转基因动物研究（共12篇）
转基因动物研究 篇1
转基因动物 (trangenic animal) 是通过实验方法, 人工地将外源基因导入动物受精卵 (或早期胚胎细胞) , 使之与动物本身的基因组整合在一起, 外源基因能随细胞的分裂而增殖, 并能稳定地遗传给下一代的动物。转基因动物的研究是一项需要应用现代动物胚胎学、发育生物学、分子生物学、遗传学等众多基础生物学科的理论知识和技术成果的一项极富挑战性研究。由于转基因动物体系打破了自然繁殖中的种间隔离, 使基因能在种系很远的机体间流动, 将会对整个生命科学产生全局影响, 促进生物医学、农牧业和药物产业等诸多方面的发展, 因此在1991年第一次国际基因定位会议上, 转基因动物技术被认为是遗传学研究历史上继经典连锁遗传分析、近代体细胞遗传以及基因克隆之后的第4代技术, 成为科学发展史上又一个重要的里程碑。
1 转基因动物制作方法
1.1 显微注射法 (microjection)
该法是指通过显微操作仪把外源基因注入受体动物的受精卵细胞中, 外源基因整合到受体细胞染色体上, 发育成转基因动物的技术, 是目前应用最广泛, 发展最早、最有效的方法之一。该法是美国人Gordon所发明, 由于条件限制, Gordon当时应用此法并未直接获得转基因小鼠, 但他的实验工作却给予了以后研究工作者有力的启发, 开辟了一条崭新的研究途径。1982年, Palmiter将5'端调控区缺失后的大鼠生长激素基因与小鼠金属硫蛋白I基因启动子相连接, 然后将融合基因注入受精小鼠雄原核, 成功研制出了著名的“超级小鼠” (super mouse) 即生出的7只转基因阳性鼠的2号鼠, 在生后74d时, 体重达到了同类转基因小鼠平均体重的1.87倍。这项研究成果经英国科学杂志《自然》发表, 在生命科学领域中引起了一场不小的轰动, 从此掀起了试验研究转基因动物热潮, 在不很长的时间里, 应用该方法相继研究了转基因兔 (布莱姆等, 1985) 、转基因绵羊 (哈默等, 1985) 、转基因猪 (哈默等, 1985) 、转基因牛 (罗西劳等, 1989) 及转基因山羊 (艾伯特等, 1991) 。
该法外源基因转移率整合率小鼠为6%~10%, 猪和羊分别为0.98%和1%, 鱼类通常可达10%~15%。外源基因随机整合到基因组内, 常导致宿主DNA中的染色体序列丢失、重排、插入突变, 有的造成严重生理缺陷。
1.2 逆转录病毒感染法
逆转录病毒感染法 (retrovirus-mediated gene transter) 是应用分子生物学技术, 将外源基因接到逆转录病毒 (一种RNA病毒) 载体上, 因此病毒感染动物胚胎。1974年, Jaenishch等将SV40 DNA注入小鼠胚腔中, 发现获得的小鼠体内有SV40 DNA整合。1975年, Jaenish用小鼠 (Moloney) 白血病毒 (Mo MLV) 作为载体, 将外源基因导入小鼠胚腔中, 实验证明, 病毒转染的小鼠胚胎可以发育成携带病毒基因的小鼠, 并遵从孟德尔定律, Mo MLV可以在成年小鼠体内重新被激活, 再使小鼠发生白血病。不过直到1998年, 尚无人能用逆转录病毒感染法生产转基因动物, 原因是它们所感染的基因转移生产出来的动物都是嵌合体 (chimera mosdic) 。1998年, Bremel等用将逆转录病毒直接注入卵母细胞方法才生产出转基因牛。
该法操作简单, 且能很快地得到适当病毒生产株。外源基因难以植入生殖系统, 成功率低, 产生的动物为嵌合体, 需要广泛的杂交, 以建立转基因系。携带的外源基因病毒载体, 在导入受体细胞基因过程中, 有可能激活细胞DNA序列上的原癌基因或其它有害基因。
1.3 胚胎干细胞插入法
胚胎干细胞插入法 (embryonic sterm cells gene transfer) 是通过电穿孔等方法将外源基因导入胚胎干细胞 (ES) , 然后将基因的胚胎干细胞插入培养的胚胎中。
1986年, Roberoton等利用携带neo基因的逆转录病毒载体转化小鼠的ES细胞注入囊胚后, 在获得的小鼠组织中发现有neo基因表达, 共得21只小鼠, 其中20只小鼠体细胞及生殖细胞中含有外源载体序列, 部分嵌合体小鼠可将外源DNA传递给F1代, 用这种方法制作转基因小鼠的阳性率接近100%, 为首次利用胚胎干细胞介导法培育成转基因小鼠。此后, Piedrahita等于1988年从猪胚胎中获得了干细胞克隆系, Stirce和Srtethenko等1996年获得了牛的胚胎干细胞, 为转基因在动物上的定点整合开创了新的领域。不过, 目前还只有小鼠的胚胎干细胞可供商业应用。其次, 即使有了胚胎干细胞, 由于尚须经过嵌合体阶段, 对小鼠来说比较容易, 但对于繁殖周期长的其它动物则有一定困难。
1.4 精子载体法
精子载体法 (sperm mediated gene tranter) 是将活动精子放入DNA溶液中, 当精子吸附外源基因后, 用这些精子进行体外受精, 再进行胚胎移植, 使外源基因得到表达的一种方法。早在1971年, Brack等将精子暴露于纯化的SV40 DNA中后, 在精子头部监测到放射性物质, 表明异源的DNA可以进入哺乳动物的精子, 而且精子可能将外源DNA携入卵母细胞。1989年, Lavitrano等首次报导了将小鼠精子与环状或线状的PSV2CAT质粒在等渗的缓冲液中孵育15min, 然后与小鼠卵子进行体外受精, 受精卵在2细胞时移入受体鼠的输卵管。在所产生的250只小鼠中, 有30%个体为转基因阳性, 转基因可转移给后代。目前精子载体法已在12种动物中获得了基因后代 (Spadafora, 1998) , 其中包括牛 (Schellender等, 1995) 、猪 (Sperandio等, 1996) 、兔 (Rottrmann等, 1994) 、小鼠 (Lavitrano等, 1989) , 这表明精子载体法是一种有用的转基因方法。
2 转基因动物技术的发展
2.1 研究转基因动物传统方法存在的问题
外源基因的整合率低, 是当前研究转基因传统方法存在的一个共同不足问题。有资料表明, 平均每注射40枚小鼠卵可能得到1只转基因小鼠。对绵羊、山羊、牛来说, 获得1头转基因动物则分别需要110、90、1 600枚卵, 一般来说, 只有半数的转基因动物 (如猪、鱼) 能够表达外源基因。以显微注射法生产转基因动物为例, 小鼠转基因阳性率为2.6%, 大鼠为4.4%, 兔为1.5%, 猫为0.9%, 绵羊为0.9%, 牛为0.7%。此法操作过程中造成胚胎机械损伤而导致胚胎死亡是整合率低的一个极其重要原因。
其次, 整合了的外源基因在动物体内没有预期功能, 即不表达或表达水平不高。造成这种原因, 有目的基因问题, 即不同的外源基因表达水平很不相同。如在转移GH基因猪中, 仅有转移r GH和p Gh的转基因猪生长速度加快, 而转移h GH和b GH等的转基因猪作用不明显, 尽管猪血浆中GH浓度增加, 但GH浓度与促生长作用不成比例。另外, 还有一点更重要的原因是外源基因在动物基因组内整合的位置, 即所谓“位置效应”的问题。目前我们所应用的传统转基因动物技术, 还无法控制外源基因整合位置, 而只能是随机的整合。因此, 科学家正在努力研究把外源基因整合到所需要的部位的所谓“定量整合技术”。
2.2 转基因克隆动物技术
该技术首先是将目标基因转移到一种胚胎或成体来源的培养细胞中, 筛选出已整合目标基因的细胞克隆, 建立转基因细胞系。然后再用去核卵母细胞质供体, 用转基因细胞系的细胞作核供体, 通过核移植产生重植胚胎, 再通过胚胎移植产生克隆的转基因动物。Wilmut研究小组在取得克隆绵羊多利后, 于1997年6月报导用胚胎细胞为核供体, 获得了能表达治疗人血友病的凝血因子IX转基因克隆绵羊“波利” (Polly) ;1997年12月又在美国的“Science”发表了用转染胚胎成纤维细胞获得6只转基因克隆绵羊的报道。目前转基因克隆绵羊能高水平地表达人凝血因子Ⅸ, 开创了转基因克隆动物技术研究的先河。
从下表列出Comball和Brink等人的实验结果分析可说明动物克隆方法生产出转基因动物的效率, 表现出较多优点是:转基因效率已显著超过显微注射法, 按出生的幼畜计算, 牛和羊的转基因效率均为100%, 由于核移植的后代100%均为转基因动物, 可以节约90%以上的受体动物, 而显微注射实验中受体母畜所孕育的95%是非转基因动物;用基因表达水平可以预测, 不靠基因整合的机遇, 在建立细胞系过程中, 在扦测基因整合, 可同时扦测基因表达, 使用表达水平合格的细胞系进行核移植 (克隆) 。
注:COMBELL和Brink等试验资料
2.3 转基因家畜技术路线
为提高转基因家畜成功率, 鉴于经典技术路线不足, 中国和英、美科学家于1997和1998年相继研究建立3条新的转基因技术路线。
2.3.1 整合胚胎移植技术路线。
我国上海医学遗传研究所黄淑帧教授等针对当前使用的经典技术路线的缺点, 作了3方面的改进:其一, 是用体外受精技术, 从羊的卵巢里获得卵细胞, 体外孵育成熟后, 加入精子进行体外受精, 在体外培养受精卵, 观察受精卵发育的整个过程, 找到受精卵显微注射的最佳时机, 使注射后的受精卵成活率达95%以上;其二, 在胚胎移植前对外源基因在胚胎体内是否已经整合作分子鉴定, 从中挑选有目的基因整合的胚胎进行移植, 使所出生的羊羔整合率在理论上可达100%;其三, 是改进胚胎移植技术, 采用经阴道非手术胚胎移植法, 大大减少了对受精卵的损伤, 使受孕率明显提高。以上3项技术相结合在一起, 使得转基因羊的成功率提高了好几倍。这条技术路线被中国科学院和中国工程院两院院士评为1998年中国十大科技进步之一。
2.3.2 核移植 (克隆) 技术路线。
该方法是由英国罗斯林研究所应用动物克隆 (核移植) 与转基因技术相结合研制转基因的方法。研制转基因羊所用的核移植方法和克隆绵羊“多利”的方法差不多, 只是在核移植前把外源基因导入到胎羊的成纤维细胞核中, 其基本过程是:首先将编码药物蛋白的外源基因导入到胎羊的成纤维细胞核中, 获得整合有外源基因的成纤维细胞;然后取羊的成熟卵, 去掉其中的细胞核, 得到只有细胞质 (胞质体) 的“卵子”;再从整合有外源基因的胎羊成纤维细胞中吸出细胞核, 通过显微操作, 将此细胞核植入去掉细胞核的“卵子” (受精体) 中, 组装成一个类似受精卵的具有发育全能性的组装细胞。这一组装细胞 (受精卵) 经电刺激后能分裂, 并在体外培养至囊胚期, 再移植进同步发情的受体动物子宫内, 让其发育成完整的个体。据英国罗斯林研究所的研究资料表明, 应用核移植方法研制转基因羊比应用经典技术路线成功率提高2.5倍。
2.3.3 整合卵受精技术路线。
