主基因组中的比例增大,这是造成物种多样性的重要推动力。Vitte等人研究了水稻基因组中41个LTR反转录转座子家族的进化历史发现每个LTR反转录转座子都有独特的转座方式,并且其DNA序列的变化速度非常快[7];研究表明,澳洲野生稻在过去的三百万年的进化过程中,其基因组中增加了9万个反转录转座子的拷贝,从而导致其基因组大小增加了约1倍[8]。在某些基因组较大的植物中,还发现了“嵌套式反转录转座子”,即一个反转录转座子存在于另外一个反转录转座子之中。通过比较玉米和高粱该区域的“嵌套式反转录转座子”序列发现,高粱中缺乏该结构,说明“嵌套式反转录转座子”的形成是在玉米和高粱2个物种分化之后形成的。同时研究还表明,在玉米和高粱分化之后,反转录转座子在2个物种基因组中的转座频率是不一样的[9]。

3.2 LTR反转录转座子在基因功能研究中的应用

LTR反转录转座子可用于对植物基因功能的研究,反转录转座子在转座时能够插入到植物基因内部或基因附近,从而造成了该基因的缺失或者破坏该基因的启动子而导致基因的表达量发生变化,通过对表型的鉴定可获得特定基因的功能[10,11]。另外,研究表明,反转录转座子能够改变某些蛋白的空间结构,从而改变蛋白的功能[12]。在水稻中,Hirchick等构建了反转录转座子Tos 17基因敲除体系,用于水稻中基因的克隆[13]。应用该体系,Sato等人克隆了水稻OSH15基因,并证明了该基因能够控制水稻的节间延伸[14]。

4 结论与展望

功能基因组学研究 篇6

1 DAZ基因家族的起源和结构

AZF区域可划分为3个亚区,依次为AZFa、AZFb和AZFc。最新的研究表明,还存在第4个亚区,即AZFd,此亚区位于第2和第3亚区之间。迄今为止,已从这些区域分离出至少12个基因,AZFc位于Y染色体缺失间隔区的远端,在2%～10%的精子缺乏或重度精子减少患者中均存在AZFc区域缺失现象,此区域包含7个被认为与精子发生有关的基因家族。 通过对不同动物DAZ基因同源序列的分析发现,DAZ基因家族有3个成员,即BOULE、DAZL、DAZ。此家族的基因以在生殖细胞中表达为特征,编码的蛋白含有1个高度保守的RNA识别序列。BOULE基因和DAZL基因含有1个DAZ复制子,而DAZ含有多个呈串联排布的DAZ重复序列。BOULE和DAZL基因均为常染色体单拷贝基因,前者被认为DAZ基因家族的祖先基因,它的同源物已在秀丽线虫、果蝇、老鼠和人类中被鉴定;DAZL基因的同源物仅在脊椎动物中存在,它们和DAZ基因的同源性比BOULE基因更近一些;DAZ基因仅存在于旧大陆猴和类人猿的Y染色体中。BOULE、DAZL和DAZ基因属于同一基因家族,然而它们编码的蛋白却相差很大。BOULE基因与DAZL或DAZ之间的同源性是有限的,在RNA识别结构域(RRM)和DAZ重复区其同源性分别为78%和50%。DAZL和DAZ基因的长度相当,但在C端由于DAZ重复区下游读码框的不同而导致2条序列的完全不同;因此,不同的DAZ蛋白对应不同的RNA底物,发挥着不同的功能,人类或鼠的DAZL基因的无义突变会导致精子发生缺陷。

