基因功能（共11篇）
基因功能 篇1
中国自古以来就是养马大国, 截止2013年底, 据联合国粮农组织统计, 我国马匹存栏量现为633万匹, 位居世界第三位。在我国的农业发展史上, 马不仅仅提供了奶和肉, 在农业生产中还是必不可缺的畜力。现今我国的马产业正处于由传统马业向现代马业转型的关键时期。与侧重于役用的传统马业不同, 现代马业主要以赛马、马术运动、体育休闲、 培育运动马匹等非役用功能为主。
1驯化马匹品种的形成
研究认为马大约于6000多年前在欧亚草原上被驯化, 伴随着人类的活动逐渐扩散至世界的很多地方。有的适合拖行重物 (苏维埃重挽马) ;有的适合长途奔跑 (阿拉伯马, 蒙古马) ;有宠物马如设特兰等;还有适合不同赛事的运动马匹:盛装舞步赛, 障碍赛, 综合三项赛, 以及以速度与力量见长的赛马。赛马品种中最广泛应用的马为纯血马。
2现代马产业中最重要的马种- 纯血马
纯血马原产地为英国, 经过育马者人为选育, 现今的纯血马的直系父亲都可追溯到三匹种公马, 被称为纯血马父系的三大祖先。他们分别是巴利土耳其、达利阿拉伯与古多芬阿拉伯, 近年来的研究发现全世界约有95%的纯血马源自达利阿拉伯的血统。每一匹纯血马自从诞生后都有自己的身份证, 并且需要进行严格的DNA亲缘检测以后, 才可以登记在马血统纪录总簿上, 只有经过验明正身的纯血马才具有参加比赛的资格。1791年, 英国整理出版发行了马血统纪录总簿第一版, 纯血马详细而且完善的谱系登记已经持续了300余年。纯血马成为人类培养的动物中谱系资料最为完善的品种, 为科学研究提供了极好的素材。
3纯血马的生理特点
纯血马是速度赛马中使用的唯一品种。他以中短距离速度快而称霸世界, 创造和保持着5000m以内各种距离速力的世界纪录。纯血马拥有独特的运动生理上特点。纯血马平均体重大约为0.5t, 最高时速为64km/h, 最大心跳240次/min。拥有约占体重55%的肌肉重量, 其他非运动型马种肌肉重量只占体重的40%。大容量的肺活量, 高浓度的血液中红血球含量, 强劲的心脏收缩率使得氧气可以被大量而且高效的运送至肌肉组织中进行有氧代谢。
4基于纯血马在运动基因组学上的研究进展
在对于运动马匹的长期人工选择中, 会受到环境, 营养, 训练, 管理等因素协调影响, 但大约有35%~55%的运动潜质是可以遗传的。2009年Gu等人首次发现在纯血马基因组中存在与运动性状相关的表现强烈选择信号的区域。随后, 发现以下候选基因:肌肉生长抑制素、细胞色素C氧化酶亚基4, 2亚基、丙酮酸脱氢酶激酶同工酶4中的SNPs标记在纯血马中同运动能力显著相关, 同时利用全基因组关联分析, 确定了MSTN基因1号内含子中一个突变, 同纯血马的最佳赛程长度为极显著相关。 随后, 系列研究发现MSTN中基因间区域和上游区域存在的另外一些SNPs标记和结构变异也同赛马的运动性能相关。在后续研究中, 2012年碧翠丝等人发现“MSTN- 速度基因”这一突变可追溯至17世纪一匹母马产生的新突变上。2013年皮特森将马运动性能这一复杂性状定位于马8号, 17号及14号染色体区区间上。对马运动基因的系统研究表明: 在马这一系列运动性能候选区间中, 同运动性能显著相关的SNP标记位点均为基因间SNPs, 即位于基因组非编码区域内的遗传标记。
综上所述, 为了满足人们的不同需要, 驯化马匹逐渐形成了不同的品种。其中纯血马被主要用作速度赛马。自纯血马这一品种形成的300多年来, 育马人一直以马的谱系进行选育, 这种选育方法对提高纯血马速度的进展十分缓慢, 成效不明显。由此, 近期的一系列对纯血马运动性能的研究, 初步揭示了纯血马在运动功能基因组上的特点。这些研究为定向选育纯血马提供了科学的有力支撑, 同时对赛马产业将会产生巨大推动作用。
参考文献
[1]韩国才.马的起源驯化、种质资源与产业模式[J].生物学通报, 2014, 2:1-3.
[2]Gu, J.et al. (2009) .A genome scan for positive selection in thoroughbred horses[J].PLo S One, 4, e5767.
基因功能 篇2
烟草脆裂病毒诱导的基因沉默在植物基因功能研究中的应用
烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)是一类应用比较广泛而且效率和持久性较好的病毒载体,能够介殚导基因沉默同时不会带来病毒诱导的症状.改造后的病毒能够促进非病毒序列的插入以及对植物的后续感染,也可以鉴定宿主植物生长点的基因,因此TRV在植物基因功能鉴定中具有广泛的`应用.该文介绍TRV沉默载体的构建、诱导基因沉默原理、在植物基因功能研究中的应用以及优缺点.
作 者：唐清杰 沈文涛 周鹏 TANG Qing-Jie SHEN Wen-Tao ZHOU Peng 作者单位：中国热带农业科学院热带生物技术研究所、热带作物生物技术国家重点实验室,海口,571101刊 名：生命的化学 ISTIC PKU英文刊名：CHEMISTRY OF LIFE年，卷(期)：200626(4)分类号：Q94关键词：烟草脆裂病毒 病毒诱导的基因沉默 基因功能
基因功能 篇3
关键词 巴西橡胶树 ；草甘膦 ；HbEPSPS ；表达分析
中图分类号 S794.1 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.09.008
Abstract The target enzyme of herbicide Glyphosate is 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase （EPSPS）. In order to study the function of HbEPSPS in stress response of rubber tree， we analyzed HbEPSPS expression patterns in rubber tree treated with glyphosate， mechanical wounding， powdery mildew infection and different hormones. Results show that glyphosate， mechanical wounding and IAA treatment induced significant upregulation of HbEPSPS； drought， ABA， SA and ETH treatment also upregulated HbEPSPS expression obviously. In rubber tree leaves treated with H2O2， HbEPSPS expression showed a bimodal pattern. Rubber tree leaves infected with powdery mildew had a significant downregulation of HbEPSPS expression. Expression analysis in different parts of rubber tree showed that HbEPSPS was most highly expressed in flower， followed by the bark and leaves， the lowest in latex. This study indicates that HbEPSPS plays an important role in the response to glyphosate phytotoxicity and hormone signal， which lay a good foundation for further study of the stress resistance mechanism in rubber tree.
Keywords Hevea brasiliensis ； glyphosate ； HbEPSPS ； expression analysis
5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase， EPSPS）催化莽草酸-3-磷酸（S3P）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）生成烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸（EPSP）[1]。草甘膦（Glyphosate）除草剂抑制EPSPS的活性，从而阻断芳香族氨基酸的生物合成，影响植物体内蛋白质、生长素等的前体、黄酮、质体醌及酚类和生物碱的次生代谢途径[2]。目前，已在拟南芥[3]、烟草[4]、棉花[5]、油菜[6]及大豆[7]等物种中克隆了EPSPS基因，并做了相关的基因功能研究。已有研究结果表明，在草甘膦胁迫下植物通过提高部分EPSPS基因的表达量来降低药害[8]。EPSPS基因在植物不同组织和不同激素处理下表达有显著差异[9-10]。在外界胁迫条件下，植物抗逆性相关物质如黄酮、木质素和生物碱等在植株中大量积累[11]。但目前关于橡胶树EPSPS基因在不同环境胁迫方面研究较少。
橡胶树是中国的经济作物之一，其在生长过程中容易受到外界环境的影响，如在干旱时发生病虫害，降低胶乳产量，甚至导致其死亡[12]；白粉病侵染使橡胶树叶片脱落，生长受抑制[13]；外源茉莉酸（JA）能够诱导乳管分化和乳汁的生物合成[14-15]；乙烯利刺激橡胶树增产[16]。笔者已经证明，草甘膦诱导橡胶树叶片畸形[17]。本研究以橡胶树品种CATAS7-33-97为材料，采用qPCR方法分析已克隆巴西橡胶树EPSPS基因（登录号：JQ914660.1）在不同组织、不同激素处理、干旱、伤害和白粉菌处理条件下的表达情况，为进一步解析橡胶树HbEPSPS基因结构和草甘膦抗性等逆境响应机理提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
以中国热带农业科学院橡胶研究所培育的巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）品种热研7-33-97芽接苗、成龄开割树和GT1种子的实生苗为材料，芽接苗和实生苗种植于海南大学环境与植物保护学院（儋州校区）实验基地（草炭土与粘土体积比为3∶1的育苗袋中）。
nlc202309082105
1.2 方法
1.2.1 RNA提取和cDNA合成
根据天根多糖多酚植物总RNA试剂盒说明书提取各处理样品的RNA，分别用超微量核酸蛋白分析仪检测RNA浓度、纯度和1%甲醛变性胶电泳检测RNA的完整性，再用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行反转录[18]。
1.2.2 HbEPSPS基因的表达分析
（1）选取均匀一致且稳定期的芽接苗，采用有效成分含量为41%的草甘膦异丙胺盐水剂稀释2 400倍处理，分别采集未喷药前叶片、喷药前半黄半绿叶片、小于7 cm畸形叶、大于7 cm畸形叶和新生的恢复叶。
（2）干旱处理采用CATAS7-33-97芽接苗为材料，断水10 d，分别采取叶子样品，对照保持水分[19]。
（3）机械伤害采用镊子夹伤叶片，在0、0.5、1、2、6和12 h采取叶片样品，以未处理的植株作为对照。
（4）激素处理采用CATAS7-33-97芽接苗为材料，分别是200 μmol/L脱落酸（ABA）、100 μmol/L吲哚乙酸（IAA）、3 mmol/L赤霉素（GA3）、5 mmol/L水杨酸（SA）、1.0%乙烯利（ETH）、200 mmol/L茉莉酸（JA）和2%过氧化氢（H2O2），分别在0、0.5、2、6、10、24、48和72 h采取叶片样品，所有药剂用0.05%乙醇进行溶解，对照植株喷施0.05%乙醇水溶液[20]。
（5）白粉菌处理以巴西橡胶树GT1种子的实生苗为材料，进行白粉菌侵染，然后分别采集0、1、3、5和7级叶片；同时采集15年生的成龄开割树CATAS7-33-97的叶片、胶乳、花和树皮样品[21]。
以HbACTIN为内参基因，设计荧光定量引物NEPSPSF（5'-GAGTCACCATAGAACACAGT-3'）和HbEPSPS（5'-CCAGCGTCATAGCAACAT-3'），分析HbEPSPS基因的表达量。
1.2.3 统计分析
实验测定为3次重复，采用SAS9.1.3软件对数据进行单因素方差分析和多重比较分析，采用Excel 2013软件进行数据处理，使用origin 2015软件进行作图。
2 结果与分析
2.1 草甘膦处理后橡胶树中HbEPSPS的表达分析
从图1可知，草甘膦处理橡胶树芽接苗后，叶片呈现半黄半绿、畸形叶片等表型，叶片处于半黄半绿时，HbEPSPS的表达量显著提高，是对照的2.5倍，而畸形叶、恢复叶与对照无显著差异。
2.2 机械伤害下HbEPSPS的表达分析
由图2可以看出，机械伤害处理0.5 h时，HbEPSPS基因的表达量达到最高峰，是对照的1.8倍。随着处理时间的延长，该基因的表达量显著下调，至处理12 h时表达量达到最低点。说明HbEPSPS基因可能参与了橡胶树机械伤害的早期胁迫响应机制。
