植物基因组学

植物基因组学（共10篇）

植物基因组学 篇1

转座子是一类可在植物中移动的遗传元件,通常可分为两种类型,第一种类型如研究最早的存在于玉米基因组中的Ac/Ds和Spm/En转座系统,是以DNA为中介,在植物基因组中是以“剪切-粘贴”的方式移动,这种转座方式并不增加植物基因组的大小;第二种类型则是以RNA为中介,在植物基因组中是以“复制-粘贴”的方式移动,称为反转录转座子,该种转座方式可导致宿主基因组的扩增。目前,反转录转座子在植物基因组组成、表达调控以及在植物基因组学研究中的应用已受到广泛关注。

1 反转录转座子的类型与结构

反转录转座子是真核生物中最为广泛的转座因子,在植物基因组中占有极大的比例,在水稻中占18%,在玉米中占50%~80%,在小麦中达90%[1]。反转录转座子根据其5′端和3′端是否有重复序列首先可被分为两类:长末端重复反转录转座子(long terminal repeats,LTRs)和非长末端重复反转录转座子(non-long terminal repeats,non-LTRs)。LTR反转录转座子又可分为Ty1-copia与Ty3-gypsy两个亚类。而非长末端重复反转录转座子根据长度和组成的不同又分为LINEs(long interspersed nuclear elements)和SINEs(short interspersed nuclear elements)两种类型[2](见图1)。

长末端重复反转录转座子在转座子的5′端和3′端有一对同向高度相似的序列,长度从几百bp到几千bp不等。重复序列中通常含有一些调控元件,主要包括反转录转座子转录需要的启动子和终止子,长末端反转录转座子通常由RNA聚合酶II转录,从5′端开始,结束于3′端。Ty1-copia与Ty3-gypsy两类反转录转座子都编码一个多聚蛋白(polyprotein),该蛋白可被蛋白酶切割形成有功能的多肽,称为gag和pol。其中gag编码结构蛋白负责包涵反转录转座时的RNA中间体,而pol则编码反转录转座子生活周期中的一些酶类。Ty1-copia与Ty3-gypsy中这些酶在pol中的顺序并不一样[3]。目前已发现的具有活性或潜在转座活性的植物LTR类反转录转座子见表1。

非长末端重复反转录转座子没有两端的LTR序列,在3′端以poly(A)结尾(见图1)。LINEs和长末端重复反转录转座子类似,也是RNA聚合酶Ⅱ转录而来,具有gap和pol等机构蛋白。通常认为LINE是长末端重复反转录转座子的前体。SINEs是RNA聚合酶Ⅲ转录而来,不具备编码任何蛋白的功能,通常只存在于被子植物中[4]。

2 LTR反转录转座子的活性调节

LTR反转录转座子通常在植物基因组中以多拷贝的形式存在,并占有极高的比例,例如大麦中的Ty1-,BARE-1以及玉米中的Opie-1和Huck2通常都有20 000~200 000个拷贝。植物为了防止这些反转录转座子频率过高的转座而造成基因突变以及基因组的不稳定性,进化出很多机制抑制反转录转座子转座的机制,其中,基因沉默(gene silencing)是最普遍和有效的方法。基因沉默分为转录后水平的基因沉默(Posttranscriptional gene silencing,PTGS)和转录水平的基因沉默(Transcriptional gene silencing ,TGS)。目前研究表明,TGS是植物抑制反转录转座子的转座的主要方式,在此过程中,在宿主中表达与目标序列多个拷贝是介导TGS沉默的关键因素[5]。例如,通过表达多个拷贝的果蝇LINE类型的反转录转座子“Drosophila I”的部分序列,能够强烈抑制该反转录转座子的活性。同时,研究表明,植株体内的干扰性小分子RNA(short interfering RNA,siRNA)也能介导TGS从而导致反转录转座子的沉默[6]。

3 LTR类反转录转子在植物基因组学研究中的应用

3.1 LTR类反转录转座子在植物基因组进化研究中的应用

LTR类反转录转座子在植物进化中具有重要的研究价值,LTR类反转录转座子可以像反转录病毒一样,以RNA为中间载体,以通过“复制-粘贴”的方式反复插入基因组,导致宿主基因组被扩增而自身在宿主基因组中的比例增大,这是造成物种多样性的重要推动力。Vitte等人研究了水稻基因组中41个LTR反转录转座子家族的进化历史发现每个LTR反转录转座子都有独特的转座方式,并且其DNA序列的变化速度非常快[7];研究表明,澳洲野生稻在过去的三百万年的进化过程中,其基因组中增加了9万个反转录转座子的拷贝,从而导致其基因组大小增加了约1倍[8]。在某些基因组较大的植物中,还发现了“嵌套式反转录转座子”,即一个反转录转座子存在于另外一个反转录转座子之中。通过比较玉米和高粱该区域的“嵌套式反转录转座子”序列发现,高粱中缺乏该结构,说明“嵌套式反转录转座子”的形成是在玉米和高粱2个物种分化之后形成的。同时研究还表明,在玉米和高粱分化之后,反转录转座子在2个物种基因组中的转座频率是不一样的[9]。

3.2 LTR反转录转座子在基因功能研究中的应用

LTR反转录转座子可用于对植物基因功能的研究,反转录转座子在转座时能够插入到植物基因内部或基因附近,从而造成了该基因的缺失或者破坏该基因的启动子而导致基因的表达量发生变化,通过对表型的鉴定可获得特定基因的功能[10,11]。另外,研究表明,反转录转座子能够改变某些蛋白的空间结构,从而改变蛋白的功能[12]。在水稻中,Hirchick等构建了反转录转座子Tos 17基因敲除体系,用于水稻中基因的克隆[13]。应用该体系,Sato等人克隆了水稻OSH15基因,并证明了该基因能够控制水稻的节间延伸[14]。

4 结论与展望

目前对植物中LTR反转录转座子的研究还不够深入,尤其是对其作用的分子机制尚不十分清楚,对于反转录转座子的研究,对于解释很多生物学现象,具有重要的意义。目前还有许多研究表明,LTR类反转录转座子的转座活性受外界环境的调节,其转录可被多种生物的和非生物的环境因素所激活[15,16,17,18],这些都为植物中LTR反转录转座子的研究提供了新的研究思路。

植物基因“养活”海蜗牛 篇2

海蜗牛是陆地蜗牛的“远房亲戚”,属裸腮亚目海栖腹足纲,以身体色彩缤纷而闻名遐迩,素有“最艳丽动物”之美誉。它们的兄弟姐妹,有的妖冶绚烂,有的性感华美,有的五光十色,以致初次看到海蜗牛的人,总会情不自禁地联想起《红楼梦》中的林黛玉,楚楚动人却又娇弱可怜:在危机四伏的大海里,海蜗牛没有足够的力量与海潮抗衡,只能随波逐流,过着飘萍般无依无靠的流浪生活。但事实上,这种认识是极为偏谬的。在林林总总的海洋生物中,海蜗牛并非弱者,甚至在很多时候,它们还会激发出无比强大的战斗力!

美国缅因州大学生物学家詹姆斯·曼哈特博士,曾在巴西东部海岸追踪调查海蜗牛的生存状况时遇到过这样的情景:一天傍晚,距离海岸大约50米的浅海处突然飘来数百片奇形怪状的“树叶”。放眼看去,正是成群结队的海蜗牛。那一刻,它们安安静静地躺在水面上,只露出三角形的小脑袋和牛角一样的短触角。周围,一群美丽的水母在浪花中若隐若现;水面上,几只海雀在欢快地飞来飞去。突然,一只潜藏已久的海龟忽地窜出。令人吃惊的是,海雀惊飞,水母急沉,唯有海蜗牛依然故我,仍在不紧不慢地徜徉游荡。眼看海龟气势汹汹地逼近,只见海蜗牛集体向海龟喷射出一股云彩状的墨绿色分泌物。不可思议的一幕随即发生了——海龟本已大张的嘴巴在不知不觉中悄然闭紧,接下来,“敌我双方”竟然在同一片水域中“和平共处”了近一个小时!