2 DAZ基因家族的表达

DAZ基因家族只在生殖细胞中表达,至于它们是存在于睾丸组织或卵巢组织还是两者均有,取决于基因及物种。BOULE基因表达于大多数动物的睾丸组织(秀丽线虫除外),而BOULE基因的同源物DAZL基因仅表达于卵巢组织。相对于DAZL和DAZ基因来说,BOULE基因的表达发生于雄性生殖细胞发育的晚期。在果蝇中,BOULE蛋白首先出现在精母细胞的核周区域,并且在减数分裂初始就从细胞核转位到细胞质中[2];在人类和小鼠的睾丸组织中,BOULE基因存在于精母细胞粗线期的细胞质中及精子细胞的周围,而从精原细胞期开始缺失[3]。DAZL在睾丸组织和卵巢中都有表达,而位于Y染色体上的DAZ基因仅在睾丸中表达,DAZL和DAZ均可在胎儿性腺的原始生殖细胞核中检出,在成年鼠和人类的睾丸组织中,它们主要存在于粗线期精母细胞的细胞质中,而在精原细胞中含量较少;因此,这2种蛋白在减数分裂期即从细胞核转移到细胞质。

3 DAZ基因家族是生殖细胞发育所必需的

DAZ基因家族是生殖细胞发育所必需的,在雄性果蝇中,BOULE基因的突变会引发不孕,它们的精母细胞发育会在G2/M期停止,这表明BOULE基因是雄性生殖细胞减数分裂所必需的[4]。与之相反,秀丽线虫的BOULE基因是雌性生殖系统所必需的,雌雄同体的虫体因缺失DAZ-1基因而导致卵子发生障碍,最终产生不孕[5]。有研究者构建了BOULE基因敲除小鼠,有趣的是BOULE基因缺失的小鼠减数分裂完全正常,并且可以稳定地检测到单倍体次级精母细胞;然而,单倍体次级精母细胞除第6阶段外其他阶段均未发育,说明BOULE基因在精子形成中的作用是促进次级精母细胞向成熟精子的分化,而在BOULE基因缺失小鼠中,精子形成过程的关键调控子表达并未受影响。在脊椎动物中,爪蟾卵DAZL 基因mRNA的缺失可导致蝌蚪原始生殖细胞的缺失,说明DAZL基因影响生殖细胞的发育[6]。老鼠DAZL同源基因的无义突变可引起雌、雄双性不育,在发生无义突变的9日龄小鼠睾丸组织中几乎没有生殖细胞,而在同日龄的野鼠睾丸中发现大量的A型精母细胞,而不是前细线期精原细胞[7]。A型的精母细胞具有增殖活性,并且c-kit蛋白试剂染色呈阳性,DAZL基因发生无义突变的小鼠精子发生障碍主要表现在从A型精母细胞到A1型细胞的分化失败,表明DAZL基因是A型精母细胞分化所必需的,同时也表明DAZL和DAZ在原始生殖细胞发育以及生殖细胞的分化、成熟过程中均发挥了作用。尽管在很多有机体包括人类中,DAZ基因家族的缺失和不育密切相关,但是对体内转录子的调控仍然不清楚。有研究者运用免疫共沉淀和微阵分析,鉴定出一些在体内外可与鼠DAZL结合的mRNA, 通过序列分析表明,这些转录子含有DAZL的结合位点,缺失DAZL基因的小鼠Mvh蛋白的表达水平降低,此基因是雄性配子形成必需的,这说明DAZL对Mvh翻译的调控是哺乳动物精子形成必不可少的[8]。有学者研究了DAZL基因在小鼠生殖细胞中的功能,结果发现DAZL与动力蛋白轻链之间有特殊关系,DAZL的细胞亚分布是微管依赖性的,并且其选择结合的mRNA都聚集在细胞核周围区域;因此,推断DAZL在转运特异动力蛋白mRNA过程中发挥作用[9]。有研究者利用一个生殖细胞报告基因,定量地从男性和女性的胚胎干细胞中分离出初始生殖细胞,对编码生殖细胞特异的RNA结合蛋白采用沉默及超表达技术,调控人类生殖细胞的形成和发育过程,结果发现人类DAZL基因在初始生殖细胞形成中的作用与DAZ、BOULE基因在减数分裂和单配体发育中的促进作用密切相关。有人分析了174例原发性不育患者及58例用重亚硫酸盐处理的对照序列,发现在对照组中,DAZ基因启动子区域CpG岛的甲基化方式在体细胞和精子细胞之间是不同的。在体细胞中,处于不同不育阶段的精子细胞DAZ基因的甲基化方式是相同的,但在精子细胞中,正常者是完全甲基化的;而精子缺乏症患者是完全没有甲基化的,这说明DAZ基因的甲基化方式和精子发生失败不相关,也提示DAZ基因的后天修饰不是精子发生失败的病因[10]。