这是1998年末, 美国威斯康星大学的科学家报道的一条转基因家畜技术路线。该法是将外源基因先导入卵子, 待卵细胞整合后再和精子受精。具体做法是:先将编码乙肝表面抗原的外源基因导入一种病毒 (逆转录病毒) , 构建成带有外源基因的病毒载体, 然后将该病毒感染乳牛的卵母细胞, 待卵母细胞成熟后, 再加入精子使之受精。结果在836个注入这种抗原基因的卵母细胞中, 有174个能受精并发育成早期囊胚。将其中10个囊胚移植入5头“养母”乳牛子宫内, 有3头怀孕, 生下4头小牛 (2公2母) 。检测这些牛的皮肤和血液细胞DNA, 发现4头都携带有导入的乙肝抗原基因, 就是说:应用这种方法获得的转基因成功率达到100%。
上述3条转基因家畜新技术路线, 均在不同程度上提高了转基因效率, 为批量研制转基因家畜开辟了道路。
3 转基因动物研究的应用
3.1 促进生长、提高产量、改善品质
“超级小鼠”的研究成功为培育大型动物开辟了新思路, 掀起了向动物体内导入GH基因研究的高热潮。20世纪80年代育成的各种转基因哺乳动物中, 就是以整合表达各种不同GH (生长激素) 基因个体为主, 其中猪是主要目标, 并先后育成了转人GH、大鼠GH、牛GH基因等外源DNA的转基因猪, 这些转GH基因猪表现出瘦肉率高等优良特性, 但由于原代转基因猪具有高致畸率、高胎死亡率等缺点, 难以育成一个稳定的具备良好生产性状遗传力的种群。
美国的pursel等人 (1989年) , 曾将牛的GH转入猪中, 生产出2个猪的家系, 其生长速度比对照猪提高11%~14%, 饲料转化率提高16%~18%, 我国陈永福等用自己构建的融和基因OMT/PGH进行基因转移, 获得转基因猪生长速度提高11.8%~14.8%, 饲料利用率提高10%。
澳大利亚科学家将羊毛的一种蛋白质 (La-白蛋白) 的主要成分半胱氨基酸导入绵羊胚胎, 繁殖出的转基因羊可使羊毛增产5%, 估计全年收入增加3亿美元。另外, Pouell等将无角蛋白型中间的细丝基因导入绵羊基因组, 转基因羊毛光泽度以及羊毛中毛脂含量明显提高。
3.2 培育抗病动物
将抗病毒基因导入受精卵。由此发育成的个体会具有抗病能力, 或者应该能减轻该种病毒侵染时为机体带来的危害。1989年, 美国农业部以禽白血病病毒 (ALV) 为载体, 获得了抗ALV的新品系鸡, Carba等将小白鼠抗流感病毒基因MXI转至鸡细胞中, 使鸡获得对禽流感的抗性;Chements等将绵羊髓鞘脱落病毒 (Visna) 的衣壳蛋白基因 (EVE) 转入绵羊, 所获得转基因羊的抵抗力明显提高。
另外, 干扰素是动物机体产生的一种免疫因子, 能增加机体各种病毒感染的能力。如导入B1-干扰素基因获得的转基因鼠, 对狂犬病毒的抵抗力明显提高, 感染病毒4d后无一死亡, 数月后仍有25%的转基因鼠健在;而对照组的同窝非转基因鼠感染病毒后4d内50%死亡, 6d内全部死亡。
3.3 生产药用蛋白
通过转基因动物生产珍贵的多肽或蛋白类药物, 是当前转基因动物研究热点, 这种转基因动物被称为生物反应器 (animal bioreactor) 。乳腺是生产药用蛋白的主要靶器官, 如果将编码有生理活性物质基因与乳腺特异表达基因启动子重组, 转入乳用家畜, 便可使这些具有生理活性的物质从乳汁中不断地分泌出来, 然后用蛋白提取技术从乳汁中分离生理活性物质, 作为珍贵多肽或蛋白药物。这种方法最大优点作为生物反应器转基因动物, 可以无限扩繁, 表达产物可大量生产, 成本低, 投资周期短, 其产物为活性比较接近天然蛋白, 能充分修饰具有稳定的生物学结构。
1997年, 英国科学家Wilmat等用绵羊胚胎细胞进行核移植, 成功获得了整合人凝血因子IX的转基因绵羊, 可从其乳汁中大量表述昂贵的医用人凝血因子IX。我国扬州大学与中国科学院发育研究所合作, 已研制出具有商业应用价值的人促红细胞生成素 (EPO) 的转基因的山羊。
应用转基因动物 (家畜) —乳腺生物反应器技术来制造基因药物, 也是一种可以获得巨额经济利润的新型产业。如荷兰金发马 (genpharm) 公司用转基因牛生产乳铁蛋白, 预计每年用牛奶生产出来营养奶粉的销售额是50亿美元, 其乳汁中含有a1-抗胰蛋白酶 (a1-antitrypsin) 可治疗肺气肿病 (一种因体内缺乏该蛋白酶而导致的遗传病) 。患这种病的病人以前只能依赖于注射人的a1-抗体胰蛋白酶作替代疗法, 价格昂贵。现在用转基因羊来生产这种蛋白酶, 每升羊奶可售6 000美元。
3.4 生产移植动物器官
异种器官的移植可能是解决世界范围内目前普遍存在器官短缺的有效途径。由于猪器官的体积、形状及DNA基本上与人类相似, 因此就成为理想的肾、心、肝等器官的供应者。但是, 异种器官移植时容易产生超急性免疫排斥反应 (HAR) , 会使移植物破坏, 阻止器官移植这一进程。
超急性免疫排斥反应 (HAR) 是一种剧烈的生理反应, 其主要机制是人体内存在针对猪器官组织成分的天然抗体, 这种天然抗体通过与猪血管内皮细胞表皮的靶分子 (a-半乳糖苷) 结合, 激活补体系统, 导致细胞毒作用。为了克服超急性免疫排斥, 英国科学家将抑制人体免疫排斥反应的基因导入猪的受精卵获得转基因猪。将这种猪的心脏移植至黑猩猩体内, 能够抑制黑猩猩的免疫排斥反应, 所以术后生存了60多天, 而对照猪的心脏移植仅活了55min。
现在, 科学家设想应用基因“剔除”技术, 把猪的a-半乳糖苷基因“剔除”剔除了天然抗体作用的靶分子, 从面就避免了机体对这种猪器官的免疫排斥反应。
4 前景展望
转基因动物是一项诞生至今只有十几年历史的生物高新技术。现在, 尽管还有一些技术关键问题亟待解决, 还有一些理论问题需要阐明。现在研究成果与当前实际需要尚存在相当距离, 不过随着以后转基因研究的深入和相关生物工程技术的进步及其产业的发展, 将为解决世界人口、粮食、环境和健康等影响21世纪人类生存的重大问题都会发挥不可估量的作用。
转基因动物研究 篇2
摘要………………………………………………………………(3)引言………………………………………………………………(3)
1.转基因动物……………………………………………………(4)
1.1转基因动物概念
1,2 转基因动物技术
2.转基因动物制药………………………………………………(4)
3.转基因动物制药的优势和不足……………………………(5)
3.1 优势
3.2 技术不足转基因动物制药的发展现状和前景…………………………(6)
5.结论……………………………………………………………(7)
6.参考文献……………………………………………………(7)
转基因动物制药现状及发展前景
张亮
（暨南大学公共管理学院、行政管理、2012050691）
摘要 ： 转基因动物技术始于上个世纪80 年代, 20 多年来，转基因技术不断发展, 利用转基因动物生产药用蛋白质即转基因动物制药的研究也取得了突破性进展, 转基因制药成为了各国科学家、生物制药公司争相研究的重点领域。目前, 转基因动物制药正走向产业化的道路, 具有十分广阔的前景。但是由于我国生物制药技术起步较晚，与欧美发达国家有不小的差距，因此加快转基因动物制药的研究对我国生物技术、医学技术的发展具有极其重要的作用。关键词 ： 转基因动物转基因动物制药现状发展前景 Abstract：Transgenic animal technology began in the 1980s, more than 20 years, transgenic technology continues to develop, the use of transgenic animals to produce pharmaceutical proteins gene animal pharmaceuticals that turn also made a breakthrough, transgenic pharmaceuticals became national scientists, bio-pharmaceutical company competing for researching focus areas.Currently, transgenic animal pharmaceutical industry is moving towards the road, with a very broad prospect.However, Due to the late start of biopharmaceutical manufacturing technologies, European and American countries have not a small gap, so the study of gene transfer for animal pharmaceuticals accelerate the development of bio-technology, medical
technology has an extremely important role.keyword： transgenic animal ； Transgenic animal pharmaceutical ；present situation ； Prospects for development
转基因动物技术和转基因动物制药是近年来世界范围内的研究热点, 各国学者竞相加入研究行列, 许多国家的政府和一些大的生物技术公司都给予其极大的关注, 相继投入巨资进行研究。转基因动物制药是基因制药的一个重要领域，是生物基因技术、生物医学技术发展重要成就。基因工程药物的发展经历了三个方面。一是微生物基因工程：即把目的基因导人大肠杆菌等工程菌中，通过微生物 来表达目的基因蛋白，目前已上市的基因工程药物，均采用此法。二是细胞基因工程，用哺乳动物细胞株表达目的产物，如 生产凝血因子Ⅸ。三是转基因动物：将人们所需的目的基因直接导人鼠、兔、羊、猪体内，使目的 基因在哺乳动物体内表达，从而获得目的产品，是当前极具发展前景的药物生产方式。本文将对转基因动物制药的现状及发展前景进行回顾和展望。
1.转基因动物
1.1 转基因动物概念
转基因一词是20世纪80年代由美国的一位科学家提出的，它是指遗传物质在生殖细胞间跨物种的转移。转基因动物就是所有组织细胞携带有外源基因的动物，而这一遗传物质可以由亲代向子代传递，通过遗传物质的转移，使生物体能够在一定程度上按人们的意愿表现某些性状。