震惊之余,詹姆斯博士提取了部分墨绿色的分泌物并进行检测,竟然发现其中含有能让海龟闭嘴的化学物质——L赖氨酸和精氨酸!再饥饿的食肉动物一旦接触到这两种化学物质,神经系统就会紊乱,饥饿感也便荡然无存。有了這种“化学武器”,海蜗牛自然就不怕凶悍的海龟了。

海蜗牛不但拥有“先进”的“化学武器”,还是令人类望尘莫及的发明家。2007年年初,美国休斯敦石油公司的海底输油管道发生泄漏事件,严重的石油污染致使海面上的海藻大面积死亡,很多以海藻为“口粮”的海洋生物纷纷饿毙。出人意料的是,海蜗牛却悠然自得地躲过了灭顶之灾!通过细致检测,詹姆斯博士惊喜地发现,海蜗牛的体内竟然存在着一种能进行光合作用的绿色颗粒。这种颗粒与藻类细胞内的叶绿体具有完全相同的分子结构,并且海蜗牛的绿色颗粒中对光合作用起到至关重要作用的基因psbO完全来自藻类的HGT。这充分说明,psbO这种控制光合作用的基因在两种完全不同形态的生物——海藻和海蜗牛之间进行了水平转移,从植物基因转变成了动物基因!而拥有这种基因的海蜗牛,它的光合作用能力能够维持一生。这就意味着,它们这一海洋族群永远悠闲快乐,永远不会因食物短缺而被饿死!

植物基因组学 篇3

基因芯片(Gene Chip, DNA Chip),又称DNA微阵列(DNA Microarray),是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所组成的微点阵阵列。在一定条件下,载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核酸片段进行标记,在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号。基因芯片技术主要包括四个主要步骤:芯片制备、样品制备、杂交反应、信号检测和结果分析。基因芯片具有高通量、并行性、微型化和自动化的特点,通过基因芯片上高度集成的DNA分子微阵列,能够在很短时间内分析整个基因组范围的众多基因表达水平的变化,使人们能够快速准确地获取样品中的生物信息,较之传统研究手段具有极高的检测效率。

2 基因芯片的数据分析

随着cDNA微阵列和寡核苷酸芯片等高通量检测技术的发展,我们可以从全基因组水平定量或定性检测基因转录产物。通过基因芯片数据分析就能够检测不同条件下的基因转录变化,能够显示反映特征组织类型、发育阶段、环境条件应答、遗传改变的基因谱。然而由于生物体中的细胞种类繁多,同时基因表达具有时空特异性,因此,基因表达数据与基因组数据相比,要更为复杂,数据量更大,数据的增长速度更快。所以对基因表达数据的成功分析是获取基因功能和基因表达调控信息的关键,也是基因芯片能够在植物学、动物学、医学和农学等研究领域中广泛应用的重要原因之一。

2.1 芯片数据的预处理

对基因表达数据进行分析之前,往往需要进行预处理,包括高背景值数据的去除,异常值的判定和过滤,缺失值的估计以及针对分析方法选择合适的数据转换方法等。DNA 微阵列实验得到的数据往往是扣除了背景的荧光信号强度值,因此有时会出现负值或很小的值,显然这些数据是没有生物学意义的。对于这些数据点,常用的方法是把此类数据置为缺失或赋予统一的数值,例如,对于寡核苷酸芯片数据,可以将低于100的数据全部设置为100,然后用于后续的数据处理。所谓异常值是指一些由于污染等原因导致的不可靠数据。通过标准差或异常值常数等判定方法可将此类数据予以过滤,对于单张芯片重复点样的芯片可用变异系数的方法进行过滤,如果变异系数接近或大于10%,就认为该数据不可靠而应删除。数据的缺失对于某些后续数据分析来说有着非常大的影响,必须采取相应的方法。一个简单方法是直接过滤掉这些存在缺失数据项的行向量或列向量。另一个方法是设定阈值,计算行向量或列向量中的缺失项数目,如果达到该阈值,则将该数据项所在行或列从数据矩阵中删除;如果没有达到阈值但存在缺失项,对这些缺失项以0代替,或用基因表达谱中的平均值或中值进行替代,这些方法都比较简单,但是否与真实值接近,很难进行评估。较为复杂和可靠的方法是,分析基因表达谱的模式,从中得到相邻数据点之间的关系,根据这种关系,利用相邻数据点估算得到缺失值。由于芯片实验的昂贵性,决定了芯片数据的小样本和大变量的特点,导致数据分布常为偏态且标准差较大,影响了数据的进一步分析。 采用对数转换能使数据更加符合正态分布;同时对数转换使荧光信号强度的标准差减少,有利于进一步的数据分析。数据转换通常使用以2为底数的对数转换。

2.2 芯片数据的归一化

由于芯片实验中涉及许多不确定因素,如芯片本身理化性质的差异、由点样不均引起的差异、样品起始RNA 量的不等、不同的标记方法、标记和杂交效率的差异等[1],因此原始数据需经过归一化,以消除由于系统变异引起的误差,使得基因表达数据能够真实地反映测量样品的生物学差异。归一化可分为芯片内数据的归一化和芯片间数据的归一化等[2]。对于芯片内数据的归一化,常用的是看家基因(housekeeping gene)法, 它预先选择一组表达水平不变的看家基因, 计算出这组基因平均ratio 值为1时的归一化系数, 然后将其应用于全部的数据以达到归一化的目的。而内标参照(spike control)法是选择一个通用基因或DNA片断作为对照基因固定在芯片上,杂交时将一定量的与之互补的荧光标记探针混合到杂交液中。这样可以将对照点信号与各样点信号比较,其比值便可消除各实验室的差异。此外还可以利用局部加权回归分析(Lowess)的方法对数据进行归一化[3]。由于在芯片实验中,大部分基因的表达是没有显著差异的,所以若将全部的基因放入计算回归式时,可能会产生较大的误差,因此可以选定参与局部回归分析的观察值个数f(通常f=20%)。原始数据经加权函数得到的值的矫正就可以达到归一化的目的。对于芯片间的数据常用的方法是平均数、中位数归一化(mean or median normalization)。即将各芯片数据的log ratio 中位数或平均数调整为0,把各芯片上的数据调整到同一水平,从而使之具有可比性。

2.3 差异基因的判断

用于检测基因表达水平的 DNA 微阵列实验,应用之一是比较不同条件下的基因表达差异。对于这些表达数据的分析,目的就是要识别一个基因在不同样本(或不同处理)中表达水平的检测值在排除系统误差等因素外,达到一定的差异,具有统计学意义,同时也具有生物学意义。常用的分析方法包括倍数分析、t 检验和方差分析等[4,5]倍数变化(fold change,FC)分析是最早应用于基因芯片数据分析的方法,该方法是通过对基因芯片的ratio值从大到小排序,ratio是cy3/cy5的比值,又称R/G值。一般0.5~2.0范围内的基因不存在显著表达差异,该范围之外则认为基因的表达出现显著改变。然而,这样简单的2倍法并不能产生最优的结果。对于低表达水平的基因,其信噪比太低,用2倍法作为判断条件太宽松;而对于高表达基因,条件又太苛刻,往往小于2就具有生物学意义。在具体应用中,并没有明确的阈值,往往根据分析的具体要求由数据分析者自行确定。

t检验(t -test)是差异基因表达分析的另一种方法,当t 超过根据可信度选择的标准时,比较的两样本被认为存在差异。但是t检验常常受到样本量的限制,由于基因芯片成本昂贵,重复实验又很费时,小样本的基因芯片实验是很常见的,但是小样本导致了不可信的变异估计,因此会导致较高的假发现率(FDR,False Discovery Rate)。控制假阳性率有4 种方法,即邦弗朗尼(Bonferroni)法、Bonferroni Step-down(Holm)法、Westafall & Young 参数法及Benjamini & Hochberg假阳性率法。

方差分析(analysis of variance,ANOVA),又称变异数分析或F检验,其目的是推断两组或多组资料的总体均数是否相同,检验两个或多个样本均数的差异是否有统计学意义。根据实验中考虑的因素多少(如处理的时间和浓度、种系不同等)选择不同的方差分析。如果只受单个因素的影响,考虑用单向方差分析(one-way ANOVA);如受多因素影响则考虑多因素方差分析(two- way ANOVA)。

2.4 聚类分析

聚类分析(cluster analysis)是指根据数据点间的相似性来组织数据并构建系统树的多变量分类法。通过聚类分析,可以了解在某一生物学途径上催化一系列反应的酶的表达规律,从而有助于阐明一些特殊的代谢通路和基因共调控的机理。同时,聚类分析为鉴别和分析具有相似功能的基因提供了一个快速而直观的方法。当某些新基因与已知功能的基因归为一类时,就可以推测并描述新基因的潜在功能。聚类结果还可以进一步为难以进行遗传学处理和基因组序列不全的物种提供功能分析的切入点。在基因芯片表达数据分析中,应用最为广泛的是系统聚类分析[6](hierarchical clustering),此外还有Bayesian聚类分析,K均值聚类分析(k-means clustering),自组图分析(self-organizing maps,SOMs),二向聚类分析(two-way clustering),神经网络聚类分析(neural network clustering),主成分分析(principal component analysis),多维标度分析(multidimensional scaling analysis)等统计分析手段。