4 DAZ蛋白的功能

S.Maegawa等[11]研究发现,DAZ蛋白可能调控蛋白的合成,果蝇的Twine基因突变在表型上和BOULE基因很相似,说明这2个基因可能具有相似的生物学功能。Twine基因编码减数分裂特异性的Cdc25磷酸酶,此酶可以促进细胞的分化。研究发现,在BOULE基因突变者中,Twine蛋白的水平有明显下降。运用启动子及精母细胞特异的β2微管蛋白基因的5′端和3′端非编码基因经转基因异源表达可恢复BOULE基因在减数期的缺失,这表明BOULE基因在控制Twine基因的mRNA翻译过程中发挥重要作用。

4.1 DAZL蛋白的RNA结合活性

在体外,DAZ蛋白可与RNA聚合物在RRM区结合,并且优先选择polyU和polyG区域。有人采用指数富集的配基系统进化技术(SELEX)及酵母3杂交系统测定DAZL蛋白对(GUn)n RNA序列结合的特异性,发现1个富含U的序列位于鼠Cdc25C基因的5′端非编码区。鼠中共有3个Cdc25基因,Cdc25A在有丝分裂和减数分裂的生殖细胞中均有表达;Cdc25B在体细胞和睾丸组织中表达;Cdc25C在大多数处于粗线期-双线期的精母细胞及精子中表达。研究发现,Cdc25C的5′端非编码区在酵母3杂交分析以及体外凝胶阻滞试验中都能特异性地与mDAZL结合,说明Cdc25C是mDAZL的下游靶标。用免疫共沉淀技术从小鼠睾丸分离到了DAZL相关的RNP离子,并且测定了离子中所含RNA种类。以几个已知的基因为假定mDAZL RNA底物进行鉴定,这些基因包括Tpx-1、Pam、Trf2、GRSF1、Cappb 2、Pa 7/C8和H47,其中特别值得关注的是Tpx-1基因,它是富含半胱氨酸分泌性蛋白家族中的一员,特异性表达于睾丸组织中,并且已证实与Sertoli生殖细胞有关。还有研究发现,其免疫选择基因包含3′端非编码区的共同序列,而并非是富含U的序列;另外,这个DAZL结合位点存在于小鼠Cdc25A基因的3′端非编码区,而Cdc25C不含此位点。

4.2 DAZL基因在蛋白合成中的作用

尽管早期的研究为BOULE基因在调控mRNA翻译方面的作用提供了有力证据,但是有关DAZL在此方面的证据至今严重不足。有研究者运用SELEX技术检测发现,斑马鱼DAZL基因能特异性地与GUUC序列结合,此序列位于Twine和斑马鱼DAZL序列的3′端非编码区。研究表明,体外培养的CV-1细胞中所含的斑马鱼DAZL基因可以适当增强荧光素酶报告基因的表达。但也有研究发现,小鼠睾丸中的DAZL可以利用oligo-dT捕获,揭示其可以与poly A+ mRNA结合。

