植物功能基因组

植物功能基因组（精选9篇）

植物功能基因组 篇1

根癌农杆菌介导的遗传转化由于操作简单、转化效率高、插入片段稳定性好、已被广泛应用于植物转基因研究。具体思路是将外源T—DNA转入植物基因组, 以T—DNA作为插入标记, 来分离或克隆因为插入而失活的基因并研究基因功能。由于T—DNA左右边界及内部的基因结构是已知的, 因此对获得的转基因T-DNA插入突变体就可以通过已知的外源基因设计引物, 利用相应的PCR策略进行突变基因的克隆和序列分析, 对比突变的表型进而研究基因的生理生化功能。

1 T-DNA插入突变简介

T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列, 它能整合到植物基因组中并稳定地表达。T-DNA在植物中一般都以低拷贝插入, 多为单拷贝。单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中, 就会表现出孟德尔遗传特性, 在后代中长期稳定表达, 且插入后不再移动, 便于保存。早期研究认为, T-DNA在基因组中的整合是一个随机过程, 没有明显的偏爱性。以T-DNA作为插入元件, 不但能破坏插入位点基因的功能, 而且能通过插入产生的功能缺失突变体的表型及生化特征的变化, 为该基因的研究提供有用的线索。由于插入的T-DNA序列是已知的, 因此可以通过已知的外源基因序列, 利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析, 并对比突变的表型研究基因的功能。还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列, 建立侧翼序列数据库, 对基因进行更全面的分析。由此可见, T-DNA插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。

2 T—DNA标签的应用

2.1 大规模的植物基因功能分析

大规模的植物基因功能分析目前使用最多的是插入突变的策略。由于农杆菌介导的T-DNA转化方法具有高效、重复性好、简便易行和表达稳定等优点[8], 而且技术已经非常成熟, 大多数植物都可以使用。此外T—DNA插入随机比, 插入的位点可以贯穿整个基因组, 甚至达到饱和, 尤其像拟南芥这样的基因组很小的植物几乎可以标签到所有的基因。因此使用T—DNA作为插入突变源进行突变体的筛选并进行基因功能的研究在许多植物中应用并取得成功。现在拟南芥已经有几个大规模的T—DNA插入突变体库供人们进行研究, 美国Salk基因组分析实验中心的Salk T—DNA库就是其中之一。这些大规模的T—DNA插入库为拟南芥基因功能的进一步研究提供了有利的工具。

2.2 时空特异性启动子和表达基因的分离

如果在插入T—DNA的一端安置一个报告基因, 该报告基因没有启动子或只带有弱小的启动子, 本身不表达或表达量极低。当这样的结构整合到宿主基因组时, 如果报告基因位于内源启动子之下或者增强子附近, 或者与内源的基因进行融合就被激活表达, 并反映出正常内源基因的表达模式。利用该项技术 (trapping vector) 可以较方便地分离到一些特异性启动子和特异时空表达的基因, 而不必一定要产生突变表型。这种方法已经被成功地应用于植物启动子和基因的克隆中。

Puzio利用启动子标签法标记到一个与线虫取食有关的基因pyk20, 对该基因在各种外源激素处理和逆境胁迫反应中的基因表达模式进行研究发现, 生长素、细胞分裂素和线虫取食处理植物可提高该基因的转录水平, 而温度胁迫和外源ABA处理降低该基因的转录水平, 分析携带gus基因的转基因系和野生型的序列, 结果显示外源T—DNA插入到了该基因的启动子处。

2.3 T—DNA插入突变体库及侧翼序列库的构建

T—DNA插入突变最大的用处是构建突变体库, 在此基础上构建侧翼序列库;目前在拟南芥中已经建立了接近饱和的T—DNA插入突变体库, 该突变体库包含超过225000个独立的T—DNA插入株系, 在预测的29454个基因中有21700个基因发生了插入突变[11]。含T~DNA激活标签的拟南芥群体已经获得, 并且在这些群体中已经获得大量的异常突变体和被标记基因。Sessiens等采用Tail—PCR的方法分离了拟南芥插入突变体库85108条T—DNA侧翼序列。结果表明, 平均约1000个拟南芥激活标签转化子能发现一个形态学突变。水稻中已建立了具有一定规模的突变体库, 但远没有达到饱和的程度。水稻上大约获得了47932个T—DNA插入株系和3290个水稻激活标签转化子, 同时扩增出27621个侧翼序列。An等从6749个水稻标签系中分离了3793条T—DNA侧翼序列, 并建立了侧翼序列数据库

3 T—DNA插入突变技术存在的问题及发展方向

随着大量基因序列的获得, 基因功能的研究变得日益重要。T-DNA插入由于其自身的优越性已成为研究基因功能的重要工具。T-DNA插入突变已被广泛应用于拟南芥、水稻等模式植物的突变体库构建, 并逐渐被用于番茄、矮牵牛、香蕉、豆类的研究。但是该方法仍有一定的局限性。T—DNA插入突变的研究还主要局限于少数模式植物。究其原因, 一方面是由于植物本身的生物学特性和遗传特性所致。另一方面, T—DNA标签载体也在很大程度上影响着研究进程与研究结果。目前的标签载体大多采用Ca MV35S增强子元件, 而Ca MV 35S增强子具有组织特异性。再就是T-DNA转移和整合机制迄今尚不完全清楚, 有时会出现多拷贝插入, 且容易产生直接的串联、反向重复和边界缺失, 而且在组织培养过程中也会产生突变, 这些都增加了突变基因的分析难度, 给研究工作带来很大困难。