2.3 干旱胁迫条件下HbEPSPS的表达分析
由图3可知，干旱处理橡胶树芽接苗9 d时，HbEPSPS基因的表达量显著上调并达到最高值，是处理前的3.4倍，随后表达量有所下降，但变化不显著。从图3中不断变化的HbEPSPS基因表达情况可看出，该基因参与橡胶树干旱胁迫响应过程。
2.4 白粉菌侵染下HbEPSPS的表达分析
由图4可以看出，相对于未处理时，橡胶树叶片中HbEPSPS基因的表达水平在白粉菌侵染作用下显著下调。随着病害程度的加重，HbEPSPS基因的表达量先显著上升，再显著下降，最后又显著上升，但表达量始终低于处理前。
2.5 不同组织中HbEPSPS的表达分析
从图5可以看出，HbEPSPS基因在所有组织中显著表达，其中在花中表达量最高，是胶乳的4倍，其次是树皮和叶，在胶乳中表达量最低。
2.6 不同激素和H2O2处理下HbEPSPS的表达分析
由图6可以看出，ABA处理橡胶树叶片后，HbEPSPS基因的表达量在处理的48 h内呈现上升趋势，在处理后48 h达最高值，相当于对照的2.4倍。在SA处理作用下，HbEPSPS基因表达量持续上升，在处理后72 h达最高峰，是对照的2.5倍。ETH处理后24 h内，HbEPSPS基因的表达量较对照显著下调，48 h时其表达量显著上调，达到最大值，是对照的2.5倍。JA处理下，HbEPSPS基因表达量差异显著，在0.5 h时表达量达最高，随后该基因的表达量显著下降，至24 h达到最低值。IAA处理橡胶树叶片后，HbEPSPS基因表达量在处理后2 h达最高值，是对照的25倍，随后显著下降，随着时间的延长，该基因的表达量无显著性变化。在H2O2处理的橡胶树叶片中，HbEPSPS基因表达量在0.5 h 显著上调，但随后便显著下降。在处理后10 h再次显著上升，达到表达最高值，是对照的15倍。由此可知，ABA、SA、ETH、JA和IAA均能诱导橡胶树叶片中HbEPSPS基因的表达量发生变化。推测橡胶树HbEPSPS基因可能参与橡胶树不同的激素信号传导途径。
3 讨论与结论
目前，关于EPSPS基因的研究大部分集中在草本植物抗除草剂机制的领域[3-7]。有研究者发现，在草甘膦胁迫下，植物为适应正常芳香族氨基酸的合成，EPSPS基因的表达量会增加，并通过此原理获得了抗草甘膦细胞株[22]。在橡胶树中，HbEPSPS基因在草甘膦处理后叶片处于半黄半绿时表达量显著升高，其他不同叶片状态下表达量较对照无差异，与草甘膦促使银杏中EPSPS基因表达量的升高一致[10]。
激素和各种环境胁迫能够诱导EPSPS基因的表达量升高，如在矮牵牛中，紫外光、低温和激素均能使诱导EPSPS表达的转录因子ZPT2-2在花器官中表达量升高[23-24]。还有研究结果表明，外界的环境压力能够在莽草酸途径下合成黄酮类等前体物质[25]。本研究中，机械伤害和IAA处理前期能诱导HbEPSPS基因表达在橡胶树上显著上调；在干旱、ABA、SA和ETH处理后期能诱导HbEPSPS基因表达显著上调；H2O2处理时，HbEPSPS基因表达量既在处理前期又在处理后期显著表达；白粉菌侵染橡胶树叶片下，HbEPSPS基因表达量较对照显著下调。因此，橡胶树叶片中HbEPSPS基因在环境压力下表达量受影响可能与芳香族氨基酸途径有关，说明HbEPSPS基因能够迅速应答外界环境胁迫，起到调控作用。
nlc202309082105
HbEPSPS基因在橡胶树花中表达量最高，其次是树皮和叶，在胶乳中表达量最低，这一结果与矮牵牛中EPSPS基因在花瓣中的表达量最高一致[26-27]。但在木本植物喜树中，EPSPS基因在叶中表达量最高，与本实验结果不一致[28]。出现这种表达差异的原因可能是由于EPSP基因在不同的组织中发生转录的起始位点不同。
因此，了解HbEPSPS基因的结构及逆境响应机制，将为橡胶树抗除草剂、抗逆机理及橡胶树抗性品种培育提供理论依据。
参考文献
[1] Herrmann K M， Weaver l M. The shikimate pathway[J]. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology， 1999， 50（1）： 473-503.
[2] Amerhein N， Deus B， Gehrke P， et al. The siteof the inhibition of the shikimate pathway by glypho-sate：II. Interference of glyphosate with chorismate formation in vivo and in vitro[J]. Plant Physiology， 1980， 66（5）：830-834.
[3] Klee H， Muskopf Y G. Cloning of an Arabidopsis thaliana gene encoding 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase：Se-quence analysis and manipulation to obtain glyphosate-tolerant plants[J]. Molecular and General Genetics， 1987， 210（3）：437-442.
[4] Wang Y， Jones J， Weller S， et al. Expression and stability of amplified genes encoding 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase in glyphosate-tolerant tobacco cells[J]. Plant Molecular Biology， 1991， 17（6）： 1 127-1 138.
[5] 章郑专，汤磊鹏，王 钰，等. 抗草甘膦基因aroA转化陆地棉胚性愈伤组织的研究[J]. 棉花学报，2014，26（3）：237-243.
[6] 芦宝琳. 抗草甘膦基因甜菜遗传转化的研究[D]. 哈尔滨：黑龙江大学，2012.
[7] 高 越，刘 辉，陶 波. 抗草甘膦野生大豆筛选及其抗性生理机制研究[J]. 大豆科学，2013，32（1）：76-79.
[8] 刘东军，张 锐，郭三堆，等. 棉花品系Y18对草甘瞵应激反应机理的研究[J]. 中国生物工程杂志，2008，28（10）：55-59.
[9] 童旭宏，吴玉香，祝水金. 陆地棉EPSPS基因的克隆及其组织特异性表达分析[J]. 棉花学报，2009，21（4）：259-264.
[10] 程 华，李琳玲，王 燕，等. 银杏EPSPS基因克隆及表达分析[J]. 西北植物学报，2010，30（12）：2 365-2 372.
[11] Hermann K M. The shikimate pathway： early steps in the biosynthesis of aromatic compounds[J]. Plant Cell， 1995， 7（3）：907-919.
[12] 王立丰，王纪坤，安 锋，等. 巴西橡胶树HbCytb561的克隆及表达分析[J]. 热带作物学报，2015，36（11）：1 965-1 970.
[13] 刘 静. 橡胶树白粉病的研究进展[J]. 热带农业科技，2010，33（3）：1-5.
[14] Rizhong Z， Cuifang D， Xiaoyuan L， et al. Vacuolar-type inorganic pyrophosphatase located on the rubber particlein the latex is an essential enzyme in regulation of the rubberbiosynthesis in Hevea brasiliensis[J]. Plant Science， 2009， 176（5）： 602-607.
[15] Tian C L， Ye F， Wang L， et al. Nitric oxide inhibits ghrelin-induced cell proliferationand ERK1/2 activation in JAR1 cells[J]. Endocrine， 2010， 38（3）： 412-416.
[16] 庄海燕，安 锋，张硕新，等. 乙烯利刺激橡胶树增产机制研究进展[J]. 林业科学，2010，46（4）：120-125.
[17] 潘 敏，王 萌，李晓娜，等. 草甘膦对巴西橡胶树芽接苗叶片形态和生理指标的影响[J]. 热带作物学报，2016，37（1）：59-64.
[18] 覃 碧，王 萌，林雨见，等. 巴西橡胶树HbMlo9基因克隆及其序列特征分析[J]. 热带农业科学，2013，33（8）： 47-52.
nlc202309082105
[19] Wang L F. Physiological and molecular responses to drought stress in rubber tree（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）[J]. Plant Physiol Biochem， 2014， 83（2）：243-249.
[20] Qin B， Zheng F， Zhang Y. Molecular cloning and characterization of a Mlo gene in rubber tree（Hevea brasiliensis）[J]. J Plant Physiol， 2015， 175（1）：78-85.
[21] Wang L F， Wang M， Zhang Y. Effects of powdery mildew infection on chloroplast and mitochondrial functions in rubber tree[J]. Trop Plant Pathol， 2014， 39（3）： 242-250.
[22] 徐 杰，蒋世云，傅凤鸣，等. EPSP合酶的研究进展[J]. 生物技术通报，2014，6（6）：40-50.
[23] Papanikou E， Brotherton J E， Widholm J M. Length of time in tissue culture can affect the selected glyphosate resistance mechanism[J]. Planta， 2004， 218（4）： 589-598.
[24] Krol A R， Plas L H. Developmental and wound-， cold-， desiccation-， ultraviolet-B-stress-induced modulations in the expres-sion of the petunia zinc finger transcription factor gene ZPT2-2[J]. Plant Physiology， 1999， 121（4）： 1 153-1 162.
[25] Hermann K M. The shikimate pathway：early steps in the biosynthesis of aromatic compounds[J]. Plant Cell， 1995， 7（3）： 907-919.
[26] Benfey P N， Takatsuji H， Ren L， et al. Sequence requirements of the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase 5[prime]-upstream region for tissue-specific expression in flowers and seedlings[J]. Plant Cell， 1990， 2（9）： 849-856.
[27] Gasser C S， Winter J A， Hironaka C M， et al. Structure， expression， and evolution of the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase genes of petunia and tomato[J]. The Journal of Biological Chemistry， 1988， 263（24）： 4 280-4 287.
[28] Gong Y， Liao Z， Chen M， et al. Characterization of 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase genefrom Camptotheca acuminata[J]. Biologia Plantarum， 2006， 50（4）： 542-550.