4.3 DAZ、DAZL与其他蛋白的关系

通过酵母双杂交技术已经鉴定了几种与DAZ和DAZL有关系的蛋白[12]。事实上,人类BOULE基因最初是以DAZ为诱饵蛋白,利用酵母双杂交技术获得的;因此,DAZ蛋白在细胞中以同源二聚体或异源二聚体的形式存在。目前,已经证实mDAZL二聚体的形成是RNA依赖的,并且需要1个与C末端部分重叠的有53个氨基酸残基序列[13],其他与DAZ和DAZL有关系的蛋白包括DAZAP1、DAZAP2、 PUMILIO-2、hQK3、DZIP1、DZIP2和DZIP3。除DAZAP2和DZIP3之外,其余均为RNA结合蛋白。DAZAP1在睾丸中大量表达,它广泛存在于粗线期精母细胞和精子细胞的细胞核中,而在精子细胞拉长期进入细胞质中,它在非洲爪蟾中的同源物多聚脯氨酸RNA结合蛋白(Prrp)结合于Vg1 mRNA 3′端非编码区的定位元素,是成熟卵子穿过植物皮层所必需的,提示其与DAZAP1转运及RNA定位的功能相似。研究发现,DAZAP1是mRNA降解和沉默所必需的。DAZAP2 Prtb编码的蛋白相似,小鼠中此基因的缺失可导致不太明显的生殖缺陷。研究表明,PUMILIO-2与胚胎干细胞和生殖细胞在果蝇及秀丽线虫PUMILIO同系物中是维持生殖干细胞所必需的[14]。在果蝇中,PUMILIO是结合于弓形结构mRNA 3′端非编码区的微调控元件,并且抑制其翻译。DAZ与DAZL蛋白之间的关系目前尚未确定,其生物学作用也属未知。

5 问题和展望

功能基因组学研究 篇7

一、Septin基因家族的分类

Septin基因最早是在酿酒酵母 (Saccharomyces Cerevisiae) 中被发现的[1]。随后, 陆续在真菌、线虫、果蝇以及哺乳动物中发现有septin基因的存在。到目前为止, 人们已经在酵母中已发现了7种septin基因;线虫中有2种;果蝇中有5种;迄今为止, 人类已有14个septin基因被发现, 这些基因被统一命名为SEPT。发现的这14种SEPT基因分别是SEPT1~SEPT14, 这些基因编码蛋白质相对分子质量大约在39~60k Da之间[2]。此外, 根据序列相似程度, 人们将SEPT基因家族成员又分为了4个不同的亚家族, 分别是SEPT 2亚家族 (SEPT 1、2、4、5) 、SEPT 3亚家族 (SEPT 3、9、12) 、SEPT 6亚家族 (SEPT 6、8、10、11、14) 、SEPT 7亚家族 (SEPT 7、13) 。

二、septin的生理功能

近年来的研究表明, septin蛋白作为一种新的细胞骨架成分, 在很多细胞生理过程中发挥着重要的作用, 包括细胞分裂、细胞内物质运输以及细胞凋亡等。

1. 参与胞质分裂。

Septin基因最早是在分裂缺陷型的酿酒酵母中被发现的, 该基因的缺失[1]或突变都会引起酵母的胞质分裂受阻。在酵母中, 人们发现细胞分裂最典型的特征是形成收缩环。母细胞就是在收缩环的作用下被肌动蛋白纤维束牵引着分裂成两部分, 同时胞内物质也被均等地分配到两个子细胞中去。Mostowy等[3]研究发现, septin蛋白在细胞分裂过程中为收缩环和相关分裂因子的形成起着一个骨架支撑的作用。如果该基因的表达异常则会导致细胞分裂受阻, 出现细胞及胞内物质分离障碍。Kim等[4]认为septin蛋白之间可以通过中间的GTP结合区相互作用形成septin原纤维, 从而参与到细胞的分裂过程。微丝和微管作为细胞质分裂过程中功能最重要的两种细胞骨架成分, 调控着Septin原纤维的组装。目前的研究认为, septin原纤维组装可分为依赖肌动蛋白组装和不依赖肌动蛋白组装两种模式[5]。前者是在纤维状肌动蛋白束存在时, septin原纤维丝通过Anillin等接头蛋白与肌动蛋白纤维束形成Septin/Anillin复合物, 并且在该复合物的形成过程中不需要消耗GTP, 而是通过C端自身的卷曲结构域进行连接, 形成约7nm长的丝状结构。该模式即为依赖肌动蛋白的septin组装。后者是在人为细胞损伤等特殊情况下, 肌动蛋白的组装变得异常活跃, 此时septin-肌动蛋白复合物中的septin蛋白纤维微丝发生分离, 卷曲形成“C”型、“O”型的环状结构, 因此把这种组装模式称之为不依赖肌动蛋白的septin组装。Septin组装的这两种模式均在细胞分裂过程中起到非常重要的调节作用。