目前, 以T-DNA插入突变体为基础的分离、鉴定和分析基因功能的方法在决定基因组基因功能的研究中逐渐扮演重要角色。可以预见, 在不久的将来会有更多的植物基因被克隆和鉴定, 特别是控制重要农艺性状的基因, 这无疑将会给农业生产带来极大的收益。

植物功能基因组 篇2

能基因组研究

以大豆为代表的豆科作物多数是较为严格的自花授粉物种，这使得杂交优势利用非常困难。授粉类型必须有特定的花形态结构作保障。因此，改变花型发育的关键调控基因，就有可能改造花的形态与结构，使异花授粉成为可能。有研究报道，金鱼草的CYC基因在花型发育中起了关键作用。同时，有研究报道，豆科的不对称花型是独立进化而来的，因而相关研究不仅具有重要的应用价值，同时具有重要的理论意义。为此，我们实验室开展了豆科CYC基因的研究工作。

首先，我们在豆科模式植物百脉根（Lotus japonicus）中用cDNA文库筛选等方法克隆了3个CYC同源基因，并进而开展了功能研究。RNA原位杂交实验和RT-PCR实验证明，LjCYC1、2、3基因在生殖期分生组织(花序、花原基)中有较强的表达，而在不同的花瓣原基中，LjCYC1,2主要在旗瓣表达，而LjCYC3在旗瓣和翼瓣均有较强表达，而在营养期的顶端分生组织中只有LjCYC1有微弱的表达。实验结果说明，LjCYC1、2、3基因主要参与花器官的发育，尤其是背部器官的发育。转基因实验结果表明，过量异位表达Ljcyc1、2基因能够改变花的对称性以及花型。

在克隆百脉根CYC基因的基础上，根据同源克隆的方法，我们在大豆中分离了6个CYC同源基因，分别命名为GmCYC1a, GmCYC1b, GmCYC2a, GmCYC2b, GmCYC3a, GmCYC3b。这6个基因根据序列同源性可以分为三组：GmCYC1a和GmCYC1b为一组，核苷酸序列相似性为95.1%，GmCYC2a和GmCYC2b为一组，核苷酸序列相似性为92.7%，, GmCYC3a和GmCYC3b为一组，核苷酸序列相似性为88.6%。

将豆科中的CYC-like基因通过最大简约法构建系统进化树，分析结果显示这三组序列分别对应百脉根，豌豆，蒺藜苜蓿中的三个CYC基因LjCYC1/PsCYC1/MtCYC1，LjCYC2/PsCYC2/MtCYC2，LjCYC3/PsCYC3/MtCYC3，这说明相对于豆科中的其他物种来说，在大豆基因组中CYC基因至少又发生了一次基因倍增事件。

植物功能基因组 篇3

1 反转录转座子的类型与结构

反转录转座子是真核生物中最为广泛的转座因子,在植物基因组中占有极大的比例,在水稻中占18%,在玉米中占50%~80%,在小麦中达90%[1]。反转录转座子根据其5′端和3′端是否有重复序列首先可被分为两类:长末端重复反转录转座子(long terminal repeats,LTRs)和非长末端重复反转录转座子(non-long terminal repeats,non-LTRs)。LTR反转录转座子又可分为Ty1-copia与Ty3-gypsy两个亚类。而非长末端重复反转录转座子根据长度和组成的不同又分为LINEs(long interspersed nuclear elements)和SINEs(short interspersed nuclear elements)两种类型[2](见图1)。

长末端重复反转录转座子在转座子的5′端和3′端有一对同向高度相似的序列,长度从几百bp到几千bp不等。重复序列中通常含有一些调控元件,主要包括反转录转座子转录需要的启动子和终止子,长末端反转录转座子通常由RNA聚合酶II转录,从5′端开始,结束于3′端。Ty1-copia与Ty3-gypsy两类反转录转座子都编码一个多聚蛋白(polyprotein),该蛋白可被蛋白酶切割形成有功能的多肽,称为gag和pol。其中gag编码结构蛋白负责包涵反转录转座时的RNA中间体,而pol则编码反转录转座子生活周期中的一些酶类。Ty1-copia与Ty3-gypsy中这些酶在pol中的顺序并不一样[3]。目前已发现的具有活性或潜在转座活性的植物LTR类反转录转座子见表1。

非长末端重复反转录转座子没有两端的LTR序列,在3′端以poly(A)结尾(见图1)。LINEs和长末端重复反转录转座子类似,也是RNA聚合酶Ⅱ转录而来,具有gap和pol等机构蛋白。通常认为LINE是长末端重复反转录转座子的前体。SINEs是RNA聚合酶Ⅲ转录而来,不具备编码任何蛋白的功能,通常只存在于被子植物中[4]。

2 LTR反转录转座子的活性调节

LTR反转录转座子通常在植物基因组中以多拷贝的形式存在,并占有极高的比例,例如大麦中的Ty1-,BARE-1以及玉米中的Opie-1和Huck2通常都有20 000~200 000个拷贝。植物为了防止这些反转录转座子频率过高的转座而造成基因突变以及基因组的不稳定性,进化出很多机制抑制反转录转座子转座的机制,其中,基因沉默(gene silencing)是最普遍和有效的方法。基因沉默分为转录后水平的基因沉默(Posttranscriptional gene silencing,PTGS)和转录水平的基因沉默(Transcriptional gene silencing ,TGS)。目前研究表明,TGS是植物抑制反转录转座子的转座的主要方式,在此过程中,在宿主中表达与目标序列多个拷贝是介导TGS沉默的关键因素[5]。例如,通过表达多个拷贝的果蝇LINE类型的反转录转座子“Drosophila I”的部分序列,能够强烈抑制该反转录转座子的活性。同时,研究表明,植株体内的干扰性小分子RNA(short interfering RNA,siRNA)也能介导TGS从而导致反转录转座子的沉默[6]。