猪脂肪性状相关功能基因的研究 篇4
1瘦素(Leptin)基因
Leptin由肥胖基因编码,是一种主要由白色脂肪细胞分泌的反馈性抑制脂肪的激素,由167个氨基酸组成,相对分子质量16 ku[6]。Leptin具有广泛的生物学效应,可调节摄食、能量利用、生长、繁殖和免疫等生物学过程[7],其中最突出的功能是作用于下丘脑的体重调节中枢,引起食欲降低、能量消耗增加,从而降低脂肪沉积、抑制体增重[8,9,10]。
Leptin作为一种脂肪细胞分泌的激素主要在调节机体能量平衡及脂肪沉积方面发挥重要作用[11]。 在人类和鼠上发现,血清Leptin水平及脂肪组织中Leptin的m RNA量与肥胖程度呈正相关,肥胖者表现出Leptin抵抗[12,13,14]。在猪的研究上得出相似结论,肥胖型猪的血清Leptin水平和脂肪组织中Leptin m RNA的表达量均高于瘦肉型猪或较瘦的杂交猪[15], 而且血清Leptin水平与胴体背膘厚度呈高度正相关,与胴体瘦肉率或眼肌面积呈强负相关,而与主观大理石评分相关性较弱[16,17]。脂肪组织中Leptin m RNA的表达量 与背膘厚 度呈正相 关[18]。 血清Leptin水平与脂肪组织Leptin m RNA的表达量也呈正相关[19]。另有研究结果发现,随着猪前体脂肪细胞的增殖和脂肪细胞的肥大,脂肪细胞中Leptin m RNA的表达量也随之升高,说明Leptin可能作为一种脂肪生成反馈剂去除多余脂肪[20,21]。猪的脂肪沉积能力愈强,脂肪组织分泌和表达的Leptin就愈多,而且Leptin的分泌量和表达量与猪胴体品质具有紧密相关关系[22]。
2解偶联蛋白3(Uncouplingprotein3,UCP3)基因
猪解偶联蛋白3基因属于UCP基因家族,位于9号染色体上,其开放阅读框长度为936 bp,编码331个氨基酸的蛋白质。猪UCP3具有6个跨膜功能域和一个嘌呤核苷酸结合区[23,24]。UCP3是分布于线粒体内膜的质子转运载体,介导内膜外侧的质子内流形成质子漏,降低内膜两侧H+电化学梯度,造成氧化过程与ADP磷酸化过程解偶联,质子所带有的能量以热的形式释放,是机体耗能产热的重要方式[25]。在骨骼肌和脂肪组织中表达的UCP3具有显著影响肌肉和脂肪能量转换的基因效应,可能是肉质性状的主效基因或与主效基因紧密连锁的标记基因。
对猪UCP3基因的部分编码区进行了测序,在395 bp处发现了1个c SNP位点[26],该c SNP位点发生G-A突变,并导致相应编码氨基酸由Gly-Arg的改变。该位点可以被限制性内切酶SmaⅠ识别。利用PCR-RFLP方法,发现AA、AB和BB 3种基因型,其中A等位基因频率0.56,B等位基因频率0.44。UCP3 SmaⅠ位点主要表现为加性效应,基因型AA降低膘厚,提高系水力和降低失水率,但同时也降低肌内脂肪含量。猪UCP3基因5'调控区序列的AvaⅠ酶切位点与肌肉和脂肪的能量转化显著相关[27]。在基因调控区序列发现一个AvaⅠ酶切位点,该酶切位点与猪的不同能量代谢类型极显著相关[28]。通过PCR-SSCP方法,证实基因与胸腰椎间膘厚、系水力和失水率呈显著相关[29]。因此,UCP3基因的遗传变异,有可能导致机体能量消耗程度的差异,从而可能导致个体间的体脂代谢、体脂含量乃至脂肪沉积性状的改变。寻找UCP3基因的多态性,研究其对脂肪沉积和肉质性状的遗传效应,有可能为今后猪的遗传品质改良提供一定的遗传学依据。
3叉头转录因子O亚家族1(ForkheadtranscriptionfactorgroupO1,FoxO1)基因
叉头(forkhead box, Fox)转录因子是对异常头果蝇突变体的研究中发现的,在众多的家族成员中,研究最深入的是叉头转录因子O亚家族(forkhead transcription factor group O, Fox O)[30]。 Fox O在哺乳动 物中的成 员包括Fox Ol、 Fox O2、 Fox O3和Fox O4,主要参与细胞周期调控、DNA修复等。利用RT-PCR方法,以提取猪脂肪组织总RNA为模板,在成功扩增得到长度为414 bp的猪Fox Ol基因c DNA部分序列的基础上,运用RACE技术成功得到了猪Fox Ol基因c DNA全长[31]。
利用RT-PCR法检测6月龄八眉、长白和长×八杂交猪后腿部比目鱼肌、腓肠肌和趾长伸肌中Fox Ol基因的表达量[32],结果发现,Fox Ol基因在八眉猪和杂交组合猪骨骼肌中的表达量均显著高于长白猪, 表明Fox O1很可能对猪骨骼肌的含量进行负调控, 此基因很可能是导致不同经济类型猪肌肉发育过程产生差异的主要基因之一[33],同时还发现在以IIb型纤维为主的趾长伸肌中表达丰度远远高于以I型纤维为主的比目鱼肌,表明Fox Ol基因的表达与I型肌纤维的含量成反比,Fox Ol基因调控不同经济类型猪品种骨骼肌的发育。同年,又研究发现Fox Ol和成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen, Myo D)基因m RNA的表达在不同经济类型猪肌肉发育中存在负相关,相关系数为0.728[34]。利用RT-PCR、Western blotting等检测在猪成肌细胞分化过程中Fox O1早期和晚期Myo D及肌细胞生成素 (myogenin, Myo G)的表达变化,结果发现,尽管Fox O1 m RNA表达量显著增加,但总蛋白量变化不显著,显著上调了其磷酸化水平[35];同时,高表达Fox O1的猪成肌细胞中,Myo D蛋白变化不显著, Myo G水平却明显降低,表明猪成肌细胞的分化时间推迟及被抑制分化很可能是因为Fox O1作用的结果。Fox O1在180日龄大白猪比目鱼肌、趾长伸肌、 腓肠肌和背最长肌中的表达差异均不显著,其蛋白表达与My HC各亚型呈显著相关,用青霉素(wortmannin)处理原代培养的猪骨骼肌成肌细胞的第3和5天时,Fox O1蛋白与My HC I、My HC IIa和肌细胞增强因子2c(MEF2c)表达均呈显著负相关[36],表明Fox O1很可能是通过抑制My HC I的表达来调控肌纤维类型。Fox O1很可能是通过抑制神经钙蛋白(calicineurinm, Ca N)/活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NEAT)信号通路或Ca N/ MEF2信号通路对I型肌纤维的表达进行负调控[37]; 2、5月龄民猪和长白猪的肾周脂肪中Fox Ol基因表达量极显著高于1、6、8月龄,并发现Fox O1可能通过抑制PPARγ、 CCAAT区/增强子结 合蛋白 α (CCAAT/ enhancer binding protein α, C/EBPα) 基因的表达来减少脂肪沉积[38]。
4钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin,CAST)基因
钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin, CAST)基因是一种特定的、内源性的、需钙激活的蛋白酶抑制剂,被定位于猪的2号染色体上[39]。CAST基因与肌肉嫩度存在极其紧密的联系,其产物对于肌肉生长过程中蛋白质的更新具有重要作用。在细胞内普遍存在着需钙蛋白酶(calpain)的蛋白水解系统,大量参与到生长和代谢过程。钙蛋白酶系统主要包括钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白。钙蛋白酶根据其表现半最高活性所需的Ca2 +浓度分为2类,钙蛋白酶1 (u-calpain)和钙蛋白酶2(m-calpain)。活体屠宰后较低浓度的Ca2+就可以激活u-calpain,使其表现出蛋白水解酶活性。如果附近有CAST,就可迅速与u-calpain结合,抑制蛋白酶的活性,从而抑制肌肉内蛋白质的降解,促进蛋白质的合成,提高肌细胞生长速度[40]。猪肉的嫩度与CAST/u-calpain的活性比值有密切的联系,活性比值越大,CAST的量相对越大,钙蛋白酶抑制蛋白对钙蛋白酶的抑制作用越强,肉的嫩度越好[41]。对125头杂交猪进行多态位点研究并分析其对猪的肉质和背膘的影响时发现, 其中A、B 2个位点均对肌内脂肪含量有显著影响, B、C、D 3个位点均对背膘厚有显著影响[42]。对3个猪品种钙蛋白酶抑制蛋白基因多态性进行了研究,结果发现钙蛋白酶抑制蛋白基因的一定基因型与猪肉的嫩度存在相关性。由此看来,钙蛋白酶抑制蛋白主要通过影响猪肉的嫩度来改变猪肉的肉质性状[43]。
5促黑激素皮质素4受体(Melanocortin-4receptor,MC4R)基因
促黑激素皮质素4受体(melanocortin- 4 receptor, MC4R),由332个氨基酸残基组成,是跨膜G-蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors, GPCRs)超家族的成员之一[44]。MC4R能够通过中枢神经系统调节体重,主要表现为抑制摄食,导致血糖、胰岛素和瘦素水平降低,从而减少体脂、降低体重,在动物的体重、能量稳态和采食量的调控中具有重 要作用[45]。 猪MC4R基因位于1号染色体q22-27处,与猪1号染色体上的数个标记明显连锁,用两点连锁分析得到的两个离MC4R基因最近的连锁标 记是SO3113(0, 17.76)和S0082(0.05, 14.74)[46]。
MC4R基因型与背膘厚和生长率以及采食量呈强相关,AA基因型背膘比BB基因型薄9%,BB基因型比AA基因型日增重高37 g/d,且差异显著[47]。不同的MC4R基因型间肉质指数、最后肋骨处背膘厚、腰部背膘厚、平均背膘厚、平均日增重、肌肉中乳酸的集中差异显著[48]。猪MC4R基因第7跨膜结构功能区域的一个高度保守区存在G-A错义突变,产生Taq I酶切位点的改变,这一突变使MC4R蛋白第298位氨基酸天冬氨酸被天冬酰胺代替[49]。对不同品系猪该位点的多态与生产性能关系的研究,证实了MC4R基因型与背膘厚、生长率和采食量呈强相关[50]。猪MC4R基因存在一个氨基酸编码的错义突变,可导致猪胴体重和采食量显著变化[51]。
综上所述,Leptin、UCP3、Fox O1、CAST、MC4R基因对猪的脂肪沉积与代谢均起重要作用。尽管对这些基因的结构和表达调控规律有了一些认识,但具体调控机理和分子机制还有待于从细胞水平和分子水平上作进一步研究[52]。另外,希望在不久的将来能利用这些猪肉质性状主要功能基因进行肉质改良等育种工作,为优质肉质性状的猪品种的育种实践提供依据,从而获得更高品质的猪肉来满足人们的需求[53]。
摘要：猪肉品质性状改良是当今遗传育种界的研究热点之一,脂肪性状是肉质的一项重要指标。本文综述了影响猪脂肪性状的几个功能基因,即瘦素(Leptin)基因、解偶联蛋白3(UCP3)基因、叉头转录因子O亚家族1(Fox O1)基因、钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因、促黑激素皮质素4受体(MC4R)基因的研究进展,以期为改善猪脂肪性状提供参考。
基因功能 篇5
文章就乙烯受体家族成员的`结构、功能特异性和表达的差异研究进展做了介绍.