2. 参与细胞内的物质运输。

胞内运输 (intracellular transport) 是真核生物细胞与细胞内环境进行物质交换的一种重要方式, 也是维持机体生命活动的必要条件。该过程的实现需要多种物质的参与和调控, 其中, 最重要的调控因子就是组成细胞骨架的主要成分———微管蛋白。恰恰微管蛋白的形成与septin有着密切的联系。Weirich等[6]研究表明在He La细胞系里, SEPT 9基因编码的SEPT 9蛋白可直接与微管、纺锤体共定位。用微管聚合的特异性抑制剂———秋水仙胺 (demecolcine) 处理后, SEPT 9结构受到影响, 在细胞质内分布呈点状。但用si RNA (Small interfering RNA) 抑制SEPT 9的正常表达后, 微管蛋白的结构稳定性以及表达等均不受影响, 但同样用si RNA抑制住SEPT 6的表达, 反而可以大大增强微管的稳定性。这是因为SEPT 6可以与微管蛋白MAP4 (microtubule-associated protei) 相互结合, 从而阻止了微管与MAP4的结合, 所以当SEPT 6的表达受到抑制后, 微管蛋白与MAP4的结合增加, 使微管结构更加稳定。此外, septin蛋白家族成员中的septin 2和septin 5与影响物质运输的另外两种大分子SNARE (Soluble NSF attachment protein receptor) 蛋白和exocyst-sec6/8复合物存在着相互作用。这两种septin蛋白在细胞内物质的运输与分泌中有重要作用。

3. 参与细胞凋亡。

Septin蛋白已经被证实参与了凋亡信号通路。SEPT4的变异剪接本ARTS (apoptosis-related protein in the TGF-beta signalling pathway) 参与了细胞凋亡途径。该蛋白在一些凋亡刺激因子如Fas、TGF-β、etoposide等作用下, ARTS可以促进细胞的凋亡[7]。此外, 细胞凋亡过程中还有一组发挥着重要作用蛋白酶———半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶 (caspase) 。该酶的活性可被ARTS活化, 从而激活凋亡通路。并且在凋亡信号的刺激下, ARTS从线粒体释放, 并在胞质中与X连锁凋亡抑制蛋白 (X—linked inhibitor of apoptosis, XIAP) 特异性结合, 这就极大地降低了XIAP的表达水平, 从而解除了XIAP对caspase的抑制作用, 增强了ARTS的活性, 进而促进细胞凋亡。

三、结语

Septin基因家族的功能研究从发现以来已经取得了相当大程度的进展。目前越来越多的证据表明, septin很有可能是作为一种脚手架蛋白负责募集或阻隔相关的细胞功能蛋白来参与调控一系列重要的生理过程, 包括细胞分裂、细胞极性形成、囊泡运输、胞吞胞吐和细胞凋亡等。但由于septin基因家族结构的特殊性和成员的复杂性, 其详细的生理功能还有待进一步深入研究。综合近年来有关septin基因家族的研究报道发现, 未来的研究重点可能会是系统探索和阐明septin基因与疾病的关系以及其在人类疾病中扮演的角色。

参考文献

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[3]Mostowy S, Cossart P.Septins:the fourth component of the cytoskeleton[J].Nature reviews Molecular cell biology, 2012, 13 (3) :183-194.

[4]Kim M S, Froese C D, Xie H, et al.Uncovering principles that control septin-septin interactions[J].Journal of Biological Chemistry, 2012, 287 (36) :30406-30413.

[5]Kinoshita M, Field C M, Coughlin M L, et al.Self-and actin-templated assembly of mammalian septins[J].Developmental cell, 2002, 3 (6) :791-802.

[6]Weirich C S, Erzberger J P, Barral Y.The septin family of GTPases:architecture and dynamics[J].Nature reviews Molecular cell biology, 2008, 9 (6) :478-489.

