基因研究（共12篇）
基因研究 篇1
近年来肺癌的发病率和病死率均呈明显增高趋势, 男性的肺癌发病率和病死率已位居所有恶性肿瘤的第一位, 女性发病率居第四位, 病死率居第二位, 其中非小细胞肺癌 (NSCLC) 占80%。绝大多数肺癌于发现时已属晚期, 失去手术机会[1], 而即使接受手术的患者术后大多也需接受化疗, 化疗已成为肺癌治疗的主要手段之一。不同患者接受同一化疗方案其疗效有很大差异, 近年来研究显示, 造成这种差异的一个重要原因是基因多态性, 基因通过影响所编码酶的活性最终影响药物的疗效。亚甲基四氢叶酸还原酶 (MTHFR) 是人体叶酸代谢过程中的关键酶之一, 近年来众多研究显示MTHFR基因与肺癌的发病及化疗药物疗效有密切关系, 本文对此方面的研究作一综述。
亚甲基四氢叶酸还原酶 (methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR) 是影响机体叶酸代谢的关键酶之一, MTHFR基因于1998年被首次克隆, 定位于1号染色体上1p36.3, 长度20.3kb, 包含11个外显子, 其基因产物可将5, 10-亚甲基四氢叶酸不可逆地催化为5-甲基四氢叶酸。MTHFR基因最重要的多态位点为677位点, 位于第4外显子, 为一个胞嘧啶 (C) 突变为胸腺嘧啶 (T) , 导致一个丙氨酸被一个缬氨酸取代, 使酶活性及耐热性下降, 突变杂合子CT、突变纯合子TT, 其所编码的酶相比野生型CC所编码酶, 酶活性下降分别达35%, 70%。另一个较常见的多态位点为第7外显子的1 298位点, 为一个胞嘧啶 (C) 取代腺嘌呤 (A) , 导致一个丙氨基团取代一个谷氨酸基团, 导致酶活性降低, 但程度低于C677T位点变异, 且酶的热稳定不受影响, 因此目前关于1 298位点的研究较677位点偏少。
1 MTHFR基因与叶酸代谢的研究
叶酸在维持基因稳定及DNA低甲基化方面起重要作用, 亚甲基四氢叶酸还原酶可将5, 10-亚甲基四氢叶酸不可逆地催化为5-甲基四氢叶酸。 (1) 5, 10-亚甲基四氢叶酸为叶酸在细胞内的存在形式, 为脱氧尿苷酸 (d UMP) 合成脱氧胸苷酸 (d TMP) 的反应提供甲基, 而带d TMP为DNA合成的原料之一, 叶酸缺乏时, d UMP无法转化为d TMP, 过量积累而进入脱氧核糖核酸 (DNA) , 导致DNA双链解离, 染色体遭到破坏。 (2) MTHFR催化产物为5-甲基四氢叶酸, 是机体叶酸在胞外的主要存在形式, 是同型半胱氨酸 (Hcy) 合成蛋氨酸的甲基供体, 蛋氨酸可转化为S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) , 而SAM是人体大部分的生化反应包括DNA的甲基化的甲基供体[2,3]。因此, MTHFR基因对维持DNA的稳定性、调节DNA甲基化方面具有十分重要的作用。
2 MTHFR基因多态性与肺癌易感性的研究
肺癌的发生与吸烟、环境、饮食、人种等有关, 而肺癌的发生是一个多细胞、多阶段, 有众多基因参与的过程, 基因因素在肺癌发生发展过程中扮演着非常重要的角色。MTHFR基因多态性导致酶活力及叶酸代谢情况的改变, 从而影响DNA的修复合成及甲基化, DNA的甲基化程度可影响原癌基因活性, 最终在一定程度上影响肺癌的发生。MTHFR基因多态性与肺癌的关系引起了人们的高度重视。日本Heijmans等的研究纳入了860例受试者, 这些受试者的年龄分布于65岁~84岁, 随后对其进行了长达10年的随访研究后发现MTHFR 677TT基因型人群较其他基因型人群患结肠癌、肾癌、膀胱癌和前列腺癌的相对危险度为1.8倍 (95%CI为1.09~3.00) , 而患肺癌的相对危险度为1.15, 经统计学分析, 与CT、CC基因型之间的差异无统计学意义。台湾的Liu CS等、Jeng YL等及日本的Suzuki等的研究均提示MTHFR TT基因型可降低肺癌的发病风险。但是Siemianowicz等在波兰进行的研究得出了相反的结论, MTHFR677TT基因型与肺癌风险增高相关, 且不受肿瘤病理类型的影响, 中欧的Hung等及中国的Shen等也报道了相似的结果, 他们的实验结果均显示, MTHFR 677TT基因型增加了患肺癌的风险。2008年Mao等[4]的一项纳入了8项病例对照试验的Meta分析显示, MTHFR基因677位点、1 298位点基因多态性与肺癌的发病均无明显相关性, 而2009年Boccia等人的Meta分析显示, MTHFR 677T基因型与肺癌发病率具有相关性。2011年韩国的Cui等人报道了一项迄今为止样本规模最大的试验结果, 该试验纳入了3 938例诊断明确的肺癌患者及1 700例对照, 结果显示, 相对于MTHFR 677CC基因型, TT及CT基因型对肺癌的发病具有微弱的保护作用, 但这种差异无统计学意义。随后研究者们对结果进行了基于组织学的分层并进行统计学分析, 分析显示MTHFR 677CT基因型明显降低了肺鳞癌的发病风险, 将CT组、TT组合并后, 仍显示有降低肺鳞癌发病风险的作用, 该试验揭示了MTHFR基因多态性与肺癌组织学类型发病风险之间的相关性, 这是之前研究所欠缺的。2012年Xin-Heng Huo等[5]的一项Meta分析显示, MTHFR C677T基因多态性与肺癌发病无明显联系, 但进一步的组织学分层分析显示, MTHFR 677T基因缺失可能会增加NSCLC的发病风险。综上所述, 目前关于MTHFR基因多态性与肺癌发病的相关性研究结果尚不完全一致, 这可能受民族、饮食、环境、研究方法、样本量大小等的影响, 但这些研究提示MTHFR基因与肺癌发病之间可能存在密切关系, 应进一步深入研究, 以期为肺癌的预防及早诊早治提供新的启示。
3 MTHFR基因多态性与培美曲塞化疗疗效关系的研究
培美曲塞是一种多靶点抗叶酸制剂, 已被证实在晚期非小细胞肺癌的一线、二线治疗以及后续的维持治疗中具有非常良好的治疗效果[6,7]。培美曲塞直接抑制叶酸代谢过程中的3种关键酶的活性, 通过干扰叶酸代谢影响细胞的复制过程。MTHFR是叶酸代谢过程中的关键酶之一, 关于MTHFR基因与培美曲塞疗效的关系近年已展开较多研究。Smit等人在2009年的试验对240例患者进行了研究, 这些患者均为接受培美曲塞二线治疗的晚期NSCLC患者, 其有127例患者接受了MTHFR 677位点的基因检测, 研究显示TT基因型患者的中位无进展生存时间 (7.9个月, 95%CI:3.9个月~16个月) , CC和CT基因型基因型的中位无进展生存时间 (2.9个月, 95%CI:2.8个月~3.4个月) 经Log-rank检验差异有统计学意义 (P=0.03) , 提示MTHFR基因677位点TT基因型能延长接受培美曲塞NSCLC患者的无进展生存时间[8]。2013年WEN-JUAN LI[9]等报道了一项包含39例初治晚期肺腺癌患者的研究, 该研究对MTHFR基因多态性与培美曲塞联合顺铂化疗方案疗效之间的关系进行了分析, 共有37例患者完成了研究。结果显示MTHFR基因677位点CC、CT和TT基因型之间客观缓解率及PFS的差异均无统计学意义, MTHFR基因多态性可能与晚期肺腺癌培美曲塞化疗疗效无相关性。2013年Minkyu Jung等[10]检测了90例肺腺癌患者的4个基因, 共8个位点, 对这些基因的多态性与培美曲塞化疗疗效的关系进行了研究, 结果显示MTHFR基因677位点、1298位点基因多态性与培美曲塞化疗疗效及毒性作用均无相关性。以上研究规模较小, 结论尚不完全一致, 仍需对此进行更加深入和更大规模的研究, 目前尚不能将MTHFR基因作为培美曲塞疗效的预测因子。
4 结语
综上所述, 许多研究提示MTHFR基因多态性与肺癌发生、相关肿瘤药物疗效存在关系, 但关于这方面的研究目前仍处于起步阶段, 各项研究结论尚不完全一致。MTHFR基因作为影响叶酸代谢的重要基因, 相信随着对其研究的不断深入, 其与肺癌发病风险及化疗疗效的关系将逐渐明确, 为肺癌的预防、早期诊断及个体化治疗提供新的指导和方法。
参考文献
[1]Spiro SG, Silvestri GA.The treatment of advanced non-small cell lung cancer[J].Curr Opin Pulm Med, 2005, 11 (7) :287-291.
[2]Calvaresi E, Bryan JB.Vitamins, cognition, and aging:a review[J].J Getontol B Psychol Sci Soc Sci, 2001, 56 (6) :327-339.
[3]Zingg JM, Jones PA.Genetic and epigenetic aspects of DNA methylation on genome expression, evolution, mutation and carcinogenesis[J].Carcinogenesis, 1997, 18 (5) :869-882.
[4]Mao R, Fan Y, Jin Y, et al.Methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms and lung cancer:a meta-analysis[J].J Hum Genet, 2008, 53 (4) :340-348.
[5]Xin-Heng Hou, Yu-Min Huang, et al.Methylenetetrahydrofolate Reductase Gene C677T Polymorphism and Lung Cancer:an Updated Meta-analysis[J].Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 2012, 13 (5) :2025-2029.
[6]Hanna N, Shepherd FA, Fossella FV, et al.Randomized phaseⅢtrial of pemetrexed versus docetaxel in patients with non-small-cell lung cancer previously treated with chemotherapy[J].J Clin Oncol, 2004, 22 (9) :1589-1597.