系统聚类分析法是将芯片表达的数据点分配进入有严格等级的层层嵌套的子集。最相接近的数据点分成一组,并用一个新点来替换,该新点的值为此两点的平均值,其他点同样处理,然后用同样的方法进行下级处理,直至最终成为一个点,这样数据点就形成一个家谱的树状结构,树枝的长度表示两组数据的相似程度。系统聚类分析适合于具有真正等级下传的数据结构,不适合于基因表达谱可能相似的复杂数据集。

K均值聚类与分层聚类有本质的区别,它首先要估计出将要分出几个类,然后将全部的基因按照相似性的距离归入这几类中,计算出每个类中的基因的均值,然后,将每个基因分配到均值与它最相近的那个类中。然后重复以上两个步骤,直到所有的基因都被分配到类中。

主成分分析可以将多维空间内的关系简化于三维空间,即可以常规图形形式显示复杂数据。它是一类多变量技术,即以统计学的方法比较多个不同的变量。主成分分析保留了多维空间内基因间最紧密的联系,因此多维空间内位置相近的基因在三维空间内亦设定为相互接近。主成分分析广泛应用于基因芯片分析,以鉴别在多种实验条件下有相似的调节方式的各组基因;根据与之靠近的已知基因的特征,可以推测生物学功能未知基因的功能。根据主成分分析图象还可以发现游离基因,即多种实验条件下表达方式与大多数基因都不相同的个别基因,据此推断它们可能有新的功能。

聚类方法有两个显著的局限:首先,聚类结果要明确就需分离度很好的数据。几乎所有现存的算法都是从互相区别的不重叠的类数据中产生同样的聚类。但是,如果类是扩散且互相渗透,那么每种算法的结果将有所不同。结果就会导致每种算法界定的边界不清,每种聚类算法得到各自的最适结果,每个数据部分将产生单一的信息。为解释因不同算法使同样数据产生不同结果,必须注意判断不同的方式。对遗传学家来说,正确解释来自任一算法的聚类内容的实际结果是困难的(特别是边界)。最终,将需要经验可信度通过序列比较来指导聚类解释。第二个局限是由线性相关产生。上述的所有聚类方法分析的仅是简单的一对一的关系。因为只是成对的线性比较,大大减少发现表达类型关系的计算量,但忽视了生物系统中多因素和非线性的特点。

3 基因芯片在植物基因组研究中的应用

目前,应用基因芯片技术研究植物基因表达谱已经成为功能基因组研究的一个热点,并且已经在拟南芥、水稻、玉米中取得了很大进展。应用基因芯片研究植物在生长发育和逆境胁迫下的基因表达变化情况,可以使我们了解在不同代谢途径中的各基因的功能,明确植物与外界环境的相互作用机制,揭示信号转导途径间的内在联系,从而在整体上把握植物的基因表达调控网络。

在植物的生长发育方面。Lan等[7]将来自于水稻芽和根的代表10000个基因的ESTs序列制成了cDNA芯片,然后对水稻授粉和受精的多个时期的基因表达进行了分析。研究表明,253个ESTs在授粉和受精过程中表现了差异表达,荧光实时定量PCR对芯片的结果进行验证,结果两者得到了相似结论。Wang等[8]利用cDNA芯片研究了在高浓度硝酸盐(5~10 mMol·L-1)和低浓度硝酸盐(250 μMol·L-1)处理后拟南芥的基因表达变化情况。结果发现,亚硝酸还原酶基因(NiR)、硝酸还原酶基因(NR)、尿卟啉甲基还原酶Ⅲ基因(UPM1)以及一些编码硝酸盐转运因子(CHL1, NTL1 , NTL8)的基因在施加处理后,表达量获得了明显上升。硝酸盐应答基因不同的表达方式表明此类基因在硝酸盐的吸收和同化过程中具有重要的调控作用。Girke等[9]应用含有2600个cDNA序列的芯片对拟南芥在种子和根、叶中的基因表达情况作了研究。结果表明,25%的基因在种子中的表达量是在根和叶中表达量的2倍以上,10%的基因在种子中的表达量是叶和根的10倍以上。表达量上调的基因包括编码转录因子、蛋白激酶、磷酸酶的基因以及一些未知功能基因。此外,研究还发现大约10个参与脂肪酸合成的基因在拟南芥种子中特异性表达。McGonigle等[10]应用基因芯片技术对同一基因家族不同成员的功能进行了分析。他们认为基因家族各成员虽然在进化上相关,产物也相似,但在功能上却存在显著差异。他们把来自玉米谷胱苷肽转移酶家族的42个成员固定在芯片上,然后用它对施加了除草剂和乙醇处理的玉米植株进行芯片分析,结果在处理前后,基因家族各成员的表达方式出现了很大的不同,由此进一步说明了基因家族各成员在功能上的差异性。

在植物抗逆境胁迫方面。Seki等[11]应用含有1300个拟南芥全长基因的cDNA芯片对干旱和低温诱导的基因进行了研究。发现44个基因为干旱诱导基因,其中30个尚未报道过;19个基因是低温诱导的基因,其中10为新基因。进一步研究还发现,有16个基因同时受干旱和低温胁迫所诱导,其中12个是转录因子DREB1A的目标基因。此外,基因芯片技术也可以对植物耐盐机理在分子水平上加以研究。Kawasaki等[12]利用基因芯片对水稻耐盐品种(Pokkali)在盐处理后不同时间的基因表达谱进行了比较。研究表明,在盐处理15 min至6 h内,在Pokkali中约有33%的基因出现上调表达,而在对照品种中,只有7%的基因上调表达。将差异表达的基因进行cluster分析可以发现至少10种基因表达的调控模式。另外,通过cluster分析,也发现了在特定的时间段上调或下调的基因群,经Northern杂交验证,结果与其基本一致。Yu和Setter[13]利用cDNA芯片比较了干旱胁迫下在玉米授粉早期胎座和胚乳中基因表达谱。发现在授粉9 d后,两者的表达谱即有明显的不同。在胎座组织中发现有79个基因在胁迫下的表达发生了明显变化,其中89%为上调表达基因;在胚乳组织发现了56个表达发生变化的基因,其中82%为下调表达基因。在这些干旱诱导基因中仅有9个在胎座和胚乳组织中同时发现。

基因组学之父 篇4

两度辉煌的学术生涯

弗雷德里克·桑格于1918年8月13日出生于英国格洛斯特郡的一个小镇。父亲老桑格是一位全科医师，也是一个热忱的博物学者，对所有的现代科学和医学思想都有兴趣。

桑格最初计划学习医学，但是在进入大学之前，他渐渐觉得自己更适合一个可以将活动和兴趣集中于某一目标的职业，一个解决问题的职业。最终，桑格决定学习自然科学。桑格对生物化学最初的接触，主要是通过剑桥大学生物化学系里那些年轻并且充满活力的师生。对桑格来说，从生物化学里可以找到理解生命物质的方式，还可以通过生物化学的方法认识与解决许多医学问题。

桑格有着和平主义者的理念，在战争期间拒服兵役，继续攻读博士学位。他在生物化学系跟随纽伯格做研究，研究赖氨酸代谢和马铃薯氮素的实际应用。在桑格看来，纽伯格是第一个教他怎么做研究的人。1943年，吉布纳尔继任剑桥生物化学系的教授职位。由于个性和志趣相似，吉布纳尔邀请桑格加入了他的研究小组，对胰岛素进行化学分析。当时新的蛋白质分离、提纯技术发展迅速，桑格通过研究，找到“2，4-二硝基氟苯”试剂（DNFB，后人以他的名字将其命名为桑格试剂），给蛋白质一端的氨基酸着色、切割，然后用纸色层分离法测定氨基酸，最终推断出胰岛素的完整序列。正因为通过这种方法测定了胰岛素的一级结构，他获得了1958年的诺贝尔化学奖。这是人类历史上第一次完整地描述出一个蛋白质大分子中氨基酸的顺序。桑格多次表示过，第一次获奖对他之后的学术生涯有着重要的激励作用。这次获奖给了他更多自信和热情，支持他继续以自己喜欢的方式进行科学研究。