功能基因组学研究 篇8

人食管癌相关基因4(esophageal cancer related gene 4, ECRG4)是重要的食管癌相关的新基因[5,6]。我们发现,人食管癌相关基因4的基因表达的下降在食管鳞状细胞癌的发生中具有非常重要的地位。目前,人食管癌相关基因4蛋白的生物学抑制肿瘤生长的功能还不清楚。我们的初期研究结果表明,人食管癌相关基因4是食管癌的候选抑癌基因,人食管癌相关基因4蛋白是食管癌预后的标志物。人食管癌相关基因4可以通过参与炎症反应的中心通路,并且下调炎症产物环氧化酶-2的表达来发挥其抑制肿瘤细胞生长的功能[7,8,9]。Mori等[10] 研究进一步证实了我们的结论。

以往的研究表明,人食管癌相关基因4是肿瘤相关抑癌基因,人食管癌相关基因4的表达过量能够抑制肿瘤细胞的生长增殖[7]。然而,关于人食管癌相关基因4蛋白的亚细胞定位和抗肿瘤增殖功能国内还未见报道。本实验中,我们检测人食管癌相关基因4蛋白的亚细胞定位,同时进一步研究纯化的重组人食管癌相关基因4蛋白的体外抑癌功能,研究重组人食管癌相关基因4蛋白能否成为未来的食管癌的生物治疗药物。

1 资料与方法

1.1 材料与试剂

我们采用人的食管癌细胞系EC9706和NEC,和动物的永生化细胞株HEK293。实验细胞细胞培养利用含有10%的胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 U/ml 链霉素的RPMI1640培养基,培养条件为37 ℃和5% CO2 的饱和湿度培养箱。实验用的DMEM培养液、胎牛血清、青霉素和链霉素等试剂都购买于美国Gibco公司。医学科学院肿瘤研究所自己研制了抗人食管癌相关基因4蛋白的多克隆抗体[7]。羊抗兔IgG购自Santa Cruz公司。Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。

1.2 人食管癌相关基因4蛋白的亚细胞定位

1)内源性:将EC9706肿瘤细胞接种到准备好的培养皿中,等到肿瘤细胞生长到符合条件,采用即时准备的4%多聚甲醛固定肿瘤细胞10 min。PBS溶液冲洗三次。0.2% triton X-100细胞通透化处理10 min。PBS溶液冲洗三次。再利用即时准备的2%BSA封闭30 min。PBS溶液冲洗三次。然后我们再加入即时稀释的抗人食管癌相关基因4蛋白的多克隆抗体,在温箱中放置1 h。PBS洗三遍,5 min/次。加入荧光标记的二抗,室温孵育45 min。PBS溶液冲洗三次。然后我们再加入即时准备的0.5 μg/ml的DAPI溶液染色15 min。PBS溶液冲洗三次。最后我们加入即时准备的20 μl 封片剂封片,冰箱中备用。荧光照相装置利用激光共聚焦显微镜拍照定位。DAPI(蓝色)染细胞核。2)外源性:我们利用NEC肿瘤细胞转染标记了绿色荧光蛋白的人食管癌相关基因4的基因质粒,表达出了伴随有绿色荧光蛋白的人食管癌相关基因4蛋白。具体步骤为将 EC9706肿瘤细胞接种到准备好的培养皿中,等到肿瘤细胞生长到符合条件,参照LipofectminTM2000试剂盒的说明分别转染pEGFP-N1-ECRG4及空载质粒。2 d后扔掉肿瘤细胞培养基,PBS溶液冲洗三次,取出玻片,然后用4%的多聚甲醛固定肿瘤细胞30 min。PBS溶液冲洗三次,然后在玻片上加入一定的甘油缓冲液(将NaHCO3 3.7 g和 Na2CO3 0.6 g溶于100 ml去离子水中,用NaOH调pH至9.5,加入等量的甘油,充分混合),盖在载玻片上,封片,防止气泡产生。荧光照相装置利用激光共聚焦显微镜拍照定位。

1.3 分泌蛋白的检测

计数瞬转后培养24 h的EC9706/pcDNA3.1 和EC9706/pcDNA3.1-ECRG4 细胞,然后我们扔掉肿瘤细胞培养基,然后肿瘤细胞离心15 min,然后我们用滤膜过滤肿瘤细胞培养液,滤过液Heto FD3(Heto-Holten, Denmark) 浓缩。