[7]Scagliotti GV, Parikh P von Pawel J, et al.PhaseⅢstudycomparing cisplatin plus gemcitabine with cisplatin plus pemetrexed in chemotherapy-naive patients withadvanced-stage non-small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol, 2008, 26 (21) :3543-3551.
[8]Smit EF, Burgers SA, Biesma B, et al.Randomized phaseⅡand pharmacogenetic study of pemetrexed compared with pemetrexed plus carboplatin in pretreated patients with advanced non-small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol, 2009, 27 (12) :2038-2045.
[9]WEN JUAN LI, HUA JIANG, et al.Polymorphisms in thymidylate synthase and reduced folate carrier (SLC19A1) genes predict survival outcome in advanced non?small cell lung cancer patients treated with pemetrexed?based chemotherapy[J].Oncology Letters, 2013, 5:1165-1170.
[10]Minkyu Jung, Chul Ho Lee.Pharmacogenomic Assessment of Outcomes of Pemetrexed-Treated Patients with Adenocarcinoma of the Lung[J].Yonsei Med J, 2013, 54 (4) :854-864.
基因研究 篇2
人类基因组研究和基因工程对社会、伦理的影响
人类基因组序列的`揭示将给人类社会特别是对医学具有重要意义,但也可能产生负面影响.将基因工程应用到人类时存在着确立伦理标准和伦理主体的权限的困难,并且,人类基因的研究对人生观、价值观、命运等方面都具有潜在影响.
作 者：霍春涛 作者单位：中国海洋大学,社会科学部,山东,青岛,266003 刊 名：中国海洋大学学报(社会科学版) 英文刊名：JOURNAL OF OCEAN UNIVERSITY OF CHINA(SOCIAL SCIENCES) 年，卷(期)： “”(4) 分类号：B82-057 关键词：人类基因工程 人类基因组研究 伦理 社会基因研究 篇3
植物的性状分为质量性状和数量性状，两者在表现和遗传上是不同的。经典数量遗传学基于遗传学和统计学的一些假定，导出了一系列分析数量性状遗传的理论，大量实验数据证实在上述假定的基础上导出的基本公式与理论是有效的。然而，受上述假定的限制，有些研究难以深入，如多基因的基因效应被看成是微效和相等的。盖钧镒等认为大多数量性状多基因间的效应并不相等，也存在主效和微效之分，并依此提出了数量性状的泛主基因+多基因遗传理论；同时结合相应的统计学方法，建立了植物数量性状遗传体系。该遗传体系既可对单个分离世代(如F2、DH、RIL群體等)进行简单分离分析，还可结合不分离群体(如P1、P2和F1群体)进行多世代联合分析。该方法适用于育种工作者利用杂种分离世代的数据对育种性状的遗传组成做出初步判断，制定相应的育种策略，也可用于校验QTL定位所揭示的性状遗传组成。目前，该遗传理论已经将遗传模型拓展至4对主基因+多基因的分离分析方法，并在大豆、水稻、小麦、玉米、棉花以及西红柿、黄瓜等作物中得到了广泛的应用。本文则侧重探讨该遗传理论在小麦抗病、品质及产量相关性状研究中的应用，旨在分析小麦相关性状的遗传组成，为育种提供有益的参考。
基因研究 篇4
植物转基因操作中,通常用标记基因将转化细胞筛选出来。在选择压力下,非转化细胞不具备抗性而死亡,因此在转基因研究中,抗性标记基因对于从大量非转化细胞中选择转化细胞至关重要。目前,转基因研究中普遍应用的抗性标记基因是抗生素和除草剂抗性基因。这些抗性标记基因在植物转化过程中是很有利的选择工具。然而,一旦转化完成,这些抗性基因便失去了作用,其存在还可能带来生物安全性问题[1]。另外,由于选择标记基因数量有限,这些基因的存在也给转基因植物的再次转化带来了不便[2]。
对转基因植物中标记基因的安全性评价主要集中在环境和食品安全性2个方面,其中对环境危害评价已发展到从分子、个体、种群、群落到生态系统的水平。标记基因的环境安全性主要包括:转基因植物的残枝落叶转移到其他土壤微生物中从而导致外源抗性基因的逃逸,可能造成生态失衡;很多情况下标记基因的沉默可能引起邻近目的基因的沉默。转基因产品中的抗生素抗性基因,有可能通过食物链,最终给人类的安全带来潜在的威胁[3]。在解决转基因植物可能存在的安全性问题中,研究者研究了共转化法、转座子法、位点特异性重组系统、同源重组[4]、无选择标记基因的转化系统[5]及安全标记基因的转化系统等方法。现对提高转基因植物标记基因安全性的方法作一综述。
1 共转化法
共转化的原理是将目的基因和标记基因单独组装到2个质粒上,或1个质粒的2个不同T-DNA区段上,然后同时转化。由于T-DNA的插入是随机的,二者可同时插入同一细胞的不同染色体上,经过后代的遗传重组,使目的基因与标记基因分离,从而获得仅带有目的基因的转基因植株[6](图1)。
Komari et al[7]构建了包含2个T-DNA的超二元质粒载体,将gus(β-glucuronidase)和hpt(hygromycin phosphotran sferase)通过共转化方法转入烟草和水稻,经过后代分离,50%以上的株系为无标记基因的gus转基因植株。Miller e al[8]通过多个菌株共转化玉米,共转化率为11.7%;而通过包含双T-DNA超二元质粒载体进行转化,共转化率高达93.4%。陈松彪等[9]采用体外重组技术构建一个双T-DNA载体系统,41.7%的后代为无选择标记的转基因烟草植株。为了提高共转化效率,研究者们对共转化方法进行了改进。叶兴国等[10]通过几个中间质粒构建了含有3段T-DNA的双元表达载体p NB35SVIP1,高频率获得无选择标记转基因大豆植株。
共转化系统去除转基因植物中选择标记为最早研究的技术,因其方法简单,多数无选择标记转基因作物均通过共转化系统所获得。目前,国内外已成功地运用共转化法获得了烟草、水稻、玉米和大豆等[7,8,9,10]作物的无选择标记转基因植株。但是共转化需要有性杂交过程将标记基因和目标基因分离,限制了此种方法在无性繁殖植物中的应用。此外,共转化耗时长,工作量大且转化效率较低,极大地限制了共转化系统的应用。
2 转座子法
转座子是存在于染色体DNA上的一段可自我复制和移动的DNA序列。把标记基因或目的基因和转座子相连,在转座子移动的过程中,标记基因与目的基因分离,子代植株通过遗传分离,获得仅带目的基因的转基因植株。因此,转座子系统可用于培育无选择标记的转基因植株。目前,已经报道的用于转基因植物标记基因删除的转座系统来源于玉米的Ac/Ds系统。
Goldsbrough et al[11]以nptⅡ(neomycin phosphotransferaseⅡ)为选择标记基因,以gus为报告基因转化番茄,在转基因植株后代中发现nptⅡ和Ds-gus-Ds结构的重组分离现象,获得了只含gus基因而无选择标记基因nptⅡ的转基因植株。Ebinuma et al[12]将ipt(isopentenyltransferase)基因插入Ac基因中,然后与nptⅡ和gus基因串联构建成MAT(MultiAuto-Transformation)表达载体,用其转化烟草和白杨,在转基因植株后代中发现无标记基因的转基因植株。
转座子具有跳跃性和可删除性,不需要再次转化或杂交引入重组酶。但是该途径也存在一些问题,如效率较低、需要有性繁殖分离途径、周期较长等,仅适用于有性繁殖以及生活周期短的植物,限制了其在标记基因剔除中的应用。
3 位点特异重组系统
位点特异性重组系统包括2个基本元件,即重组酶基因和特异性识别位点。把标记基因放在2个识别位点之间,在重组酶的作用下,标记基因可以被切除[13](图2)。
目前,在植物中已发现的有效的位点特异性重组系统有来源于噬菌体Pl的Cre/lox P(Cre:causes recombination;Lox P:locus of crossing X-over in P1)系统、接合酵母SR质粒的R/RS(R:recombinatinase;RS:recombination site)系统、啤酒酵母的2μm质粒FLP/FRT(FLP:flipping DNA;FRT:FLP recombination target)系统和噬菌体Mu的Gin/Gix(Gin:invertion of the G loop;Gix:Gin invertion complex sites)系统,其中以Cre/lox P系统的应用最为广泛。