所谓转基因动物(transgenic animal)，就是在经典遗传学、分子遗传学、结构遗传学和DNA重组技术的基础上用实验的方法将人们所需要的外源目的基因，整合的外源导入动物的生殖细胞受精卵里，并整合该细胞后发育成为个体整合的外源基因，整合外源基因又能影响其后代遗传的动物。若外源基因与动物本身的基因整合在一起，外源基因就能随细胞的分裂而增殖，在体内得到的表达，并能稳定地遗传给后代。其实质就是按人们的需要有计划、有目的地定向改造动物的遗传组成，赋予转基因动物新的特征，使之更好地为人类服务。【1】
1.2 转基因动物技术
若使动物组织能够特异性地表达外源蛋白质，必须人为地将编码这种蛋白质的基因转移到动物的胚胎中，使目的基因能够整合到动物染色体上，进而得到表达。制作转基因动物的方法主要有：原核期胚胎的显微注射法、逆转录病毒感染法、精子载体法、原生殖细胞法、胚胎干细胞法、体细胞移植技术、腺病毒载体法和精子头与转移基因共注射法。目前一般使用逆转录病毒载体法（应用较为成功的方法）、显微注射法、精子载体法及等来制作转基因动物。【2】
2.转基因动物制药
转基因动物的一个十分重要的用途就是可以用来生产重要的蛋白质药物, 即转基因动物制药(Try ansg enic animalpharming)。70 年代后期, 随着DNA 重组技术的问世,诞生了基因工程药物, 高产值、高效率的基因工程药物的出现给药物的生产带来了一场革命,推动了整个医药产业的发展。基因药物的发展经历了细菌基因工程、细胞基因工程、转基因动物制药三个阶段，转基因动物制药就是利用动物来生产药用蛋白。利用转基因动物生产药用蛋白主要通过3种渠道。一是通过血液，Dnx 公司将人的血红蛋白基因转移给猪种，这样可以通过转基因猪来生产人血红蛋白。二是通过尿腺，利用膀胱中尿腺合成和分泌蛋白的功能作为反应器的优点是，转基因动物终其一生都将产尿，并且尿中几乎不含脂肪和其他蛋白，容易纯化。三是通过乳腺，泌乳是动物的一种生理活动，对动物健康没有影响，加之乳腺摄取、合成、分泌蛋白质的能力很强，并且能对重组蛋白质进行多种翻译后加工，包括羟基化、糖基化、氨基化等，同时能将重组蛋白质折叠成有功能的构象,。【3,4】
那怎样来实现转基因动物制药的过程呢？
生物机体对能量的利用和转化效率是当今世界上任何机械装置所望尘莫及的。因此，通过转基因动物来生产药物是迄今为止人们所能想象得出的最有效、最先进的系统。
动物的乳房是一种天然的高效合成蛋白质的生物反应器，有强大的生产蛋白质的能力。20世纪80年代中期，英国科学家克拉克首先在鼠的乳腺组织中 高效表达了人抗胰蛋白酶因子基因，开创了研制动物乳房生物反应器的先河。1991年，他们又在绵羊乳腺中表达了人抗胰蛋白酶因子基因。在这只名叫“翠 喜”的母羊初乳中，该药品的含量高达35g/L。
在动物体内，细胞的分化需要发育基因来调节。这种调节是由多种蛋白质因子对增强区(enhancer)和 启动区(promotor)中成丛的顺式元件进行作用实现的。最有效的顺式调节元件丛之一就是“基因座控制 区”(LCR)。用乳汁蛋白质基因的调节元件，不仅有可能使转基因的表达只限于乳腺组织，而且可能使转基 因表达产物得到高水平表达和大量生产。各种酪蛋白，以及乳清蛋白和乳球蛋白等基因的调节元件已相 继被克隆和投入使用。时至今日，已经有多种具有生物活性的昂贵的医用蛋白质在转基因动物乳腺组织 中合成并分泌，如用绵羊乳球蛋白基因启动区产主了人凝血因子Ⅸ和α-抗胰蛋白酶(α-AT)基因的转 基因绵羊；用乳清酸性蛋白(WAP)基因启动区，转基因山羊表达人的组织型溶纤酶原激活因子(tPA)。据 美红十字会和美国遗传学会预测，到2005年，全美动物乳房反应器生产的药物，年销售额可达350亿美元。到2010年，所有基因工程药物中利用动物乳房生物反应器生产的份额将高达95%。
发展乳房生物反应器首先要选择好目的基因。目前国际上都选择医用蛋白基因在动物乳腺中表达，这些基因产品市 场价值较高，作为首选对象是可以理解的。也有选择治疗性抗体基因作为目的基因的，这些产品一般需求量大。【5】
3.转基因动物制药的优势和不足
3.1 优势
(一)品种多，产量高，质量好动物的乳房有强大的生产蛋白质的能力。1只优良品种的乳牛，在305d的泌乳期中可产 奶>10t。鲜奶的蛋白质含量占3.2%～3.6%，每天蛋白质产量lkg。1只绵羊la可产奶300～500kg，奶中蛋白质含量约 占7%，折合每只母羊产纯蛋白20～30ks。即使1只小小的家兔，1a可以产奶20kg，奶中蛋白质含量高达10%，la可产奶蛋白2kg。到20世纪90年代中期，国际上已成产了数10家转基因动物公司，转基因羊、绵羊和猪的成功实例有10多种，生产出 贵重的药用蛋白，如α1-抗胰蛋白酶、人红细胞生成素、乳铁蛋白、人血清白蛋白、人血红蛋白、人凝血因子Ⅸ、Ⅷ、抗凝血 酶Ⅲ、胶原、血纤蛋白原、LAI-PA、蛋白质C、tPA等。用动物乳房生物反应器生产的蛋白质药品，生活活性好，非常接近天然产品。
(二)生产成本低 应用转基因动物乳腺生物反应器技术来制造基因药物也是一种可以获得巨额
经济利润的新产业。以 转基因动物生产目的新产品，可极大地降低成本和投资风险。国外经济学家曾算过一笔帐，若用其他生产工艺(如哺乳动物 细胞培养方法)来生产1g药物蛋自，成本需800～5000美元，而利用转基因动物只需0.02～0.50美元。
(三)设备简单，不耗能，元环境污染动物乳房生物反应器 生产药品，基本上是一个畜牧业过
程。虽然饲养乳腺分泌药品的牛羊需要养在特别洁净的环境中，但仍是给牛羊草料，牛 羊产奶，奶中可提取药品，原料生产成本几乎可以忽略不计。动物生产奶蛋白并不需要什么珍贵原料，也不需要复杂的设 备，不会消耗大量的能源，动物吃的是饲料，生产出的是高营养价值的动物蛋白。
(四)生产周期短 目前一种新药从研制开发，通过新药评审，直到上市需15～20a。如果利用转
基因动物乳腺生物反应 器，新药生产周期约5a，如以动物生命的周期计算，转基因羊从显微注射到泌乳的周期是18个月，而转基因牛只要25～29个月。
3.2 技术不足
目前利用转基因动物生产药物仍然处于较为初级的阶段，一些关键技术还有待突破，但是目前转基因动物制药已经显示出了极大地应用价值和广阔的发展前景。当然，目前转基因动物制药还有一些技术上的不成熟。
首先，转基因技术支撑体系不够完善，主要表现为目前转基因动物的外源基因成功率和成活率极低，这是限制转基因动物发展的主要因素。目前，小鼠成活率仅为2．6％，大鼠4．4％，兔1．5％，羊0．9％，猪0．7％，牛0．7％。
其次，体细胞克隆等技术环节还有待于成熟，并且有些技术会对动物健康产生危害，这就需要研究者在转基因技术的基础理论研究方面进行更为深入的探索。
第三，外源基因在目的基因中的整合率低，效果不稳定。
第四，转基因在宿主基因组中的行为难以控制，在宿主基因组中的插入可能造成内源基因的破坏,还可能激活原本已关闭的基因，使其进行表达，导致动物出现异常。
第五．对转基因过程中的精细理论及其过程不甚清楚。例如整合的拷贝数、整合的机理、宿主染色体之间的相互作用，以及相同的基因表达调控元件在不同种系的差异与其宿主的遗传背景、外源基因的结构及其各种调控因子结合位点之间的关系等，都不是很清楚。
第六．尽管转基因动物给人类带来巨大的益处，但也存在一些安全性问题。如外源基因的插入可能造成基因污染，对生态平衡以及物种的多样性产生不良影响；转基因移植可能加大人畜共患病的传播机会，给人类带来灾难性的危害等等。
4.转基因动物制药的发展现状和发展前景
尽管利用转基因动物制药是一项新兴技术，但是发展速度极快，并且取得了相当大的成就。转基因动物技术和转基因动物制药将为人类解决许多生命科学领域的重大问题, 是蛋白质药物生产领域的一场革命, 这就决定了在今后这方面的研究将不断的深入,竞争也将更加激烈。国外的经济学家估计, 大约在10 年后,转基因动物生产的药品就会鼎足于世界市场, 销售额将超过250 亿美元(不包括营养蛋白质和其他产品), 成为最具有高额利润的新型工业。目前, 我国“8 63”计划已将山羊乳腺生物反应器研究列为重大项目, 用于生产重要的重组白质药物的转基因牛、奶山羊和转基因兔等已相继诞生, 这标志着我国在转基因动物制药方面的研究已达到相当的水平, 为以后的研究工作打下了良好的基础。的α1—AAT用于治疗肺气肿，美国genzyme公司AT-Ⅲ(抗凝血因子Ⅲ)在1999年完成临床研究，在2000年提出新药申请。在80年代初中国科学院施履吉院士就提出构建乳腺生
物反应器的构想，并获得了表达乙肝病毒表面抗原的转基因兔。在90 年代一些单位继续在此领域做了积极的努力。目前，欧美等国在转基因动物方面开发了至少120种以上的药物。如包括$+ 种药用单抗，一些抗245 的药物。从蛋白本身来讲既有复杂的多亚基蛋白，也有较小的多肽如降钙素。美国对奶牛除开展生产血清白蛋白、人纤维蛋白原研究之外，还开展了对预防疟疾病菌的研究。英国正在研制生产治疗束性纤维变性和肺气肿的蛋白质，这种药物可以预防因粘液积聚所致的肺部损伤。荷兰正在开展对治疗血友病的研究，目前对该病主要靠从人血中提取凝血蛋白来治疗，如果改用转基因动物制药，不仅降低了成本，而且提供的量也可更多。据专家介绍，目前研制的上述药物，预计在今后的10年内能够上市，而最快的第一批药物年内就能投入市场。总之，转基因动物制药的可行性已毋庸置疑，而且技术已经成熟。目前，国际上有13 家公司开发乳腺生物反应器，最领先的已经做临床Ⅲ期。也就是从2000年的AT-Ⅲ和α1—Ⅲ提出新药申请开始，很快会有多种由转基因动物生产的商品上市。美国权威机构红十字会预测：到2010年转基因动物生产的商品将达到350亿美元的销售额，生产的药物将占整个基因工程药物的90％以上。【6】
总之，转基因动物制药是21世纪生物医药产业的一种新的药物生产模式。转基因动物制药的可行性已毋庸置疑，该项技术的迅速发展为制药业带来了全新而巨大的变革，也为制药业发展提供了良机，处在世纪之交，政府和制药企业，特别是大型企业，应当抓住有利时机，加强研究及增加投资强度，加快我国转基因动物制药（乳腺生物反应器）的研究速度，尽快使其实现产业化，使我国的转基因动物制药在21世纪的生物医药产业革命中占有一席之地。但该项技术的迅速发展为制药业带来了全新而巨大的变革,也为制药业发展提供了良机。而相关法规的出台,也必将加速和正确引导转基因动物药物的研究和开发。
结论：鉴于转基因动物制药的广阔发展前景和我国生物医学技术的相对落后，我国应该大力加强基因工程制药的研制和生产，制定转基因动物制药的长期发展战略，规范医药市场的秩序，保护知识产权，鼓励科研人员在基因制药领域的创新，促进转基因动物制药的发展。
参考文献：
1.郝捷，冯波，王建辰.转基因动物研究进展[J].动物医学进展，2004,25（1）
2.刘文献.转基因动物技术研究综述[J].生物技术，2003，13（4）
转基因食品的动物试验 篇3
普兹泰博士开始对这种转基因土豆的安全性深信不疑，并认为自己的独立研究将见证转基因食品的光明前景。然而，试验结果与他的预料相差得越来越远。