1951年起，桑格成为英国医学研究理事会的成员。20世纪50年代中期，卡文迪许实验室的核酸研究者们对桑格的蛋白质测序工作产生了兴趣，DNA双螺族结构发现者克里克认为桑格的研究有助于他们对基因序列的研究。于是，桑格与克里克等人开始了进一步的合作。20世纪60年代初，他开始着手与RNA（与DNA相关的一种遗传物质）有关的实验。1962年，桑格加入了新成立的英国医学研究理事会分子生物学实验室，他很快就对核酸产生了兴趣。从研究蛋白质转向核酸，看起来像是一个大的变动，但对于“测序”基本问题的关注是相同的。桑格认为选择“测序”作为自己的研究中心，一方面是因为它的内在魅力；另一方面是因为他有一个信念，那就是有关序列的知识能够贡献于人类对生命物质的理解。在转向核酸研究之后，桑格首先发现了一种测定RNA序列的微量32P标记寡核苷酸法。在研究DNA序列分析过程中，桑格又发明了许多测定DNA序列的快速而简便的方法，如DNA序列分析的加减测序法和双脱氧链末端终止法等。1977年，桑格和同事们完成了对含有5375个核苷酸的噬菌体DNA序列的测定。之后他们又完成了对人类线粒体DNA序列和λ噬菌体DNA序列的测定。正因为对核酸基本序列测定所作出的贡献，桑格和另一位独立发展出DNA测序方法的科学家吉尔伯特共同分享了1980年的诺贝尔化学奖。吉尔伯特的测序方法在20世纪80年代末期大尺度测序工程兴起之后，就不再使用。

桑格测序DNA的方法直至今日仍被人们使用，为之后人类基因组计划庞大的测序活动奠定了基础。1993年，剑桥的一所以桑格冠名的研究所成立，这家研究所在人类基因组计划中起到了重要作用。

桑格的中国缘

桑格的中国缘始于父辈。他的父亲老弗雷德里克·桑格曾跟随英国圣公差会来到中国，加入了他们在福建莆田的兴化圣教医院。在中国期间，他对教育的强烈兴趣还促使他建立了一所男子学校。在中国服务6年之后，因为身体状况不佳，返回英国。

当然，桑格和中国的缘分并不止于此。新中国成立后，中国科学界第一个能够跻身世界领先水平的基础理论研究——人工合成牛胰岛素就和他的研究工作密不可分。领导这项研究工作的是中国生物化学奠基人之一王应睐，他曾在剑桥大学生物化学系读博士，在剑桥时就与桑格相识。王应睐于1958年担任新成立的中国科学院（上海）生物化学研究所所长，这一年也正值桑格因为胰岛素的测序工作获得诺贝尔化学奖。当时的中国科学技术界，普遍有赶超世界先进水平的强烈愿望，生化所也提出了要人工合成一个蛋白质的想法。由于桑格的研究，胰岛素成为了当时唯一一个已知一级序列的蛋白质，所以中国研究人员便选择胰岛素作为人工合成蛋白质的对象。1965年9月17日，中科院生化所的研究协作组终于成功地实现了人工合成具有天然生物活力的蛋白质——结晶牛胰岛素。中国研究者成功合成胰岛素，对桑格之前的工作起了验证作用，推翻了可能存在的质疑。

除了桑格对中国生物化学界产生了重要影响，也有中国学者参与了桑格的研究工作，并做出贡献。1979年，王应睐把生化所的中国学者洪国藩介绍给桑格，投入到了λ噬菌体基因组的测定工作。1982年，这个小组最终测定了λ噬菌体60个基因、48，500个核苷酸的顺序。这是桑格的重要工作之一，是当时测序的最大基因组，也是核酸研究方面里程碑性质的工作。

桑格为人谦逊，从踏入学术生涯直至退休，在实验室花去了大部分时间。即使是在获得诺贝尔奖之后，他仍坚持自己操作许多实验，而不是像典型的现代实验室那样，把实验任务分配给低级别研究者。谈及两次获得诺贝尔奖，桑格依然低调表示：“第一次获奖十分困难，但如果你已经拿到一个奖，你就更容易获得工作所需设备，能够吸引优秀的合作者，一切都变得简单了。”

【责任编辑】张小萌

植物基因组学 篇5

一、动植物转基因的常见方法

1. 动物转基因的常见方法。

动物转基因最常用的方法是显微注射法, 转染的成功率较高, 该方法需要保证基因表达载体的高纯度, 利用到的技术主要是超数排卵、体外受精 (或体内受精) 、早期胚胎培养、胚胎移植等生物学技术。该方法最终将目的基因直接注入了目的细胞的细胞质或细胞核。但是显微注射技术操作繁琐, 无法一次获得大量转基因细胞。因此科研人员设计了一些载体介导的转基因动物方法, 如适用于哺乳动物的SV40载体 (simian vacuolating virus 40 vector) , 它可以携带目的基因通过非同源重组而整合进真核细胞的染色体组。而另一种载体人乳多空BK病毒 (human papova BK virus, BKV) 则可以携带目的基因以类似于质粒的方式----多拷贝染色体外双链DNA形式存在数代。另外转基因动物的基因导入方法还有电击法、脂质体介导的基因转移等多种方法。

2. 植物转基因的常见方法。

植物转基因使用最多的将目的基因导入植物细胞的方法是农杆菌转化法。革兰氏阴性菌土壤农杆菌 (Agrobacterium tumerfaciens) 携带的Ti质粒 (tumor-inducing plasmid) 上有一段DNA, 称为T-DNA (transfer-DNA) , 它可以高效的携带目的基因进入双子叶植物并整合到植物细胞的染色体中, 并发生稳定的遗传。此法介导的基因转移具有转化效率高、目的基因无重大修饰改变、单拷贝转移等优点。

二、动植物转基因的遗传方式

随着现代生物技术的快速发展, 转基因的新技术不断产生, 老技术不断完善, 由于不同的目标, 人们选择的受体细胞也有所不同, 比如人们如果想得到某种具有某一特殊的性状的细胞或相应的细胞产物, 常会选择那些分裂能力强、繁殖周期短的细胞, 比如为获得用于表达外源蛋白的哺乳动物细胞系, 人们都是用培养的癌细胞来作为受体细胞, 因为癌细胞具有较好的分裂稳定性, 可确保转入的目的基因多次传代后不丢失, 能稳定遗传。

1. 细胞核遗传。

当转基因技术被用于动植物育种时, 人们主要考虑的是尽可能的把目的基因转入细胞核并整合到染色体当中去。转基因动植物在育种中的利用主要有两种方式, 直接育成新品种, 或转基因生物作为种质资源通过有性杂交或回交育种进行再利用。综合分析众多的转基因遗传结果, 可以得知绝大多数转基因的遗传方式符合孟德尔的基因分离定律。以抗虫棉为例, 若以转基因直接获得抗虫棉为亲本P, 与普通的非抗性棉花杂交, F1当中抗性与非抗性的比值满足1:1, F1当中的抗性植株自交产生的F2当中抗性与非抗性的比值满足3:1的性状分离比, 由此可知抗虫棉是由一对等位基因控制的, 普通抗虫棉基因型可看作Aa, 如果直接以此棉花作为转基因抗虫棉去推广种植, 很显然会在后代出现性状分离, 最终抗性比例逐渐下降, 为了解决此问题我们可以通过将普通转基因抗虫棉经过多代自交后获得稳定遗传的纯合子AA。如果通过纯种抗虫棉与非抗虫棉的正、反交, 其F1具有明显的棉铃虫杭性, 杭虫水平与纯合亲本一致, 抗棉铃虫性状表现为显性遗传, 正、反交F1的抗虫性基本相近, 表明转基因获得抗虫棉属于典型的细胞核遗传。

2. 细胞质遗传。

在转基因动植物的细胞核遗传给人类带来更多的喜悦和收获的同时, 有关转基因植物的安全性问题日益受到普遍关注。例如重组核基因通过植物异花授粉向野生近缘种传播的可能性 (特别是一些异花授粉植物接受抗除草剂基因的可能性) , 庆幸的是人类作为一种高级动物, 早就意识到科技进步的两面性, 因此有科学家根据有性生殖过程中雌雄配子的形成和受精的特点, 设想把有些特殊目的基因转入到受体细胞的叶绿体或线粒体基因组中, 由于植物的花粉和动物的精子几乎不会将细胞质基因带入受精卵, 也就是说受精卵中的由细胞质基因几乎全部来自卵细胞, 表现出来的就是典型的母系遗传现象。

将目的基因导入线粒体或叶绿体, 虽然可以有效的防止转基因生物的目的基因通过花粉转移到自然界中的其他植物, 造成“基因污染”, 但是由于细胞质遗传时, 位于线粒体和叶绿体的遗传物质是随机地、不均等地分配到子细胞中去的, 所以遗传的稳定性远不如将目的基因导入细胞核那样稳定。

三、总结

综上所述, 解决转基因动物的遗传问题, 首先要弄清目的基因被导入的是细胞核还是细胞质 (线粒体和叶绿体) , 如果导入的是细胞核, 那么一般可以把转基因直接获得的转基因动植物看成杂合子 (Aa) , 按孟德尔的基因分离定律去分析;如果导入的是植物细胞质, 那么可以避免转基因作物的目的基因通过花粉发生“基因污染”, 但还是可以通过卵细胞将目的基因遗传给子代的, 按细胞质遗传的特点来分析。