3 LTR类反转录转子在植物基因组学研究中的应用

3.1 LTR类反转录转座子在植物基因组进化研究中的应用

LTR类反转录转座子在植物进化中具有重要的研究价值,LTR类反转录转座子可以像反转录病毒一样,以RNA为中间载体,以通过“复制-粘贴”的方式反复插入基因组,导致宿主基因组被扩增而自身在宿主基因组中的比例增大,这是造成物种多样性的重要推动力。Vitte等人研究了水稻基因组中41个LTR反转录转座子家族的进化历史发现每个LTR反转录转座子都有独特的转座方式,并且其DNA序列的变化速度非常快[7];研究表明,澳洲野生稻在过去的三百万年的进化过程中,其基因组中增加了9万个反转录转座子的拷贝,从而导致其基因组大小增加了约1倍[8]。在某些基因组较大的植物中,还发现了“嵌套式反转录转座子”,即一个反转录转座子存在于另外一个反转录转座子之中。通过比较玉米和高粱该区域的“嵌套式反转录转座子”序列发现,高粱中缺乏该结构,说明“嵌套式反转录转座子”的形成是在玉米和高粱2个物种分化之后形成的。同时研究还表明,在玉米和高粱分化之后,反转录转座子在2个物种基因组中的转座频率是不一样的[9]。

3.2 LTR反转录转座子在基因功能研究中的应用

LTR反转录转座子可用于对植物基因功能的研究,反转录转座子在转座时能够插入到植物基因内部或基因附近,从而造成了该基因的缺失或者破坏该基因的启动子而导致基因的表达量发生变化,通过对表型的鉴定可获得特定基因的功能[10,11]。另外,研究表明,反转录转座子能够改变某些蛋白的空间结构,从而改变蛋白的功能[12]。在水稻中,Hirchick等构建了反转录转座子Tos 17基因敲除体系,用于水稻中基因的克隆[13]。应用该体系,Sato等人克隆了水稻OSH15基因,并证明了该基因能够控制水稻的节间延伸[14]。

4 结论与展望

植物功能基因组 篇4

以中国板栗、茅栗和锥栗的叶片为材料,提取栗属的DNA.针对栗属植物富含多酚类等次生物质的特点对栗属DNA的提取方法进行了改良,采用CTAB-蛋白酶K法加重复抽提,去除栗属植物中的相关次生物质,获得了高质量的DNA.所提取的`DNA完全满足PCR、RAPD、SSR等一些分子生物学实验要求.

作 者：艾呈祥 余贤美 刘庆忠 张力思 AI Cheng-xiang YU Xian-mei LIU Qing-zhong ZHANG Li-si 作者单位：艾呈祥,刘庆忠,张力思,AI Cheng-xiang,LIU Qing-zhong,ZHANG Li-si(山东省果树研究所,山东省果树生物技术育种重点实验室,山东,泰安,271000)

余贤美,YU Xian-mei(中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南 儋州 571737)

植物功能基因组 篇5

植物转基因操作中,通常用标记基因将转化细胞筛选出来。在选择压力下,非转化细胞不具备抗性而死亡,因此在转基因研究中,抗性标记基因对于从大量非转化细胞中选择转化细胞至关重要。目前,转基因研究中普遍应用的抗性标记基因是抗生素和除草剂抗性基因。这些抗性标记基因在植物转化过程中是很有利的选择工具。然而,一旦转化完成,这些抗性基因便失去了作用,其存在还可能带来生物安全性问题[1]。另外,由于选择标记基因数量有限,这些基因的存在也给转基因植物的再次转化带来了不便[2]。

对转基因植物中标记基因的安全性评价主要集中在环境和食品安全性2个方面,其中对环境危害评价已发展到从分子、个体、种群、群落到生态系统的水平。标记基因的环境安全性主要包括:转基因植物的残枝落叶转移到其他土壤微生物中从而导致外源抗性基因的逃逸,可能造成生态失衡;很多情况下标记基因的沉默可能引起邻近目的基因的沉默。转基因产品中的抗生素抗性基因,有可能通过食物链,最终给人类的安全带来潜在的威胁[3]。在解决转基因植物可能存在的安全性问题中,研究者研究了共转化法、转座子法、位点特异性重组系统、同源重组[4]、无选择标记基因的转化系统[5]及安全标记基因的转化系统等方法。现对提高转基因植物标记基因安全性的方法作一综述。

1 共转化法

共转化的原理是将目的基因和标记基因单独组装到2个质粒上,或1个质粒的2个不同T-DNA区段上,然后同时转化。由于T-DNA的插入是随机的,二者可同时插入同一细胞的不同染色体上,经过后代的遗传重组,使目的基因与标记基因分离,从而获得仅带有目的基因的转基因植株[6](图1)。

Komari et al[7]构建了包含2个T-DNA的超二元质粒载体,将gus(β-glucuronidase)和hpt(hygromycin phosphotran sferase)通过共转化方法转入烟草和水稻,经过后代分离,50%以上的株系为无标记基因的gus转基因植株。Miller e al[8]通过多个菌株共转化玉米,共转化率为11.7%;而通过包含双T-DNA超二元质粒载体进行转化,共转化率高达93.4%。陈松彪等[9]采用体外重组技术构建一个双T-DNA载体系统,41.7%的后代为无选择标记的转基因烟草植株。为了提高共转化效率,研究者们对共转化方法进行了改进。叶兴国等[10]通过几个中间质粒构建了含有3段T-DNA的双元表达载体p NB35SVIP1,高频率获得无选择标记转基因大豆植株。