作 者：王中凤 应铁进 张英 WANG Zhong-Feng YING Tie-Jin ZHANG Ying 作者单位：王中凤,张英,WANG Zhong-Feng,ZHANG Ying(广西工学院生物与化学工程系,广西,柳州,545006)
应铁进,YING Tie-Jin(浙江大学生物系统工程与食品学院,杭州,310029)
基因功能 篇6
摘 要 本课题从拟南芥中克隆了超长链脂肪酸代谢相关的功能基因AtKCS12，转入酵母（INVSC1）表达系统中表达，检测酵母细胞中脂肪酸组成。脂肪酸组成结果分析表明，AtKCS12使酵母中棕榈酸（16∶0）和硬脂酸（18∶0）的相对含量显著增加了，十八烯酸（18∶1）的相对含量显著减少了。这些结果共同提示，AtKCS12表达的蛋白不能利用酵母中的脂肪酸作为催化底物合成超长链脂肪酸，或者AtKCS12蛋白无酶活性。
关键词 拟南芥；β-酮脂酰辅酶A合成酶；超长链脂肪酸；表达载体
中图分类号：S565.4 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.21.109
超长链脂肪酸（VLCFA）是生物体中碳原子数超过18碳的脂肪酸，直接参与油料作物中甘油脂、生物膜膜脂和鞘脂的生物合成，同时也为角质层蜡质的生物合成提供前体物质[1]。在超长链脂肪酸合成过程中，KCS酶是催化第一步缩合反应的调控延伸反应的限速酶[2]。它以酰基-CoA（≥C18）和丙二酰-CoA为原料，合成碳链延伸了2个C的β-酮脂酰-CoA[3]。研究显示，拟南芥KCS基因家族有21个成员，依据氨基酸序列的同源性可将21个成员划分为FAE1、KCS1、FDH、CER6四个亚组[3]；而依据基因组构成、亲缘关系、蛋白质的拓扑结构和3D构象，21个基因成员又可分为8个亚类[4]。这些KCS基因在植物体的不同组织、器官特异性表达，并具有底物特异性。
虽然KCS家族在植物形成长链脂肪酸中发挥重要功能已有报道，部分家族成员的具体作用机制也已被证实，但其成员AtKCS12在不同种类脂肪酸形成过程的功能却鲜有报道。本研究利用分子遗传的方法，对在拟南芥中编码脂肪酸代谢途径中关键酶的基因AtKCS12的功能进行研究，为下一步克隆油料作物中的AtKCS12，改善油料作物的含油量，提供更多长链以及超长链脂肪酸打下基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
野生型拟南芥（Arabidopsis）的种子采自本实验室。TIANScript cDNA第一链合成试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；INVSc1酵母本实验室保存；转化入pYES2的E·Coli本实验室保存。其他相关试剂购自上海生物工程公司。
1.2 拟南芥RNA提取及cDNA合成
拟南芥叶片的RNA采用CTAB-LiCl法提取[5]。cDNA合成参见TIANScript cDNA第一链合成试剂盒（TIANGEN，China）。
1.3 酵母表达载体的构建
分别用SacI和XbaI，SacI和EcoRI两种酶对KCS-pEASY质粒和pYES2质粒进行酶切，T4连接酶连接，重组质粒的转化。
1.4 重组质粒转入INVSc1酵母细胞
INVSc1酵母在缺His、Leu、Try、Ura的缺陷培养基上不能生长。pYES2质粒可合成尿嘧啶，故用尿嘧啶缺陷筛选。挑单个菌落接种于20 mL YPD液体培养基中，将1μg质粒DNA，10μL变性鲑鱼精子DNA（10 mg/mL）于上述酵母溶液混匀；加入1×LiAc/40%PEG-4000/1×TE，混匀；加入88 μLDMSO混匀，42 ℃加热7 min；
12 000 rpm离心10 s，重悬细胞，12 000 rpm再离心；涂布于SC-U固体培养基。
1.5 酵母脂肪酸的分析
收集酵母菌体后进行酵母脂肪酸的提取与甲酯化[6]。石英毛细管柱HP-5（30 m×0.35 mm，0.25 μm），程序升温：从180 ℃开始，以5 ℃/min升到230 ℃，保持20 min；载气为He，柱流量1.5 mL/min，进样口温度230 ℃，检测器温度为FID为230 ℃，分流比30∶1。色谱柱信息：Agilent Technologies，Inc。货号：125-3237。型号：
DB-FFAP 30 m×0.530 mm，0.5Micro[7]。
1.6 数据处理
采用SAS 6.0统计软件分析，比较转基因酵母与对照组酵母中脂肪酸含量的差异。若概率P<0.05，则认为结果是显著的；若P<0.01，则认为结果是极显著。
2 结果与分析
2.1 AtKCS12的克隆和序列分析
克隆AtKCS12 cDNA序列片段（见图1A），将其连接到pEASY 载体后双酶切（SacI和EcoRI）验证。结果如图1B所示，双酶切（SacI，XbaI）和（SacI，EcoRI）后两条带的大小分别为1 500 bp左右与5 900 bp左右，结果与目的基因预期分子量大小相符合。
AtKCS12含有一个1431bp的开放阅读框架（ORF），编码一个含476个氨基酸的多肽。AtKCS12基因编码的氨基酸多肽，是缩合酶超家族的一员，包含查尔酮合酶（CHS_like）高度同源区域，该区域为91-1266bp编码的392个氨基酸序列，结果表明，该cDNA序列很可能编码脂肪酸代谢途径中3-ketoacyl-CoA synthase。
2.2 酵母转化子鉴定
将目的基因-pYES2重组表达载体转入INVSc1酵母中，转化效果良好，随机挑选4个单菌落将其进行扩培，提取质粒并进行PCR验证是否成功将表达质粒转入酵母，结果见图2。
由图2可以看出，含目的基因的pYES2重组表达质粒成功转入酵母中，接下来将通过诱导培养基诱导目的基因表达，收集菌体，进行脂肪酸的提取与检测分析。
2.3 AtKCS12功能分析
利用气相-质谱联用技术（GC-MS）分析酵母主要脂肪酸种类以及总脂肪酸含量。分别培养、诱导酵母转化子和对照酵母，收集菌体，提取油脂，经甲酯化后进行气相质谱分析，主要有4个脂肪酸甲酯的峰，分别为C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1。将所得的数据用SAS软件分析，比较转基因酵母与对照组酵母脂肪酸含量的差异。分析结果如表1，数据以平均值标准方差的形式表示，而*表示样品与对照组之间的差异显著，**表示样品与对照组之间的差异极显著。
AtKCS12转基因酵母和对照的脂肪酸组成分析结果如图3所示。可以看出，与对照组相比，AtKCS12在转基因酵母中表达使得酵母中的棕榈酸（16∶0），硬脂酸（18∶0）的相对含量增加了4.5%，22.78%，十八烯酸（18∶1）的相对含量减少了5.85%，棕榈烯酸（16∶1）的含量变化不显著。
3 讨论
本实验克隆了拟南芥cDNA文库中的AtKCS12基因，并在酵母（INVSc1）中进行表达。分析脂肪酸组成发现，转基因酵母和空白对照中只有C16∶0、C16∶1、C18∶0和C18∶1这4种长链脂肪酸，与空白对照相比，转AtKCS12基因的酵母没有检测到超长链脂肪酸的合成。推测AtKCS12蛋白不能利用酵母中的C16∶0、C16∶1、C18∶0和C18∶1脂肪酸作为催化底物合成超长链脂肪酸，或者在酵母中异源表达的AtKCS12蛋白没有酶活性。
参考文献
[1]郑德松.油脂合成过程中甘油三磷酸脱氢酶基因及乙酰辅酶A羧化酶基因的克隆与鉴定[D].济南：山东农业大学，2012.
[2]周丹，赵江哲，柏杨，等.植物油脂合成代谢及调控的研究进展[J]. 南京农业大学学报，2012，35（5）：77-86.
[3] Wu G， Wu Y， Xiao L， et al. Zero Erucic Acid trait of Rapeseed （Brassica napus L.） Results from a Deletion of Four Base Pairs in the Fatty Acid Elongase 1 Gene[J].Theoretical and Applied Genetics，2008， 16（4）：491-499.
[4] Costaglioli P， Joubès J， Garcia C， et al. Profiling Candidate Genes Involved in Wax Biosynthesis in Arabidopsis Thaliana by Microarray Analysis[J]. Biochimica et Biophysica Acta （BBA）-Molecular and Cell Biology of Lipids， 2005， 1734（3）： 247-258.
[5] Joubès J， Raffaele S， Bourdenx B， et al. The VLCFA Elongase Gene Family in Arabidopsis Thaliana： Phylogenetic Analysis， 3D Modelling and Expression Profiling[J]. Plant molecular biology， 2008， 67（5）： 547-566.
[6]Paul S， Gable K， Beaudoin F， et al. Members of the Arabidopsis FAE1-like 3-ketoacyl-CoA Synthase Gene Family Substitute for the Elop Proteins of Saccharomyces Cerevisiae[J]. Journal of Biological Chemistry， 2006， 281（14）： 9018-9029.
[7]Chi X，Yang Q，Pan L， et al. Isolation and Characterization of Fatty Acid Desaturase Genes from Peanut （Arachis hypogaea L.）[J].Plant Cell Reperts，2011（30）：1393-1404.
基因功能 篇7
关键词：转基因,免疫,增殖,IL-2,IFN-γ
近年来,转基因动物的研究发展比较迅速,获得了多种转基因动物,但转基因家畜商业化育种还面临着许多问题。例如,目的基因的随机插入和异位表达对转基因动物及其后代的生产性能、生理健康、免疫力水平等方面还有许多问题需要解决[1,2]。目前,国内外关于转基因动物的研究主要集中在生长发育、血液生理生化指标检测、生物安全性评价、外源基因遗传和表达稳定性等方面,外源基因的插入对宿主免疫功能的影响报道较少,而这恰恰又是转基因动物育种过程中的一大障碍[3,4,5,6]。
试验以实验室现有的转牛Myf6基因的子一代小鼠为研究对象,采用MTT法检测小鼠脾脏T淋巴细胞、B淋巴细胞的增殖能力,用实时荧光定量PCR法分别检测IL - 2和IFN - γ mRNA相对表达量的变化,来评估转基因小鼠脾脏的免疫功能,以期为外源基因的转入对动物免疫功能的影响提供证据。
1材料
1. 1试验动物
转牛Myf6基因原代FVB品系小鼠,由广州赛业生物科技公司提供; 转基因雌鼠与野生型FVB公鼠杂交获得子一代小鼠,经实验室鉴定分为Myf6阳性鼠( 命名为Myf6鼠1 ~ 5号) 和阴性对照鼠,每组各5只。
1. 2主要试剂
TRIZol试剂盒,购自美国Invitrogen公司; 刀豆蛋白A( Con A) 、脂多糖( LPS) 、噻唑蓝( MTT) ,购自Sigma公司; 百泰克反转录试剂盒 ( Bio Teke super RT Kit) 、Power 2 × SYBR Real - time PCR Premixture,均购自北京百泰克生物技术公司。
2方法
2. 1脾淋巴细胞悬液的制备
参照参考文献[7 - 9]的方法: 小鼠颈椎脱臼处死,无菌取脾脏,用PBS漂洗后,去掉脾脏两头,剪碎,用400目金属筛网过滤,反复吹打制备单细胞悬液,1 000 r/min离心5 min; 弃上清液,加入相同体积的红细 胞裂解液 ( Tris - NH4Cl ) 处理2 min, 1 000 r / min离心5 min; 弃上清液,再用培养液洗2次,重悬; 用台盼蓝染色法计算活细胞数,如活细胞数在95% 以上,稀释成1 × 107个/m L的细胞悬液, 备用。
2. 2 T淋巴细胞、B淋巴细胞增殖试验———MTT法
在96孔细胞培养板上,空白孔只加RPMI - 1640培养液200 μL; 对照孔为细胞悬液100 μL + RPMI 1640培养液100 μL; T淋巴细胞试验孔为细胞悬液100 μL + 含20 μg / m L Con A的RPMI - 1640培养液100 μL; B淋巴细胞试验孔为细胞悬液100 μL + 含10 μg / m L LPS的RPMI - 1640培养液100 μL,每个样品重复3次。在37 ℃、5% CO2的培养箱内培养21 h,小心吸去 上层培养 液100 μL,分别加入5 mg / m L的MTT( 溶解于RPMI - 1640) 溶液10 μL继续培养3 h; 最后加入DMSO 100 μL,移到37 ℃ 恒温箱作用30 min; 用酶标仪在490 nm波长读取各孔OD490值,代入计算公式“淋巴细胞相对增殖指数 = ( OD试验孔组- OD空白孔组) /( OD对照孔组- OD空白孔组)[10]” 进行计算。