摘要：转基因动植物的遗传问题是近几年高考和各地调研试题的一个热门考点, 考察的知识点涉及基因工程、细胞核遗传与细胞质遗传 (母系遗传) 、孟德尔遗传定律等多个方面, 总体难度比较大, 概念易混淆, 本文拟从转基因动植物的一般原理和方法的介绍开始, 然后再联系几个典型试题进行必要的分析。

关键词：转基因动植物,目的基因,遗传

参考文献

[1]瞿李嘉, 顾红雅, 胡苹等.现代生物技术导论.北京:高等教育出版社, 1998:232—235

以用基因技术培育节水植物 篇6

研究项目负责人, 以色列特拉维夫大学植物科学系的阿姆拉姆·艾歇尔教授表示, 水是作物的生命之源, 提高灌溉过程中作物的摄水量十分重要。他和希勒尔·福摩教授以及整个研究团队希望能够利用新发现的, 可控植物根部向水性的基因对作物进行监控, 确保灌溉水源到达根部。

研究人员正在实验室内对气雾培植的拟南芥进行研究, 以得知基因改良的植物根部如何感知灌溉水源的具体方位。气雾培是把植株悬挂于雾化空间, 让其根系获取水分氧气及营养方式发生变化的一种方式。是用加压雾化或超声波雾化的方法, 为根域创造最佳的环境条件。气雾培是当前农业生产中最先进的栽培模式, 能实现植物短期内的快速生长与发育, 对农业生产意义重大。迄今为止, 这种培植方法只在小范围内得以应用。

艾歇尔教授表示:“我们的目标是节省水源, 现正在努力提高植物的摄水量。未来时代, 高感水性的植物可创造更高的经济价值。”

丙戊酸钠的药物基因组学 篇7

基于癫痫的病理机制, 癫痫患者需长期甚至终生药物治疗。丙戊酸钠 (valproate, VPA) 是临床上常用的一线抗癫痫药物之一。临床发现VPA的用药剂量和血药浓度存在很大的个体差异, 部分患者即使应用较小剂量, 其血药浓度仍会超过有效血药浓度范围。研究表明, 基因多态性可导致药物疗效差异, 是影响给药剂量确定的重要因素之一。 药物基因组学 (Pharmacogenomics) 主要研究与药物疗效及不良反应相关的基因多态性, 指导临床开出“基因合适”的处方, 使患者得到最佳治疗效果, 从而达到真正的“个体化用药”目的。VPA的疗效、不良反应与代谢酶的基因多态性有关。本文着重就国内外VPA药物基因组学研究进展综述如下。

1 丙戊酸钠的体内药代动力学特点

VPA在体内97%通过肝脏代谢, 主要有三条代谢途径[1]:Ⅰ相线粒体内 β氧化、CYP450酶的代谢和Ⅱ相尿苷酸二磷酸葡萄糖醛酸酶 (UGT) 的羧化作用。其中50%通过结合反应被尿苷酸二磷酸葡萄糖醛酸酶代谢 (UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7) 为无活性的产物, 40%通过线粒体β氧化, 只有10%左右通过细胞色素P450代谢 (主要是CYP2C9、CYP2C19、CYP2A6、CYP2B6) 催化为各种衍生物, 而1%～3%是以原型药的形式从肾脏中排除。目前有关CYP450酶及UGT系统基因多态性对丙戊酸钠药物的作用及不良反应的影响研究逐渐得到重视。

2 CYP450基因多态性

目前研究抗癫痫药物代谢的遗传因素中, 较为深入的是CYP450酶的遗传多态性。在CYP2C亚族中, CYP2C9和CYP2C19亚型对抗癫痫药物的代谢起着关键性的作用, 且不同的基因型代谢药物的能力明显不同, 从而产生血药浓度的个体差异。

2.1 CYP2C9＼2C19基因多态性

VPA的代谢过程受到多种CYP450酶的作用, 其中以CYP2C9CYP2C19为主[2]。国外在体外的肝微粒体孵育试验中证明, VPA具有肝毒性的代谢产物为4-ene-VPA, 这种产物--主要由CPY2C9代谢产生而目前发现的几种CYP2C9基因突变中[3]CYP2C9*1、CYP2C9*2、CYP2C9*3代谢生成4-ene-VPA的水平有很大差异。因此, 在体内体外研究CYP2C9基因多态性与肝毒性代谢产物的生成差异, 有重要的临床意义。

Ho等的研究表明CYP2C9与VPA的代谢有关, 且不同的基因型代谢VPA的能力不同。野生型CYP2C9*1代谢VPA的能力明显强于突变型CYP2C9*2和CYP2C9*3。VPA的代谢物 (4-Ene-VPA, 4-OH-VPA, 5-OH-VPA) 在突变型杂合子的比率分别减少29%, 28%和30%, 而突变型纯合子的比率下降为61%, 73%, 和58%[4]。

另有研究表明CYP2C19也与VPA的代谢有关, 且CYP2C19突变型基因患者VPA的血药浓度显著高于野生型CYP2C19*1基因患者, 同时VPA的血药浓度曲线明显右移[5]国内外研究都表明CYP2C19*2基因突变后血中VPA浓度会升高[11]YP2C19是CYP450超家族的一种同工酶, 其酶缺陷频率在东方人中很高 (其中CYP2C19*2突变率非常高, 在韩国人群地突变率为21.1%在中国人群中高达32.9%[6]) 成为其酶代谢底物产生药物效应个体差异和种族差异的重要原因, 是药物代谢酶分子遗传药理学研究领域中最为关注的靶目标之一。

CYP2C19酶活性在人群中呈两态分布, 即快代谢者 (EMs) 和慢代谢者 (PMs) 据国内的研究, PMs发生率在汉族人群中为14.20%或13.43%[7]。一般情况下, 对于PMs 药物在其体内易蓄积, 表现为常用剂量下出现过强的药效或极易引起药物中毒。相反, EMs 常常表现出对药物的过分耐受以致降低药效。

2.2 CYP2A6/CYP2B6的基因多态性

体内、外试验[8]已证实不同个体间CYP2A6与CYP2B6的酶活性差异具有显著性, 故通过其代谢的药物在不同的个体之间的药理过程也会有显著不同。体外试验[9]还证实CYP2A6与CYPCD6介导VPA的代谢。

有研究[10]对CYP2A6与CYP2B6基因多态性分析显示, 中国人与高加索人及日本人各突变的基因频率有显著不同, 中国人CYP2A6*4等位基因频率 (15.1%) 与高加索人 (0.5%～1.0%) 差异尤其显著。CYP2A6*4亚型是所有CYP2A6基因突变中基因频率最高者, 而CYP2B6*6亚型是所有CYP2B6基因突变中频率最高者[11]。

国内谭兰等人研究[12]对携带CYP2A6*4或/和CYP2B6*6等位基因的中国癫痫患者, VPA的使用剂量应低于惯用剂量, 这样可以避免潜在的药物过量引起的不良作用。

3 UGT的基因多态性

在Ⅱ相代谢中, 最主要的酶是尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶 (UGT) 。许多药物的代谢都经过结合反应, VPA有50%通过结合反应被尿苷酸二磷酸葡萄糖醛酸酶代谢 (UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7) 为无活性的产物。

王艳等人[13]对河南汉族癫痫儿童UGT1A6A541G基因多态性分布分析显示, A541G突变发生率为26.2%, 与日本人群的突变率基本一致UGT1A6A541G位点的基因多态性与VPA血药浓度的关系研究显示, 杂合子突变型及突变纯合性较野生基因型VPA血药浓度偏低, 但基因型间血药浓度差异无统计学意义。

孙妍萍等人[14]研究分析癫痫患者的 UGT1A6基因552位点的多态性, 结果UGT1A6基因多态性可影响丙戊酸钠的代谢, UGT1A6基因552位点含有C等位基因的患者应用VPA应较常规增加用药剂量。

4 展望

高等植物开花基因FT研究进展 篇8

1 植物开花基因FT概述

在1865年Sachs就引入成花物质概念,最早分析出成花物质是由叶片送到叶芽并导致开花;开花素概念是由Chailakhyan在1936年根据嫁接试验提出的,认为对光周期产生不同反应的植物之间也许有相同的物质来促进开花;2005年,Huang et al[6]发现FT m RNA就是开花素或其中的一部分。最近,英美等国家的科学家利用分子生物学的手段证明,植物开花素是FT蛋白而不是FT m RNA,否认了FT m RNA是开花素的这一结论。FT基因本身受光周期途径中的锌指结构蛋白的诱导[7],具有维管束组织特异表达的属性[8]。在茎尖分生组织,FT和转录因子蛋白FD直接或间接作用促进开花和花分化。目前,FT和FD蛋白的互作在小麦、拟南芥、玉米等不同物种上均得以验证[9]。