共转化系统去除转基因植物中选择标记为最早研究的技术,因其方法简单,多数无选择标记转基因作物均通过共转化系统所获得。目前,国内外已成功地运用共转化法获得了烟草、水稻、玉米和大豆等[7,8,9,10]作物的无选择标记转基因植株。但是共转化需要有性杂交过程将标记基因和目标基因分离,限制了此种方法在无性繁殖植物中的应用。此外,共转化耗时长,工作量大且转化效率较低,极大地限制了共转化系统的应用。

2 转座子法

转座子是存在于染色体DNA上的一段可自我复制和移动的DNA序列。把标记基因或目的基因和转座子相连,在转座子移动的过程中,标记基因与目的基因分离,子代植株通过遗传分离,获得仅带目的基因的转基因植株。因此,转座子系统可用于培育无选择标记的转基因植株。目前,已经报道的用于转基因植物标记基因删除的转座系统来源于玉米的Ac/Ds系统。

Goldsbrough et al[11]以nptⅡ(neomycin phosphotransferaseⅡ)为选择标记基因,以gus为报告基因转化番茄,在转基因植株后代中发现nptⅡ和Ds-gus-Ds结构的重组分离现象,获得了只含gus基因而无选择标记基因nptⅡ的转基因植株。Ebinuma et al[12]将ipt(isopentenyltransferase)基因插入Ac基因中,然后与nptⅡ和gus基因串联构建成MAT(MultiAuto-Transformation)表达载体,用其转化烟草和白杨,在转基因植株后代中发现无标记基因的转基因植株。

转座子具有跳跃性和可删除性,不需要再次转化或杂交引入重组酶。但是该途径也存在一些问题,如效率较低、需要有性繁殖分离途径、周期较长等,仅适用于有性繁殖以及生活周期短的植物,限制了其在标记基因剔除中的应用。

3 位点特异重组系统

位点特异性重组系统包括2个基本元件,即重组酶基因和特异性识别位点。把标记基因放在2个识别位点之间,在重组酶的作用下,标记基因可以被切除[13](图2)。

目前,在植物中已发现的有效的位点特异性重组系统有来源于噬菌体Pl的Cre/lox P(Cre:causes recombination;Lox P:locus of crossing X-over in P1)系统、接合酵母SR质粒的R/RS(R:recombinatinase;RS:recombination site)系统、啤酒酵母的2μm质粒FLP/FRT(FLP:flipping DNA;FRT:FLP recombination target)系统和噬菌体Mu的Gin/Gix(Gin:invertion of the G loop;Gix:Gin invertion complex sites)系统,其中以Cre/lox P系统的应用最为广泛。

3.1 Cre/lox P系统

Cre/lox P系统去除筛选标记的原理是将标记基因构建于lox系统的2个34 bp特异识别序列之间,将目的基因构建于lox位点之外,筛选到转化子后再诱导Cre酶表达,从而切除选择标记基因。

Dale et al[14]首次利用此方法转化烟草,将一个嵌合的荧光素酶(Luc)基因作为报告基因插入到含有选择标记基因hpt的载体中,Cre重组酶的表达催化2个同向lox位点间的重组反应,使hpt基因被切除,切除效率达到90.9%。一些研究者采用诱导型启动子诱导Cre重组酶的表达,在适当的时候对转基因植株进行化学诱导或热激处理来删除标记基因。此系统通过一次转化即可获得无选择标记的转基因植株。Zuo et al[15]构建了一个化学诱导型的载体转化拟南芥,以受雌二醇诱导的融合转录激活因子XVE控制Cre基因的表达,从而剔除lox序列之间的选择标记基因,获得了高频率的无选择标记的转基因拟南芥。Luo et al[16]利用同向融合lox P与FRT 2个特异识别位点构建识别位点lox P-FRT,获得一个全新的基因删除系统,大大提高了外源基因的删除效率。宋洪元等[17]利用Cre/lox定位重组系统在烟草中成功实现了与gfp(green fluorescent protein)基因连锁的bar(bialaphos resistance)基因的高效删除,并通过自交分离的办法获得了含gfp的无选择标记转基因烟草,表明利用Cre/lox系统获得烟草无选择标记的转基因植物是稳定可行的。Zhang et al[18]在位点特异重组系统Cre/lox中引入雌二醇诱导表达系统,成功获得了无选择标记基因的抗逆番茄。Khattri et al[19]利用Cre/lox系统转化水稻,由大豆热激启动子控制Cre重组酶基因的表达,获得了无选择标记基因的转基因水稻。由于化学诱导和热激诱导都需要对转基因植株进行处理,这可能对转基因植株的生长产生不利的影响。利用组织特异性启动子调控表达Cre基因来删除标记基因,不需要任何诱导剂即可完成标记基因的组织特异性删除。Kopertekh et al[20]将2个载体p LH-nap-vst-lx-35S-bar-lx和p LH-gusnap-cre共转化烟草。Cre重组酶基因由种子特异性启动子napin控制,在种子中特异表达并删除bar基因。结果表明T1代种子中bar基因已被高效删除。通过反相高效液相色谱证明了此系统不会对靶基因的表达产生影响。

3.2 FLP/FRT系统

FLP/FRT系统中FLP重组酶可催化位于同一DNA分子上2个同向位点FRT间DNA片段的切除,可用于选择标记基因的删除。目前,已成功获得无选择标记基因的烟草、玉米、水稻等[21,22,23,24,25]作物。