1998年，普兹泰博士在电视上公开了他的研究成果：食用了转基因土豆超过110天的老鼠个头比普通老鼠小很多，更让人担心的是，食用转基因土豆的老鼠肝脏和心脏甚至脑部都比正常老鼠小，免疫系统更加脆弱。他说：有人向我们保证转基因食品是绝对安全的，我们可以随时食用转基因食品，而且也必须随时食用转基因食品，但是，作为长期从事这一领域研究的专家，我认为把人类当做小白鼠一样来做试验是非常非常不公平的。我们应该到实验室去找小白鼠。……如果是我，在得到和我们针对转基因马铃薯所做的试验可比较的科学证据之前，是绝对不会食用转基因食品的。
2006年，俄罗斯科学院高级神经活动和神经生理研究所科学家伊丽娜·叶尔马科娃博士在小白鼠交配前两周以及在它们怀孕期间，给它们喂食转基因大豆。结果：一半以上的小白鼠刚出生后就很快死亡，幸存的40%生长发育也非常迟缓，它们的身体都比那些没有喂食转基因大豆的小白鼠所生下来的幼崽小。同时发现，喂食含有基因食品的母鼠和幼鼠攻击性和焦虑症状增高，而且有些母鼠不再有母性本能。科学家们表示，该研究结果令人非常不安，因为这意味着转基因食品会给孕妇和胎儿带来风险。针对转基因产品对孕妇和胎儿产生的影响进行研究，这在全球当数首次。目前，伊丽娜·叶尔马科娃博士已经被任命为俄罗斯基因安全委员会的副主席。
1997年，一位德国农民开始给自己的奶牛喂食转基因玉米，这位接受过高等教育的农民一开始就详细记录喂养、产奶等各种数据，为转基因动物饲养提供了宝贵的资料。开始3年，这位农民少量喂食了转基因玉米，没有出现什么异常。第四年当他增加了转基因玉米喂食量，并期待他的奶牛提高产量时，他的奶牛却纷纷出现腹泻、便血、停止产奶等问题，最终，他的70头牛几乎全死光了。著名的瑞士联邦技术研究院的安格里·卡·海尔比克教授发现，在这位农民提供的转基因玉米样本中，Bt毒素不仅以活性形式存在，而且极其稳定。
2007年3月，法国生物学家塞拉里尼在美国《环境污染与毒理学文献》杂志上发表论文说，雌性试验鼠在食用MOM863转基因玉米后开始变胖，而且肝功能受损；雄性试验鼠食用这种转基因玉米后开始消瘦，并伴有肾功能受损。他希望有关政府机构能够重新验证这种转基因玉米的安全性，并暂时取消这种玉米的上市许可。
2008年7月，奥地利研究人员发现，用Bt转基因玉米饲料喂养小鼠，对小鼠的肾脏和生殖产生了影响。
2008年11月，意大利的研究人员用转基因玉米喂养刚断奶的幼鼠和年迈的老鼠，发现这些鼠的免疫系统反应异常。也就是说，转基因食物会给免疫系统造成影响，并且对不同年龄段的生物造成不同的影响。
相关的事例和试验很多，我们在此就不一一列举了，对于一些试验，不少科学家还在争论当中，但这些试验的结果至少说明：在转基因食品是否会对动物产生危害方面，科学界还远未达成共识。
转基因动物用于老年学的研究 篇4
关键词：雄原核注射技术,KM转基因小鼠,老年学,记忆
转基因动物是指以实验方法导入外源基因, 在染色体组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。1982年人类首次获得转基因小鼠, 在小鼠体内转入大鼠的生长激素基因, 使小鼠体重为正常个体的2倍, 因而被称为“超级小鼠”[1]。目前已有多种转基因小鼠应用于实验以及其它领域。目前, 生产转基因动物较为成熟的方法有:雄原核注射法、精子载体法、慢病毒载体法、胚胎干细胞介导法、体细胞克隆介导法、人工染色体介导的基因转移法等[2,3,4]。雄原核注射法最早是由美国人Gordon利用原核内显微注射实现的, 是目前应用最广泛、发展最早的方法之一[5]。本研究利用雄原核注射技术获得的转基因KM小鼠, 并将其应用于老年学研究, 报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物
昆明系小鼠若干, 所有动物均由武汉大学动物实验中心提供。
1.2 转基因小鼠的制备[6]
选用性成熟的雌性小鼠做供卵母鼠, 分别在其腹腔注射PMS和HCG诱发排卵, 在PMS注射后, 隔42~48h注射HCG, 然后让雌鼠与种鼠合笼交配, 12h后检出阴栓阳性的雌鼠。从雌鼠体内摘取输卵管, 在解剖镜下操作, 于输卵管壶腹部采出卵团, 使卵团浸在M2培养液中, 加入透明质酸酶, 浓度为1mg/mL, 把卵团分离成单个卵, 用M2培养液清洗两遍, 将单个卵移入M16微滴培养液中待微注射, 其它存放于37℃、5%CO2的孵箱中。用持卵管固定受精卵, 在微分干涉倒置显微镜下可见受精卵内两个原核, 其中较大的为雄性原核, 原核最大的可以是20mm, 用显微注射针管吸入DNA液, 显微操作注射雄性原核。在显微镜下可清晰的感觉原核的膨胀, 有些注射后的受精卵原核边缘更清楚, 注射后的受精卵放置在CO2孵箱中培养。微注射后的受精卵培养至两细胞期, 在镜下可根据受精卵分化情况筛选出注射成活的卵。显微外科操作假孕母鼠, 使之暴露卵巢和输卵管, 以每侧12个两细胞期受精卵移入假孕雌鼠输卵管内。幼鼠出生后, 酚法提取DNA, PCR法检出阳性个体, 确定阳性转基因小鼠。
1.3 动物分组与实验方法
选择KM小鼠与转基因成功小鼠, 动物房正常饲养, 10个月后分别选择20只小鼠作为对照组和研究组的研究对象。两组小鼠均接受Morris水迷宫行为学测试, 每天训练4次, 连续1周后取平均逃避潜伏期大于青年小鼠平均逃避潜伏期x±2s的小鼠为老年学习记忆减退小鼠, 其它为正常老年小鼠, 统计两组小鼠记忆减退的情况。
1.4 统计学处理
所有数据均由SPSS13.0软件处理。小鼠记忆减退情况的比较采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
分析两组小鼠的记忆减退情况, 20只KM老年小鼠中有13只出现记忆减退, 占总数的65%, 转基因小鼠中有4只出现记忆减退, 占总数的20%, 两组相比较差异有显著性意义 (P<0.05) 。见表1。
注:与对照组比较, *P<0.05。
3 讨论
本研究旨在通过对比利用雄原核注射技术获得的KM转基因小鼠与一般的KM小鼠在进入老年后记忆能力方面的差别, 来探讨转基因小鼠在老年学方面的应用。本研究的结果表明, 我们所培育的转基因小鼠进入老年期以后, 其记忆减退方面要优于一般的KM小鼠, 利用雄原核注射技术获得的转基因动物在延缓衰老方面的研究具有一定的现实意义。
转基因小鼠记忆能力的提高, 必然与其相关基因的表达有关。有关研究表明, 老年学习记忆减退海马干细胞相关基因的影响重点放在Tgf、Wnt、Fgf和Sox家族[7]。另外, 有报道指出, 作为国家遗传工程小鼠资料库中目前最常用的老年痴呆双转基因模型动物的APPswe/PSEN1dE9双转基因小鼠, 在6~7月龄时, 大脑里就已生成β-淀粉样蛋白的病理性沉积, 7月龄的APPswe/PSEN1dE9双转基因小鼠和同月龄同背景的野生型小鼠间学习记忆能力已经出现了有统计学意义的差异[8]。
衰老是一种正常而复杂的生物学过程。在衰老过程中, 机体出现各种功能下降及生理紊乱现象, 学习记忆伴随着机体的老化, 也出现了明显减退。在基因与学习记忆调控的研究方面, 快速反应基因 (IEGS) 被认为是一类可被第二信使诱导的原癌基因, 具有把短时程作用的细胞外信号和细胞功能的长时程改变偶联起来的效应。在多种模型诱导的学习记忆活动中, c-fos、c-jun等都有即刻、早期的表达, 其激活被认为是学习记忆形成的必要条件。
总之, 记忆减退在老年学研究方面具有明显的特征, 其发生发展与多个基因有关, 利用雄原核注射技术获得的KM转基因小鼠用于此方面研究有一定的现实意义。
参考文献
[1]PALMITER R D.Dramatic growth of nlice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion gene[J].Nature, 1982, 300 (5893) :611-615.
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[5]李想, 逍遥, 张鑫, 等.转基因动物研究进展[J].中国奶牛, 2009 (12) :25-30.
[6]鞠丽梅, 三好一郎, 笠井意雪, 等.显微注射法制备转基因小鼠的技术研究[J].中国实验动物学报, 1999, 7 (1) :11-15.
[7]尹海燕, 吴巧凤, 曾芳, 等.艾灸对老年学习记忆减退大鼠海马干细胞相关基因的影响[J].中国老年学杂志, 2008, 28 (5) :937-939.
转基因动物研究 篇5
一种提取动物基因组总DNA的野外样品保存方法
为了确定一种方便的野外动物样品保存方法,以新鲜材料作对照,从-20℃冰箱、70%乙醇、含50 mmol/L EDTA的70%乙醇、95%乙醇、液氮处理的高原鼠肌肉和肝脏组织中提取基因组总DNA.通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计对提取的基因组总DNA质量进行检测.结果显示:相同处理的肝脏DNA产量大,肌肉组织提取的DNA质量好;各种保存方法提取的DNA降解程度依次为,-20 ℃冰箱、70%乙醇＞含50 mmol/L EDTA的70%乙醇、95%乙醇＞液氮＞新鲜.选择新鲜肌肉和95%酒精处理的`肌肉样品提取的总DNA作模板,进行微卫星PCR扩增,均可获得清晰的电泳带.将该方法用于高原鼢鼠,进行线粒体12S rRNA、Cyt b和D-loop区测序,结果显示该方法保存的样品与新鲜样品没有差别.因此,在野外用95%乙醇固定肌肉样品是一种可行的样品保存方法.
作 者：蔡振媛 张同作 连新明 慈海鑫 苏建平CAI Zhen-yuan ZHANG Tong-zuo LIAN Xin-ming CI Hai-xin SU Jian-ping 作者单位：蔡振媛,连新明,慈海鑫,CAI Zhen-yuan,LIAN Xin-ming,CI Hai-xin(中国科学院西北高原生物研究所,西宁,810008;中国科学院研究生院)张同作,苏建平,ZHANG Tong-zuo,SU Jian-ping(中国科学院西北高原生物研究所,西宁,810008)
刊 名：四川动物 ISTIC PKU英文刊名：SICHUAN JOURNAL OF ZOOLOGY 年，卷(期)：2006 25(3) 分类号：Q78 关键词：野外取样 高原鼠兔 高原鼢鼠 样品保存方法 总DNA提取男人爱买春的动物基因 篇6
据统计，美国警方2007年关押的罪犯中，因买春而破抓捕的就有78000人，更有数据显示，接近10％的男性在一生中都有过性交易的经历，其中不乏已婚的商界成功人士、学者、名流。男人为何钟情于花钱买性呢?