3.1 Cre/lox P系统
Cre/lox P系统去除筛选标记的原理是将标记基因构建于lox系统的2个34 bp特异识别序列之间,将目的基因构建于lox位点之外,筛选到转化子后再诱导Cre酶表达,从而切除选择标记基因。
Dale et al[14]首次利用此方法转化烟草,将一个嵌合的荧光素酶(Luc)基因作为报告基因插入到含有选择标记基因hpt的载体中,Cre重组酶的表达催化2个同向lox位点间的重组反应,使hpt基因被切除,切除效率达到90.9%。一些研究者采用诱导型启动子诱导Cre重组酶的表达,在适当的时候对转基因植株进行化学诱导或热激处理来删除标记基因。此系统通过一次转化即可获得无选择标记的转基因植株。Zuo et al[15]构建了一个化学诱导型的载体转化拟南芥,以受雌二醇诱导的融合转录激活因子XVE控制Cre基因的表达,从而剔除lox序列之间的选择标记基因,获得了高频率的无选择标记的转基因拟南芥。Luo et al[16]利用同向融合lox P与FRT 2个特异识别位点构建识别位点lox P-FRT,获得一个全新的基因删除系统,大大提高了外源基因的删除效率。宋洪元等[17]利用Cre/lox定位重组系统在烟草中成功实现了与gfp(green fluorescent protein)基因连锁的bar(bialaphos resistance)基因的高效删除,并通过自交分离的办法获得了含gfp的无选择标记转基因烟草,表明利用Cre/lox系统获得烟草无选择标记的转基因植物是稳定可行的。Zhang et al[18]在位点特异重组系统Cre/lox中引入雌二醇诱导表达系统,成功获得了无选择标记基因的抗逆番茄。Khattri et al[19]利用Cre/lox系统转化水稻,由大豆热激启动子控制Cre重组酶基因的表达,获得了无选择标记基因的转基因水稻。由于化学诱导和热激诱导都需要对转基因植株进行处理,这可能对转基因植株的生长产生不利的影响。利用组织特异性启动子调控表达Cre基因来删除标记基因,不需要任何诱导剂即可完成标记基因的组织特异性删除。Kopertekh et al[20]将2个载体p LH-nap-vst-lx-35S-bar-lx和p LH-gusnap-cre共转化烟草。Cre重组酶基因由种子特异性启动子napin控制,在种子中特异表达并删除bar基因。结果表明T1代种子中bar基因已被高效删除。通过反相高效液相色谱证明了此系统不会对靶基因的表达产生影响。
3.2 FLP/FRT系统
FLP/FRT系统中FLP重组酶可催化位于同一DNA分子上2个同向位点FRT间DNA片段的切除,可用于选择标记基因的删除。目前,已成功获得无选择标记基因的烟草、玉米、水稻等[21,22,23,24,25]作物。
Woo et al[24]采用氧化胁迫诱导的过氧化物酶(POD)启动子控制重组酶FLP基因的表达,将转基因烟草用过氧化氢处理,13%~41%的再生植株的标记基因被删除。Li et al[25]将表达FLP重组酶基因的转基因玉米与包含靶基因At NHX1(提高植物耐盐性)和位于FRT 2个识别位点之间的选择标记基因als(acetolactate synthase)的转基因玉米进行杂交,在F1代植株中,40.7%的als基因被删除。进一步盐胁迫试验表明,在高盐环境下,无选择标记的At NHX1转基因玉米的产量高于野生型。
3.3 Gin/gix系统
Maeser et al[26]发现Gin/gix系统,重组酶Gin表达时可催化同一DNA分子上2个特异位点gix间DNA片段的切除,但因Gin基因影响植物的再生,该系统在植物中成功应用尚未见报道。
3.4 R/RS系统
R/RS系统中重组酶R能够专一地识别其特有的识别序列RS,并将2个紧邻的RS之间的DNA片段切除。
Onouchi et al[27]将含有RS-gus-RS的转基因拟南芥与由35S启动子控制的R基因的转基因拟南芥进行有性杂交,借助杂合状态下R基因的表达,删除了转RS-gus-RS基因拟南芥中的gus基因。Sugita et al[28]利用R/RS系统建立了GST-MAT载体,将重组酶R与化学诱导表达的启动子GST-Ⅱ-27(glutathione-S-transferase,谷胱甘肽转移酶)融合,这样在转化当代就获得了无选择标记的转基因烟草。Saelim et al[29]利用该系统对木薯进行转化,表型正常的转化植株中有88%~96%为无选择标记转基因木薯。Khan et al[30]利用该系统获得了无ipt选择标记基因的转基因番茄。位点特异性重组是目前无选择标记转基因植物研究中广泛应用的方法。尤其是后来发展起来的化学诱导系统,通过化学诱导表达的启动子驱动重组酶基因表达,从而严格控制标记基因删除。此外,此技术在标记基因删除过程中不需要二次转化,适合于无性繁殖的植物。同时它也存在弊端,利用位点特异重组酶切除标记基因时,往往在重组位点留下一个识别序列,从而影响同一位点特异性重组系统在受体植物中的再次应用。另外,经过几次去除标记基因后,基因组中分布着多拷贝的识别序列,可能会导致目的基因沉默。
4 同源重组
同源重组发生在DNA的同源序列之间,重组以后会导致位于同源序列之间的基因序列的切除。把标记基因放在2个DNA同源序列之间,发生同源重组后,标记基因可以被切除,即可获得无标记基因的转基因植株。
Fischer et al[31]利用同源重组的原理,在标记基因aad A(aminoglycoside-3′-adenyltransferase)两端加上正向重复序列,转入烟草叶绿体基因组,在有选择压力条件下得到转化植株,当去掉选择压力后发现aad A基因由于同源重组而被去除。噬菌体的352 bp的附属P区域att P(attachment site phage)是3个特异蛋白的结合位点,在烟草中,att P区不需要特异蛋白辅助就能切除位于2段att P重复序列之间的DNA序列。Zubko et al[32]利用attp同源序列介导的染色体内同源重组剔除了选择标记基因,得到了无标记基因的转基因烟草。
同源重组对序列特异性没有要求,严格地配对即可,其机理与位点特异性重组相同,但无需辅助蛋白参与,因而也不会对植物基因组造成可能的伤害。但是由于重组频率低,限制了其广泛应用。目前,此技术已成功应用于微生物和动物,但在植物中的应用尚处于探索阶段。
5 无选择标记基因的转化系统
在植物遗传转化过程中,可以不使用选择标记基因就能获得含目的基因的转基因植株,如马铃薯[33]、烟草[34]等。L et al[35]通过根癌农杆菌介导转化烟草,在不使用选择压力的情况下获得了无选择标记的转基因烟草,转化率为4%。Madhurima et al[36]报道了一个不使用任何选择标记基因的方法转化花生。他们利用根癌农杆菌介导转化花生的子叶外植体,转化率高达75%。无选择标记基因的转化系统简单、高效,为培育无选择标记转基因植株提供了新的方法。但是此方法也存在弊端,由于无法对转化植株的生长进行选择性地控制,研究者们必须从大量的再生植株中检测出转基因植株,这样不仅花费高而且还很耗时[37]。
6 安全标记基因的转化系统
安全标记基因是对生态环境和人体健康相对安全的标记基因。使用这类基因作选择标记的转化选择系统不是将非转化细胞杀死,而是使转化细胞处于某个有利的代谢或发育条件下,从而筛选出转化植株[38]。
近年来发现的生物安全标记基因主要有木糖异构酶基因(xylose isomerase,xyl A)、6-磷酸甘露糖异构酶基因(6-phosphomannose isomerase,pmi)、异戊烯基转移酶基因(isopentenyl transferase,ipt)、吲哚-3-乙酰胺水解酶基因(indole-3-acetamide hydrolyse,iaa H)、甜菜碱醛脱氢酶基因(betainealdehydedehydrogenase,BADH)、β-葡萄糖醛酸苷酶基因(β-glucuronidase,gus)、绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,gfp)等。目前,生物安全标记基因已成功用于水稻、玉米、小麦、大麦等[39,40,41,42]的遗传转化。
安全标记基因本身及表达产物一般没有毒性,选择剂也无毒副作用,转化效率高,因此安全标记基因的筛选系统在提高转基因植物安全性研究中发挥了重大作用。然而,标记基因的存在不利于多重转化,无法将多个优良性状累积在同一转化植株内;而标记基因删除技术为此提供了一个很好的解决方案,能够彻底地删除转基因植物中的标记基因,从根本上解决转基因植物安全性问题。
7 展望
基因研究 篇5
节肢动物线粒体基因组研究进展与基因顺序分析
在总结了68种节肢动物线粒体基因组的测序种类、基因组组成、结构及基因排序情况的.基础上,特别对节肢动物线粒体基因组基因排列顺序数据进行了详细的分析.线粒体基因组基因排列顺序数据显示六足动物与甲壳动物之间相似,螯肢动物与多足动物相似,这个结果和以前Boore对节肢动物线粒体基因组顺序分析结果不同, 却和核rRNA数据的分析结果一致.