Woo et al[24]采用氧化胁迫诱导的过氧化物酶(POD)启动子控制重组酶FLP基因的表达,将转基因烟草用过氧化氢处理,13%~41%的再生植株的标记基因被删除。Li et al[25]将表达FLP重组酶基因的转基因玉米与包含靶基因At NHX1(提高植物耐盐性)和位于FRT 2个识别位点之间的选择标记基因als(acetolactate synthase)的转基因玉米进行杂交,在F1代植株中,40.7%的als基因被删除。进一步盐胁迫试验表明,在高盐环境下,无选择标记的At NHX1转基因玉米的产量高于野生型。

3.3 Gin/gix系统

Maeser et al[26]发现Gin/gix系统,重组酶Gin表达时可催化同一DNA分子上2个特异位点gix间DNA片段的切除,但因Gin基因影响植物的再生,该系统在植物中成功应用尚未见报道。

3.4 R/RS系统

R/RS系统中重组酶R能够专一地识别其特有的识别序列RS,并将2个紧邻的RS之间的DNA片段切除。

Onouchi et al[27]将含有RS-gus-RS的转基因拟南芥与由35S启动子控制的R基因的转基因拟南芥进行有性杂交,借助杂合状态下R基因的表达,删除了转RS-gus-RS基因拟南芥中的gus基因。Sugita et al[28]利用R/RS系统建立了GST-MAT载体,将重组酶R与化学诱导表达的启动子GST-Ⅱ-27(glutathione-S-transferase,谷胱甘肽转移酶)融合,这样在转化当代就获得了无选择标记的转基因烟草。Saelim et al[29]利用该系统对木薯进行转化,表型正常的转化植株中有88%~96%为无选择标记转基因木薯。Khan et al[30]利用该系统获得了无ipt选择标记基因的转基因番茄。位点特异性重组是目前无选择标记转基因植物研究中广泛应用的方法。尤其是后来发展起来的化学诱导系统,通过化学诱导表达的启动子驱动重组酶基因表达,从而严格控制标记基因删除。此外,此技术在标记基因删除过程中不需要二次转化,适合于无性繁殖的植物。同时它也存在弊端,利用位点特异重组酶切除标记基因时,往往在重组位点留下一个识别序列,从而影响同一位点特异性重组系统在受体植物中的再次应用。另外,经过几次去除标记基因后,基因组中分布着多拷贝的识别序列,可能会导致目的基因沉默。

4 同源重组

同源重组发生在DNA的同源序列之间,重组以后会导致位于同源序列之间的基因序列的切除。把标记基因放在2个DNA同源序列之间,发生同源重组后,标记基因可以被切除,即可获得无标记基因的转基因植株。

Fischer et al[31]利用同源重组的原理,在标记基因aad A(aminoglycoside-3′-adenyltransferase)两端加上正向重复序列,转入烟草叶绿体基因组,在有选择压力条件下得到转化植株,当去掉选择压力后发现aad A基因由于同源重组而被去除。噬菌体的352 bp的附属P区域att P(attachment site phage)是3个特异蛋白的结合位点,在烟草中,att P区不需要特异蛋白辅助就能切除位于2段att P重复序列之间的DNA序列。Zubko et al[32]利用attp同源序列介导的染色体内同源重组剔除了选择标记基因,得到了无标记基因的转基因烟草。

同源重组对序列特异性没有要求,严格地配对即可,其机理与位点特异性重组相同,但无需辅助蛋白参与,因而也不会对植物基因组造成可能的伤害。但是由于重组频率低,限制了其广泛应用。目前,此技术已成功应用于微生物和动物,但在植物中的应用尚处于探索阶段。

5 无选择标记基因的转化系统

在植物遗传转化过程中,可以不使用选择标记基因就能获得含目的基因的转基因植株,如马铃薯[33]、烟草[34]等。L et al[35]通过根癌农杆菌介导转化烟草,在不使用选择压力的情况下获得了无选择标记的转基因烟草,转化率为4%。Madhurima et al[36]报道了一个不使用任何选择标记基因的方法转化花生。他们利用根癌农杆菌介导转化花生的子叶外植体,转化率高达75%。无选择标记基因的转化系统简单、高效,为培育无选择标记转基因植株提供了新的方法。但是此方法也存在弊端,由于无法对转化植株的生长进行选择性地控制,研究者们必须从大量的再生植株中检测出转基因植株,这样不仅花费高而且还很耗时[37]。

6 安全标记基因的转化系统

安全标记基因是对生态环境和人体健康相对安全的标记基因。使用这类基因作选择标记的转化选择系统不是将非转化细胞杀死,而是使转化细胞处于某个有利的代谢或发育条件下,从而筛选出转化植株[38]。

近年来发现的生物安全标记基因主要有木糖异构酶基因(xylose isomerase,xyl A)、6-磷酸甘露糖异构酶基因(6-phosphomannose isomerase,pmi)、异戊烯基转移酶基因(isopentenyl transferase,ipt)、吲哚-3-乙酰胺水解酶基因(indole-3-acetamide hydrolyse,iaa H)、甜菜碱醛脱氢酶基因(betainealdehydedehydrogenase,BADH)、β-葡萄糖醛酸苷酶基因(β-glucuronidase,gus)、绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,gfp)等。目前,生物安全标记基因已成功用于水稻、玉米、小麦、大麦等[39,40,41,42]的遗传转化。

安全标记基因本身及表达产物一般没有毒性,选择剂也无毒副作用,转化效率高,因此安全标记基因的筛选系统在提高转基因植物安全性研究中发挥了重大作用。然而,标记基因的存在不利于多重转化,无法将多个优良性状累积在同一转化植株内;而标记基因删除技术为此提供了一个很好的解决方案,能够彻底地删除转基因植物中的标记基因,从根本上解决转基因植物安全性问题。