对于男性喜欢寻花问柳的原因，美国一家机构做了一次问卷调查，结论中可以看到这种行为在全世界各地的男人中都非常常见，在各社会阶层中都存在着。即使处于稳定的婚姻家庭关系中的男性，依然会买春，一如“老虎”伍兹或是那些英格兰足球队员。从心理层面上，调查报告给予了如下的原因。在常规的家庭生活中，男性因较重的社会责任而承担着压力，当他们在妻子身上寻求不了压力的释放，便容易转投向陌生女人，通过金钱交易来获得放松。也或者，家庭关系因道德伦理所约束，而如佛洛伊德所言，人的本能欲望是趋于快乐，逃离非理性逃离道德伦理的束缚，买春正给予了男性这样的机会。无论是猎奇、尝新。还是寻求刺激，任何一种表象的成因归根结底都是受到本能欲望驱使，并不是性驱动下简单的满足性欲需求。毕竟大多数男性并非没有固定的性伴侣，需要在陌生女人身上寻求性满足，而是希望通过这种行为，从社会道德伦理中遁逃，这就是男性的心理成因。
通俗地说，男人在性爱领域就像一个探险家。探险家被好奇心及挑战欲所驱使，越是充满困难和危险的未知世界越是勇往直前。男人们这种对于性的好奇心在脱衣舞厅之类的地方更是暴露无遗。当脱衣舞女在舞台上叉开大腿时，看客一齐发出“噢——!噢——!”的叫嚣，纷纷从座位上探出身子争窥舞女的那一点秘处，表面看上去一本正经的公司白领此时也争先恐后，唯恐错过。那种场面实在滑稽可笑，但从某种意义上讲，也算是男人不加掩饰的真实一面吧。如果用女性的例子来作比较，那场面或许同女人们纷纷涌向名牌商品减价促销活动现场有些类似。活动现场的女人们根本顾不上仔细选择货物，也无矜持优雅可言，不论什么，只管抢到手再说，唯恐被别人抢先一步。
这些雄性探险家们，对于尚未彻底明了的世界总想加以了解，对于被包裹在一层神秘外壳中的事物具有无限的探知欲。他们想要饱览不曾见过的东西，观察不曾了解的东西，把玩不曾触摸过的东西。故此看到身着衣裳的女人，便会涌起一种强烈的欲望，希望脱掉她的衣裳，尽情地欣赏她的裸姿，抚摩她的玉体。但如果女人一开始就一丝不挂的话，就激不起他们强烈的情欲来。这就好比就近去一个容易抵达的地方，便感觉不到探险的愉悦一样。
所以说，无论身边的妻子多么貌美如花、温婉可人，男人依旧情不自禁地想接触其他女人并与之交合。这种性的冲动和欲望同对方的外貌美丑并没有什么必然联系。事实上，有些女人较之自己的妻子毫无姿色，但就因为她们是未知的存在，男人仍然会对她们生发出性冲动。即便没有真的交合，仍可以天马行空地在想象的世界里与之共赴巫山。现实生活中不乏这样的事例。
转基因动物研究 篇7
1 转基因动物的研究概况
1974年Jaenisch等将猿猴的空泡病毒 (SV40) 的DNA注入小鼠的胚泡, 培养出转基因动物[1]。1982年Palmiter等将大鼠生长激素基因转入小鼠受精卵中, 获得了生长快、体型大的超级小鼠[2], 从而开始转基因动物的研究。1997年英国罗斯林研究所Wilmut等首次利用羊体细胞获得克隆羊“多莉”, 突破了有性生殖的框架, 表明高等动物也可以由无性生殖来繁殖[3]。同年, 美国PPL公司和Roslin研究所合作, 利用该法生产出具有乳腺表达人第九因子的绵羊。Schnieke等于1998年利用该法得到表达治疗人血友病的凝血因子IX的转基因克隆绵羊[4]。2001年英国PPL公司宣布世界首例转基因克隆猪诞生。Berkel等利用牛的αs12酪蛋白启动子与人乳铁蛋白基因组的6.2 kb片段构建转基因载体, 通过显微注射获得转基因牛[5]。
1984年我国开始进行转基因动物研究, 同年获得了含人β-珠蛋白基因的转基因小鼠。1985年和1986年又分别获得了含人生长激素 (MT-hGH) 基因的转基因泥鳅和小鼠。1987年获得含有大肠杆菌galk和gpt基因的转基因小鼠。以后又相继获得了含HbgAg乙型肝炎表面抗原基因的转基因兔、转基因猪、含EPO基因和人乙型肝炎表面抗原基因 (HbgAg) 的二种乳腺特异性表达的转基因山羊、含人凝血因子IX的转基因山羊 (1998) 、含人血清白蛋白基因的转基因奶牛 (1999) 等。2008年吉林大学的欧阳红升教授成功获得了带有猪瘟病毒抗性的转基因猪。这些研究标志着我国转基因技术进入了崭新的阶段。
2 转基因动物的原理
转基因动物指通过基因工程技术将目的基因导入生殖细胞、早期胚胎干细胞和早期胚胎, 并整合到受体细胞的基因组中, 它们经过各种发育途径形成所有细胞都包含目的基因的个体, 称转基因动物 (也称个体表达系统) [6]。
利用转基因技术, 人们可以在动物基因组特定的位点引入所设计的基因突变, 模拟造成人类遗传性疾病的基因结构或数量异常;可以通过对基因结构进行修饰, 在动物发生、发育的全过程研究体内基因的功能及其结构功能的关系;可以在动物基因组引入病毒基因组以模拟病毒性疾病的发病过程;可以通过引入具有重要药用价值蛋白的编码基因, 使动物成为该药物蛋白的生产场所;可以将所引入的DNA片段作为环境诱变剂作用的靶DNA, 通过对它回收后的结构分析, 研究诱变剂造成的DNA损伤和诱发基因突变的规律[7]。
从原理、技术及在生命科学研究领域中可将转基因动物研究分为以下3个部分: (1) 上游部分:克隆目的基因, 分析基因的结构并在体外或其他系统中进行功能研究; (2) 中游部分:设计遗传修饰策略 (包括载体系统的构建等) , 选择适当的靶细胞进行基因转移和鉴定, 在此基础上将遗传修饰由细胞向整体动物过渡, 实现对整体动物基因组进行人为修饰的目的; (3) 下游部分:按育种程序进行工程动物的选育和建系, 在整体动物的背景上对目的基因的功能进行详细的研究, 并进一步开发利用符合设计要求的遗传工程动物。
转基因动物的遗传修饰策略包括: (1) 导致产生新功能的基因组修饰 (gain of function, GOF) ; (2) 导致功能丢失的基因组修饰 (loss of function, LOF) , 主要有插入突变、大片段缺失突变、点突变及条件性基因缺失突变; (3) 导致基因替换的基因组修饰; (4) 染色体畸变[8]。
3 转基因的主要技术
3.1 显微原核注射法
显微原核注射法利用显微操作系统和显微注射技术将外源基因直接通过注射器注入实验动物的受精卵中, 再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体子宫内继续发育成转基因动物。试验的过程中大多数转基因动物能把整合的基因传给后代, 建立转基因动物体系。Brandl等利用该方法成功制作成了转基因兔、转基因猪和转基因绵羊[9]。目前通过显微注射法已经获得的转基因动物有兔、猪、羊、牛和鱼等, 其整合率小鼠为6%~40%, 猪和羊分别为0.98%和0.1%, 鱼类可达10%~75%[10]。
这种方法的优点是转基因效率比较稳定, 注射基因片段大小不受限制, 无需载体, 制备相对容易。缺点是操作复杂, 效率较低, 成本较高, 并且操作对胚胎损伤较大, 影响胚胎存活。
3.2 逆转录病毒感染法
逆转录病毒作为转基因载体, 感染胚胎成功获得转基因动物:将目的基因重组到逆转录病毒RNA载体上, 主要是利用逆转录病毒DNA的LTR区域具有转录启动子活性这一特点, 将外源基因连接到LTR下部进行重组后, 包装成高滴度病毒颗粒, 人为感染着床前或着床后的胚胎, 或微注入囊胚腔中, 外源基因进入宿主细胞后, 反转录为DNA, 并在整合酶和其末端特殊核酸序列的作用下整合到宿主细胞的基因组中进行表达和遗传得到转基因动物。
这种方法的优点是操作简便, 无需特别的仪器设备;整合效率高, 效果稳定, 通常外源基因是单拷贝整合到受体基因组中;而且转染不受胚胎发育阶段限制。缺点是感染宿主时, 为非同源整合, 结合不稳定, 调控区内可能会发生相互作用, 所以应选择能稳定整合表达的外源基因, 并用高感染力的反转录病毒作载体;若外源基因的长度超过8 kb, 整合后的表达率低, 并且有潜在的致病性和致癌性。
3.3 胚胎干细胞介导法
囊胚期内细胞团 (ICM) 是多潜能细胞, 可以传代增殖。当这些细胞被注入另一囊胚期胚胎的囊胚腔之后, 会很快与受体ICM聚集在一起, 共同参与正常胚泡的发育, 产生一部分细胞含有外源基因的嵌合体, 再将这种嵌合体动物与正常动物连续交配, 则可生产出转基因动物[11]。胚胎干细胞 (ES细胞) 是早期胚胎的内细胞团经体外培养建立起来的多功能细胞系, 利用反转录病毒载体、电击法等将外源基因导入ES细胞内, 外源基因通过随机插入或者同源重组的方式整合到胚胎干细胞的基因组中, 然后把转染的胚胎干细胞注射入受体囊胚腔, 参与各种嵌合体的形成。将来出生的动物的生殖系统就有可能整合有外源基因, 通过杂交繁育得到含纯合目的基因的个体, 即为转基因动物。Thompson等利用DNA同源重组, 首次在ES细胞中成功进行了基因打靶, 定点修复了E14TG2α细胞株中的hprt-突变型, 获得了hprt-得到纠正的纯合体小鼠[12]。
ES介导法的优点是可对转化的干细胞进行阳性选择, 提高了转基因效率。用外源DNA转染后胚胎干细胞可以被克隆, 继而可以筛选含有整合外源DNA的细胞用于细胞融合, 由此可以得到很多遗传上相同的转基因动物。但ES介导法的缺点是ES建株很困难, 需要预先选择和克隆基因转移型细胞, 而且许多嵌合体转基因动物生殖细胞内不含有转基因, 第一代一般是嵌合体, 很难把外源基因遗传给后代。由于家畜干细胞系没有完全建立, 它的运用前途受到很大的限制。
3.4 精子载体法
精子载体法是一种直接用精子作为外源DNA载体的转基因方法。精子能够吸附外源DNA, 大多数被吸附的外源DNA位于精子头部的赤道段和顶体后区, 精子的这种吸附DNA的能力是由精子头部的蛋白所介导的。少数DNA能够进入精子的核区, 这部分DNA只有极少数能够整合到基因组上[13]。然后将精子用于体外受精, 并进行胚胎移植, 产生的后代中就有一定比例的动物能得到外源基因的表达。现已成功制备转基因鸡、鱼、牛、羊、兔等[14]。1989年, Lavitrano等将小鼠精子与线状或环状pSV2CAT质粒一起孵育15 min后, 再与成熟卵细胞进行体外受精, 产生转基因小鼠, 且转基因效率高达30%[15]。1999年, Perry等报道利用胞质内显微注射法制作转基因小鼠[16]。预先将小鼠精子与编码绿色荧光蛋白的外源DNA共孵育1 min然后将精子的头部显微注射入减数分裂II期的小鼠卵母细胞质中, 后代中20%的小鼠表达了绿色荧光蛋白。新疆畜牧科学院绵羊中心 (农业部畜牧兽医生物技术重点实验室) 运用精子载体法得到了8只绵羊。
运用精子载体法生产转基因动物时, 许多因素影响着DNA与精子的结合。例如较长的DNA片断 (7 kb) 与较短的DNA片断 (150~750 bp) 相比, 较短的DNA片段更容易被精子所摄取。
3.5 体细胞核移植转基因法
体外培养的体细胞经外源基因转染后, 筛选获得转基因的阳性细胞群。用这些阳性细胞群作为核供体, 通过体细胞核移植技术, 生产转基因胚胎, 通过胚胎移植将转基因胚胎移植给受体母畜, 即可直接获得转基因动物。转基因动物携带的外源基因在世代交替过程中可逐代传递。1996年, Campbell等用体细胞核移植转基因技术成功获得了世界上第一只转基因羊Dolly[17]。之后, 各国科学家相继报道了类似的研究成果。目前通过细胞核移植获得的动物有牛 (Cibelli, 1998) 、猪 (Lai, 2002) 和山羊 (Keefer, 2001) 等。2008年吉林大学的欧阳红升教授成功获得了带有猪瘟病毒抗性的转基因猪。