2. 3脾脏细胞因子mRNA表达量的检测
2. 3. 1引物的设计根据Gen Bank中已公布的小鼠( Mus musculus) 基因序列,应用Primer Premier 5. 0软件设计荧光定量引物( 见表1) ,并由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
2. 3. 2样品RNA的提取以及反转录将在液氮中保存的脾脏样品取出,置于盛有液氮的研钵中,研成粉末,转移到1. 5 m L的Eppendorf管中,每100 mg加入1 m L的TRIZol,严格按照TRIZol法提取组织总RNA。在分析验证纯度和完整性后,按照百泰克反转录试剂盒操作方法,将RNA样品反转录成c DNA,并置于 - 20 ℃保存,备用。
2. 3. 3实时荧光定量PCR检测用SYBR Green Ⅰ 方法进行实时荧光定量PCR,以 β - actin为内参基因,样品按照百泰克Power 2 × SYBR Real - time PCR Premixture说明书中二步法进行PCR扩增,程序如下: 95 ℃预变性2 min; 95 ℃变性15 s; 60 ℃ 退火/ 延伸31 s,共40个循环。应用ABI 7300 System进行数据分析。本试验目的基因和内参基因的扩增效率都在95% 左右,故可用2- ΔΔCt相对定量法[11],其计算公式为: ΔΔCt = ( 待测组Ct目的基因- 待测组Ct内参基因) ( 对照组Ct目的基因- 对照组Ct内参基因) 。
3数据的统计与分析
应用SPSS 18. 0软件,采用单因素方差分析法对试验数据进行统计与分析,结果以“± s”表示,P < 0. 05为差异显著,表示有统计学意义。
4结果与分析
4. 1小鼠脾脏T淋巴细胞、B淋巴细胞的增殖
本试验分别对阴性对照鼠和Myf6鼠( n = 5) 进行脾脏T淋巴细胞、B淋巴细胞增殖试验,将所得的OD值( 每个样品重复3次) 代入2. 2中的计算公式, 得到各组淋巴细胞的增殖指数( 其大小可反映淋巴细胞的增殖能力) ,统计结果见表2。
注: 与阴性对照鼠比较,同列数据肩标**表示差异极显著( P < 0. 01) 。
4. 2脾脏总RNA的抽提结果
采用TRIZol进行组织样本总RNA的抽提,结果可见,3组条带依次为28 S、18 S、5 S; 对抽提的总RNA样本进行吸光度检测,样品OD260 /280值为1. 83 ~ 1. 90,证明样品完整性和纯度良好,可用于反转录操作。
4. 3脾脏组织细胞因子的表达量差异
为了分析脾脏细胞因子的表达差异,对完成反转录的所有样本的c DNA进行96孔板的实时荧光定量检测,每个检测样品重复3次,得到Ct值,平均值在1. 0以下,说明重复性良好,熔解曲线出现单一峰值, 证明样本均被成功特异性扩增,见图1、图2、图3。
根据获得样本数据,代入2. 3. 3公式,结果见图4、 图5。
由图4可以看出,Myf6小鼠的IL - 2 mRNA相对表达水平极显著低于阴性对照鼠( P < 0. 01) ,各转基因小鼠间差异不显著( P > 0. 05) 。
由图5可以看出: 与阴性对照鼠比较,转Myf6鼠的IFN - γ mRNA相对表达水平极显著低于阴性对照鼠( P < 0. 01) ,具有统计学意义。Myf6鼠之间比较不具有统计学差异。
5讨论
在转基因动物研究中,发现通过胚胎的体外操作获得的转基因动物存在抵抗病力低的情况。在研究转基因动物过程中,也出现了这种情况,转入的基因是与肌肉发育相关的基因,这些基因与免疫功能无关。有关外源基因与动物机体抵抗力之间关系的研究还很少,因此,试验选择转Myf6基因的FVB雌鼠与FVB野生雄鼠杂交获得的子一代小鼠来研究外源基因转入与机体抵抗力之间的关系。选择子一代小鼠可以消除转基因操作过程中因胚胎的体外操作对小鼠造成的影响。试验动物经PCR检验分成带有Myf6基因的试验鼠和不带Myf6基因的阴性对照鼠, 尽量消除小鼠因遗传背景、日龄、饲养管理等外界客观因素的影响。
注: 与阴性对照鼠相比, ** 表示差异极显著( P < 0. 01 ) 。
注: 与阴性对照鼠相比, ** 表示差异极显著( P < 0. 01 ) 。
脾脏是机体最大的免疫器官,同时是T淋巴细胞、B淋巴细胞聚集的部位。T淋巴细胞、B淋巴细胞具有特异性抗原受体,接受抗原刺激后能发生活化、增殖、分化,产生细胞免疫和体液免疫等特异性免疫应答,其增殖能力的变化可以作为衡量免疫反应能力的一个重要指标[7,8,9]。试验通过MTT法检测了转基因小鼠脾脏内的T淋巴细胞、B淋巴细胞的增殖能力,证明转基因小鼠的T淋巴细胞、B淋巴细胞增殖能力显著低于对照鼠。贺晓玉等[3]在2011年报道绿色荧光蛋白转基因小鼠的脾脏指数显著高于非转基因小鼠,中枢免疫器官胸腺出现明显的病理变化; 方天等[12]也在2012年报道了绿色荧光蛋白转基因裸鼠的脾脏中淋巴细胞数量明显减少,也都证明外源基因的插入对小鼠的脾脏功能有影响。本试验结果表明,外源基因Myf6的插入对机体的细胞免疫和体液免疫功能都具有抑制作用。
IL - 2是主要由活化Th1细胞合成分泌的一种有效T细胞生长因子,IL - 2能增强T细胞的杀伤活性,在体外可以与IL - 4、IL - 5、IL - 6共同诱导细胞毒性T细胞的产生,并使其活性大大增强。IFN - γ 主要由活化的T细胞产生,可诱导B细胞向分泌Ig G型抗体转换从而阻断病原微生物进入宿主细胞,而Ig G是参与体液免疫应答中分布最广泛、持续时间最长的免疫球蛋白。IL - 2、IFN - γ mRNA表达水平的高低反映机体免疫功能,在机体免疫应答中起关键作用[13,14]。试验通过实时荧光定量PCR检测了小鼠脾脏中IL - 2、IFN - γ mRNA表达量,证明插入牛Myf6基因的小鼠IL - 2表达量显著降低,IFN - γ mRNA表达量也出现了显著下降。有人通过试验证明免疫低下的小鼠T淋巴细胞、B淋巴细胞增殖能力下降,IL - 2和IFN - γ mRNA表达量也降低[15,16], 这与本试验的结果一致,说明Myf6基因的转入影响了小鼠脾脏的免疫功能。
外源基因插入宿主基因的情况非常复杂,需要考虑的因素有外源基因的大小、插入的拷贝数、插入位点以及插入后的表达等,具体如何影响宿主基因的表达进而影响动物机体免疫功能还有很多工作要做。
6结论
基因功能 篇8
微小核糖核酸(microRNA,简称miRNA)是一类特殊的非编码单链小分子RNA,由19~25个核苷酸组成。大量研究证实,miRNA可通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA而阻碍其翻译,从而在生物生理、发育、代谢以及疾病发生、发展、转归过程中起着广泛而超乎想象的作用,现已作为药物干预的新靶点而成为生物医学研究的热点[2,3]。特别是近年来的研究证实,植物miRNAs结构稳定,能跨物间“穿梭”。丹参、地黄、米碎花等中药中的一些miRNAs均可以通过水煎口服、吸收进入血内,并具有显著的生物活性和组织靶向性[4,5,6]。因此,miRNAs可能是不同于次生代谢产物的、很重要的一类新的中药药效物质,但此方面的研究目前还几乎没有开展。
地黄(Rehmannia glutinosa Libosch)为玄参科地黄属Rehmannia Libosch.ex Fisch.et Mey多年生草本植物,是著名的“四大怀药”之一,具有滋阴清热、补血止血等功效,为清热凉血要药,用于温热病热入营血,身热口干、舌绛或红等症状,为多种方剂配伍要药及中成药的主要原料。现代研究表明,其主要含有梓醇、地黄苷、红景天苷等化学成分[7],具有抗炎和神经保护等多种药理活性[8,9,10]。但这些研究发现与其“清热凉血”的主治功效尚相去甚远,尚不能阐明其药效物质基础及作用机制。因此,本研究采用高通量测序的方法,从miRNA角度揭示地黄的药效物质基础,探讨地黄核酸类物质对机体生理功能的影响,拓展现有以次生代谢成分为主体的药效物质研究模式,为目前药效物质尚不明确的中药研究提供一种有益的尝试,也为具有我国特色的中药miR-NA新药研发提供依据。
1 材料
1.1 实验动物与药材
雄性清洁级ICR小鼠,体质量18~22 g,由浙江省实验动物中心提供,实验动物许可证号:SCXK(浙)2014-0001。地黄:采自河南焦作,经浙江中医药大学俞冰副教授鉴定为R.glutinosa R.Brown新鲜块根。
1.2 实验仪器与试剂
Hiseq 2500高通量测序仪:Illumina,USA;Bioanalyzer 2100生物分析仪:Agilent,USA;Qubit 2.0核酸定量仪:Life technologies,USA;荧光定量PCR仪:BIO-RAD,USA。RNA质检试剂盒:Agilent,USA;总RNA纯化试剂盒:LC Science,USA;动物RNA纯化试剂盒:LC Science,USA;Trizol reagent:Invitrogen,USA;高通量测序试剂盒:Illumina,USA。
2 实验方法
2.1 样品制备
实验分3组,地黄原植物组、空白组和喂食地黄组。其中,空白组和喂食地黄组,每组各5只小鼠。取2 g新鲜采集的地黄块根迅速置-80℃冰箱冻存,用于后续的地黄miRNA提取。另取50 g新鲜采集的地黄块根,在冰浴中碾磨,制成1 g生药/m L浓度的匀浆。将地黄匀浆灌胃给予小鼠(预先禁食12 h),按10 g生药/kg体质量给药(相当于临床等效剂量)。分别于灌胃后1 h,随机挑选5只喂食地黄的小鼠,取血分离血浆置于-80℃保存。同时,分别于上述各时间点随机取5只小鼠作空白对照,分离制备血浆,进行后续高通量测序。
2.2 miRNA c DNA文库构建及高通量测序[11]
采用Illumina试剂盒,将总RNA样品经富集、纯化,c DNA合成及PCR扩增后,获得小RNA文库,经文库质量检测合格后上机进行高通量测序分析。测序所得35个核苷酸及以下序列存在很多无用信息,需要通过去接头序列、低质量序列、污染及进行序列统计等过程来完成初级分析,然后与美国国家生物技术信息中心Gene Bank上玄参科植物RNA数据作为查询库,滤除非miRNA的小核酸序列,最后只保留16~30个核苷酸的高质量miRNA序列。对于剩余序列,则分别截取完全一致的RNA匹配序列位点上游或下游各300个核苷酸的序列,用RNAfold软件进行二级结构预测。当候选miRNA位于二级茎环结构的臂上,并满足miRNA的判断要求,则确认为地黄特有的miRNA。
经过质量控制程序处理和一系列非目标序列过滤处理后,分别构建地黄miRNA文库、喂食地黄小鼠血浆miRNA文库及空白小鼠血浆miRNA文库,用于后续数据分析。
2.3 地黄药效miRNAs的Q-PCR验证[12]
筛选喂食地黄与不喂食地黄小鼠血浆中的差异miRNA,并与地黄miRNA作比对,获得通过喂食进入血液的地黄miRNA,即地黄药效miRNA。采用荧光定量PCR法,检测地黄miRNA、喂食地黄小鼠血浆miRNA和空白小鼠血浆miRNA的表达丰度,验证小鼠体内检出的地黄miRNA。
2.4 miRNA靶基因预测及其功能分析
使用Target Scan、miRanda两款软件对筛选出的miRNAs分别进行靶基因预测。对两款软件预测出的靶基因分别按照每款软件的评分标准进行筛选。Target Scan算法中去除context score percentile小于50的靶基因,miRanda算法中去除最大自由能(Max-Energy)大于-10的靶基因。最后取交集作为目标miR-NAs的最终靶基因。最后对各个miRNA的靶基因分别进行Gene Ontology(GO)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)pathway分析,构建miRNA与靶基因的网络信号图。
3 实验结果
3.1 样本保守miRNA的鉴定及地黄新miRNA的发现
依据miRNA基因在动植物中广泛保守这一特性,按照生物信息分析流程,将地黄、小鼠全血样本高通量测序获得的原始数据与miRBase数据库及相关基因组序列比对,筛选分析后获得样本已知miRNA及全新的miRNA基因共357个。进一步分析鉴定喂食地黄与不喂食地黄小鼠血浆中的差异miRNA,并与地黄miRNA作比对,从上述差异miRNA中筛选得到2个地黄miRNA,见表1。进一步采用Q-PCR法,验证上述2个miRNA在地黄及喂食地黄小鼠血浆中的表达丰度,最终鉴定出2个地黄miRNA(表1中的miR2118、miR5290),可在地黄及喂食地黄小鼠血浆中稳定表达,见图1。
定位:成熟miRNA在前体中的定位;LM:成熟miRNA的长度;LP:前体序列的长度。
3.2 药效microRNA的靶基因预测及其功能分析
对上述鉴定所得的2个地黄miRNAs采用Target Scan与MiRanda软件,以人类mRNA为靶标,进行靶基因预测,共预测得到这2个地黄miRNA可能调控的3604个靶基因,并进一步对这些靶基因经GO分析,可知鉴定所得的2个地黄miRNA可能调控的靶基因的宏观功能范畴。发现这些靶基因主要在生化过程、细胞成份和分子功能三大区域发挥功能,见图2,参与转录调控、生物大分子合成代谢调控、磷酸化反应及胞内蛋白激酶级联反应、蛋白质转运及胞内离子运输等重要的生物学过程,发挥金属离子通道活化调控、跨膜转录因子活化、离子通道活化调控、胞内蛋白激酶信号传导等生物学功能。