7 展望

植物功能基因组 篇6

一、动植物转基因的常见方法

1. 动物转基因的常见方法。

动物转基因最常用的方法是显微注射法, 转染的成功率较高, 该方法需要保证基因表达载体的高纯度, 利用到的技术主要是超数排卵、体外受精 (或体内受精) 、早期胚胎培养、胚胎移植等生物学技术。该方法最终将目的基因直接注入了目的细胞的细胞质或细胞核。但是显微注射技术操作繁琐, 无法一次获得大量转基因细胞。因此科研人员设计了一些载体介导的转基因动物方法, 如适用于哺乳动物的SV40载体 (simian vacuolating virus 40 vector) , 它可以携带目的基因通过非同源重组而整合进真核细胞的染色体组。而另一种载体人乳多空BK病毒 (human papova BK virus, BKV) 则可以携带目的基因以类似于质粒的方式----多拷贝染色体外双链DNA形式存在数代。另外转基因动物的基因导入方法还有电击法、脂质体介导的基因转移等多种方法。

2. 植物转基因的常见方法。

植物转基因使用最多的将目的基因导入植物细胞的方法是农杆菌转化法。革兰氏阴性菌土壤农杆菌 (Agrobacterium tumerfaciens) 携带的Ti质粒 (tumor-inducing plasmid) 上有一段DNA, 称为T-DNA (transfer-DNA) , 它可以高效的携带目的基因进入双子叶植物并整合到植物细胞的染色体中, 并发生稳定的遗传。此法介导的基因转移具有转化效率高、目的基因无重大修饰改变、单拷贝转移等优点。

二、动植物转基因的遗传方式

随着现代生物技术的快速发展, 转基因的新技术不断产生, 老技术不断完善, 由于不同的目标, 人们选择的受体细胞也有所不同, 比如人们如果想得到某种具有某一特殊的性状的细胞或相应的细胞产物, 常会选择那些分裂能力强、繁殖周期短的细胞, 比如为获得用于表达外源蛋白的哺乳动物细胞系, 人们都是用培养的癌细胞来作为受体细胞, 因为癌细胞具有较好的分裂稳定性, 可确保转入的目的基因多次传代后不丢失, 能稳定遗传。

1. 细胞核遗传。

当转基因技术被用于动植物育种时, 人们主要考虑的是尽可能的把目的基因转入细胞核并整合到染色体当中去。转基因动植物在育种中的利用主要有两种方式, 直接育成新品种, 或转基因生物作为种质资源通过有性杂交或回交育种进行再利用。综合分析众多的转基因遗传结果, 可以得知绝大多数转基因的遗传方式符合孟德尔的基因分离定律。以抗虫棉为例, 若以转基因直接获得抗虫棉为亲本P, 与普通的非抗性棉花杂交, F1当中抗性与非抗性的比值满足1:1, F1当中的抗性植株自交产生的F2当中抗性与非抗性的比值满足3:1的性状分离比, 由此可知抗虫棉是由一对等位基因控制的, 普通抗虫棉基因型可看作Aa, 如果直接以此棉花作为转基因抗虫棉去推广种植, 很显然会在后代出现性状分离, 最终抗性比例逐渐下降, 为了解决此问题我们可以通过将普通转基因抗虫棉经过多代自交后获得稳定遗传的纯合子AA。如果通过纯种抗虫棉与非抗虫棉的正、反交, 其F1具有明显的棉铃虫杭性, 杭虫水平与纯合亲本一致, 抗棉铃虫性状表现为显性遗传, 正、反交F1的抗虫性基本相近, 表明转基因获得抗虫棉属于典型的细胞核遗传。

2. 细胞质遗传。

在转基因动植物的细胞核遗传给人类带来更多的喜悦和收获的同时, 有关转基因植物的安全性问题日益受到普遍关注。例如重组核基因通过植物异花授粉向野生近缘种传播的可能性 (特别是一些异花授粉植物接受抗除草剂基因的可能性) , 庆幸的是人类作为一种高级动物, 早就意识到科技进步的两面性, 因此有科学家根据有性生殖过程中雌雄配子的形成和受精的特点, 设想把有些特殊目的基因转入到受体细胞的叶绿体或线粒体基因组中, 由于植物的花粉和动物的精子几乎不会将细胞质基因带入受精卵, 也就是说受精卵中的由细胞质基因几乎全部来自卵细胞, 表现出来的就是典型的母系遗传现象。

将目的基因导入线粒体或叶绿体, 虽然可以有效的防止转基因生物的目的基因通过花粉转移到自然界中的其他植物, 造成“基因污染”, 但是由于细胞质遗传时, 位于线粒体和叶绿体的遗传物质是随机地、不均等地分配到子细胞中去的, 所以遗传的稳定性远不如将目的基因导入细胞核那样稳定。

三、总结

综上所述, 解决转基因动物的遗传问题, 首先要弄清目的基因被导入的是细胞核还是细胞质 (线粒体和叶绿体) , 如果导入的是细胞核, 那么一般可以把转基因直接获得的转基因动植物看成杂合子 (Aa) , 按孟德尔的基因分离定律去分析;如果导入的是植物细胞质, 那么可以避免转基因作物的目的基因通过花粉发生“基因污染”, 但还是可以通过卵细胞将目的基因遗传给子代的, 按细胞质遗传的特点来分析。

摘要：转基因动植物的遗传问题是近几年高考和各地调研试题的一个热门考点, 考察的知识点涉及基因工程、细胞核遗传与细胞质遗传 (母系遗传) 、孟德尔遗传定律等多个方面, 总体难度比较大, 概念易混淆, 本文拟从转基因动植物的一般原理和方法的介绍开始, 然后再联系几个典型试题进行必要的分析。