作 者：胡婧 刘念 黄原 HU Jing LIU Nian HUANG Yuan 作者单位：陕西师范大学生命科学学院,陕西,西安,710062 刊 名：昆虫分类学报 ISTIC PKU英文刊名：ENTOMOTAXONOMIA 年，卷(期)： 28(2) 分类号：Q959.22 关键词：节肢动物 线粒体基因组 基因顺序 系统发育不同种属动物MHC基因研究概况 篇6
【摘要】 主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)是由染色体上一系列紧密连锁的基因位点组成的高度多态性基因群,在脊椎动物体内普遍存在。其编码产物为免疫球蛋白样受体。MHC与免疫功能密切相关,能够控制同种移植排斥反应、应答免疫以及调节免疫等。本文依据进化过程,概述了不同种属动物(软骨鱼类、真骨鱼类、两栖类、家禽、常见哺乳动物及野生动物等)的MHC基因研究进展,以及MHC基因类型与抗病性和繁殖性能之间的关系等,同时文章还综述了MHC基因研究的意义与实际应用。
【关键词】 MHC基因 遗传特性 研究意义
基金项目:教育部第41批博士后基金(资助编号20070410999);吉林农业大学校内博士启动基金
MHC基因编码主要组织相容性抗原,并且控制同种移植排斥反应、免疫应答和免疫调节等。MHC的基因产物称为MHC抗原或MHC分子,是由MHC编码的一类细胞表面转膜蛋白,能够对各种外源抗原进行识别,因此,不同个体抗寄生虫能力以及对自身免疫疾病易感性的差异均受MHC遗传背景的影响。MHC基因一般具有高度的多态性,其多态性水平的降低可能导致种群内个体对突发性传染性病原体的抵抗力减弱,种群抗病能力单一及生存力和生产力下降等。许多物种的遗传多样性水平、进化历史和种群动态,以及种群遗传结构等信息,可以通过对MHC的遗传变异分析得到,因此有关动物MHC的研究正逐步地引起越来越多的动物学家的兴趣,成为目前研究的热点。
1.MHC分子的遗传特性
各种动物MHC之间具有一定的同源性,如囊翼蝠与大熊猫的同源性为91%,这表明该遗传结构在群体演化和进化中可能有相似作用。MHC分子还具有单体型遗传特点,在遗传过程中MHC单体型作为一个完整的遗传单位由亲代传给子代。其中基因之间有一定的交换和重组。此外,MHC分子还具有广泛的多态性和特异性,主要是由于复等位基因、共显性、基因突变和选择压力所致,其中复等位基因是直接的遗传因素。MHC复合体各等位基因均有各自的基因频率。MHC的基因座是紧密连锁的,但其各基因并非完全随机的组成单体型,某些基因比其他基因能更多或更少地连锁在一起,从而出现连锁不平衡。它与某些疾病的易感性有关(AnderssonL,1986b)。
2.MHC的研究概况
根据MHC基因编码产物的结构、表达方式、组织分布与功能的不同,将其分为Ⅰ类基因、Ⅱ类基因和Ⅲ类基因,但各种动物的命名各不相同。自1990年,从一些冷血动物中得到了MHC基因,以后又依次从软骨鱼类,真骨鱼类,两栖类中分离出Ⅰ、Ⅱ类基因。有关MHC的研究在高等动物中也非常活跃。一是出于经济目的,期望通过对畜禽MHC的改造提高其生存力和生产力;二是针对人类器官移植中供体的缺乏,期望对动物MHC的人源化使动物器官能够移植给人类;三是源于对野生动物尤其是濒危动物的保护,以维持生态平衡;另外,随着研究的深入,人类有可能真正了解MHC的起源和进化,并为研究其在生物医学中的应用起到促进作用。
2.1软骨鱼类MHC
软骨鱼类MHC的研究以鲨鱼(sharks)为代表。鲨鱼中有经典和非经典Ⅰ类基因以及RING3、LPM2、HSP70、TAP1、TAP2、Bf等基因。鲨鱼对同种移植物只有慢性排斥反应,而没有像其他真骨鱼及高等脊椎动物那样的急性排斥反应。鲨鱼MHCⅠ类分子有许多共性,而且Ⅰ类基因的CDNA显示多态性,变异位点多位于肽结合区。
2.2真骨鱼类MHC
以斑马鱼(zebrafish)为代表的真骨鱼的MHC与人类HLA主要有以下几点不同:①Ⅰ类A基因和Ⅱ类A、B基因不在同一个连锁群;②Ⅱ类基因能在两个或以上的不相连位点编码;③在19号连锁群中有两个紧密相关的Ⅰ类A基因与LMP7、LMP2、TAP2、RING3、RXRB相关;④没有Ⅲ类基因与MHC其他基因相关的证据。
2.3两栖类MHC
以爪蟾为代表,只含有一个经典Ⅰ类基因。而且肽结合区与胞膜区不连接。其他基因(如Ⅱ、Ⅲ类基因、TAP、LMP等)也存在。但基因定位研究表明,三类基因的排列顺序从中心粒开始依次是Ⅱ、Ⅰ、Ⅲ,而不是人类那样Ⅱ、Ⅲ、Ⅰ顺序(Flajnik MF et al,1999)。
2.4家禽的MHC
根据MHC分子编码蛋白的类型,把家禽MHC分子分为三类:B-F、B-L、B-G。其中的B-F和B-L分别相当于哺乳动物的Ⅰ类和Ⅱ类基因,而B-G是禽类特有的基因位点,也称为Ⅳ类(ClassⅣ)。随着生物技术的发展,鸡的MHC的B-F、B-L、B-G分别被克隆,其中的B-F、B-L部分已被测序。Briles等(1950)首次发现鸡的血细胞表面抗原是由MHC(B复合物)基因编码。Guillemot(1988)首次对鸡MHC I类分子的cDNA进行了克隆。
2.5常见哺乳类MHC
哺乳类动物MHC的组成基本上与人类HLA相似,但不同的动物又稍有不同。在人医研究中,HLA分型已经应用于器官移植和骨髓移植,灵长类MHC基因的研究资料非常丰富,在这里暂不做详尽论述。
2.5.1牛的MHC(BoLA)
牛的MHC位于第23号染色体上(Fries R et al,1986)。1978年Amorena等首次对牛的MHC基因进行了报道,并将其命名为BoLA。目前在classⅠ基因区域只发现含有一个编码α链的BoLA-A基因位点。它与HLAⅠ类基因的大小相似,其功能是编码Ⅰ类抗原的α链。ClassⅡ类甚因是由编码Ⅱ类抗原α链的DA基因和编码β链的DB基因组成。DA基因包括DRA、DQA、DNA、DMA和DYA等。DR基因含有DRA、DRB1、DRB2、DRB3等四个基因座位,其中DRA是高度表达的基因座位,DRB1是假基因,DRB2的表达量非常低或者根本不表达,DRB3是个高效表达的基因座位。DQ基因为可复制基因,至少含有DQA1、DQA2、DQB1、和DQB2等四个基因座位,均为高效表达。DB基因包括DYA、DYB、DNA、DOB、DMA、DMB、DIB、TAP1、LMP2和LMP7等。
2.5.2绵羊的MHC(OLA)
绵羊的OLA位于20号染色体上(Anills M et al,1996)。绵羊MHC Class Ⅱ基因区域与人的相似,包括DQ和DR两个亚区,其中的DRB和DQB两个基因位点所编码的MHC抗原在其免疫系统中发挥着最主要的作用;其第二外显子编码抗原的功能区(抗原结合区)具有丰富的多态性,它组成Ⅱ类抗原分子功能最重要的部分。现在已经知道了14个绵羊的MHC classⅡ位点,其中DRB1,DRA1,DQA1,DQB1,DQA2和DQB2六个是可以转录的。
2.5.3鹿的MHC
鹿科动物MHC基因的结构,也分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类基因,其中Ⅱ类基因多态性最为丰富,每个亚区包括DR、DQ等基因座,每个基因有多个不同等位基因通过对马鹿MHC的DRB基因的克隆及其第二外显子的测序,发现实验动物中每头鹿有1—4个DRB序列,第二外显子区域的α螺旋和β片层处还常出现变异,这些可以作为进化历史的标志。
2.6野生动物的MHC
近年来对扬子鳄、大熊猫、云豹、豹、东北虎等濒危野生动物的MHC的研究有了新的成果。而作为2003年中国和亚洲地区爆发的SARS病毒引起的传染病的宿主——蝙蝠,其MHC也正在逐步进入动物学家的研究视野。
史燕等利用一对简并引物对扬子鳄MHCⅡ类B基因第2外元的部分片段进行扩增,发现扬子鳄MHCⅡ类B基因第2外元有较高的多态性,有利于扬子鳄饲养种群的遗传保护。
张婷等研究了大熊猫DQB和DRA基因。将大熊猫的8种DRA基因序列与猫和狗的DRA基因的同源序列进行比较,结果发现,与狗相比,大熊猫与猫的序列亲缘关系更近。
王倩等使用一对简并引物扩增了云豹(Necfelis nebulosa)、豹(Panthera pardus)和东北虎(Panthera tigris altaica)等3种猫科动物MHCⅡDRB基因第二外显子的片段,结果显示,豹和东北虎的亲缘关系较近,而两者与云豹的亲缘关系较远。
马跃等(2006)分析了,感染禽流感病毒和未感染禽流感病毒的虎的MHCⅠ类基因的多态性及其与感染禽流感病毒易感性的关系,表明MHCⅠ类基因遗传多样性低,对病毒性疾病比较敏感,而低频等位基因在繁殖过程中容易丢失,进而可能加剧病毒性疾病的敏感性。由此可见,在遗传管理中特别要重视低频等位基因的保存。
蝙蝠MHC基因的研究目前还不是特别深入。Mayer等(2007)首次在翼手目中研究MHC基因,其研究参照人类的MHC基因(HLA)设计引物,对囊翼蝠(sac-winged bat Saccopteryx bilineata)MHCⅡ类基因DRB1第二外显子进行PCR扩增克隆,85个囊翼蝠个体检测到11个等位基因,但该研究未涉及蝙蝠MHC基因与疾病的关系,蝙蝠MHC基因结构特点、蝙蝠种群MHC基因多态性与疾病的关系还有待进一步研究。
3.MHC与疾病病因、免疫的相关性及其研究意义
MHC的研究具有非常重要的意义。一方面,它与畜禽疾病的抗病性和易感性以及生产性能等密切相关,可以通过遗传标记辅助选择进行抗病育种,以培育出高产、抗病力强的畜禽品种。另一方面,通过对MHC基因的测序工作,找到相应疾病的易感基因或抵抗基因,从而可能预防和治疗这些自身免疫性疾病。
对于野生动物尤其是濒危动物而言,将其作为一种遗传标记用于种群遗传结构和变异性的分析,进行保护遗传学研究,已成为近年来研究的热点和新的增长点。MHC的变异可反映基因组水平的变异,通过对MHC基因的变异进行分析,可有效地评估种群遗传多样性水平。同时,MHC的变异性水平被认为是生物体识别外来寄生物(细菌、病毒、原生动物及其他寄生虫和噬菌体)能力的重要依据,这样可以为病毒传播机制的研究提供宿主特异性方面的直接证据。同时还可以为野生动物传染病传播预警提供科学依据,指导野生动物传染病的防治和免疫。
【参考文献】
[1]AnderssonL(1986b)Genomic hybridization of bovine class ⅡMHC genes:2. Extensive polymorphisms of DQA and DQB genes. Animal Genetis, 17,95-112.
[2]Anills M,Francino O(1996) A PCR - RFLP tyimal method for the Caprine MHC class I DRB gene. Veterinary Immunology and Immunopathology, 55,255-260.
[3]Briles W E (1950)On multiple alleles effecting cellular antigens in the chicken. Genetics, 35,633-652.
[4]Flajnik MF,Ohta Y, Yamada CN (1999) Immunol Rev, 167,59.
[5]Fries R,Hediger R,Stranzinger G(1986) Tentati-ve chromosomal localization of bovinemajorhiatocompatibility complex by in situ hybridization.Anim Genet, 17(4),287-294.
[6]Guillemot F, Billault A ,Pourquie O (1988) the class II beta genes are closely linked to the class I genes and the nucleolar organizer. A molecular map of the chicken major histocompatibility complex. Embo J, 7,2775-2785.
[7]Lewin H A, Russell GC, Glass EJ(1999)Comparative organization And functionof the major histocompatibility complex of domesticated cattle. Immunology Review, 167,145-158.
[8]Ma Y(马跃) ,Zhang W(张伟) ,Xu YC(徐艳春)(2006)Research on relationship betweenMHC gene polymorphism and susceptibility of influenza in panthera tigris. Northeast Forestry University
[9]Mayer F,Brunner A(2007) Non-neutral evolution of the major histocompatibility complex class II gene DRB1 in the sacwinged bat Saccopteryx bilineata.Hereditics 99(3),257-264.