这种方法的优点是效率高, 理论上是100%。由于移植的胚胎就是转基因胚胎, 所以可以明显降低受体的成本, 从而使生产转基因动物的成本大大降低。缺点是该技术还处于发展阶段, 很多技术环节还有待于进一步的完善和提高。
此外, 还有人工酵母染色体法、阳离子脂质体介导的DNA转染法、原生殖细胞介导法、磷酸钙共沉淀法、电穿孔法以及精原干细胞移植法等[18,19], 这些方法也先后被应用于动物的转基因当中, 并也获得了一定的成功。但总体来说, 在转基因动物的研究中以上综述的五种技术居多, 并取得了较多的成果。
4 转基因动物的检测方法
4.1 染色体和基因水平
DNA斑点杂交是通过直接将变性的待测DNA样品点在尼龙膜 (或硝酸纤维素膜) 等固体支持物上, 然后和探针杂交, 从而检测样品中是否存在目的DNA序列。PCR反应是通过反复重复变性、复性、延伸过程, 则在短时间内可将两引物间模板扩增至百万倍[20]。染色体原位杂交是确定转基因在染色体上确切位置的重要手段, 其原理是利用碱基互补的原则, 以放射性同位素或非放射性同位素标记的DNA片段作探针, 与染色体标本上的基因组DNA在“原位”进行杂交, 经放射自显影或非放射性检测体系在显微镜下直接观察出目的DNA片段在染色体上的位置[21]。
4.2 转录水平
在mRNA水平检测外源基因是否表达, 通常在做完整合检查, 并有足够子代动物数量时进行。可采用Northern印迹法、RT-PCR、real time PCR、引物延伸分析、RNase保护分析、核酸酶S1保护分析法。
4.3 翻译水平
Western印迹分析和免疫酶标法检测表达蛋白质的方法。Western具有从混杂抗原中检测出特定抗原, 或从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性, 还可以对转移到固相膜上的蛋白质进行连续分析, 具有蛋白质反应均一性、固相膜保存时间长等优点, 因此, 该技术被广泛用于蛋白质研究[22,23]。ELISA方法中所用的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶等。由于HRP活性强、价廉和性质稳定, 故在ELISA中使用最广。
5 在畜牧业中的应用
5.1 动物抗病育种
通过克隆特定抗病基因组中的某些编码片段, 加以一定形式的修饰以后转入畜禽基因组, 如果转基因在宿主基因组能得以表达, 那么畜禽对该种病毒的感染应具有一定的抵抗能力, 或者应能够减轻该种病毒侵染时对机体带来的危害。其用于遗传育种, 不仅可以加速改良的进程, 使选择的效率提高, 改良的机会增多, 并且不会受到有性繁殖的限制。利用转基因技术有可能在较短时期内培育出常规方法不能或需长期培育才能育成的品种或种群, 是一项极有前途的研究领域。1986年, 中国科学家第一次把生长激素基因成功地转移到金鱼体内, 以后又成功地把人类、小鼠和其他鱼类的基因转移到多种鱼体内。美国科学家也成功地把某种生长基因转移到另一种鱼体内, 转基因鱼生长速度加快了, 体型变大了, 这就是人们称谓的“兰色革命”。
Clements将Visna病毒的衣壳蛋白基因 (Eve) 与其长末端重复导入绵羊基因组, 得到了3只成纤维细胞表达Eve基因的母羊, 人们已经获得了转入禽类白血病病毒 (ALV) 的衣壳蛋白基因env的转基因鸡, 获得的转基因鸡对禽类白血病病毒具有一定的抗性。Donovan等将编码溶葡球菌酶的基因转入奶牛基因组中获得转基因牛, 证明在其乳腺中表达的溶葡球菌酶可以有效预防由葡萄球菌引起的乳房炎, 转基因牛葡萄球菌感染率仅为14%, 而非转基因牛对照感染率达71%[24]。
5.2 改良动物生产性能“超级小鼠”的诞生为
培育大型动物开辟了新的思路。Pursel等曾把牛的生长激素基因转入猪, 生产出两个猪的家系, 其生长速度提高11%~14%, 饲料转化率提高16%~18%;美国科学家培育的转基因鲁鱼可增产20%~40%。我国的陈永福等用融合基因omT/GH进行基因转移, 转基因猪的生长速度提高11.8%~14.2%, 饲料利用率提高10%, 瘦肉率也有所增加;另外, 转基因鱼的生长速度提高20%, 节约饲料10%, 现有1 000多尾的转基因鱼。1996年damak等将小鼠超高硫角蛋白启动子与绵羊的IGF-ⅠcDNA融合基因显微注射到绵羊原核期胚胎中, 转基因羊的净毛产量比非转基因羊的净毛产量高6.2%。Brophy等报道通过转基因克隆技术提高牛自身β2酪蛋白基因、κ-酪蛋白基因的拷贝数, 使牛奶中β2酪蛋白的含量提高了8%~20%, κ-酪蛋白的含量提高了2倍, 大大改变了κ-酪蛋白与总蛋白的比例。2003年3月, 中国农业大学李宁课题组成功获得中国第1头体细胞转基因克隆牛, 同年10月, 又获得世界上第1头转人岩藻糖转移酶基因的体细胞克隆牛。郭志勤等通过精子载体法生产了15头转人胰岛素原基因的奶牛, 并在奶中检测到外源蛋白表达。Kuroiwa等将MMCT与体细胞克隆技术相结合, 把含有整个人类免疫球蛋白重链基因IgH和轻链基因Igλ的染色体片段转入牛的原代胎儿成纤维细胞, 获得了4只健康存活的转基因克隆牛, 它们的血液中能不同程度表达人类多克隆抗体。Richt等又通过基因打靶技术将牛的PRNP基因双位点灭活, 获得存活了2年以上的转基因牛[25]。这些牛在临床解剖、生理发育、组织病理以及免疫和生殖发育方面都很正常, 而且在体外试验中能够很好地抵抗疯牛病的传染, 这为生产不含朊蛋白的肉、奶制品提供了一种很好的方法。
6 展望
转基因动物的研究虽然取得了显著进展, 但整合和表达效率低、转基因的遗传率低和生产成本高都是转基因技术中存在的问题, 且外源基因的整合机制尚不清楚, 转基因在宿主基因组中的行为难以控制, 阻碍了该技术的发展。尽管如此, 基因打靶与核移植技术的结合是创建转基因动物很有前途的一种新方法, 可以在创建转基因动物之前在细胞中将目的基因插入染色体的特异位点, 避免基因随机整合带来的位置效应, 同时剔除或替换干扰目的蛋白分离和引起移植组织排斥的动物基因, 将转基因动物的筛选提高到细胞水平。采用体细胞核移植技术比传统的显微注射技术更具优点。体细胞数量远比受精卵丰富, 有利于降低生产成本;生产转基因动物的效率高, 在鉴定了适用的细胞克隆及其性别后, 可以获得速成动物群。
毛皮动物毛色调控基因的研究进展 篇8
研究发现,调控毛皮动物毛色的主要候选基因有MC1R基因、Agouti基因、TYR基因、CBD103 基因、SILV基因和KIT基因等,其中MC1R基因和Agouti基因是研究较早并已证实能调控哺乳动物毛色变异的2 个关键基因［1］。
1 MC1R基因、作用机理及其与毛皮动物毛色表型的相关性
MC1R( melanocortin receptor 1 ) 基因仅有1 个外显子,可编码黑皮质激素受体1,MC1R属于E族G蛋白耦联受体,有7 个跨膜区,约包含317 个氨基酸长度。MC1R能在皮肤中表达,在色素产生的类型方面起重要作用［1］。
细胞膜上的MC1R与促黑激素( α - MSH) 和促肾上腺皮质激素( ACTH) 结合后,使与其耦联的G蛋白转变为三磷酸鸟苷( GTP) ,从而激活膜上的腺苷酸环化酶系统,生成环腺苷酸( c AMP) ,随后进一步激活酪氨酸激酶,进而使酪氨酸( TYR) 活化,然后TYR开始参与黑色素的合成。如果黑色素细胞中活化的TYR过量,细胞会合成真黑素,反之细胞会合成褐黑素［2］。
目前,MC1R基因与毛皮动物毛色表型的相关性研究报道较少。1997 年,D. I. Vge等［3］对不同毛色狐狸MC1R基因进行了克隆分析,在携带阿拉斯加银色等位基因EA的深毛色狐狸MC1R基因中发现了一个组成型活性突变( C125R) ,证实深色狐含有显性Extension等位基因。2005 年,D. I. Vge等［4］又以北极狐为研究对象,通过PCR - RFLP和直接测序的方法发现蓝色北极狐和白色北极狐MC1R基因编码区有2 个变异位点,即蓝色北极狐编码区的第5 个位点和第280 个位点的甘氨酸和苯丙氨酸均被半胱氨酸替代,由此阻止了冬季白毛颜色的表达。J. I. Han等［5］为了确定野生型貉黄毛色的遗传机制,比较了黄色貉和正常色貉MC1R基因的序列及其mRNA和蛋白质的表达水平,结果在5'非翻译区发现了2 bp的缺失,黄色貉MC1R蛋白的表达水平显著低于野生型,提示黄色貉增加了褐黑素的合成。J. Nowacka -Woszuk等［6］检测和比较分析了家犬、赤狐、北极狐和中国貉的整个编码区和部分3'非翻译区序列。在编码区,赤狐和北极狐共计发现17 个错意突变位点,其中有6 个SNPs为赤狐独有,2 个SNPs为北极狐独有; 貉共发现9 个错意突变。在3'非翻译区,赤狐和北极狐均发现3 个SNPs,貉发现1 个SNP。柏蒙蒙等人研究发现,红褐色貉MC1R基因编码区426 bp处存在1 个SNP( A→T) 。孙静［7］在貉MC1R基因300 bp处酶切得到AB和BB两种基因型,其中红褐色貉为AB基因型,野生型貉为BB基因型,推测等位基因A可能参与控制毛色的红褐色表型,等位基因B可能参与控制野生型毛色( 青灰色或青黄色) 表型。
2 Agouti基因、作用机理及其与毛皮动物毛色表型的相关性
Agouti基因表达时,可引起褐黑素的产生,相反则引起真黑素的产生。Agouti基因编码Agouti信号蛋白( ASIP) ,该蛋白是一种旁泌信号分子［8］。ASIP于1993 年被发现,后被证实其由约130 个氨基酸组成,而且含有1 个半胱氨酸环。
ASIP是MC1R的颉颃剂。ASIP与 α - MSH竞争性地结合MC1R,ASIP与MC1R结合后可阻断 α -MSH的起始信号,然后阻碍c AMP的产生,致使c AMP含量减少,最终导致真黑素合成量增加,褐黑素合成量减少［8］。
关于Agouti基因变异与毛皮动物毛色的相关性研究报道极少,目前仅见D. I. Vge等［3］报道携有隐性等位基因( aa) 的黑色标准银狐Agouti基因存在第1 外显子的缺失。
3 TYR基因、作用机理及其与毛皮动物毛色表型的相关性
哺乳动物酪氨酸酶( TYR) 是一种Ⅰ 型膜结合糖蛋白,其TYR基因包括5 个外显子和4 个内含子,编码序列长约1. 6 kb。TYR是动物黑色素细胞中黑色素合成的限速酶,是一个含铜的氧化还原酶,催化酪氨酸氧化成多巴,再将多巴氧化成多巴醌,最后多巴醌经过一系列的生化反应合成黑色素。TYR在黑色素合成过程中至少具有酪氨酸羟化酶和多巴氧化酶活性,其活性决定着黑色素合成的种类与数量,高活性的TYR导致真黑素产生［9］。
TYR基因若发生功能性突变,可导致动物毛色出现白化现象,此现象已经在人、牛、家猫和猕猴等动物上得到了证明。在毛皮动物方面,R. Anistoroaei等［10］在半同胞貂家族中发现了与白化表型相关的2 个微卫星标记Mvi6025 和Mvi6034,随后通过分析野生型与白化型貂的TYR基因序列,在外显子1 存在1 个无义突变,即原编码半胱氨酸的TGT转变成1 个终止密码子TGA ( c. 138T > A,p. C46X;EU627590) ,突变使该基因90% 以上的产物( 包括催化结构域) 缩短了,因而导致美国水貂的白化表型。B. F. Benkel等［11］通过对美国貂罕见毛色表型———大理石花纹表型的研究发现,显示大理石花纹表型貂的TYR基因外显子4 存在1 个突变( c. 1835C > G,p. H420Q) ,因此大理石花纹表型貂也被称作喜马拉雅山貂。
4 β - defensin 103 基因、作用机理及其与毛皮动物毛色表型的相关性