关键词：转基因动植物,目的基因,遗传

参考文献

[1]瞿李嘉, 顾红雅, 胡苹等.现代生物技术导论.北京:高等教育出版社, 1998:232—235

马运动功能基因组初探 篇7

1驯化马匹品种的形成

研究认为马大约于6000多年前在欧亚草原上被驯化, 伴随着人类的活动逐渐扩散至世界的很多地方。有的适合拖行重物 (苏维埃重挽马) ;有的适合长途奔跑 (阿拉伯马, 蒙古马) ;有宠物马如设特兰等;还有适合不同赛事的运动马匹:盛装舞步赛, 障碍赛, 综合三项赛, 以及以速度与力量见长的赛马。赛马品种中最广泛应用的马为纯血马。

2现代马产业中最重要的马种- 纯血马

纯血马原产地为英国, 经过育马者人为选育, 现今的纯血马的直系父亲都可追溯到三匹种公马, 被称为纯血马父系的三大祖先。他们分别是巴利土耳其、达利阿拉伯与古多芬阿拉伯, 近年来的研究发现全世界约有95%的纯血马源自达利阿拉伯的血统。每一匹纯血马自从诞生后都有自己的身份证, 并且需要进行严格的DNA亲缘检测以后, 才可以登记在马血统纪录总簿上, 只有经过验明正身的纯血马才具有参加比赛的资格。1791年, 英国整理出版发行了马血统纪录总簿第一版, 纯血马详细而且完善的谱系登记已经持续了300余年。纯血马成为人类培养的动物中谱系资料最为完善的品种, 为科学研究提供了极好的素材。

3纯血马的生理特点

纯血马是速度赛马中使用的唯一品种。他以中短距离速度快而称霸世界, 创造和保持着5000m以内各种距离速力的世界纪录。纯血马拥有独特的运动生理上特点。纯血马平均体重大约为0.5t, 最高时速为64km/h, 最大心跳240次/min。拥有约占体重55%的肌肉重量, 其他非运动型马种肌肉重量只占体重的40%。大容量的肺活量, 高浓度的血液中红血球含量, 强劲的心脏收缩率使得氧气可以被大量而且高效的运送至肌肉组织中进行有氧代谢。

4基于纯血马在运动基因组学上的研究进展

在对于运动马匹的长期人工选择中, 会受到环境, 营养, 训练, 管理等因素协调影响, 但大约有35%~55%的运动潜质是可以遗传的。2009年Gu等人首次发现在纯血马基因组中存在与运动性状相关的表现强烈选择信号的区域。随后, 发现以下候选基因:肌肉生长抑制素、细胞色素C氧化酶亚基4, 2亚基、丙酮酸脱氢酶激酶同工酶4中的SNPs标记在纯血马中同运动能力显著相关, 同时利用全基因组关联分析, 确定了MSTN基因1号内含子中一个突变, 同纯血马的最佳赛程长度为极显著相关。 随后, 系列研究发现MSTN中基因间区域和上游区域存在的另外一些SNPs标记和结构变异也同赛马的运动性能相关。在后续研究中, 2012年碧翠丝等人发现“MSTN- 速度基因”这一突变可追溯至17世纪一匹母马产生的新突变上。2013年皮特森将马运动性能这一复杂性状定位于马8号, 17号及14号染色体区区间上。对马运动基因的系统研究表明: 在马这一系列运动性能候选区间中, 同运动性能显著相关的SNP标记位点均为基因间SNPs, 即位于基因组非编码区域内的遗传标记。

综上所述, 为了满足人们的不同需要, 驯化马匹逐渐形成了不同的品种。其中纯血马被主要用作速度赛马。自纯血马这一品种形成的300多年来, 育马人一直以马的谱系进行选育, 这种选育方法对提高纯血马速度的进展十分缓慢, 成效不明显。由此, 近期的一系列对纯血马运动性能的研究, 初步揭示了纯血马在运动功能基因组上的特点。这些研究为定向选育纯血马提供了科学的有力支撑, 同时对赛马产业将会产生巨大推动作用。

参考文献

[1]韩国才.马的起源驯化、种质资源与产业模式[J].生物学通报, 2014, 2:1-3.

牡蛎全基因组测序与功能解析 篇8

阅读全文链接(需实名注册):http://www.nstrs.cn/xiangxi BG.aspx?id=14323&flag=1

摘要：围绕牡蛎全基因组测序、基因组结构分析、基因注释、重要功能基因发掘和SNP标记开发几个目标展开了研究。采用fosmid克隆混池和等级组装策略成功解决了牡蛎高杂合度带来的基因组拼接困难,得到的基因组Contig和Scaffold N50分别达到19.4 Kb和401 Kb,整体测序深度大于800倍覆盖度。为后续的研究奠定了基础。对牡蛎基因组结构特征进行了分析。其基因组杂合度达到2.3%,重复序列丰富。在全基因组水平筛查到SNP位点312万个,其中基因区的SNP分布少于非基因区。共注释得到基因28 000多个。通过38个发育时期的表达谱测序,筛选到具有不同生物学含义的功能基因集,发掘了大量与生长发育等相关的基因,并对一些基因进行了详细研究。对牡蛎母本效应基因进行了发掘。鉴定出1 307个在雌性性腺中特异高度表达的基因,526个雄性性腺中特异高度表达的基因,包括一些重要的父本效应基因,如K81等。对性别决定基因进行了分析,发现Sox9、SRY等基因在牡蛎雄性性腺中特异表达,可能是决定牡蛎雄性转变的重要调控基因。对重要的发育基因家族进行了详细梳理和进化分析,包括130多种Homeobox基因、20多种Fox基因、10多种Wnt基因等。此外,对一些重要的功能基因如表皮生长因子受体(EGFR)和固醇调节原件结合蛋白(SREBP)等还进行了原味杂交、蛋白重组表达等功能研究。在全基因组范围以及转录区筛选到大量的SNP标记,在一些群体中验证了超过1 500个具有多态性的SNP。并把HSP、类胰岛素多肽等基因的SNP与表型性状进行了关联分析研究,发现一些与生长性状具有显著相关性的SNP标记。由于冠轮动物超门基因组数据缺少,牡蛎基因组的测序为生物多样性和进化生物学研究提供了重要数据。为牡蛎高度适应潮间带环境的分子机制研究提供了重要基础。项目的完成对贝类发育、贝壳形成、海洋无脊椎动物浮游幼虫的进化等机制有了更深入的理解。研究成果丰富了海洋基因资源,开发了大量分子标记,为分子育种的开展提供了条件。