1.4 MTT肿瘤细胞抑制实验

将一定数量的EC9706肿瘤细胞接种到细胞培养板中,然后利用PBS溶液冲洗肿瘤细胞培养孔三次,然后我们用相应的浓度的重组人食管癌相关基因4蛋白溶液处理肿瘤细胞,并设立对照实验组, 肿瘤细胞再继续培养48 h,检测时我们每孔加入即时配制的MTT溶液15 μl,然后肿瘤细胞再培养4 h,最后我们扔掉肿瘤细胞培养液,每孔中再加入DMSO溶液150 μl,混匀溶液,最后我们利用酶标仪测定溶液吸光度值。

1.5 统计学方法

使用SPSS 11.0 软件进行实验的统计分析,P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人食管癌相关基因4蛋白的定位

1)内源性:利用免疫荧光染色的方法证实内源性表达的人食管癌相关基因4蛋白的定位是位于细胞中的细胞质部位。2)外源性:利用绿色荧光蛋白标记人食管癌相关基因4蛋白的方法证实,外源性表达的人食管癌相关基因4蛋白的定位也位于细胞中的细胞质部位。

2.2 人食管癌相关基因4蛋白是分泌性蛋白

利用 Western blot 的检测方法证实,人食管癌相关基因4蛋白是分泌性蛋白。

2.3 重组人食管癌相关基因4蛋白体外抑制肿瘤细胞增殖

利用 MTT检测的方法证实,重组人食管癌相关基因4蛋白能够在细胞培养液中抑制肿瘤细胞的生长增殖(P< 0.05)。

3 讨论

人食管癌相关基因4是与食管癌发生发展相关的重要的新基因,因此研究人食管癌相关基因4蛋白的生物学功能将具有重要的意义。研究结果表明内源性和外源性人食管癌相关基因4蛋白都定位于细胞质。而生物信息学分析提示,组成人食管癌相关基因4蛋白的148个氨基酸中,1-31个氨基酸为信号肽,是重要的分泌性蛋白质。本研究中,我们利用 Western blot 的检测方法证实,人食管癌相关基因4蛋白的确是分泌性蛋白质。而且,研究中我们进一步通过优化条件表达和纯化出大量可溶性的重组人食管癌相关基因4蛋白。实验结果表明,我们表达和纯化的水溶性的重组人食管癌相关基因4蛋白具有体外抑制肿瘤细胞增殖的生物学功能活性,为进一步研究人食管癌相关基因4蛋白的晶体结构和独特的抗肿瘤生物学功能创造了有利条件。

更重要的是,纯化的水溶性重组人食管癌相关基因4蛋白可以作为食管癌的潜在治疗药物,值得进一步深入的进行体内抗癌作用和抗癌作用机理研究。我们的结果首次证明了人食管癌相关基因4蛋白是分泌蛋白。目前,我们正在进一步深入的研究人食管癌相关基因4蛋白的体内外抑癌功能和作用机理,阐明其在食管癌发生中的作用。

摘要：目的 探讨人食管癌相关基因4(esophageal cancer related gene4,ECRG4)蛋白的亚细胞定位和重组ECRG4蛋白的体外抑癌功能。方法 用激光扫描共聚焦显微镜成像法和Western blot方法检测ECRG4蛋白的定位;用MTT方法检测纯化的重组ECRG4蛋白的体外抑癌功能。结果 激光扫描共聚焦显微镜成像显示,内源性和外源性ECRG4蛋白主要定位在细胞质。Western blot方法在细胞无血清培养液中检测到ECRG4蛋白存在,提示ECRG4蛋白是分泌蛋白。纯化的重组ECRG4蛋白可以体外抑制EC9706细胞的增殖,抑制率随着ECRG4蛋白浓度增加而升高,成剂量-效应关系(P<0.05)。结论 重组人ECRG4蛋白体外抑制肿瘤细胞增殖,可以作为ESCC的潜在治疗药物。

关键词：人食管癌相关基因4,重组蛋白,抑癌基因,分泌蛋白

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