KEGG通路数据库可提供生化物质相互转化所有可能的代谢途径,通过Pathway显著性富集能确定差异表达基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径[13]。采用DA-VID程序对2个地黄miRNA进行预测靶基因的生物学通路KEGG分析,以Pvalue of Fisher’s Exact Test<10-3为基准,筛选出地黄miRNA主要参与的8条信号通路,分别是慢性骨髓白血病、MAPK信号通路、神经胶质瘤、细胞内吞、神经营养因子信号通路、轴突传递、癌症相关信号通路、Hedgehog信号通路等,见图3。其中,图4为MAPK信号通路示意图(灰色标记部分为miRNA可能干预的靶点),是地黄药效miRNA抗炎效应的主要作用通路。利用cytoscape软件绘制MAPK信号通路的miRNAs-gene网络结构图,见图4,利用结构图论的方法对网络中miRNA在网络中的调控地位进行评价,评价的标准以miRNA在网络中的度(Degree)来衡量,度表示网络中的miRNA调控靶基因的数目,度越大代表miRNA调控的靶基因越多,在网络图中miR2218、miR5290的度基本相当,均为核心miRNAs(中间黑色节点代表miR-NA,周围淡灰色代表gene,灰色边代表miRNA对gene有调节作用。)。其主要作用靶标mRNA见图5。
1-12.生化过程;13-20.细胞成分;21-30.分子功能
由图3~5可知,地黄miRNA主要参与MAPK信号通路、细胞内吞、神经营养因子信号通路、轴突传递及癌症相关等信号通路,主要涉及细胞凋亡、炎症介质及下丘脑-垂体-肾上腺轴的神经内分泌调节过程,进而负责调节糖、脂肪、蛋白质三大营养物质及水盐代谢。临床实践证明,生地黄主要用于治疗消渴(糖尿病)、高血脂等代谢性疾病,以及脑缺血等神经性损失疾病,而这些疾病的机制均与以中枢神经系统为核心的神经免疫内分泌系统紊乱有关。因此,笔者推测地黄miRNA可能是其发挥抗血糖、神经保护作用的物质基础。
3讨论
核酸是细胞最基本和最重要的生物大分子。早在15年前国外学者即已开始着手核酸药物的大规模筛选和合成,并主要用于治疗肿瘤和HIV等病[14]。而核酸类成分(如虫草素、香菇太生、腺嘌呤)也是很多中药的活性成分,其广泛存在于冬虫夏草、香菇、灵芝、桑椹、太子参、人参等补益类中药材中,并作为此类中药材的质量控制指标[15,16]。但由于受到核酸结构稳定性及研究关注的侧重,传统认为这类物质并非人体所需,且经过胃肠道消化后吸收进入体内的均不再是具有生物活性的单体小分子,从而限制了核酸类成分的研究与开发。
特别是近年来的研究证实,植物miRNAs结构稳定,能跨物间“穿梭”;丹参、地黄、米碎花等中药中的一些miRNAs均可以通过水煎口服、吸收进入血内,并具有一定的药理活性和组织靶向性[17,18,19]。张辰宇等[20]最新研究表明,来源于金银花的miR-2911可以以进食的方式完整进入动物体内,并且能直接作用于流感病毒,通过抑制流感病毒PB2和NS1基因表达,进而抑制流感病毒的复制来达到治疗流感的目的。因此,miRNAs可能是不同于次生代谢产物的、很重要的一类新的中药药效物质,但此方面的研究目前还几乎没有开展。
本研究以地黄miRNA为模版,在喂食地黄的小鼠全血中通过高通量测序检测获得2个全新的地黄miRNA,且均具有高度表达(拷贝数10为中度表达,10以上为高度表达)。采用荧光定量PCR,确证了上述地黄miRNA可在种间“穿梭”,通过饮食途径、消化吸收进入体内。并进一步通过靶基因预测并经GO与KEGG pathway分析判定,地黄miRNA主要参与MAPK信号通路、细胞内吞、神经营养因子信号通路、轴突传递及癌症相关等信号通路的生物学过程,可对金属离子跨膜运输、神经-内分泌、炎症介质及相关癌症发生、肿瘤增殖等多个转录因子具有调控作用,提示地黄miRNA具有潜在的药效作用,可能是地黄中一类新型的药效物质。然而,地黄miRNA具体调控人体疾病的靶向基因和分子机制还需要进一步的研究证实。更进一步,植物miRNA作为外源性基因进入体内需要考虑类似于转基因食品安全性的问题;由于其药效靶标的多样性,是否会对机体的正常功能产生影响,以及其药效作用的确认还有待于进一步的实验论证。
摘要：目的:筛选地黄microRNAs(miRNAs)类药效物质及其靶基因功能分析。方法:采用高通量测序法,测定地黄、空白小鼠和喂食地黄匀浆液小鼠肝组织及血浆中miRNAs的表达丰度,并与Gene Bank上的植物microRNA数据库比对,结合荧光定量PCR验证,鉴定吸收进入体内的地黄miRNAs,以人类mRNA为靶标,采用Target Scan与MiRanda预测地黄miRNAs的靶基因,并通过GO与KEGG分析靶基因的相关功能。结果:共鉴定出2个地黄miRNAs可吸收进入体内,其主要在生化过程、细胞成分和分子功能3大区域发挥作用,并影响肿瘤、代谢、炎症等相关信号通路。结论:miRNAs可能是一类新型的中药药效物质。
基因功能 篇9
布鲁氏菌(Brucella)是一种革兰氏阴性胞内寄生病原体[1]。由布鲁氏菌引起的布鲁氏菌病是世界范围内十分常见的人畜共患病,该病主要引起人的波状热[2]和持续性感染,以及怀孕母畜流产和公畜睾丸肿大等症状[3];布鲁氏菌病的流行给畜牧业造成了重大的经济损失,并威胁着人类公共卫生安全[4]。像大多数细菌一样,铁是布鲁氏菌必需的微量元素[5,6]。作为胞内病原体,铁的摄取及转运是十分必要的[7],布鲁氏菌必须利用高效的铁转运系统克服宿主细胞的铁限制[8]。布鲁氏菌主要利用两种载体在铁限制条件下进行铁的转运和代谢,一种是结构简单的儿茶酚2,3-二羟基苯甲酸(2,3-DHBA),另一种是更为高效的邻苯二酚铁载体———brucebactin。在根瘤菌的研究中,rir A基因与irr基因共同调控铁的吸收,很多证据表明人类病原菌致病的能力与其摄取铁的能力直接相关[9]。作者课题组前期研究也显示,rir A基因的缺失可引起其胞内生存能力的改变并促进细胞凋亡[10]。然而,布鲁氏菌铁代谢是一个复杂的过程,其分子机制尚未经过实验证实。因此,本研究通过构建布鲁氏菌rir A基因原核表达载体,并检测其反应原性,同时,利用生物信息学分析其蛋白序列,将为研究该基因参与布鲁氏菌铁代谢的转录调控奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验材料
E. coli DH5α 菌株与E. coli BL21 ( DE3 ) 均为石河子大学动物疫病防控兵团重点实验室保存;p MD19 - T simple载体购自Takara公司; 原核表达载体p ET - 28a载体也由作者实验室留存。
1. 1. 2 试剂
2 × Es Taq Master Mix、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、高纯度质粒小提试剂盒均购于北京康为世纪生物公司; DNA分子量Marker、限制性内切酶EcoRⅠ和Xho Ⅰ、T4 连接酶均购自Takara公司; 氨苄青霉素、卡那霉素从Solarbio公司购置; 蛋白Marker; HRP标记的兔抗羊Ig G购于北京康为世纪生物公司; 2% WB无蛋白封闭液购于上海生工生物工程股份有限公司; 其他为国产分析纯。
1. 1. 3 仪器
PCR仪( BIO - RAD) ; 超速离心机( Eppendorf,centrifuge - 5415D) ; 恒温培养箱( DNP - 9162) ; 恒温摇床( HZQ - X100) ; 高速冷冻离心机( Sigma,2 -16K) ; 水浴锅( DKB - 501A) ; 聚丙烯酰胺凝胶电泳仪; 半干式电转仪( BIO - RAD) 。
1. 2 方法
1. 2. 1 目的基因的扩增及克隆
根据Gen Bank上公布的流产布鲁氏菌2308 菌株rir A基因( BAB2_0678) 的序列利用primer premier5. 0 软件设计引物,引物序列为: 上游引物: 5 ’GAATTCATGCGTCTTACCCGTCAGA 3 ’; 下游引物:5’CTCGAGTCATCTGGCGATCCGCGGC 3’。所用的限制性内切酶分别为EcoRⅠ和XhoⅠ,酶切位点序列分别添加下划线表示。引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。以金属浴灭活的流产布鲁氏菌2308 菌液为模板,通过PCR仪扩增。体系为25 μl: 2 × Es Taq Master Mix 12. 5 μl,上下游引物各0. 4 μl,模板2 μl以及dd H2O 9. 7 μl。反应条件为:预变性: 95℃ 5 min,变性: 94℃ 40 s,退火: 59℃ 30s,延伸: 72℃ 50 s,总延伸: 72℃ 8 min,共进行32 个循环。取PCR产物进行1. 5% 的琼脂糖凝胶电泳分析并回收目的片段。将纯化的PCR产物连接p MD19 - T simple载体,16℃ 水浴过夜。 构建的p MD19 - T simple - rir A重组质粒转入E. coli DH5α感受态中,筛选阳性菌落。选取阳性菌落接入氨苄抗性的液体LB培养基中,37℃、200 r/min,摇床中过夜培养。用高纯度质粒小提试剂盒提取质粒,酶切验证,选取正确的阳性菌液保菌,送往上海生工生物工程股份有限公司测序。
1. 2. 2 原核表达载体的构建
将测序正确的菌液,摇菌、提取质粒。利用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切提取的重组质粒p MD19 - T simple - rir A和p ET - 28a载体,经由普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段和酶切开的p ET - 28a载体。将回收的目的片段及切开的p ET - 28a载体在solutionⅠ的作用下,16℃ 水浴过夜。转入E. coli BL21( DE3) 感受态细胞中,涂布含卡那抗性的固体LB中,筛选阳性菌落并进行双酶切验证。
1. 2. 3 重组蛋白的表达及鉴定
选取正确的阳性菌液接入含卡那抗性的液体LB中,37℃ 、180 r / min,摇床中过夜培养。取过夜摇好的菌液按照1: 20 的比例转接入新的含卡那抗性的液体LB中,摇菌至OD值约为0. 4,取出1 ml菌液作为对照,之后加入24 mg /ml IPTG诱导剂( 比例为1∶ 1 000) 于剩余菌液中,分别取诱导2 h、4 h、6 h、8 h各1 ml菌液。包括对照在内,分别离心去除上清,之后加入80 μl dd H2O和20 μl 5 × SDS - PAGE Loading Buffer并混匀,沸水煮沸约10 min,分别取17 μl样品加入15% SDS - PAGE胶的泳道中,进行蛋白检测。
将诱导产物经SDS - PAGE后,转移到NC膜上,200 m A作用45 min。之后,将NC膜转移到杂交瓶中,加入5 ml的TBST清洗3 次,每次6 min。经过2% WB无蛋白封闭液封闭1 h。倒掉封闭液,加入5 ml的TBST清洗3 次,每次10 min。3 次清洗后,按照1∶ 200 的比例加入羊布鲁氏菌阳性血清,37℃ 孵育2 h。加入5 ml的TBST清洗3 次,每次10min。按照1∶ 1 000 的比例加入HRP标记的兔抗羊Ig G,37℃ 孵育2 h,加入5 ml的TBST清洗3 次,每次6 min。向杂交瓶中加入DAB显色液避光作用40 s后,加入去离子水终止显色并照相保存。
1. 2. 4 生物信息学分析目的蛋白
通过TMHMM Server v. 2. 0 软件( http: / /www.cbs. dtu. dk / services / TMHMM / ) 在线分析rir A的氨基酸序列,预测其蛋白跨膜区; 应用Signal P 4. 1Server在线预测rir A蛋白的信号肽( http: / / www.cbs. dtu. dk / services / Signal P / ) ; SOPMA在线软件预测rir A蛋白的二级结构( https: / /npsa - prabi. ibcp.fr / cgi - bin / npsa _ automat. pl? page = / NPSA / npsa _sopma. html ) ; Phyre2 构建rir A蛋白三维结构模型( http: / /www. sbg. bio. ic. ac. uk /phyre2 /html/page.cgi? id = index) ,并利用Antheprot _3D _ viewer软件可视化蛋白的三维结构; 使用PDBsum Generate( http: / / www. ebi. ac. uk / thornton - srv / databases / pdbsum / Generate. html ) 在线对蛋白质结构模型进行评估。
2 结果与分析
2. 1 目的基因的扩增
将PCR产物用1. 5% 琼脂糖电泳进行检测,在462 bp有明显的条带并与rir A基因序列大小相符,如图1 所示。
注: 1 ～ 5，rir A 的 PCR 产物; 6，阴性对照; M，DNA marker。Note:1-5,PCR production of rir A;6,negative control;M,DNAmarker.