[10]Swarbrick P A , Schwaiger F W, Epplen J T (1995) Cloning and sequencing of expressed DRB genes of the red deer ( Cervus elaphus)Mhc.Immunogenetics , 42(1) ,129.
[11]Swarbrick P A,Crawford A M (1997) The red deer ( Cervus elaphus)contains two expressed major histocompatibility complex class Ⅱ DQB genes. Anim Genet,28 (1),49-51.
[12]Takahata N, Nei M(1990) Allelic genealogy under overdominant and frequency-depe- ndent selection and polymorphism of major histocompatibility complex loci.Genetics,124,967-978.
刘乃芝 (1982-),女,硕士研究生。
基因研究 篇7
1 材料与方法
1.1 动物分组及ARDS模型建立
健康雄性纯系SD大鼠(由山东绿叶制药有限公司提供,体重200 g~300 g)8只,随机分为2组,每组4只。ARDS组:大鼠舌下静脉注射油酸0.2m L/kg体重,观察呼吸变化及全身情况,确定具有ARDS表征后,于注射油酸4 h后处死动物,取肺组织,液氮速冻,然后置于-80℃冰箱备用。正常对照组:用生理盐水代替油酸静脉注射,余同ARDS组。
1.2 RNA提取
Trizol(Invitrogen,Gaithersburg,MD,USA)一步法分别抽提每只大鼠肺组织总RNA,通过异丙醇沉淀法浓缩RNA,并进一步采用Nucleo Spin RNA clean-up试剂盒(MACHEREY-NAGEL,Germany)对总RNA进行过柱纯化,最后用分光光度计定量,甲醛变性胶电泳质检。
1.3 标记探针的制备
以RNA为模板,按照博奥生物公司晶芯c RNA扩增标记试剂盒提供的步骤,先合成双链c DNA,然后再以c DNA为模板,用T7 Enzyme Mix合成c D-NA。用Random Primer反转录成c DNA。然后,用该引物进行KLENOW酶标记。将对照组和ARDS组的c DNA探针分别用Cy5-d CTP、Cy3-d CTP(GE Healthcare Cat。No.PA55021/PA53021)标记,标记产物用PCR Nucleo Spin Extract II Kit(MN)纯化,抽干。
1.4 基因芯片杂交
所用芯片为博奥生物芯片有限公司的27K Rat Genome Array芯片,共有约26 962约70mer长度的Oligo DNA,来自于Operon公司的oligo库:Rat Genome Version 3.0.5,涵盖27 044转录本,代表22 012个基因。将对照组和ARDS组的c DNA探针两两随机组合,与同一张芯片杂交,共4张芯片。
标记的DNA探针溶于80μL杂交液中(3×SSC,0.2%SDS,5×Denhart’s,25%甲酰胺),于42℃杂交过夜。杂交结束后,洗脱芯片,甩干后即可用于扫描。
1.5 信号扫描和分析
芯片结果采用Lux Scan 10KA双通道激光扫描仪(Capital Bio A公司)进行扫描,采用Lux Scan3.0图像分析软件对芯片图像进行分析,标准化处理,比值为实验组(ARDS组)与对照组相比,即ratio=Cy3/Cy5。当ratio≥1.5时定为基因表达上调,ratio≤0.67时定为基因表达下调。用Sam3.0进行统计分析,用博奥生物分子功能注释系统(CB-MAS)V4.0进行功能分析。
1.6 荧光定量RT-PCR验证
随机选取3个在2种组织中差异表达的基因,根据Gen Bank序列号获取全长c DNA序列,由上海康成生物技术有限公司设计并合成上下游引物。基因名称和上、下游引物序列以及退火温度和产物长度见表1。SYBRGreen荧光实时定量RT-PCR反应在ABIPRISM 7000序列检测仪上进行。各样品的目的基因和管家基因分别进行Real-time PCR反应。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线,各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度,即为此样品受检基因校正后的相对含量。
2 结果
2.1 样本RNA抽提结果
通过动物表征和肺组织切片病理观察,确定油酸处理组大鼠已经发生ARDS。总RNA抽提8个样品的A260/280值均在1.94~2.01之间,总量均在102.75~323.10μg之间。电泳结果见图1。由图可见,RNA电泳条带清晰,28S比18S r RNA条带亮度接近1∶1,说明纯度高,未降解,且总量够用,可以满足后续实验需要。
2.2 芯片检测结果
在芯片杂交伪色图中,正常对照大鼠肺组织的c DNA探针以Cy5荧光素(呈红色)标记,而ARDS大鼠肺组织的c DNA探针以Cy3荧光素(呈绿色)标记。对于某一点的信号来讲,如果cy3信号较强,该点多显绿色;如果Cy5信号较强,该点多显红色;如果强度相似,即显黄色,这种红绿荧光素信号的差异,即反映该点所代表的基因在两种组织中表达水平上的差异。
利用基因芯片27K Rat Genome Array对正常大鼠和ARDS组肺组织c DNA进行检测发现,在总共27044个转录本中,4张芯片平均检测出11 229个基因,占总数的41.5%。用Sam3.0进行统计分析,结果显示,在ARDS大鼠肺组织中,表达上调1.5倍以上的基因有73个,下调1.5倍以上的基因有298个。其中,有功能的已知基因158个,未知基因213个。代谢相关基因上调的有1个,下调的有34个;免疫相关基因上调的有3个,下调的有7个;信号传导相关基因上调的有2个,下调的有9个;神经相关的基因上调的有3个,下调的有3个。带下划线的基因为重复出现的基因,即与多种生理过程相关。具体见表2。
在ARDS大鼠肺组织差异表达的基因中,随机选取3个基因Lif、Stat4、Rhoa做荧光定量RT-PCR检测。发现在ARDS大鼠肺组织中,虽然上述3个基因在两种组织中的变化倍数不完全相同,但变化方向与基因芯片检测结果一致,证明基因芯片结果准确可靠(表3)。
3 讨论
在本实验的表达谱芯片检测结果中,我们发现了许多ARDS差异表达基因,其中有158个已知基因表达变化在1.5倍以上。这些基因与代谢、免疫作用、信号转导、神经生物学等过程有关,在此只讨论一些我们感兴趣的基因及其有关的生物学过程。
大鼠ARDS发生后,引起代谢相关基因的表达变化(见表1),共有35个相关基因差异表达。其中,下调34个,上调1个,这可能是由于在ARDS情况下,急性炎症导致呼吸膜损伤、肺部细胞严重缺氧,从而处于低代谢状态,糖、蛋白质、脂类合成减少,能量代谢如糖酵解、三羧酸循环、脂肪酸的氧化等过程降低。比如,基因Aldh9a1、Aldh2、Aldh3a2(三者都为醛脱氢酶)Adh4、Acaa2、Acat1等,均为脂肪酸代谢、糖酵解以及其他一些代谢过程中必需的酶,这些基因表达的降低,说明与之相关的生物过程也随之减低。
ARDS情况下,免疫相关基因差异表达的有10个。其中,上调的3个,下调的有7个。这些基因涉及到的免疫过程有9个,说明在肺严重损伤的情况下,既能激发一些免疫反应,同时又能使一些免疫过程受到抑制。Serpine1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)为丝氨酸蛋白酶抑制剂,通过调节一系列丝氨酸酶和半胱氨酸酶的活性,参与了许多基本的生命活动,例如纤溶、炎症反应、细胞迁移、细胞分化、凋亡等。有研究表明,在急性肺损伤或慢性肺间质病中,serpine1可以通过抑制纤溶酶的活性,进一步激活纤维蛋白原成为纤维蛋白凝块,引起机体弥漫性微血管栓塞、弥散性血管内凝血(DIC),不但能够增强血管通透性、促进炎症介质的表达和释放、改变多种细胞的迁移和增殖,还使表面活性物质失活,并为成纤维细胞提供迁移和产生胶原的环境[5]。在本实验中,Serpine1基因表达上调6.07倍,因此推测该基因的高表达可能与ARDS形成有关。
本实验检测到与信号转导有关的基因11个,其中上调的2个,下调的9个,涉及的信号通路11个。Lif(leukemia inhibitory factor)在细胞因子网络中是一个多功能的细胞因子,通过激活JAK/STAT(Janus kinase/Signal transducer and transcription activeator signal pathway)和MAPK(Mitogen activated protein kinase signal pathway)通路起作用。有研究证实,在ARDS、肺炎及正常人血清对照中,该基因仅在ARDS中高表达,因此有可能成为ARDS的指示基因[6]。另有实验证实,在ARDS、健康人、有ARDS潜在危险患者的肺灌洗液中,能够检测出Lif基因的表达,但只在10例(共12例)ARDS组中检测到该基因的高表达[7]。Lif基因在本实验ARDS大鼠中表达上调2.35倍,与前人研究结果一致,说明Lif基因在ARDS发生过程中可能起到重要作用。
另外,在JAK/STAT信号通路中,STAT1和STAT4基因表达均下调,ratio值均为0.51,降低近两倍。STAT1具有促炎、促调亡作用,在炎症组织中表达增强。DIEU研究发现,在博莱霉素(BLM)所致大鼠肺纤维化模型中,肺泡巨噬细胞(AM)内存在STAT1的异常活化,异常活化的STAT1可能参与了BLM所致大鼠肺纤维化时肺泡炎症的形成[8]。STAT4在多种细胞和免疫应答多个时相中发挥作用,特别在免疫应答的早期,STAT4可促进固有免疫的进程,促使NK细胞和APC(巨噬细胞或DC)产生IFN2γ等在固有免疫早期发挥重要功能的炎症介质;在STAT4缺失的情况下,初始的炎症反应明显减轻[9]。在本实验结果中,两个STAT基因表达均下降,究其原因,可能是JAK/STAT通路主要在ARDS发生早期被促炎因子激活,进而引发下游基因的大量表达,促进ARDS的发生。随着时间的延长,促炎因子表达下降,JAK/STAT通路作用也跟着降低,或者抗炎因子表达增强,对该通路产生某种抑制作用。至于JAK/STAT通路在ARDS不同进程中的表达情况及其影响因素,还有待于进一步研究。
感觉神经末梢受刺激时可释放速激肽(Tachyki-nins,TKs),速激肽通过其受体在体内发挥许多重要的生理和病理作用。速激肽及其受体参与免疫细胞和炎症细胞的肺内募集。研究发现,速激肽在嗜酸性粒细胞的肺浸润过程中起作用,同时速激肽也可影响巨噬细胞的吞噬功能[10]。另外,速激肽还具有强烈的促进与哮喘相关的细胞因子及炎性介质释放的作用,包括可诱导哮喘患者肺泡灌洗细胞组胺的释放,增加血管上皮细胞粘附分子的表达,并刺激人T淋巴细胞或B淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和成纤维细胞分泌等[11]。迄今速激肽与ARDS的关系还未见报道。在本研究中,该基因(Tac1)表达上调1.93倍,预示在ARDS发生过程中可能起到重要作用。
本实验采用肺组织进行基因芯片的检测,得到了许多差异表达基因,但由于肺组织包含40多种细胞,因而具体哪些基因是由哪类细胞表达难以明确。也许一种细胞表达多种差异基因,或者一种蛋白由多种细胞分泌,或者仅由某种细胞表达某种关键物质,这些都还有待于进一步实验验证。鉴于我们所采用的全基因表达谱芯片技术,能够在全基因组的水平上筛选ARDS大鼠差异表达基因,结果也表明我们确实得到了许多差异表达基因,有些还可能是参与ARDS发生、发展的重要基因,说明这种方法高通量筛选的效率是其他方法难以比拟的。
总之,本实验采用全基因表达谱芯片技术筛选大鼠ARDS差异表达基因,在全基因组的水平上纵览了ARDS基因表达的情况,得到一批相关基因。其中,免疫反应、信号传导方面的基因在ARDS发生过程中可能扮演重要角色。至于这些基因在ARDS进程中的作用和机制还有待于进一步探索,同时也说明基因芯片技术用于筛选疾病相关基因是行之有效的。
参考文献
[1]CHEN HI,HSIEH NK,et al.Protective effects of propofol on a-cute lung injury induced by oleic acid in conscious rats[J].Crit Care Med,2008,36(4):1214-1221.