植物开花基因FT基因家族成员逐步被发现扩充。目前在拟南芥中共发现了FT/TFL1基因家族的6个成员,有TFL1基因、FT基因、BFT基因、MFT基因、TSF基因和ATC基因[10,11,12,13]。

2 植物开花基因FT在花发育转化中的作用

2.1 作用模式

Abe et al[9]、Wigge[14]的研究结果显示,FD能与FT相互作用,FD的突变可以35S∷FT植株的早花表型受到强烈抑制;同时FT可以活化AP1的表达,因为观察到AP1表达量在35S∷FT植株中呈现上升的现象。已有研究验证FD可以结合到AP1的启动子上,并且响应FD的元件已在AP1的启动子上定位。由此提出其作用模型,即FD与FT一起在花分生组织细胞内,刺激AP1的表达,成为转录复合体的一部分。在茎端分生组织(SAM)处,AP1基因不是FT基因唯一的靶子,即使在35S∷CO植株中也是如此,FT突变会强烈延迟SOC1的表达;而在SAM处若将SOC1基因直接表达也能促使开花(FT或CO突变的情况下),说明在FT基因的下游SOC1基因也促进开花。同时也有研究说明,因为FD或FT任何一个基因的突变,使得SOC1基因的表达减少和延迟[15],SOC1活化的过程是通过依赖FD的FT作用完成的。转录因子FD与FT在花发育过程中调控植株的开花时间,上调花特性基因AP1和SOC1基因的表达,在茎端共同起作用。

2.2 春化途径(Vernalization pathway)和自主途径(Au-tonomous pathway)中FT基因的作用

FLOWERING LOCUS C(FLC)基因是开花抑制物,它是春化途径和自主途径的汇集点(convergence point)[16],在维管组织和茎分生组织处表达[17]。Searle应用染色质免疫沉淀试验,证明在春化作用以前,FLC就直接与FT基因第1个内含子的5'末端CAr G盒处结合,阻止系统信号的形成,FT基因的表达被抑制,而在SAM处SOC1能够被这个信号激活表达。另外,FLC可以直接与SOC1和FD启动子上的CAr G盒区域结合,抑制叶片中FT信号的响应,在分生组织处降低表达。Michaels et al[16]的研究证明,SOC1的表达可以强烈抑制FLC所引导的晚花表型,直接被TSF和FT激活,但对FLC m RNA的表达水平无影响。以上研究说明FLC的表达直接介导其靶基因的表达,可以不受FT的影响,从而促进开花,而FLC基因抑制FT靶基因对FT信号的响应或FT基因的表达。

2.3 光周期途径(Photoperiodic pathway)中FT基因的作用

CO是光周期途径中的关键基因,其能引起花分生组织基因的表达,作用机理是将来自于光周期途径中的信号传递到FT和SOC1等成花信号枢纽处[7]。分别将韧皮部特异的启动子SUC2和分生组织特异的KNAT1启动子与CO连接(KNAT1∷CO,SUC2∷CO),结果表明CO基因在分生组织处过量表达则对开花过程无影响,CO基因在韧皮部处过量表达能够引起早花,CO基因不是在分生组织处,而在维管组织处促进开花。SUC2∷CO植株的早花表型会被FT的突变强烈地抑制[18,19],在SUC2∷CO植株其韧皮部处及维管组织处FT m RNA的丰度会增加,表明来自于CO的全部信号几乎都会被FT的突变所抑制,同时在FT突变体中CO基因过量表达也会引起晚花表型,说明CO基因下游主要的靶基因是FT。以上研究结果说明,FT的产物可能成为成花刺激物,CO的主要作用是在调控花发育过程中在叶片处活化FT,其长距离转运到SAM处促使开花。2007年Lin[4]、Tamaki[5]的研究进一步验证,蛋白FT-like从叶片转运到SAM处,是作为成花激素促使花分生组织特异性基因的表达,从而促进开花。

3 植物开花基因FT基因研究前景

植物转基因技术的研究和应用 篇9

关键词: 转基因技术 植物 医疗 环境保护

中图分类号: Q91 文献标识码: A文章编号: 1007-3973 (2010) 04-070-02

将外源或者人工修饰的基因导入植物基因组并稳定表达,可改变生物体性状并遗传下去,这就是植物转基因技术。1983年,人类首次获得转基因植物,1986 年美国和法国的科学家第一次进行了抗除草剂转基因烟草的田间试验。此后,植物转基因的研究与应用在世界各地蓬勃发展,并创造了巨大的经济效益。随着研究的深入,转基因植物的应用被不断拓宽,在农业上取得巨大经济效益的同时,其在医疗、资源、环境污染处理等方面的研究也吸引了越来越多的研究者。

1 植物转基因

1.1 植物转基因的原理

具有外源物种基因的植物叫做转基因植物,一般通过基因工程获得。基因工程是指按照人们的意愿用人工方法在体外对各种不同生物的DNA进行重组,构成遗传物质的新组合,并使其在受体细胞内持续稳定繁殖,从而获得大量新物种的技术。获得转基因植物需要具备3个要素:植物受体、目的基因和转化方法。受体的选择要考虑很多因素,如是否会对人类健康和生态环境有不利影响,是否有演变为杂草的可能,是否有敏感源和是否有毒等等。转基因的目的也应考虑进去,例如,选择合适的受体植物是生产转基因植物口服疫苗的关键,合适的受体植物可以使疫苗兼具表达量高、耐储藏和适宜于口服等优点。又如,为了利用转基因植物处理土壤污染,则尽量选择大型植物,以提高处理污染的效率。目的基因的选择也是根据具体研究的需要,截取需要表达的特性对应的基因。

另外,完成基因转化还需进行选择和一系列的鉴定工作,有时外源转化基因和植物中同源的内源基因的表达均被抑制即所谓的共抑制现象,有时外源基因在受体原生质中的表达瞬时不稳定,只有经过筛选和鉴定后,才能最终获得转化植物。

1.2 植物转基因的方法

植物转基因方法可分为生物学、化学和物理学方法三大类。生物学方法有农杆菌介导转化法、花粉管通道法、病毒介导法等;物理学方法包括基因枪法、显微注射法和电激穿孔法等;化学方法包括聚乙二醇法、脂质体法等。在上述多种方法中,占主导地位的是农杆菌介导法,常用的还有基因枪法。

农杆菌介导的转基因技术:将目的基因插入到农杆菌中的Ti质粒上,使菌体成为共整合系统或双元整合系统,当农杆菌侵染植物时,菌体中的一段携带目的基因的T-DNA插入到植物基因组内,这段基因在植物细胞内编码了植物生长素和细胞分裂素的合成,同时利用植物细胞环境编码提供自己碳源和氮源的化合物,因此农杆菌和宿主植物形成了互利共生的关系。

基因枪转基因技术:由康奈尔大学Sanford提出,是将目的基因包裹在直径在微米级的球状金粉或钨粉颗粒上,用火药爆炸或高压气体加速金属微粒将其送到受体植物细胞中,再通过组织培养获得完整植株。

2 转基因植物的应用

2.1 转基因植物在农业上的应用

转基因技术改善作物中品质:作物的优质一直是人们追求的目标,目前利用转基因技术可以改善作物中营养元素的含量、控制植物的成熟期等。目前用于优化作物产品质量的基因主要有控制果实成熟的基因,谷物种子贮藏蛋白基因,控制脂肪合成基因等。如今改变作物中氨基酸蛋白质等物质的含量已经很常见,最近由日本、韩国和丹麦研究人员组成的研究小组成功培育出铁含量3倍于普通稻米的水稻,并证实这种高铁水稻能改善实验鼠的贫血症状。

转基因增强作物抗虫害:植物病害和虫害往往使农业生产蒙受严重损失,而农药的大量使用不仅污染环境,其残留还影响人类健康,利用植物转基因技术培育抗虫作物受到了大量研究者的重视。例如一种转基因玉米,可以通过释放一种吸引线虫的化学信号从而抵抗破坏性的根虫虫害,因为线虫是甲虫幼虫的天敌。Ted Turlings及其同事把一种来自牛至的(E)-β-石竹烯(EβC,一种能吸引线虫的化学物质)合成基因插入到了玉米中,使玉米有了自我保护能力。