β - defensin 103 基因也称CBD103 基因,其编码的防御素是一种富含精氨酸残基的分泌性多肽,通常包含28 ~ 54 个氨基酸残基,分子质量为4 ~ 6 ku。
β - defensin具有直接抵抗病原微生物和免疫调节作用,但因其结构与Agouti蛋白相似,所以还会与Agouti蛋白、α - MSH竞争性地结合MC1R,进而改变黑色素合成通路,导致黑色素合成的类型、数量发生变化,最终改变动物的毛色［12］。
β - defensin 103 基因对家犬和转基因小鼠的毛色类型转换有简单而强大的作用［12］,但目前在毛皮动物上还未发现 β - defensin 103 基因与毛色表型相关的研究报道。
5 SILV基因、作用机理及其与毛皮动物毛色表型的相关性
SILV ( silver locus protein homolog ) 基因又称为PMEL( premelanosome protein) 基因,编码前黑素体蛋白或黑色素特异性糖蛋白。SILV是一个分子质量为100 ku的 Ⅰ 型跨膜糖蛋白,主要在皮肤和眼睛的黑色素细胞中表达［13］。
在黑素体形成的初级阶段,SILV具有重要作用［14］。在黑素体形成的第2 阶段,即前黑素体Ⅱ阶段,被蛋白酶处理的SILV蛋白碎片会聚集形成纤维状条纹,这些纤维状条纹将成为黑色素存储的基质,且与真黑素的形成有关。SILV具有聚合、稳定黑色素中间体的作用和( 或) 阻止有毒的黑色素中间体对黑色素细胞的破坏［15］。目前,在毛皮动物上未见SILV基因与毛色表型相关的研究报道。
6 KIT基因、作用机理及其与毛皮动物毛色表型的相关性
KIT基因与白蛋白( albumin) 和维生素D结合蛋白( Gc) 的位点密切相关,编码肥大细胞生长因子受体,该受体属于酪氨酸激酶第Ⅲ亚族。KIT由5 个免疫球蛋白区、1 个跨膜区、1 个近膜区和1 个细胞内蛋白激酶域组成,其在黑色素生成、肥大细胞发育和功能体现、配子发生和造血等过程中具有重要作用［16］。
KIT基因正常表达肥大/ 干细胞生长因子( MGF /SGF) 时,黑素细胞前体物正常迁移,导致黑素细胞的产生,随后该细胞内充满黑色素颗粒,最终使动物毛表现出有色; 反之,如果KIT发生突变或MGF/SGF缺失,则会影响黑素细胞前体物的正常迁移并使黑素细胞减少,进而导致毛囊缺乏黑素细胞和黑色素颗粒,最终使动物毛色表现出白化现象［17］。
在毛皮动物方面,C. Y. Bai等［18］通过克隆获得了银黑狐KIT基因完整编码区序列,对比家犬和狐狸KIT基因所编码的氨基酸序列后发现,二者仅有的差异是在家犬信号肽区有2 个亮氨酸残基的插入和相邻谷氨酰胺/亮氨酸的突变。对比家犬和狐狸的KIT基因c DNA序列后发现,在760 ~ 762 bp处存在3 个碱基( CAG) 的插入/缺失及2 个转录剪接变异体存在12 bp的差异,这些结果为今后深入研究狐狸KIT基因提供了重要的基础信息。S. Q. Yan等［19］利用RT - PCR技术鉴定了显性白狐和正常蓝狐KIT基因的转录本,序列分析后发现,正常蓝狐KIT转录本包含完整编码区序列( 2 919 bp) ,而显性白狐则存在外显子12 的缺失。基因组序列分析后发现,在显性白狐和正常蓝狐的内含子12 存在1 个SNP和1 bp的缺失/插入( c. 1867 + 1G > T) ,由此导致络氨酸酶的失活。上述结果表明,KIT基因内含子12 第1 个碱基的替换会导致基因翻译时跨越外显子12,最终导致蓝狐表现为显性白色。
7 小结
动物脂肪代谢关键基因的研究进展 篇9
1 脂肪酸合成酶 (FAS)
FAS是一种基本的代谢酶类, 催化乙酰Co A和丙二酸单酰Co A合成软脂酸, FAS的多少和活性的高低对动物体脂沉积具有重要意义, 在动物体脂沉积过程中发挥重要作用, 其表达水平的升高能够显著增加三酰甘油在体内的沉积[1]。
在能量代谢过程中, 乙酰Co A是合成脂肪的起点, 它可以进入三羧酸循环, 完全氧化, 为生物细胞提供能量来源。丙二酰Co A是脂肪酸合成酶的主要底物, 它的增多意味着能量过剩, 如不控制, 将加速脂肪合成。
近年来的研究发现, 癌细胞的生长依赖于FAS的活性, 且与肥胖、癌症等疾病的关系密切, 在具有侵袭性的癌组织中持续高表达。FAS抑制剂的研制有望为相关疾病的治疗提供新的方法。经FAS抑制剂处理的小鼠, 可以减少进食量, 增加能量消耗, 有明显的减肥效果;肿瘤的发生常与FAS的不正常表达密切相关, 已发现其在多种恶性肿瘤中过度表达, 抑制FAS的表达和活性可以抑制直肠癌发生肝转移[2]。
研究发现, FAS基因在小尾寒羊尾部脂肪组织中的表达水平随着日粮中能量水平的增加而呈升高的趋势。猪脂肪组织中的FAS与胴体脂肪量、胴体脂肪率呈极显著正相关[3]。FAS在猪腹脂中的基因表达规律是随着日龄的增加而呈现升高的趋势。
饲喂高蛋白质日粮可降低脂肪组织FAS mRNA的表达量, 但不影响肝脏组织FAS mRNA的数量, 有利于体脂肪的沉积减少, 生产出高瘦肉率、低脂肪的肉类[4]。
2 乙酰辅酶A羧化酶 (ACC)
ACC是脂肪酸合成限速酶, 具有催化乙酰辅酶A形成丙二酸单酰Co A的羧化作用, 是脂肪合成和代谢过程中重要的中间代谢产物[5]。已确认的ACC有两种形式, 即ACCα和ACCβ, 它们由不同基因编码, 在不同的组织中表达, 具有不同功能。在进食后和高胰岛素水平下, ACCα处于激活状态, 协助机体以脂肪形式储存能量或减少摄食;而在空腹状态下, ACCβ是被抑制的, 有利于脂肪的水解和氧化。因此, 可通过激活ACCα或抑制ACCβ来达到治疗糖尿病的目的。
在下丘脑, ACCα可能参与了饱感的过程, 丙二酰Co A在下丘脑中有调控摄食的重要作用, 高的胰岛素和血糖水平 (餐后状态) 激活ACCα, 可以抑制动物的摄食行为[6]。哺乳动物ACCβ被证实可以作为治疗肥胖、糖尿病等代谢疾病的活性靶标[7]。肥胖小鼠血清中的三酰甘油和总胆固醇浓度高于正常小鼠。研究发现, ACC抑制剂能抑制小鼠体重的增加, 减少肥胖小鼠的肥胖程度, 降低血清中三酰甘油和胆固醇含量, 提示ACC抑制剂对肥胖小鼠有减肥作用。
ACC在多种肿瘤组织中呈高表达, 不同的ACC抑制剂能有效抑制脂肪酸合成, 具有抗肿瘤细胞增殖的作用, 并且可以引起细胞凋亡及周期阻滞, 这些结论均表明抑制ACC活性可能成为治疗恶性肿瘤的新靶点。
3 肾母细胞瘤过度表达 (NOV) 基因
NOV是CCN家族成员之一, 与大多数CCN家族成员的结构和功能相似, NOV可参与调节细胞增殖、分化、黏附及血管形成等复杂的病理和生理过程, 还可促进骨骼、神经和血管的发育。NOV基因与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关, 它是一种原癌基因[8]。在鸡胚胎和成体脑组织中存在一定量的NOV mRNA, 提示在这些组织中NOV基因可能有一定的促细胞生长、分化作用[9]。
研究发现, NOV可调节细胞内钙离子水平, 并对某些肿瘤有抑制生长作用, 其生物学效应也许与效应细胞种类有关。NOV基因对成纤维细胞生长也有抑制作用, 可使细胞从生长转为静止状态。
最新的研究结果表明, 背最长肌组织中NOV基因表达量与肌间脂肪含量之间具有负相关关系 (P<0.01) 。另外, NOV基因还可以在育肥牛血液中表达, 其表达丰度与育肥日龄有一定关系[10]。
4 胰岛素样生长因子-Ⅰ (IGF-Ⅰ)
IGF-Ⅰ是胰岛素样生长因子家族中的一种, 通过与IGF-Ⅰ受体结合产生生物学效应。IGF-Ⅰ是生长激素发挥促生长作用的重要调节因子。IGF-Ⅰ在哺乳动物、禽类的胚胎期和出生后的生长过程中起重要作用, 与初生重、日增重、背膘厚度等性状均有一定的相关性[11]。
IGF-Ⅰ是一种碱性多肽, 具有调节机体生长发育、生殖免疫和机体代谢的功能;此外, 还具有类似于胰岛素样的生物合成代谢功能, 能够调节机体血糖水平。研究发现, IGF-Ⅰ能够抑制多种类型细胞凋亡, 促进细胞增殖和分化。在肌细胞形成过程中, IGF-Ⅰ可促进肌细胞分化;在骨骼肌生长过程中, IGF-Ⅰ可调节骨骼肌的生长。
IGF-Ⅰ可促进骨细胞、肌肉细胞的增殖和前脂肪细胞分化, 瘦肉型猪血浆中IGF-Ⅰ含量高于脂肪型, 血浆中IGF-Ⅰ水平与体重及增重呈正相关。选择较低水平的IGF-Ⅰ会得到更多的瘦肉, 更快地生长和更有效益的猪。
研究发现, IGF-Ⅰ与断奶重及肉牛的初生重相关, 与某些猪种的背膘厚度相关。IGF-Ⅰ基因位点的多态性对日增重、瘦肉率, 以及骨、皮、脂含量等性状有显著影响[12]。育成牛血液中IGF-Ⅰ的浓度与平均日增重之间存在着正相关, 血清中的IGF-Ⅰ浓度可作为改善生长和饲料效率的选择指标而被应用于育种中[13]。
5 小结
动物的生长育肥过程受众多因子、酶体系的调控, 其生化过程极其复杂, 并非单一的对应关系, 综上所述的关键酶mRNA表达量高, 并不一定等于酶蛋白的含量高或酶的活性高, 还可能受其他因素共同影响。迄今为止的大部分研究多局限于动物营养代谢和单一的生化过程。今后的研究应定位于特定组织与基因表达特性, 研究生长与脂肪代谢相关信号通路和分子调控通路, 从分子水平揭示动物体内营养代谢及其调控机制。
摘要：动物脂肪代谢包括合成代谢和分解代谢, 两者共同调控着脂肪的沉积。在两个动态调控过程中, 脂肪酸合成酶 (FAS) 、乙酰辅酶A羧化酶 (ACC) 、肾母细胞瘤过度表达 (NOV) 和胰岛素样生长因子-Ⅰ (IGF-Ⅰ) 基因参与细胞的分化和脂肪的形成, 并且扮演着较为重要的角色。文章对FAS、ACC、NOV和IGF-Ⅰ基因的生理功能及研究进展进行了综述。
转基因动物研究 篇10
1 H-FABP基因的分子结构及定位
H-FABP基因又称FABP3, 不同物种H-FABP基因都由4个外显子和3个内含子组成, 其间距大约为10bp, 如图1所示。外显子1包含了所2有5’未翻译序列, 并编码最初的24个氨基酸;外显子2和3分别编码59和34个氨基酸, 外显子4编码最后的16个氨基酸和3’未翻译的区域。在不同种物种之间H-FABP基因的编码区有很高同源性, 这不仅表现在所编码的氨基酸上, 还表现在其DNA序列上。在物种间外显子具有高度的保守性, 分别编码了24、58、34和17个氨基酸, 三个内含子的大小分别为4.2、2.5和1.5kb, 但内含子在物种间的差异却很大[4]。
不同物种间H-FABP基因定位于不同的染色体上, 人类的H-FABP基因定位于1号染色体上[5];猪的H-FABP基因定位于6号染色体上, 拥有1.6kb的上游调控序列和0.2kb的3’非转录区, 含有4个外显子, 分别转录含有24、58、17和17个氨基酸的多态片段[6]。鼠的H-FABP基因定位于4号染色体上[7]。鸡的H-FABP基因定位于23号染色体上, 牛定位于2号染色体上, 都由4个外显子和3个内含子组成。
2 H-FABP基因遗传多态性