[2]FUJISHIMA S,MORISAKI H,et al.Neutrophil elastase and systemic inflammatory response syndrome in the initiation and development of acute lung injury among critically ill patients[J].Biophys J,2008,62(5):333-338.
[3]DERISI J,PENLAND L,et al.Use of a cDNA microarray to analyse gene expression patterns in human cancer[J].Nat Genet,1996,14:457-460.
[4]SCHENA M,SHALON D,et al.Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray[J].Science,1995,270:467-470.
[5]WYGRECKA M,JABLONSKA E,et al.Current view on alveolar coagulation and fibrinolysis in a cute inflammatory and chronic interstitial lung diseases[J].Thromb Haemost,2008,99(3):494-501.
[6]GRUSON D,HILBERT G,et al.Sequential production of leukaemia inhibitory factor by blood cell culture in patients with ARDS[J].Intensive Care Med,1998,24(4):366-368.
[7]JORENS PG,DE JONGH R,et al.High levels of leukaemia in-hibitory factor in ARDS[J].Cytokine,1996,8(11):873-876.
[8]DIEU MC,VANBERVLIET B,VICARI A,et al.Selective re-cruitment of im mature and mature dendritic cells by distinct chemokines expressed in different anatomic sites[J].J Ex-Med,1998,188(2):373-386.
[9]SUGAWARA I,YAMADA H,MIZUNO S.Relative importance of STAT4in murine tuberculosis[J].J Med Microbiol,2003,52(Pt1):29-34.
[10]GARLAND A,NECHELES J,WHITE S R,et al.Activated eosinophils elicit Substance P release from cultured dorsal root ganglion neurons[J].Am J Physiol,1997,273(5):10962-11021.
基因研究 篇8
1 整合子 - 基因盒系统的结构、分类
1. 1 整合子的结构
整合子由5' - 保守末端 ( conserved segment,CS) 、3' - 保守末端及中间的可变区域组成,它能够捕获、整合及表达耐药基因。5' - CS是整合子的基本结构,包括一个编码整合酶的IntⅠ基因、一个整合子重组位点attI和启动子。IntⅠ编码的整合酶催化基因盒在整合子重组位点attI和基因盒重组位点attC之间整合和剪切。启动子通常有P1和P2两种,大多数整合子都含有P1启动子,仅少数含有启动子P2。中间可变区域有不同种类和数量的耐药基因盒。3' - CS的结构因整合子种类而不同。
1. 2 整合子的分类
整合子有两种分类方法: 一种是依据整合子的特点和作用不同,将整合子分为2类,即耐药整合子和超级整合子; 另一种是根据其编码整合酶的DNA序列不同可分为10类,但只有5种与编码抗生素耐药性的基因盒有关,其中研究最多的为Ⅰ ~ Ⅲ类整合子[4]。目前,在大肠埃希菌的研究中发现了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ类整合子,其中以Ⅰ类整合子最为常见。
Ⅰ类整合子是迄今研究最多的一类整合子,含有337个氨基酸。Ⅰ类整合子的5' - CS部分一般相似,而3' - CS存在差异。多数3' - 保守端有3个开放阅读框架: 季铵盐化合物及溴乙锭的耐药基因、磺胺耐药基因、功能不明的ORF5。整合子的可变区带有不同数量可编码各种抗生素抗性的耐药基因盒,表现出多耐药特征。
Ⅱ类整合子的3' - 保守端包括5个tns基因,协助转座子Tn7移动。IntⅠ2是一种缺陷的IntⅠ1,可被终止密码子终止,致使Ⅱ类整合子插入基因盒的种类及数量较少且表达率低。编码的整合酶IntⅠ2约有318个氨基酸,与IntⅠ1的同源性为46%[5]。
Ⅲ类整合子的两侧是一对反向重复序列,催化环状基因盒的插入与删除,但其整合、删除基因盒的能力弱,与IntⅠ1的同源性为61% ,从Ⅲ类整合子上只发现了碳青霉烯耐药基因。
Ⅳ类整合子的可变区带有上百个基因盒,又被称为超级整合子,其整合酶IntⅠ4有320个氨基酸,与前三类整合子的整合酶的同源性为45% ~ 50% 。
1. 3 基因盒的结构、类型
基因盒是一种较小的可移动DNA分子,可表达对抗生素的耐药性。常以环状形式独立存在,也可插到整合子中进行转录表达。不同基因盒一般都有一个共同结构: 一个基因和一个整合位点attC。attC位点是一个不完全的反向重复序列,含有可被整合酶识别的特异性整合位点。因为第一个被发现的attC长度为59 bp,所以attC又称为59碱基元件。多数基因盒缺乏启动子,因此只有被整合到整合子上才能得以转录表达。
目前已发现的基因盒,如aad、aae、dfr、bla、oxa、cat、oxa、ere、sat、grr、str基因等,主要介导对氨基糖苷类、磺胺类、β - 内酰胺类、氯霉素、红霉素、链丝菌素、喹诺酮类、链霉素等药物的耐药性。
2 整合子 - 基因盒系统的整合表达与传播扩散
研究表明,整合子 - 基因盒体系是细菌对抗外界环境、传播扩散耐药基因的关键因素。整合子可通过捕获和剪切基因盒使基因盒发生移动; 另外,整合子自身可位于转座子、质粒等可移动基因元件上使整合子发生移动,使耐药基因发生播散。
2. 1 整合子 - 基因盒的捕获、表达及切除
基因盒可通过整合酶作用插到整合子上实现表达。整合酶主要识别2个重组位点: 一个是整合子上与整合酶基因相邻的attⅠ位点,另一个是基因盒上的attC位点。在整合过程中,游离的环形基因盒线性化,整合酶识别位点attⅠ和基因盒中的attC ,而后在游离环状基因盒的59be和整合子attⅠ位点之间发生位点特异重组。这是一个可逆过程,整合的线性基因盒被切下后仍可恢复为环状,切下的基因盒也可被整合到其他整合子上,进而从一个整合子转到另一个整合子。一个整合子可捕获一个或多个基因盒,基因盒严格按照5'→3'的方向插入整合子,其携带基因的起点最靠近IntⅠ,再一个一个插到整合子插入位点attⅠ,产生耐药基因序列。
多数基因盒都不含启动子,其表达需要依赖整合子上启动子的作用。基因盒一旦插到整合子中,这个基因就能在整合子可变区启动子Pant指导下转录表达。基因盒表达强弱不仅与启动子的强弱相关,而且与基因盒的插入位置也相关。对于特异性整合,距离启动子越近的基因盒表达越强,其下游的基因盒表达水平逐渐减弱。而对于非特异性整合,基因能否表达决定于其上游是否有启动子的存在。此外,质粒上的整合子其耐药基因的表达还受拷贝数的影响。研究表明,attC二级结构的改变亦可影响基因表达[6]。而在抗生素选择性压力下,整合酶介导的基因重组会影响那些处于弱启动子下或基因盒队列下游的耐药基因盒,使其插到强启动子下,提高基因表达水平,耐药水平也随之上升。
2. 2 整合子 - 基因盒系统的传播与扩散
整合子是水平传播的重要因子,也可借助于质粒或转座子的转化、转导及接合作用等来完成传播,其中接合是最为常见的水平传播方式。接合即为DNA通过细胞间直接的物理连接从供体菌转移到受体菌,由接合性质粒介导,是耐药基因转移的重要机制。接合性质粒,即R质粒,是多种抗生素耐药基因的携带载体,能够使宿主菌对抗菌药物、化学药物或重金属离子等杀菌剂表现出耐药。
翁幸鐾等[7]在对大肠埃希菌尿液分离株的研究中均检出接 合性质粒tra A、trb C,检出率分 别为89. 3% 和18. 6% ; 赵旺胜等[8]研究发现,tra A、trb C检出率分别为81. 7% 和70. 0% ; 张秀英等[9]在对24株猪源性大肠杆菌的研究发现,tra A、trb C的检出率分别是91. 67% 和62. 5% ; 另外,还有研究发现在哈尔滨周边地区的不同养殖场存在耐药谱相同或相似的菌株,这表明不同养殖场可能存在整合子和接合性质粒等水平传播的现象,这种传播方式跨越菌属的界限,甚至在真菌和细菌之间进行传播[10]。此外,通过接合水平转移的整合子可引起人类与动物之间大肠埃希菌对抗菌药物耐药性的播散[11]。