2. 2 目的基因重组质粒的酶切验证
使用EcoRⅠ和XhoⅠ限制性内切酶37℃ 水浴双酶切p ET - 28a - rir A重组质粒,经1% 琼脂糖凝胶电泳分析得出,一条带为462 bp,另一条带为5 369 bp,与理论值相符,如图2 所示。后经测序分析,扩增的目的基因与Gen Bank上公布的流产布鲁氏菌2308 菌株rir A基因同源性达到100% 。
注: 1 ～ 4，p ET － 28a － rir A 重组质粒的双酶切鉴定; 5，p ET － 28a－ rir A 重组质粒对照; M，DM10000。Note:1-4,Identification of p ET-28a-rir A recombinant plasmid with double enzyme identification;5,PET-28a-rir A recombinant plasmid control;M,DM10000.
2. 3 重组蛋白的表达与鉴定
IPTG诱导含有重组质粒的E. coli BL21 ( DE3 )菌液,经SDS - PAGE凝胶电泳分析得出6 h时,重组蛋白的表达量最大,如图3 所示。重组蛋白经IPTG诱导后可见约19. 8 k Da的特异性条带,其分子质量与重组质粒表达蛋白的分子质量相当。将经过SDS - PAGE凝胶电泳分析验证的表达重组蛋白转移到NC膜上,采用羊布鲁氏菌阳性血清作为一抗,HRP标记的兔抗羊Ig G作为二抗,进行Western blotting分析。结果可见明显的阳性条带,而作为阴性对照的E. coli BL21( DE3) 、p ET - 28a - E. coli BL21( DE3) 没有出现条带。诱导后在重组蛋白的位置上出现了明显的印迹反应,如图4 所示。
2. 4 目的蛋白的生物信息学分析
通过TMHMM Server v. 2. 0 在线软件分析得出,目的蛋白无跨膜螺旋结构,如图5 所示。Signal P4. 1 Server对该蛋白氨基酸序列分析显示,该蛋白无信号肽,如图6 所示。利用SOPMA在线软件分析该蛋白的二级结构,结果显示,82 个氨基酸参与形成 α- 螺旋,占53. 59% 。延伸链占19. 61% ,有11 个氨基酸参与形成 β - 折叠,占7. 19% ,无规卷曲结构占19. 61% ,如图7 所示。
注: M，蛋白分子 marker; 1，E． coli BL21 ( DE3) ; 2，p ET － 28a －DE3; 3 ～ 7，IPTG 诱导 0、2、4、6、8 h 的 p ET － 28a － rir A。Note:M,Protein molecular marker;1,E.coli BL21(DE3);2,p ET-28a-DE3;3-7,Induced p ET-28a-rir A for 0,2,4,6,8 hours by IPTG.
注: 1，E． coli BL21( DE3) ; 2，p ET － 28a － DE3; 3 ～ 7，诱导 0、2、4、6、8 h 的 p ET － 28a － rir A 重组蛋白。Note:1,E.coli BL21(DE3);2,p ET-28a-DE3;3-7,Induced the recombinant protein p ET-28a-rir A for 0,2,4,6,8 hours.
通过Phyre2 在线服务器构建出并优化目的蛋白的三维结构,如图8 所示。利用PDBsum Generat在线评估,如图9 所示。从Ramachandran图中可以看出,在153 个氨基酸残基中,有121 个处于核心允许区,占87. 7% ,11 个处于额外允许区,占8. 0% ,6个处于最大允许区,占4. 3% ,不可信区域为0。这说明该模型具有一定的可信度。
3 讨论
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属引起的一种全球范围内重要的人畜共患病[11],引起怀孕母畜胎盘炎、公畜附睾炎和睾丸炎等[12]。铁作为重要的微量元素,对于细菌是不可或缺的。同样,作为胞内病原体,布鲁氏菌必须利用高效的铁运输系统克服宿主细胞内的铁螯合。布鲁氏菌主要侵染巨噬细胞和胚胎滋养层细胞,而该菌在这两种细胞中生长、复制等生命活动都需要不同的铁摄取系统以满足自身对铁的需求。早在1992年,Ignacio López-goi等人[13]就已证实,流产布鲁氏菌2308菌株分泌简单的儿茶酚2,3-二羟基苯甲酸(2,3-DHBA)来应对铁的限制。同时,对于布鲁氏菌铁的代谢过程中,也有一些基因参与铁的调控,包括Bfu A、dhbR、irr、rir A等基因。孙晓庆等人[14]研究显示,Bfu A基因表达产物作为流产布鲁氏菌铁离子转运蛋白,可能参与布鲁氏菌体内对铁的吸收、摄取、利用过程。DhbR基因可以编码阿糖胞苷型转录调节因子,通过提供铁载体生物合成基因调控对Fe3+的利用。近期国内外研究发现,Irr基因作为铁反应调节器,调控自身铁代谢基因的表达。而rir A基因作为布鲁氏菌另一个铁反应调节器,也参与自身铁代谢的调控。当布鲁氏菌菌内铁的水平较高时,rir A基因被激活,调控铁代谢,防止铁含量过高对布鲁氏菌产生毒性;反之,当布鲁氏菌菌内铁的水平较低时,irr基因被激活,调控铁代谢,确保布鲁氏菌菌内的铁含量保持正常的生理水平。然而,参与铁代谢的基因众多,其具体的分子机制尚不清楚。
本研究通过生物信息学分析,发现该基因所表达的蛋白没有跨膜结构,表明其可能不参与胞内外信号的转导。而且该蛋白没有信号肽,这意味着该蛋白属于非分泌性蛋白,不能被布鲁氏菌分泌到胞外发挥作用。其二级结构主要以 α - 螺旋为主,像其它蛋白的二级结构一样,都是通过骨架上的羰基和酰胺基团之间形成的氢键维持二级结构的稳定。本研究利用生物信息学软件如Phyre2 等构建了rir A蛋白的三维模型,有利于蛋白的结构、功能的可视化分析。该蛋白经过三维建模分析,与其同源性的模型具有转录调控功能,从侧面验证了该蛋白具有转录调控的功能; Jonathan D. todd等人［15］研究也发现,根瘤菌中rir A基因的缺失调控了某些ABC转运子蛋白的差异表达,结合本文研究我们推测,布鲁氏菌rir A也可能通过调控ABC转运子的表达影响铁的转运。
基因功能 篇10
1 DAZ基因家族的起源和结构
AZF区域可划分为3个亚区,依次为AZFa、AZFb和AZFc。最新的研究表明,还存在第4个亚区,即AZFd,此亚区位于第2和第3亚区之间。迄今为止,已从这些区域分离出至少12个基因,AZFc位于Y染色体缺失间隔区的远端,在2%～10%的精子缺乏或重度精子减少患者中均存在AZFc区域缺失现象,此区域包含7个被认为与精子发生有关的基因家族。 通过对不同动物DAZ基因同源序列的分析发现,DAZ基因家族有3个成员,即BOULE、DAZL、DAZ。此家族的基因以在生殖细胞中表达为特征,编码的蛋白含有1个高度保守的RNA识别序列。BOULE基因和DAZL基因含有1个DAZ复制子,而DAZ含有多个呈串联排布的DAZ重复序列。BOULE和DAZL基因均为常染色体单拷贝基因,前者被认为DAZ基因家族的祖先基因,它的同源物已在秀丽线虫、果蝇、老鼠和人类中被鉴定;DAZL基因的同源物仅在脊椎动物中存在,它们和DAZ基因的同源性比BOULE基因更近一些;DAZ基因仅存在于旧大陆猴和类人猿的Y染色体中。BOULE、DAZL和DAZ基因属于同一基因家族,然而它们编码的蛋白却相差很大。BOULE基因与DAZL或DAZ之间的同源性是有限的,在RNA识别结构域(RRM)和DAZ重复区其同源性分别为78%和50%。DAZL和DAZ基因的长度相当,但在C端由于DAZ重复区下游读码框的不同而导致2条序列的完全不同;因此,不同的DAZ蛋白对应不同的RNA底物,发挥着不同的功能,人类或鼠的DAZL基因的无义突变会导致精子发生缺陷。
2 DAZ基因家族的表达
DAZ基因家族只在生殖细胞中表达,至于它们是存在于睾丸组织或卵巢组织还是两者均有,取决于基因及物种。BOULE基因表达于大多数动物的睾丸组织(秀丽线虫除外),而BOULE基因的同源物DAZL基因仅表达于卵巢组织。相对于DAZL和DAZ基因来说,BOULE基因的表达发生于雄性生殖细胞发育的晚期。在果蝇中,BOULE蛋白首先出现在精母细胞的核周区域,并且在减数分裂初始就从细胞核转位到细胞质中[2];在人类和小鼠的睾丸组织中,BOULE基因存在于精母细胞粗线期的细胞质中及精子细胞的周围,而从精原细胞期开始缺失[3]。DAZL在睾丸组织和卵巢中都有表达,而位于Y染色体上的DAZ基因仅在睾丸中表达,DAZL和DAZ均可在胎儿性腺的原始生殖细胞核中检出,在成年鼠和人类的睾丸组织中,它们主要存在于粗线期精母细胞的细胞质中,而在精原细胞中含量较少;因此,这2种蛋白在减数分裂期即从细胞核转移到细胞质。
3 DAZ基因家族是生殖细胞发育所必需的
DAZ基因家族是生殖细胞发育所必需的,在雄性果蝇中,BOULE基因的突变会引发不孕,它们的精母细胞发育会在G2/M期停止,这表明BOULE基因是雄性生殖细胞减数分裂所必需的[4]。与之相反,秀丽线虫的BOULE基因是雌性生殖系统所必需的,雌雄同体的虫体因缺失DAZ-1基因而导致卵子发生障碍,最终产生不孕[5]。有研究者构建了BOULE基因敲除小鼠,有趣的是BOULE基因缺失的小鼠减数分裂完全正常,并且可以稳定地检测到单倍体次级精母细胞;然而,单倍体次级精母细胞除第6阶段外其他阶段均未发育,说明BOULE基因在精子形成中的作用是促进次级精母细胞向成熟精子的分化,而在BOULE基因缺失小鼠中,精子形成过程的关键调控子表达并未受影响。在脊椎动物中,爪蟾卵DAZL 基因mRNA的缺失可导致蝌蚪原始生殖细胞的缺失,说明DAZL基因影响生殖细胞的发育[6]。老鼠DAZL同源基因的无义突变可引起雌、雄双性不育,在发生无义突变的9日龄小鼠睾丸组织中几乎没有生殖细胞,而在同日龄的野鼠睾丸中发现大量的A型精母细胞,而不是前细线期精原细胞[7]。A型的精母细胞具有增殖活性,并且c-kit蛋白试剂染色呈阳性,DAZL基因发生无义突变的小鼠精子发生障碍主要表现在从A型精母细胞到A1型细胞的分化失败,表明DAZL基因是A型精母细胞分化所必需的,同时也表明DAZL和DAZ在原始生殖细胞发育以及生殖细胞的分化、成熟过程中均发挥了作用。尽管在很多有机体包括人类中,DAZ基因家族的缺失和不育密切相关,但是对体内转录子的调控仍然不清楚。有研究者运用免疫共沉淀和微阵分析,鉴定出一些在体内外可与鼠DAZL结合的mRNA, 通过序列分析表明,这些转录子含有DAZL的结合位点,缺失DAZL基因的小鼠Mvh蛋白的表达水平降低,此基因是雄性配子形成必需的,这说明DAZL对Mvh翻译的调控是哺乳动物精子形成必不可少的[8]。有学者研究了DAZL基因在小鼠生殖细胞中的功能,结果发现DAZL与动力蛋白轻链之间有特殊关系,DAZL的细胞亚分布是微管依赖性的,并且其选择结合的mRNA都聚集在细胞核周围区域;因此,推断DAZL在转运特异动力蛋白mRNA过程中发挥作用[9]。有研究者利用一个生殖细胞报告基因,定量地从男性和女性的胚胎干细胞中分离出初始生殖细胞,对编码生殖细胞特异的RNA结合蛋白采用沉默及超表达技术,调控人类生殖细胞的形成和发育过程,结果发现人类DAZL基因在初始生殖细胞形成中的作用与DAZ、BOULE基因在减数分裂和单配体发育中的促进作用密切相关。有人分析了174例原发性不育患者及58例用重亚硫酸盐处理的对照序列,发现在对照组中,DAZ基因启动子区域CpG岛的甲基化方式在体细胞和精子细胞之间是不同的。在体细胞中,处于不同不育阶段的精子细胞DAZ基因的甲基化方式是相同的,但在精子细胞中,正常者是完全甲基化的;而精子缺乏症患者是完全没有甲基化的,这说明DAZ基因的甲基化方式和精子发生失败不相关,也提示DAZ基因的后天修饰不是精子发生失败的病因[10]。
4 DAZ蛋白的功能