Gerbens等[8]用PCR-RFLPs技术, 发现了位于5’上游区的1个多态位点Hinf I-RFLP以及位于第二内含子内的2个多态性位点Hae III-RFLP和Msp I-RFLP。张桂香等[9]运用PCR-RFLP技术研究9个猪种 (皖南花猪、二花脸猪、金华猪、小梅山猪、滇南小耳猪、香猪、荣昌猪、北京黑猪和大白猪) H-FABP基因5’-上游区和第二内含子的遗传变异发现, 9个品种中都在5’-上游区验证了一个Hinf I-RFLP多态性位点, 而在内含子发现了一个Hae III-RFLP, 但该多态性位点只存在于皖南花猪和大白猪中, 另外还发现了一个新的多态Hinf I*酶切点, 但在所有所测猪中并没发现Msp I-RFLP。曹红鹤等[10]进一步确定了3个酶切位点 (5’-上游区Hinf I-RFLP、内含子2的Hae III-RFLP和Hinf I*-RFLP) 并对每个多态片段进行克隆测序分析发现, 5c-上游区Hinf I-RFLP是由于1324位的碱基发生了T到C的突变;在内含子2中, Hae III-RFLP变异酶切位点在1811位, 发生了C→G的突变引起;Hinf I*-RFLP是由于1970位发生了T到C的碱基替换。朱弘焱等[11]检测辽宁种猪 (东北荷包猪、大白猪、长白猪和杜洛克猪) H-FABP的多态性位点发现, Hinf I和Hae III酶切点都显示多态性, 且优势基因型分别为HH和dd型, 其中分析荷包猪H-FABP基因5’-上游区和第二内含子多态性, 结果显示H和d基因的频率较高。周全勇等[12]运用PCR-RFLP技术对玉山黑猪多态性进行分析发现, 在Hinf I位点上玉山黑猪H-FABP基因表现多态性, 在Hae III位点上为单一等位基因。
3 H-FABP基因在动物生产中的应用
3.1 H-FABP基因在猪生产中的应用
猪肌内脂肪 (intramuscular fat, IMF) 含量是猪肉品质的重要性状之一。H-FABP基因作为IMF候选基因, 其遗传变异影响了猪肉肌肉脂肪含量及猪肉品质。庞卫军等[13]对西部地区主要猪种和野猪的H-FABP基因研究表明, 同一猪种的不通基因型间IMF含量存在差异, 9种基因型对IMF含量均存在影响, HH>Hh>hh, DD
不同H-FABP基因的基因型对猪的生长性能存在一定影响。刘剑锋等[18]对中畜黑猪1系研究发现, 在Hinf I-RFLP位点上, HH和hh 2种基因型间170日龄体重差异显著, 在其他位点上未发现生长性能间的显著差异。林万华等[19]的研究报道, 20日龄的二花脸猪H-FABP基因, HH、Hh和hh 3种基因型间体重差异显著;在不同基因型间, 每个日龄组的肌肉组织学性状值表现为差异不显著。曲亮等[20]的试验分析H-FABP基因的3个变异位点对胴体性状的影响, 结果显示只有Hinf I位点对苏淮猪胴体性状影响显著, HH基因型个体的瘦肉率最高, hh基因型个体的背膘最厚;分析3个变异位点单倍体发现, HH-DD-AA型和HH-Dd-Aa型的瘦肉率超过60%, 同时, hh-DD-AA型背膘最厚, 瘦肉率最低, 与HH-DD-AA相比, 预示H等位基因能明显提高瘦肉率等性状。为提高胴体性状, 在育种工作中可以重点选留HH型个体繁殖后代。
3.2 H-FABP基因在禽类生产中的应用
王彦等[21]通过运用PCR-RFLP技术分析鸡的H-FABP基因发现在引物1260位点处有一个C到T的单碱基突变和在2765位点处的一个A到G的单碱基突变, 产生了3种基因型:AA、AB、BB。结果在T260C位点上, 所有鸡的品种中AA基因型的IMF含量显著高于BB基因型个体;而在不同品种中, AA和BB基因型只对封开杏花鸡和岭南黄鸡II号的IMF含量有显著影响, 对其他品种鸡的IMF含量都无显著影响。朱祥云等[22]以H-FABP为候选基因, 运用PCR-SSCP方法对6周零3个群体的北京鸭进行SNP分析发现, H-FABP基因第3内含子的第156个碱基处发生1个C到G的突变, 该突变对Z4群体胴体质量、皮脂质量、皮脂率和全净膛质量有显著影响, 因此H-FABP基因可以作为北京鸭Z4群体屠宰性能的候选基因应用于选育工作中。游小燕等[23]对鸡的H-FABP基因采用PCR-SSCP研究推测, H-FABP基因很大程度上影响鸡的屠宰性能或与控制屠宰性能的主基因连锁。H-FABP基因多态性对IMF含量存在显著影响, H-FABP基因m RNA表达水平对IMF含量也影响显著。李文娟等[24]的研究表明, 随着鸡日龄的增长, H-FABP基因m RNA表达量显著降低, 且白莱航鸡、北京油鸡和AA鸡群体的H-FABP基因m RNA表达水平与屠体重及IMF含量呈现显著的负相关。屠云洁等[25]对鹿苑鸡和隐性白羽鸡H-FABP基因研究也发现H-FABP基因m RNA表达水平与IMF含量呈显著负相关。而H-FABP基因m RNA表达水平受环境和个体因素的影响, 实际应用中应综合考虑。
3.3 H-FABP基因在反刍动物生产中的应用
周国利等[26]对鲁西黄牛H-FABP基因研究表明, BB基因型对牛肉嫩度的剪切力值有较大的影响, BB型所对应的WBS值显著高于AA和AB, 而WBS值越高, 肉质性状越差。AA、AB和BB 3种基因型对大理石纹影响不显著;为了加快肉牛肉品质的遗传发展, 在育种工作中可以通过选择A等位基因或纯合子AA基因型个体作为辅助选择的依据。余刚等[27]对陕北白绒山羊H-FABP基因研究发现, H-FABP基因外显子2的第22位存在G到C的基因突变, 造成的3种不同基因型对胴体性状的影响。其中AA型个体具有显著的脂肪沉积能力, AB型基因在胸围等性状上可能是有利基因型。曹健[28]对耗牛H-FABP基因研究得出, H-FABP突变影响甘南阉耗牛眼肌面积和胴体重。王兰萍等[29]运用PCR-SSCP技术对黄淮山羊H-FABP基因进行分析发现, 黄淮山羊只存在一个突变位点, 其中两个基因型GG和GC, GC型个体的IMF含量显著高于GG, 在背最长肌、胸肌和腿肌间, GC型个体的IMF含量同样显著高于GG。由此可以推测GC基因型可能是黄淮山羊IMF含量性状的有效标记基因型。谢一妮[30]对4个成年山羊群体进行H-FABP基因研究发现2个酶切点Hae III和Sau I共得到6种基因型, 其中B和D等位基因为优势基因, 对IMF含量有一定影响。陈春华等[31]对陇东地方牛和西杂肉牛作H-FABP基因分析发现了C1006G突变位点及基因型GG/GC/CC, 其中GC和CC基因型对牛肉滴水损失有显著影响。
4 小结
在对肉品质要求不断提高的今天, 研究学者对H-FABP基因的研究热度持续高涨。从目前的研究结果来看, 前人研究主要集中在H-FABP基因5’上游区和第二内含子区的突变位点, 以及突变位点所造成的不同的基因型及基因频率对动物各种性能的影响, 包括IMF含量, 生产性能, 胴体性状, 大理石花纹, 剪切力、眼肌面积、背膘厚等。另外加上供试群体品种多样以及对供试群体的选择、样本含量的大小存在的局限性, 现今对候选基因内多态性的研究还远远不够;需要后人前仆后继, 扩大群体规模, 联合更多的相关候选基因和DNA标记基因来进行分析, 寻求与动物生产紧密连锁的遗传标记, 以便在动物育种生产实践的标记辅助选择中发挥遗传改良作用。虽然, 分子遗传标记已经广泛用于畜禽的育种工作中, 为畜禽遗传改良带来了福音, 但对H-FABP基因的研究方法普遍是进行PCR-SSCP反应或是PCR-RFLP反应, 之后根据电泳图谱中的条带类型对所研究的试验对象进行基因分型, 然后再分析其基因型与某一性状的遗传相关性。研究方法仍然需要进一步的创新和改进, 我们仍有大量的工作需要继续开展。
参考文献
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[11]朱弘焱, 苏玉虹, 宋衡元, 等.辽宁种猪H-FABP和AFABP基因位点多态性研究[J].畜牧与兽医, 2010, 42 (8) :15~18.
转基因动物研究 篇11
许多肿瘤对人类而言是致命的。然而，美国科学家的一项最新模拟研究表明，对体型较大的动物比如鲸鱼而言，肿瘤的出现可能更加普遍，但这些肿瘤往往不会致命。研究人员提出一种新的理论，即大型动物体内会逐渐进化产生更富有侵略性的肿瘤，而这些后来者会阻碍父代肿瘤的生长。
与体型较小的动物相比，大型动物通常体细胞较多，寿命也较长，这本应该使得它们更容易患上癌症，因为一方面细胞越多癌变的几率就越大，另外一方面年龄的增长会大大增加癌变风险。然而在现实世界中，动物患癌症的风险并未随着体格的增加而明显加大，这是一个困扰科学家多年的矛盾问题。
为了弄清这一问题，美国亚利桑那州立大学的生物学家John
Nagy和同事假设自然选择倾向于最具有侵略性的肿瘤细胞，它们生长迅速，能够分泌促进血管生长的化学物质，从而获得足够的营养。
研究人员认为，大型动物体内的癌细胞会逐渐进化为“超级肿瘤”(hypertumour)，它会破坏营养供给从而摧毁父代肿瘤。而大型动物的超级肿瘤只有进化得非常大的时候才可能是致命的，因此它们需要的进化时间也更长，这也就解释了为什么大型动物在众多肿瘤的影响下仍然能够长寿。
为了验证这一假设，Nagy等人用计算机模拟了单个随机定位肿瘤在美洲鼠兔、人类、蓝鲸等6种动物体内的演化过程。他们将每个物种的模拟程序都运行了1000次后发现，大多数动物进化出的超级肿瘤都阻碍了父代的生长。同时，物种的体型越大，产生的超级肿瘤也越多，而患上致命癌症的几率却相对较低。
科学家首次发现动物长寿基因知慧
美国科学家近日表示，他们在实验中首次发现一种长寿基因，该基因不仅可以控制生命的衰老过程，还能够有效促进身体健康。
科学界此前已经证明有两种延长寿命的方法，一种是减少细胞对胰岛素的敏感度，另一个是节食，如果动物把食量减少30％，它的寿命便可以延长20％至30％，如果人类这样做，则可以延长寿命15至20年。
美国加州索尔克研究院的科学家们在对蚯蚓进行实验后，首次发现了一种名为PHA-4的基因。研究表明，该基因对增加动物的寿命至关重要。在实验中，蚯蚓一旦吃了关掉PHA-4基因的细菌，即使它们节食，寿命也不比正常的长。而另一个测试发现．如果拥有PHA-4基因，蚯蚓即使维持正常饮食，寿命也会延长20％至30％。
科学家认为，上述研究解开了长寿的内在机制，从而为开发不节食也能使人长寿的新药作了药理学上的铺垫。
转基因动物研究 篇12
日前, 由中国农业科学院特产研究所杨福合研究员主持完成的“国家特种经济动物遗传资源库建设与创新利用”项目荣获中国农科院科技成果一等奖。该项目建成了目前世界上最大的特种经济动物基因库, 系统解决了当前我国特种经济动物遗传资源所面临的问题, 填补了国内外相关技术领域的空白, 促进了特种经济动物产业的健康发展。
该研究历时36年, 针对我国特种经济动物遗传资源保存分散、规模小, 易丢失;保存和整理不规范、缺少系统全面的评价体系;数字化管理水平较低;网络系统不健全、信息不畅通;共享机制不完善, 资源共享和创新利用率低等问题, 系统开展了我国特种经济动物遗传资源的收集保存, 整合整理, 创新利用及数据实物共享等方面大量的研究工作, 为我国资源保存利用提供基础支撑。
该项目在国内外首次对我国特种经济动物种质资源进行整理, 整合了我国农业、林业、教学科研等3大领域特种经济动物种质资源, 涵盖鹿类动物、毛皮动物、特禽及其它特种经济动物种质资源509个品种 (类型) 等, 保存在69家特种经济动物资源单位的保存场、专业实验室等;建成了目前世界上最大的特种经济动物基因库。首次建立了特种经济动物评价体系, 保证进入共享平台的特种经济动物资源的多样性和准确性。对水貂、梅花鹿、马鹿和兔资源优异基因进行了评价。制定了特种经济动物资源共性描述规范、个性描述规范、技术规程、活体异地保存技术规范和数据标准和数据控制规范等, 形成特种经济动物种质资源标准化体系;首次建立了完善的特种经济动物种质资源数据库和信息检索系统, 通过中国特种经济动物种质资源网 (www.spanimal.cn) 进行检索, 实现全方位信息共享。 (摘自农科院网站)