此外,还有一种可移动遗传元件,它与耐药基因的水平转移相关,即插入序列共同区( ISCR) 。ISCR元件不需要特异性识别,而是通过专门的转座机制捕获、移动任何邻近的细菌DNA序列。它可通过和整合子序列的相互反应将基因加到系统中,使得整个装配能从一个细菌细胞转移到另一个细菌细胞。在Ⅰ类整合子中,如有ISCR1插入,由于其自带启动子,可使距离整合酶基因远的耐药基因从低表达或不表达转变为表达。
3 调控耐药基因转移与转录的因素
3. 1 启动子
耐药基因盒的表达需要依赖于整合子可变区上的启动子Pant来启动,启动子的差异影响整合酶的重组活性。因此,可变区启动子的种类、强度和与基因盒的距离是影响基因盒转录水平的重要因素之一。T. Jové等[12]对不同整合子中的前4种Pant启动子和Pant - P2联合体的强度进行检测,同时又检测了这几种整合子中基因盒的类型和表达水平,结果表明,在Ⅰ类整合子中,基因盒的表达主要是由前4种Pant启动子和Pant - P2联合体控制的,而且启动子的强度不同基因盒的表达水平也不同,启动强度越强,基因盒表达水平就会越高。
3. 2 重组位点
在细菌整合子中,参与重组的特异性位点attΙ和attC在耐药基因盒的整合和切除中起很大作用。整合酶在attΙ位点上的结合域有4个,其中有3个结合域都含有GTTA序列,结合位点上任何一个碱基对发生改变都可以使结合位点与整合酶的结合强度发生改变。
3. 3 应激反应( SOS 反应)
SOS反应是指当染色体DNA受到严重损伤时细胞会启动的一种应激反应。当细菌处于抗菌药物环境时,其自身的SOS反应便可诱发,SOS反应会促进细菌整合子中整合酶的表达[13]。P. J. Hastings等[14]研究发现,抗生素诱发的SOS反应对耐药基因的整合与转移有一定的促进作用。
4 结语
研究表明,抗生素的应用能激发基因盒的表达,从而使其产生耐药。去除抗生素的选择性压力,整合子可能会消失[15]。基于此,应该谨慎选用抗生素,降低耐药基因的传播与扩散,进而控制耐药菌株的产生与流行。
基因研究 篇9
作为国家863计划“特色林木功能基因组研究与应用”的子项目之一, 桑树基因组测序由西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室牵头, 集合了浙江省农业科学院、广东省农业科学院、中国林业科学研究院等单位, 历时3年完成。从2010年11月开始, 项目组采用原始川桑开始进行基因测序, 成功分析出桑树的染色体基数。
据介绍, 人类对蚕桑的利用开始于5000年前, “丝绸之路”极大地影响了世界历史的进程。2008年家蚕基因组被破析, 但对桑树基因的研究才刚起步。
基因研究 篇10
■最新发现与创新
科技日报讯 由香港中文大学、华大基因等单位联合完成的野生大豆W05的全基因组测序工作, 通过对野生大豆重要农业性状关联基因研究, 发现了新的耐盐基因。7月10日, 最新研究成果于《自然通讯》杂志在线发表。
大约6000至9000年前, 我国就开始进行野生大豆的驯化。驯化过程中, 大豆的栽培种丢失了很多与环境适应相关的重要基因, 然而这种缺失的遗传多样性可以通过育种的方法进行改良, 也就是说可以将野生大豆中能够适应某一特定环境的基因重新引入到栽培大豆中。科研人员对野生大豆进行了全基因组测序, 并利用一种新颖且有效的研究策略来挖掘野生大豆基因组遗传信息。他们构建了基于测序的基因分型遗传图谱, 并利用之前获得的大豆种质资源的重测序数据, 发现了新的耐盐基因, 在盐胁迫条件下, 该基因负责维持较低的钠离子与钾离子比率, 以增强大豆的耐盐性。
盐化作用对于农业构成了严重的威胁, 影响全球20%灌溉地作物的收成。在盐胁迫条件下, 野生大豆表现出很高的耐受性, 因此对于提高大豆的耐盐性改良而言, 野生大豆拥有非常好的遗传资源。研究人员还发现拥有完整耐盐基因序列是大豆祖先共有的特征, 对盐比较敏感的栽培大豆的后代积累了不同类型的基因突变。这些变异导致耐盐基因功能异常或者低表达。
美国转基因研究的风雨历程（下） 篇11
转基因在中国这样一个具有悠久历史和传统文化的大国遭遇阻击，其实不算一个意外。如果我们回溯到清末，现代科学完全是绝大多数中国人思维范围之外的奇谈怪论、奇技淫巧。自五四运动，中国主流社会对于现代科学的看法有了一个大逆转，崇尚科学成为社会主流意识形态，从北洋军阀到国民政府再到新中国，对于中国的发展道路永远有水火不容、舞刀弄枪的争论，科学落后是中国贫穷羸弱的原因成为共识，没有谁不把振兴教育、发展科学作为向人民许诺的强国的路径。
然而，随着中国经济令全球瞩目的高速增长，中国国际地位的不断提升，同时伴随而来的拜金主义、成王败寇价值观的风行。民族自信的大幅提升和对现实人心不古的强烈忧虑，使越来越多的人开始重新反思20世纪以来中国人或明面上或骨子里对西方的膜拜，进而试图在传统文化中寻找出路。而现代科学由于和西方社会天生的连带性，自然也成为一部分社会主流人群反思和质疑的对象。
这种思想潮流和西方社会一直存在的教会势力、反全球化势力、环保原教旨主义势力结合在一起，使中国反转基因势力的背景、宗旨和行为方式显得缤纷多彩、百花齐放。
阴谋论和假想敌——孟山都
在全世界范围内，阴谋论永远是缺乏知识和耐心的普罗大众和不少人文知识分子认识世界最简便而有趣的手段。全世界反转基因斗士们当然不会例外。有阴谋论当然要有假想敌，没有什么比设立一个假想敌更能团结同志鼓舞斗志了。现在中国的反转基因都斗士为自己设立了两个非常强大的假想敌，一个是孟山都公司，另一个是——美利坚合众国。
把孟山都公司作为阴谋论的假想敌是直接从国外继承过来的，原因很简单，迄今为止孟山都公司是转基因最大的获益者。经过美国和欧洲反转基因人士、反战人士、环境保护人士、反全球化人士几十年来共同不懈的努力，孟山都公司终于被塑造成了一家恶贯满盈的公司。
孟山都的第一宗罪是他的出身。孟山都公司在1901年由约翰·奎恩伊创建，他用自己妻子的姓氏“孟山都”（Monsanto）为公司命名。对于孟山都公司为什么这么坏，挖掘的最深的一个传说是：约翰最早是个奴隶贩子，靠着从非洲向北美贩卖奴隶和对中国走私鸦片积累了第一桶金。而实际上1865年美国废除奴隶制度时，约翰不过6岁，也许这个传说安排在约翰父亲的身上更符合逻辑。这个“出身”版本的广泛流传为各种有关孟山都邪恶传说埋下了伏笔。
在转基因技术推广之前，化工行业是名声最差的行业。凑巧的是孟山都的前身就来自这个“臭名昭著”的行业。孟山都发明了糖精，并且在相当长的时间里以此为主业。孟山都靠干这一行出身，看起来很“LOW”。
孟山都的第二宗罪是环境灾难。19世纪30年代，孟山都开始涉足农药和化肥领域。随着美国农业人口的急剧减少，农业生产规模化，对除草剂和除虫剂需求日益旺盛。1956年，孟山都公司的除草剂“草毒死”和“草克死”面世。除草剂和杀虫剂的大面积使用，大幅提高了粮食单产，减少了人工成本，但随即也带来了明显的环境问题。曾经引发全球环境保护运动的著名著作《寂静的春天》，主要反映的就是这个问题。
而事实上，转基因农作物恰好是为了解决除草剂和杀虫剂污染环境问题而研发的应对方法。为了解决除草剂和杀虫剂带来的环境灾难，孟山都发明了号称无毒的除草剂“草甘膦”并将其命名为“农达”。转基因作物实际上是农达的配套产品。其基本原理是，如果农作物能够很好的抵抗农达的杀伤力，将大大提高农达的效力。孟山都将抗农达基因编辑进普通的大豆的基因中，转基因大豆应运而生。因此，从某种程度上来说，转基因恰好是为了解决环境问题才发展起来的。美国正是因为大规模使用了转基因种子，才缓解了杀虫剂和除草剂带来的环境问题，“寂静的春天”才又恢复为“喧闹的春天”。
孟山都的第三宗罪是垄断。20世纪90年代，孟山都开始在全球范围收购种子公司。从1995年到1998年间，孟山都公司总共花费80多亿美元，收购至少10家大型种子公司，控制了美国一大半农业种子市场。孟山都被指控利用垄断地位控制印度的棉花种子市场。他们先用优势的转基因棉花种子摧毁传统棉花种子市场，逼迫农民不得不使用高价的转基因种子。高额的种子成本投入，使得农民们面对市场时压力巨大。棉农自杀的案例在印度的棉产地屡见不鲜。孟山都成了谋财害命的刽子手。
公允地说，将由于棉花价格的波动和棉农使用转基因棉花种子的不适应所带来的印度棉农的自杀现象，归结在孟山都的转基因种子上是偏颇的。首先，众所周知印度农民在种植转基因棉花之前并不是富裕的农民，事实上他们的生产和生活从来都是艰难的。其次，转基因抗虫棉在中国的推广使用极大地提高了中国棉花的产量，大大改善了棉农的生活，这是举世公认的事实。从经济效益来看，种植转基因抗虫棉每亩比对照可平均增产7.5千克皮棉，按10元/千克计，每亩可增收75元；每亩减少农药投入50元、减少人工投入计工费30元，也就是说，推广转基因抗虫棉，每亩可增收节支155元。