转基因增强植物抗逆性:植物在自然界生长过程中易受外界环境影响,如旱涝、盐碱、强光、寒冷、高温、低温等作用于植物,会引起植物体内发生一系列的生理代谢反应,表现为代谢和生长的可逆性抑制,严重时甚至引发不可逆伤害导致整个植株死亡。据Wired Science报道,加州大学河滨分校的科学家通过改变一种基因,让作物能够与有毒的铝相容。通过此技术,可能栽培出能在因含铝而被定性为有毒的土壤中生长的农作物。

2.2 转基因植物在医疗方面的应用

二十多年来,植物转基因技术的发展使外源基因在植物中表达变成现实,因此,利用转基因植物作为生物反应器生产动物疫苗等蛋白质已经变成可能,从而使植物基因工程迈上了新的台阶。Julian Ma及其同事将两种已知蛋白杀菌剂b12单克隆抗体和cyanovirin-N与一个单分子结合,使这种分子的抗HIV能力增强,而这种具有生物活性的融合分子由转基因植物产生。这项研究不仅产生了一种对抗HIV传播的新药,也满足了规模化生产的需求。目前,乙型肝炎表面抗原、大肠杆菌不稳定肠毒素(LT2B)抗原、诺沃克病毒衣壳蛋白、口蹄疫病毒VP1抗原、霍乱抗原等都已经在转基因植物中成功表达,并且成功地诱导动物产生保护性免疫反应。狂犬病毒糖蛋白在转基因西红柿中也已经成功地表达。

转基因植物产生的抗体、疫苗等,具有生产成本低,可规模化生产,方便保存运输等优点,2006 年2月,美国农业部(USDA)签发批准了转基因鸡新城疫植物疫苗商品化,这是第一个被许可上市的兽用转基因植物疫苗。但是大部分转基因植物用于医疗领域的研究尚且处于初级阶段,考虑到药物的安全性问题,还没有人用植物疫苗的二期临床研究报道。

2.3 转基因植物在其它方面的应用

植物转基因技术除了主要用于农业和医疗方面外,在保护环境和能源方面也有很好的发展前景(表1)。比如转基因植物用于处理土壤重金属污染,利用重金属富集植物从土壤中吸收重金属,通过植物的迁移转运作用,在可收割部位富集,待植物收获后再进行处理。现在,转基因植物在处理Hg,Se等污染中,已经发挥重要作用;转基因植物在生产生物燃料方面也有应用,美国能源部Brookhaven国家实验室的科学家从拟南芥和白杨(Populus trichocarpa)中发现一个基因家族可以控制细胞壁-酰基的结合,阻止生物纤维被消化为糖,使工程作物更容易生产生物燃料;通过转基因技术改造的杨树也可以产生作为造纸重要原料的长纤维,使杨树成为环保优质的造纸原料;此外转基因技术在花卉改良中也发挥着重要作用,培育色彩新奇、形态优美、抗性优良和花期延长的花卉新品种是转基因技术应用于花卉的主要目标。

表 1 转基因植物用于环境保护

3 转基因植物研究中的问题

植物转基因技术正在农业、医疗等领域发挥越来越重要的作用,同时转基因植物的潜在问题也逐渐暴露出来。在培育抗虫害作物时,首先碰到的问题就是转基因植物的非靶标效应,转基因生物释放后对于目标害虫或病原菌以外的生物的各种直接或者间接的不利影响,威胁到其它有益生物的生存,同时转基因植物的生存优势可能导致其肆意蔓延生长,以至威胁到生态系统的平衡;转基因植物口服疫苗存在易被人胃肠道分解的问题,口服疫苗的剂量问题也需研究,口服疫苗难以被人们接受,这也是影响研究的重要因素之一;在处理环境污染过程中,植物生长周期长,处理效率低,这些也限制了其应用。

转基因植物是否对人具有潜在的危险,一直没有定论。转基因可能诱发植物本被抑制毒性蛋白过量表达,或者使植物产生新的过敏原,甚至通过转基因食品在人体内的NDA残余危害人类健康。已经有研究报道,证实了转基因马铃薯对于小白鼠的内脏和免疫系统的威胁。国际环保组织绿色和平重申其警告:转基因技术的安全性存在巨大的健康隐患,包括中国在内的各国政府需立即停止任何转基因粮食作物的商业化审批和种植,并同时应加强对转基因食品安全性的研究。

4 展望

转基因植物具有巨大的经济效益和环境效益。利用转基因植物作为生物反应器,生产目的蛋白,抗体,疫苗等也有巨大的发展前景。随着研究的进展,将发展转化率更高的外源基因导入方法,并逐步阐明转基因植物的分子机制,降低转基因植物的“副作用”和潜在的危险性,扩展其接受度。另外,植物转基因技术将可能应用到更多的领域,解决其它领域碰到的生物学难题。

参考文献:

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[8] 孙宁宁等. 转基因技术在污染土壤植物修复中的研究进展[J]. 中国水土保持. 2009 (6).

[9] Yu X H, J Y Gou, et al. BAHD superfamily of acyl-CoA dependent acyltransferases in Populus and Arabidopsis: bioinformatics and gene expression[J]. Plant Mol Biol. 2009 (4).

转基因植物疫苗的研究进展 篇10

转基因植物疫苗是指把植物基因工程技术与机体免疫机理相结合,生产出的能使机体获得特异抗病能力的疫苗。由于口服疫苗到肠内黏膜诱导部位之前要经过胃内的不利环境,因此有效的口服疫苗经过这些不利环境时必须要受到保护,否则会失去免疫性。而植物细胞壁作为天然的生物胶囊,可使细胞内的疫苗抵抗消化道的酸性环境和各种酶类降解,使表达的疫苗在小肠内释放,引起消化道的黏膜免疫反应,刺激黏膜下B、T淋巴细胞产生的抗菌素到消化道、血液、呼吸道中,发挥对机体的全面保护作用,疫苗通过胃进入与淋巴组织相关连的肠道,从而刺激免疫球蛋白A1的产生,以达到防治疾病的目的。动物实验已经证实,转基因植物表达的抗原蛋白经纯化后仍保留了免疫学活性,注入动物体后能产生特异性抗体;用转基因植物组织饲喂动物,转基因植物表达的抗原呈递到动物的肠道淋巴相关组织(GALT),被其表面特异受体特别是M细胞所识别,产生黏膜和体液免疫反应。

2 转基因植物疫苗的生产方法

在目前的转基因植物疫苗生产领域里,存在着两种不同的疫苗表达系统。

2.1 稳定整合的表达系统

这一方法是将抗原基因构建在植物表达载体上,利用脓杆菌或基因枪介导的方法,将抗原基因转化到植物细胞中并与植物基因组整合,获得稳定表达的转基因植株。本方法具有以下优点:一是通过有性或无性繁殖的方法,可以很容易地获得大量的转基因植株;二是通过有性杂交的方法,可以获得生产多价复合疫苗的转基因植物;三是通过特异性表达启动子使抗原基因在器官或组织中特异性表达。

2.2 瞬时表达系统

本方法是应用植物病毒作为载体,将目的基因插入病毒基因组中,然后将重组病毒接种到植物叶片上,任其蔓延,外源基因随病毒的复制而高效表达。这一方法又分为两种方式:一种是将抗原基因置于病毒基因组启动子控制之下,另一种是将抗原基因与病毒外壳蛋白基因融合在一起。值得指出的是,抗原基因融合于病毒外壳蛋白的表达方式更具有免疫原性。目前用作载体的植物病毒主要是烟草花叶病毒(TMV)和豇豆花叶病毒(CMPV)。

本方法表达量高,而且一般认为植物病毒不会传染动物,无交叉感染,但缺点是不能稳定遗传。此外,尚有几个问题需要解决:一是抗原的纯化;二是弱毒株系的选择,即病毒对植物的浸染不会使植物生长异常,还要保证抗原基因的整合不会使病毒失去浸染和复制的能力;三是现有植物病毒载体浸染的植物宿主范围有限。

2.3 生产转基因植物疫苗的一般程序

(1)克隆特异中和抗原的编码基因;(2)构建植物表达载体,把基因整合到植物表达载体上,或利用重组病毒作为载体;(3)利用各种转基因方法将抗原基因转入植物体,使植物带有编码抗原的基因;(4)进行愈伤组织的诱导和分化及转基因植物的再生,使抗原蛋白基因在植物中表达;(5)进行表达水平的检测和免疫原性的测定;(6)进行安全性评价、检测。

3 转基因植物疫苗的发展历程

近年来的研究集中在转基因植物疫苗在人类及动物中的应用。到目前为止,已报道的转基因植物疫苗大致可分为4类:即细菌疫苗、病毒疫苗、寄生虫疫苗及避孕疫苗。

3.1 细菌疫苗

用转基因植物生产的细菌疫苗主要有大肠杆菌不耐热毒素B亚单位疫苗(LT-B)和霍乱肠毒素B亚单位疫苗(CT-B)。

3.1.1 LT-B疫苗

Mason等把编码LT-B的基因转化到马铃薯中,使得LT-B在马铃薯的叶片和块茎中得到表达。经分析表明,马铃薯来源的重组LT-B具有五聚体结构,能结合神经节苷脂。