S.Maegawa等[11]研究发现,DAZ蛋白可能调控蛋白的合成,果蝇的Twine基因突变在表型上和BOULE基因很相似,说明这2个基因可能具有相似的生物学功能。Twine基因编码减数分裂特异性的Cdc25磷酸酶,此酶可以促进细胞的分化。研究发现,在BOULE基因突变者中,Twine蛋白的水平有明显下降。运用启动子及精母细胞特异的β2微管蛋白基因的5′端和3′端非编码基因经转基因异源表达可恢复BOULE基因在减数期的缺失,这表明BOULE基因在控制Twine基因的mRNA翻译过程中发挥重要作用。
4.1 DAZL蛋白的RNA结合活性
在体外,DAZ蛋白可与RNA聚合物在RRM区结合,并且优先选择polyU和polyG区域。有人采用指数富集的配基系统进化技术(SELEX)及酵母3杂交系统测定DAZL蛋白对(GUn)n RNA序列结合的特异性,发现1个富含U的序列位于鼠Cdc25C基因的5′端非编码区。鼠中共有3个Cdc25基因,Cdc25A在有丝分裂和减数分裂的生殖细胞中均有表达;Cdc25B在体细胞和睾丸组织中表达;Cdc25C在大多数处于粗线期-双线期的精母细胞及精子中表达。研究发现,Cdc25C的5′端非编码区在酵母3杂交分析以及体外凝胶阻滞试验中都能特异性地与mDAZL结合,说明Cdc25C是mDAZL的下游靶标。用免疫共沉淀技术从小鼠睾丸分离到了DAZL相关的RNP离子,并且测定了离子中所含RNA种类。以几个已知的基因为假定mDAZL RNA底物进行鉴定,这些基因包括Tpx-1、Pam、Trf2、GRSF1、Cappb 2、Pa 7/C8和H47,其中特别值得关注的是Tpx-1基因,它是富含半胱氨酸分泌性蛋白家族中的一员,特异性表达于睾丸组织中,并且已证实与Sertoli生殖细胞有关。还有研究发现,其免疫选择基因包含3′端非编码区的共同序列,而并非是富含U的序列;另外,这个DAZL结合位点存在于小鼠Cdc25A基因的3′端非编码区,而Cdc25C不含此位点。
4.2 DAZL基因在蛋白合成中的作用
尽管早期的研究为BOULE基因在调控mRNA翻译方面的作用提供了有力证据,但是有关DAZL在此方面的证据至今严重不足。有研究者运用SELEX技术检测发现,斑马鱼DAZL基因能特异性地与GUUC序列结合,此序列位于Twine和斑马鱼DAZL序列的3′端非编码区。研究表明,体外培养的CV-1细胞中所含的斑马鱼DAZL基因可以适当增强荧光素酶报告基因的表达。但也有研究发现,小鼠睾丸中的DAZL可以利用oligo-dT捕获,揭示其可以与poly A+ mRNA结合。
4.3 DAZ、DAZL与其他蛋白的关系
通过酵母双杂交技术已经鉴定了几种与DAZ和DAZL有关系的蛋白[12]。事实上,人类BOULE基因最初是以DAZ为诱饵蛋白,利用酵母双杂交技术获得的;因此,DAZ蛋白在细胞中以同源二聚体或异源二聚体的形式存在。目前,已经证实mDAZL二聚体的形成是RNA依赖的,并且需要1个与C末端部分重叠的有53个氨基酸残基序列[13],其他与DAZ和DAZL有关系的蛋白包括DAZAP1、DAZAP2、 PUMILIO-2、hQK3、DZIP1、DZIP2和DZIP3。除DAZAP2和DZIP3之外,其余均为RNA结合蛋白。DAZAP1在睾丸中大量表达,它广泛存在于粗线期精母细胞和精子细胞的细胞核中,而在精子细胞拉长期进入细胞质中,它在非洲爪蟾中的同源物多聚脯氨酸RNA结合蛋白(Prrp)结合于Vg1 mRNA 3′端非编码区的定位元素,是成熟卵子穿过植物皮层所必需的,提示其与DAZAP1转运及RNA定位的功能相似。研究发现,DAZAP1是mRNA降解和沉默所必需的。DAZAP2 Prtb编码的蛋白相似,小鼠中此基因的缺失可导致不太明显的生殖缺陷。研究表明,PUMILIO-2与胚胎干细胞和生殖细胞在果蝇及秀丽线虫PUMILIO同系物中是维持生殖干细胞所必需的[14]。在果蝇中,PUMILIO是结合于弓形结构mRNA 3′端非编码区的微调控元件,并且抑制其翻译。DAZ与DAZL蛋白之间的关系目前尚未确定,其生物学作用也属未知。
5 问题和展望
基因功能 篇11
一、Septin基因家族的分类
Septin基因最早是在酿酒酵母 (Saccharomyces Cerevisiae) 中被发现的[1]。随后, 陆续在真菌、线虫、果蝇以及哺乳动物中发现有septin基因的存在。到目前为止, 人们已经在酵母中已发现了7种septin基因;线虫中有2种;果蝇中有5种;迄今为止, 人类已有14个septin基因被发现, 这些基因被统一命名为SEPT。发现的这14种SEPT基因分别是SEPT1~SEPT14, 这些基因编码蛋白质相对分子质量大约在39~60k Da之间[2]。此外, 根据序列相似程度, 人们将SEPT基因家族成员又分为了4个不同的亚家族, 分别是SEPT 2亚家族 (SEPT 1、2、4、5) 、SEPT 3亚家族 (SEPT 3、9、12) 、SEPT 6亚家族 (SEPT 6、8、10、11、14) 、SEPT 7亚家族 (SEPT 7、13) 。
二、septin的生理功能
近年来的研究表明, septin蛋白作为一种新的细胞骨架成分, 在很多细胞生理过程中发挥着重要的作用, 包括细胞分裂、细胞内物质运输以及细胞凋亡等。
1. 参与胞质分裂。
Septin基因最早是在分裂缺陷型的酿酒酵母中被发现的, 该基因的缺失[1]或突变都会引起酵母的胞质分裂受阻。在酵母中, 人们发现细胞分裂最典型的特征是形成收缩环。母细胞就是在收缩环的作用下被肌动蛋白纤维束牵引着分裂成两部分, 同时胞内物质也被均等地分配到两个子细胞中去。Mostowy等[3]研究发现, septin蛋白在细胞分裂过程中为收缩环和相关分裂因子的形成起着一个骨架支撑的作用。如果该基因的表达异常则会导致细胞分裂受阻, 出现细胞及胞内物质分离障碍。Kim等[4]认为septin蛋白之间可以通过中间的GTP结合区相互作用形成septin原纤维, 从而参与到细胞的分裂过程。微丝和微管作为细胞质分裂过程中功能最重要的两种细胞骨架成分, 调控着Septin原纤维的组装。目前的研究认为, septin原纤维组装可分为依赖肌动蛋白组装和不依赖肌动蛋白组装两种模式[5]。前者是在纤维状肌动蛋白束存在时, septin原纤维丝通过Anillin等接头蛋白与肌动蛋白纤维束形成Septin/Anillin复合物, 并且在该复合物的形成过程中不需要消耗GTP, 而是通过C端自身的卷曲结构域进行连接, 形成约7nm长的丝状结构。该模式即为依赖肌动蛋白的septin组装。后者是在人为细胞损伤等特殊情况下, 肌动蛋白的组装变得异常活跃, 此时septin-肌动蛋白复合物中的septin蛋白纤维微丝发生分离, 卷曲形成“C”型、“O”型的环状结构, 因此把这种组装模式称之为不依赖肌动蛋白的septin组装。Septin组装的这两种模式均在细胞分裂过程中起到非常重要的调节作用。
2. 参与细胞内的物质运输。
胞内运输 (intracellular transport) 是真核生物细胞与细胞内环境进行物质交换的一种重要方式, 也是维持机体生命活动的必要条件。该过程的实现需要多种物质的参与和调控, 其中, 最重要的调控因子就是组成细胞骨架的主要成分———微管蛋白。恰恰微管蛋白的形成与septin有着密切的联系。Weirich等[6]研究表明在He La细胞系里, SEPT 9基因编码的SEPT 9蛋白可直接与微管、纺锤体共定位。用微管聚合的特异性抑制剂———秋水仙胺 (demecolcine) 处理后, SEPT 9结构受到影响, 在细胞质内分布呈点状。但用si RNA (Small interfering RNA) 抑制SEPT 9的正常表达后, 微管蛋白的结构稳定性以及表达等均不受影响, 但同样用si RNA抑制住SEPT 6的表达, 反而可以大大增强微管的稳定性。这是因为SEPT 6可以与微管蛋白MAP4 (microtubule-associated protei) 相互结合, 从而阻止了微管与MAP4的结合, 所以当SEPT 6的表达受到抑制后, 微管蛋白与MAP4的结合增加, 使微管结构更加稳定。此外, septin蛋白家族成员中的septin 2和septin 5与影响物质运输的另外两种大分子SNARE (Soluble NSF attachment protein receptor) 蛋白和exocyst-sec6/8复合物存在着相互作用。这两种septin蛋白在细胞内物质的运输与分泌中有重要作用。
3. 参与细胞凋亡。
Septin蛋白已经被证实参与了凋亡信号通路。SEPT4的变异剪接本ARTS (apoptosis-related protein in the TGF-beta signalling pathway) 参与了细胞凋亡途径。该蛋白在一些凋亡刺激因子如Fas、TGF-β、etoposide等作用下, ARTS可以促进细胞的凋亡[7]。此外, 细胞凋亡过程中还有一组发挥着重要作用蛋白酶———半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶 (caspase) 。该酶的活性可被ARTS活化, 从而激活凋亡通路。并且在凋亡信号的刺激下, ARTS从线粒体释放, 并在胞质中与X连锁凋亡抑制蛋白 (X—linked inhibitor of apoptosis, XIAP) 特异性结合, 这就极大地降低了XIAP的表达水平, 从而解除了XIAP对caspase的抑制作用, 增强了ARTS的活性, 进而促进细胞凋亡。
三、结语
Septin基因家族的功能研究从发现以来已经取得了相当大程度的进展。目前越来越多的证据表明, septin很有可能是作为一种脚手架蛋白负责募集或阻隔相关的细胞功能蛋白来参与调控一系列重要的生理过程, 包括细胞分裂、细胞极性形成、囊泡运输、胞吞胞吐和细胞凋亡等。但由于septin基因家族结构的特殊性和成员的复杂性, 其详细的生理功能还有待进一步深入研究。综合近年来有关septin基因家族的研究报道发现, 未来的研究重点可能会是系统探索和阐明septin基因与疾病的关系以及其在人类疾病中扮演的角色。
参考文献
[1]Hartwell L H.Genetic control of the cell division cycle in yeast:IV.Genes controlling bud emergence and cytokinesis[J].Experimental cell research, 1971, 69 (2) :265-276.
[2]Russell S E, Hall P A.Septin genomics:a road less travelled[J].Biological chemistry, 2011, 392 (8-9) :763-767.
[3]Mostowy S, Cossart P.Septins:the fourth component of the cytoskeleton[J].Nature reviews Molecular cell biology, 2012, 13 (3) :183-194.
[4]Kim M S, Froese C D, Xie H, et al.Uncovering principles that control septin-septin interactions[J].Journal of Biological Chemistry, 2012, 287 (36) :30406-30413.
[5]Kinoshita M, Field C M, Coughlin M L, et al.Self-and actin-templated assembly of mammalian septins[J].Developmental cell, 2002, 3 (6) :791-802.
[6]Weirich C S, Erzberger J P, Barral Y.The septin family of GTPases:architecture and dynamics[J].Nature reviews Molecular cell biology, 2008, 9 (6) :478-489.