关键词：牡蛎,基因组,功能解析,生长发育

高等植物开花基因FT研究进展 篇9

1 植物开花基因FT概述

在1865年Sachs就引入成花物质概念,最早分析出成花物质是由叶片送到叶芽并导致开花;开花素概念是由Chailakhyan在1936年根据嫁接试验提出的,认为对光周期产生不同反应的植物之间也许有相同的物质来促进开花;2005年,Huang et al[6]发现FT m RNA就是开花素或其中的一部分。最近,英美等国家的科学家利用分子生物学的手段证明,植物开花素是FT蛋白而不是FT m RNA,否认了FT m RNA是开花素的这一结论。FT基因本身受光周期途径中的锌指结构蛋白的诱导[7],具有维管束组织特异表达的属性[8]。在茎尖分生组织,FT和转录因子蛋白FD直接或间接作用促进开花和花分化。目前,FT和FD蛋白的互作在小麦、拟南芥、玉米等不同物种上均得以验证[9]。

植物开花基因FT基因家族成员逐步被发现扩充。目前在拟南芥中共发现了FT/TFL1基因家族的6个成员,有TFL1基因、FT基因、BFT基因、MFT基因、TSF基因和ATC基因[10,11,12,13]。

2 植物开花基因FT在花发育转化中的作用

2.1 作用模式

Abe et al[9]、Wigge[14]的研究结果显示,FD能与FT相互作用,FD的突变可以35S∷FT植株的早花表型受到强烈抑制;同时FT可以活化AP1的表达,因为观察到AP1表达量在35S∷FT植株中呈现上升的现象。已有研究验证FD可以结合到AP1的启动子上,并且响应FD的元件已在AP1的启动子上定位。由此提出其作用模型,即FD与FT一起在花分生组织细胞内,刺激AP1的表达,成为转录复合体的一部分。在茎端分生组织(SAM)处,AP1基因不是FT基因唯一的靶子,即使在35S∷CO植株中也是如此,FT突变会强烈延迟SOC1的表达;而在SAM处若将SOC1基因直接表达也能促使开花(FT或CO突变的情况下),说明在FT基因的下游SOC1基因也促进开花。同时也有研究说明,因为FD或FT任何一个基因的突变,使得SOC1基因的表达减少和延迟[15],SOC1活化的过程是通过依赖FD的FT作用完成的。转录因子FD与FT在花发育过程中调控植株的开花时间,上调花特性基因AP1和SOC1基因的表达,在茎端共同起作用。

2.2 春化途径(Vernalization pathway)和自主途径(Au-tonomous pathway)中FT基因的作用

FLOWERING LOCUS C(FLC)基因是开花抑制物,它是春化途径和自主途径的汇集点(convergence point)[16],在维管组织和茎分生组织处表达[17]。Searle应用染色质免疫沉淀试验,证明在春化作用以前,FLC就直接与FT基因第1个内含子的5'末端CAr G盒处结合,阻止系统信号的形成,FT基因的表达被抑制,而在SAM处SOC1能够被这个信号激活表达。另外,FLC可以直接与SOC1和FD启动子上的CAr G盒区域结合,抑制叶片中FT信号的响应,在分生组织处降低表达。Michaels et al[16]的研究证明,SOC1的表达可以强烈抑制FLC所引导的晚花表型,直接被TSF和FT激活,但对FLC m RNA的表达水平无影响。以上研究说明FLC的表达直接介导其靶基因的表达,可以不受FT的影响,从而促进开花,而FLC基因抑制FT靶基因对FT信号的响应或FT基因的表达。

2.3 光周期途径(Photoperiodic pathway)中FT基因的作用

CO是光周期途径中的关键基因,其能引起花分生组织基因的表达,作用机理是将来自于光周期途径中的信号传递到FT和SOC1等成花信号枢纽处[7]。分别将韧皮部特异的启动子SUC2和分生组织特异的KNAT1启动子与CO连接(KNAT1∷CO,SUC2∷CO),结果表明CO基因在分生组织处过量表达则对开花过程无影响,CO基因在韧皮部处过量表达能够引起早花,CO基因不是在分生组织处,而在维管组织处促进开花。SUC2∷CO植株的早花表型会被FT的突变强烈地抑制[18,19],在SUC2∷CO植株其韧皮部处及维管组织处FT m RNA的丰度会增加,表明来自于CO的全部信号几乎都会被FT的突变所抑制,同时在FT突变体中CO基因过量表达也会引起晚花表型,说明CO基因下游主要的靶基因是FT。以上研究结果说明,FT的产物可能成为成花刺激物,CO的主要作用是在调控花发育过程中在叶片处活化FT,其长距离转运到SAM处促使开花。2007年Lin[4]、Tamaki[5]的研究进一步验证,蛋白FT-like从叶片转运到SAM处,是作为成花激素促使花分生组织特异性基因的表达,从而促进开花。

3 植物开花基因FT基因研究前景