动物实验表明,转基因马铃薯产生的LT-B能刺激小鼠产生体液和黏膜免疫反应,它诱导产生的抗体能中和LT的活性。之后,他们对此进行了深入研究,结果表明LT-B主要积累在叶片和块茎中。用含有重组LT-B的马铃薯块茎直接饲喂小鼠,每周1次,每次5 g(约含LT-B 20μg),共免疫3次,免疫后的小鼠产生了黏膜和血清抗体;同时,用5μg细菌来源的重组LT-B来免疫小鼠(采用管饲法),在第3次免疫结束后隔一周采血检测抗体水平,结果显示用马铃薯来源的重组LT-B免疫小鼠所产生的抗LT-B血清抗体和黏膜抗体水平比用细菌来源的重组LT-B免疫小鼠所产生的抗体水平高;然后用25μg的LT喂小鼠进行攻击感染,结果显示用高剂量转基因马铃薯LT-B疫苗比用源于细菌的重组LT-B疫苗更具保护作用。

3.1.2 CT-B疫苗

霍乱毒素B亚单位(CT-B)与肠道黏膜细胞表面的特异性神经节苷脂结合会引起腹泻。Arakawa等将该基因导入马铃薯中,用其块茎直接饲喂小鼠,而后在其血清和肠道内检测到了特异性抗体,当黏膜抗体水平下降后,用其块茎强化免疫,抗体水平又迅速提高。毒性中和实验表明,马铃薯口服疫苗诱导小鼠产生的特异性抗体可以中和CT的毒性。用CT接种经转基因马铃薯口服免疫后的小鼠,其肠道腹泻分泌液量与对照组小鼠相比减少了60%。以上结果说明,口服转基因植物疫苗有可能成为一种预防细菌内毒素疾病的有效手段。

3.2 病毒疫苗

3.2.1 乙型肝炎(HB)疫苗

Mason等首次报道了转基因植物HB疫苗的研究结果。乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)可刺激机体产生针对HBV的保护性抗体,此抗体是现有商业疫苗的主要成分。他们将编码HBs Ag的结构基因导入烟草并获得了表达,在叶片提取液中检测到了HBs Ag及其特异性m RNA,并在电镜下观察到重组HBs Ag形成了直径为22 nm的球形颗粒,与其天然状态相似。用相当于商用疫苗3%有效剂量的转基因植物蛋白粗提液肌肉注射小鼠,发现能诱导较强抗体。来源于经植物疫苗免疫过的小鼠T细胞,在体外能被植物来源的重组HBs Ag、酵母来源的HBs Ag及合成的多肽激活,表明植物疫苗免疫的小鼠产生了T细胞免疫。这些结果说明,转基因植物中表达的HBs Ag具有正确的B细胞及T细胞识别表位。

刘玉乐等将人乙型肝炎病毒(adw亚型)表面抗原(HBs Ag)基因插入植物双元载体p ROKⅡ-HBs Ag的Ca MV35S启动子下游,构建重组质粒p ROKⅡ-HBs Ag,将此质粒导入脓杆菌LBA4404中,利用脓杆菌感染叶盘的方法转化烟草,经酶联免疫分析,发现转化植株及其后代均能产生具有免疫活性的HBs Ag;免疫吸附电镜观察表明,转化植株产生的HBs Ag呈典型的直径为22 nm的颗粒,显示了用植物生产HBs Ag的可行性。刘德虎等人利用所获得的转基因马铃薯饲喂小鼠后,在小鼠血液中检测到了乙肝病毒保护性抗体,其抗体滴度足以对人产生保护力。

3.2.2 兔出血症病毒(RHDV)疫苗

Vp60是RHDV的主要结构蛋白。Castanon等用编码RHDV Vp60蛋白的基因转化马铃薯,该转基因马铃薯植株产生了特异的m RNA和正确的Vp60蛋白,用此植株的叶片提取物免疫兔子,在兔子体内产生了高滴度的抗Vp60特异性抗体。攻毒试验表明,所免疫兔子完全避免了兔出血症的发生。

3.2.3 口蹄疫病毒(FMDV)疫苗

Wigdorovitz等用转基因苜蓿表达了FMDV结构蛋白vp1,用此转基因苜蓿的新鲜叶片饲喂小鼠后,小鼠体内产生了特异性抗体。攻毒试验表明,经免疫的小鼠能抵抗毒性FMDV的感染。

3.3 寄生虫疫苗

疟疾是世界性的严重寄生虫病。Turpen等将编码疟原虫抗原决定簇的基因片段插入到烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白的编码区中,构建了植物病毒载体,然后用它感染烟草,所产生的高水平重组融合蛋白经试验证明具有抗原活性。

3.4 避孕疫苗

哺乳动物受精过程中精卵细胞的结合具有种属特异性,这种特异性的结合是由精子表面的特异性蛋白与卵细胞透明带糖蛋白通过受体配体模式进行的,透明带是卵细胞膜外的一层非细胞结构,是精子与卵细胞识别和结合的部位,透明带具有多种糖蛋白,其中ZP3充当精子受体在受精过程中起着重要作用,而从避孕的角度来说它是免疫避孕的一个靶位。Fitchen等将小鼠ZP3蛋白的一个含有13个氨基酸残基的抗原决定簇转化到烟草花叶病毒的衣壳蛋白中,利用其作载体感染植物获得了转基因植物,用此转基因植物免疫小鼠,其体内产生了抗ZP3的特异性血清,还发现透明带聚集了抗ZP3抗体,证明利用转基因植物生产避孕疫苗具有可行性。

4 转基因植物疫苗的优点

4.1 利于大规模工业化生产

利用哺乳动物细胞表达系统的优点是可与人的内环境进行相似的复制、翻译、表达,但是哺乳动物细胞培养需要牛血清,成本花费大,而植物是能够大规模也是最经济的生产蛋白质的生产系统。在转基因植物中,只要将外源基因成功转入一个植株中,就可以通过种子遗传给下一代,从而大面积种植,成本很低。其次,动物细胞培养不利于大型工业化生产,它受很多因素制约,如温度、p H值、溶解氧浓度等,这些因素会影响细胞产出蛋白的量。当然,植物中蛋白质的密码子和哺乳动物的仍有差别,但是和微生物相比,这种差异较小。

4.2 使用安全

对免疫接种动物来说,表达系统中的非目的成分对动物无害,不存在其他动物病原体污染的可能;免疫接种时,不需要注射器和针头之类的设备,不存在通过注射接种而使动物感染病原微生物的可能,同时大大减少了免疫接种时动物的应激反应。关于转基因食品安全性的争论,美国食物安全和应用营养中心已经证明了卡那霉素抗性基因植物作为食物添加剂的安全性。对环境来说,转基因植物疫苗也是绿色环保产品,无论其生产过程还是生产成品都不存在污染环境的问题。转基因植物只表达亚单位疫苗,不含致病微生物或潜在的致病微生物,对人畜安全。

4.3 免疫效果好

植物细胞中的疫苗抗原通过胃内的酸性环境时可受到细胞壁的保护,直接到达肠内黏膜诱导部位,刺激黏膜和全身免疫反应。不仅如此,转基因植物口服疫苗还可诱导消化道相关淋巴样组织(GAL T)产生分泌性Ig A(s Ig A),并在病原体和宿主之间相互作用的起始部位直接诱发免疫反应,从而大大提高其免疫有效性。

4.4 植物细胞具有全能性

能够再生植株且易于成活,生长周期短,易于快速筛选出转基因阳性植株。不仅比构建动物生物反应器节省时间,而且构建植物生物反应器的技术更成熟,成功率更高。

4.5 能进行有效的翻译后加工

植物与动物一样,属真核生物,具有与之相似的翻译后加工过程,适合于动物病毒抗原的表达,病毒产物具有与之相似的免疫原性。

5 展望

转基因植物作为生物反应器生产转基因植物疫苗或其他转基因产品,为人和动物提供了一个最经济有效的生产系统,具有许多潜在优势,但这只能算是起步阶段,离实际应用还有很大一段距离,还面临着许多未知的和有待解决的难题,仍需做进一步的效力试验、稳定性试验以及免疫途径、免疫剂量等多方面的研究,关键问题是提高抗原表达水平。随着转基因技术和相应检测手段的逐步建立和优化,转基因植物疫苗在产业化生产中必将具有广阔的应用前景。

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