一家历史上劣迹斑斑的美国公司，通过收买中国政府官员和专家在中国推广转基因并最终垄断中国种子市场，这个看上去逻辑自洽的阴谋论，是目前国内反转基因斗士们的最主要的理论基础。
人们更愿意相信背后还有幕后黑手
另外一部分反转基因人士则自认为站的更高而看的更远。在他们看来，孟山都只不过是一名无足轻重的小卒，真正的幕后黑手是美国政府。其耸人听闻的阴谋包括为了控制世界人口总量，通过转基因食物减少有色人种，尤其是黄种人的数量。美国中央情报局是这个计划的执行机构，而洛克菲勒基金会、福特基金会、卡内基基金会等中央情报局的“外围组织”通过赞助来收买专家、政府官员和媒体舆论。具体到中国，执行的路径是通过将转基因饲料卖给中国，通过猪肉作用于中国人，使中国人不孕不育。专程赴美拍摄转基因的著名反转斗士前主持人崔老师虽然没有明说，但在其表述中能看到这一说法的影响。
20世纪60年代后，由于科学的快速发展带来的环境等问题成为社会关注焦点。美国民众的反智主义倾向抬头，对科学和科学家污名化成为媒体的时髦行为。当老百姓不断被媒体煽动起的恐惧感和他们对科学的无知结合到一起的时候，人们宁愿相信有某种力量正在酝酿更大的阴谋。几十年之后，中国社会的反智风潮也有越演越烈的态势。而当来自现代西方的反智思潮加上中国传统的迷信传统，再和当代中国的民族意识觉醒混搭在一起，所形成的反转基因力量比起当年的美国更加立体。当媒体精英、社会良心、红色二代们纷纷加入到反转阵营中之后，中国的转基因研究事实上已经受到重大困扰，以至于政府文件中都不再提“转基因”，而用敏感度较低的“分子育种技术”取而代之。这种现状如果长时间得不到改变，或将影使中国错失又一次科技进步的良机。
转基因水稻研究现状 篇12
关键词：转Bt基因水稻,生态风险,抗性,经济效益
水稻是重要的粮食作物, 全球约三分之一以上的人口以稻米为主食。水稻也是我国最大的粮食作物, 约占我国粮食总产量的40%, 因此水稻在我国的农业生产中占有举足轻重的地位。
水稻受虫害侵袭非常严重。田间危害水稻的昆虫有数百种之多, 其中鳞翅目害虫如二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟等危害最重。通过化学杀虫剂控制水稻害虫, 不仅生产成本高, 且因农药残留可对生态平衡造成破坏, 对人、畜健康产生严重危害, 同时, 害虫也易产生抗药性。因此, 培育具有抗虫能力的水稻新品种成为控制水稻害虫的重要途径。但由于在现有的水稻种质资源中, 只有极少数野生水稻对螟虫具有一定抗性, 而且很难加以利用, 常规育种受到了很大限制。转Bt基因水稻是有效防治鳞翅目害虫危害的途径之一, 基因工程技术突破了水稻常规育种的种种限制, 为确保我国粮食安全提供了新的可依赖途径。
1 转基因抗虫水稻的研究概况
水稻本身没有足够抗虫的基因, Bt基因是水稻基因工程中可利用的主要抗虫非水稻基因库源材料之一 (Fujimoto et al., 1993;Wunn et al., 1996) 。自Schnepf和Whiteley (1981) 首次从Bt中克隆Cry1A基因以来, 揭开了利用基因工程培育抗虫植物的序幕, 至今已有130多种杀虫晶体蛋白基因被报道。目前, 水稻中主要转入的Bt基因编码为Cry1A, 包括Cry1A (a) 、Cry1A (b) 、Cry1A (c) 基因 (赵玉艳等, 2004) 。随着水稻基因工程技术的飞速发展, 转基因水稻的研究成果斐然。近20年来, 利用转基因技术已成功研发出抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆境和优质高产的转基因新品种, 先后获得大量的目标性状强、遗传和表达稳定、农艺性状优良的转基因水稻株系资源 (舒庆尧等, 1998;杨庆文, 2003;蒋家焕等, 2003) 。1995年浙江大学与加拿大渥太华大学合作利用农杆菌介导法成功地将密码子经过优化的Bt杀虫基因Cry1Ab导入了多个水稻品种, 通过分子鉴定、抗虫性测定和多代筛选, 育成了以晚粳推广品种秀水11为遗传背景的“克螟稻”。
Ghareyazie (1987) 报道了转Cry1Ab基因香粳品系827, 对二化螟与三化螟有较高抗性, Cry1Ab基因在水稻籽粒灌浆期功能叶片中高效表达, 而在水稻籽粒 (胚和胚乳) 中不表达, 这一研究结果对解决人类食用转基因抗虫水稻稻谷的安全性问题具有开创性意义。
范云六院士领导的实验室与华中农业大学张启发院士领导的实验室经多年合作, 将能在单子叶植物中高效表达的融合型Bt杀虫基因 (Cry1Ab/Cry1Ac) 成功地转化到籼稻, 获得了高抗虫的“明恢63”恢复系T51-1及由它配制而成的“汕优63”杂交稻。
2 转基因水稻潜在生态风险
目前, 对于转基因水稻潜在的生态风险研究主要集中在以下四个方面:转基因水稻对非靶标生物和生物多样性的影响;转基因漂移及其环境风险;靶标害虫对抗虫转基因的抗性产生;水稻生态系统的间接环境安全问题。
2.1 基因漂流的风险
基因漂流是转基因植物可能引起的生态问题的主要风险之一。基因漂流主要指基因通过花粉授精杂交等途径在种群之间扩散的过程。转基因植物基因 (包括转基因) 漂流的途径大致有两个:一是通过转基因植物的种子或组织扩散到新的生境中, 并生存下来;二是通过花粉向同种或近缘种非转基因植物转移。转基因植物通过上述途径发生基因漂流, 产生的生态风险是多方面的, 归纳起来主要有: (1) 产生超级杂草。一些转抗除草剂基因的植物生存力增强, 大面积繁殖, 成为难以除去的杂草。转基因通过花粉转移到其它野生种或近缘种中, 使这些物种含有了某种基因而成为杂草; (2) 对自然基因库产生影响。由于转基因在环境中的释放, 一些基因进入野生植物基因库中, 影响基因库的遗传结构, 给育种和研究生物多样性工作造成危害; (3) 对自然环境的直接影响, 可能造成生物多样性的损失。
2.2 靶标害虫对抗虫植物的抗性及治理
迄今为止, 在田间和实验室研究中已经发现有10多种昆虫对Bt杀虫毒素产生了抗性。一般而言, 延缓害虫对转Bt基因植物产生抗性的策略有: (1) 基因策略, 即在作物中转入多个杀虫基因。可以是具有不同结合位点的Bt基因, 也可以将蛋白酶抑制剂基因与Bt基因同时转入作物中, 以提高杀虫效果、延缓抗性产生 (Dirie et al, 2000) 。或者可以尽可能的将基因在特定的时间或特定的时空来进行表达, 尽可能在害虫危害的高峰期表达将能较好的延缓抗性的发展 (Willia-ma et al., 1992;Gould1998) 。 (2) 田间高剂量/庇护所法。庇护所是用来保持群体中敏感性昆虫的非Bt作物植株, 可以由栽培了非Bt植株的田间构成, 或由Bt植株田间内的非Bt植株构成。在庇护所植株中生存的大量敏感型昆虫可以与在Bt植株中生存的少量抗性昆虫交配, 得到的后代将是非纯合的抗性基因昆虫, 它们在高剂量Bt植株中摄食时将不能生存。 (3) 高表达策略:在作物中使毒素的表达维持在一个高水平 (如超过99%的致死量) 称为高剂量法。多数研究表明害虫对Bt的抗性是以隐性方式遗传, 因此使用高剂量的制剂或高剂量表达毒素, 能杀死95%以上的敏感和抗性敏感杂合体个体, 从而延缓害虫对Bt毒素产生抗性。
2.3 对非靶标生物和生物多样性的影响
邓曙东等 (2003) 研究发现, 在转Bt基因棉田中, 除棉蓟马外, 其它主要非靶标害虫 (主要是刺吸性害虫) 的种群发生数量呈明显的上升趋势, 转Bt基因棉对于斜纹夜蛾与烟粉虱这两种近几年来对棉花危害有加重趋势的害虫, 在大田中没有表现出抗性。因此可以看出, 由于转基因作物对目标害虫具备很强的针对性, 目标害虫的种群数量下降, 导致生物群落中种与种间竞争格局发生变化, 某些非目标害虫由于其较强的适应性而转变成为主要害虫。
转基因作物的种植可对转基因作物田间生物种群组成、群落结构和生物多样性产生深刻影响。刘志诚等 (2004) 研究认为, 转Bt基因水稻对稻田节肢动物群落的影响明显弱于化学杀虫剂, 利用转Bt基因水稻防治水稻螟虫和稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫比使用化学杀虫剂更利于保持稻田节肢动物群落的稳定性和保护稻田中的害虫天敌。
3 结束语
随着转Bt基因水稻从实验室逐渐走向环境释放, 转基因水稻可能带来的环境安全问题等引起科学家的广泛关注, 需要对不施任何杀虫剂的转Bt水稻的经济收益作一定评估, 探讨转Bt水稻的经济效益及潜在的风险, 提出应对策略。
参考文献
[1]刘雨芳, 转Bt基因抗虫水稻的研究进展与生态安全评价, 生命科学研究, 2004, 8 (4) :294-299.
[2]邓曙东、徐静、张青文、周世文、徐冠军, 转Bt基因棉对非靶标害虫及害虫天敌种群动态的影响, 2003, 46 (1) :1-5.
[3]郭建英、万方浩、韩召军, 转基因植物的生态安全性风险, 中国生态农业学报, 2008, 16 (2) :515-522.