基因组脱氧核糖核酸（共4篇）
基因组脱氧核糖核酸 篇1
肠道菌群与肥胖、心血管系统等多种疾病相关。鉴于肠道菌群的重要性, 研究人群肠道菌群的群落结构 (如种类、数量、比例、定位和生物学特性等) 具有重要的意义。肠道菌群的研究方法主要有传统法和分子生物学的方法。传统法的培养法和镜鉴法主要用于早期肠道菌群方面的研究。目前, 分子生物学技术检测粪便中细菌基因组脱氧核糖核酸 (deoxyribonucleic acid, DNA) 是探讨人肠道菌群的群落结构的重要方法。粪便成分复杂, 含有大量多糖、胆酸等对人基因组DNA检测产生抑制作用的成分, 且粪便DNA绝大部分来源于肠道细菌, 人源DNA含量很少[1]。能否高效提取粪便中细菌基因组DNA成为影响探寻肠道菌群多样性和差异性的关键因素。本文采用四种不同方法提取人粪便细菌基因组DNA, 并将产物的16S r DNA基因V3区进行扩增, 对提取效率进行综合比较。
1 材料与方法
1.1 样品的采集与储存
收集2013年9月至10月以灭菌过的粪便取样盒采集30份体检正常的20~30岁志愿者的新鲜粪便样本, 并在采集后30 min内送至实验室, 于-20℃冻存, 备用。
1.2 仪器和试剂
1.2.1 仪器
高速冷冻离心机;Nano Drop 2000微量紫外分光光度计;聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR) 仪;BG-Power600电泳仪;BILON恒温摇床;漩涡混合器;电热恒温水浴锅。
1.2.2 试剂
磷酸缓冲盐溶液 (phosphate buffer saline, PBS) 缓冲液;三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液 (tris ethylene diamine tetraacetic acid, TE) 缓冲液;溶菌酶;10%十二烷基磺酸钠 (sodium dodecyl sulfonate, SDS) ;乙二胺四乙酸 (ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA) ;核糖核酸酶A (ribonuclease, RNase A) ;三羟甲基氨基甲烷盐酸 (tris aminomethane hydrochloride, Tris-HCl) ;氯化钠 (sodium chloride, Na Cl) ;2%十六烷基三甲基溴化铵 (cetyl trimethyl ammonium bromide, CTAB) ;氯仿;异丙醇;75%乙醇;苯酚;Tris酚;异戊醇;醋酸钠;无水乙醇;异硫氰酸胍;硅珠悬液;液氮;蛋白酶K;琼脂糖;5×Tris-硼酸电泳缓冲贮液;2×Taq PCR Master Mi X (BIOSCI) , 以上试剂均购置于上海索莱宝生物科技有限公司。粪便细菌基因组DNA提取试剂盒 (TIANamp Stool DNA Kit, TIANGEN) 。
1.2.3 引物的设计与合成
扩增样本中乳酸菌16S r DNA的V3区域特异性引物V3F+GC和V3R+GC均由上海桑尼生物科技有限公司合成, 序列如下:V3F+GC:5’-CGCCCGC CGCGCGCGGCGGGCGGGG CGGG GG CAC GG GGGC CTAC GGGA GGCAGCAG-3’;V3R+GC:5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’。
1.3 粪便细菌基因组DNA提取方法
1.3.1 改进的氯仿抽提法
根据Tsai (1991) 的方法[2], 有改动。称取200 mg粪便置1.5 m L离心管中, 加入1 m L PBS (p H7.4) 涡旋震荡充分混匀, 13 000 r/min离心2 min后, 取上清, 收集沉淀;重复步骤2次。收集沉淀加入15 mg/m L溶菌酶, 于37℃水浴20 min, 加入300μL消化液 (含20 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA、5 m L 10%SDS、0.1 mg/m L RNase A) , 于55℃水浴30 min后。13 000 r/min离心5 min, 收集上清, 移入干净的1.5 m L离心管内, 再在上清中加入100μL5 mol/L Na Cl溶液, 混匀后加入100μL CTAB, 于65℃水浴10 min。加入700μL氯仿, 室温震荡2 min, 13 000 r/min离心5 min, 取600μL上清至新的1.5 m L离心管内。加入等体积的氯仿, 室温震荡2 min, 13 000 r/min离心5 min。取400μL上清移入新的1.5 m L离心管内, 加入等体积异丙醇, 加入5μL醋酸钠, 轻轻颠倒混匀后室温放置3 min。于13 000 r/min离心10 min, 倒弃上清加入1 m L 75%乙醇冲洗沉淀两次。开盖室温晾干残余乙醇, 再加入100μL TE, -20℃冻存。
1.3.2 改进的CTAB法 (加硫氰酸胍法)
综合Constable (1995) 的方法[3], 有改动。称取200 mg粪便于1.5 m L离心管中, 加入1 m L CTAB裂解液, 混匀后55℃水浴2 h, , 每隔30 min取出摇匀一次。12 000 r/min离心5 min后, 移出700μL上清至新的1.5 m L离心管内, 在上清中加入等体积Tris酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1) , 涡旋震荡10 min。10 000 r/min离心10min, 吸出上清至另一个新的1.5 m L离心管内, 加入等体积Tris酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1) 重新抽提, 直至离心后水相和有机相之间不再有白色沉淀物。向上清中加入5μL 3 mol/L醋酸钠, 颠倒混匀后加入1.5倍体积预冷无水乙醇, 充分混匀后-20℃放置1 h。12 000 r/min离心10 min, 弃上清, 沉淀在室温中晾干。在沉淀中加入1 m L异硫氰酸胍洗液, 摇匀至沉淀完全溶解。加入100μL硅珠悬液, 缓慢摇匀吸附DNA 10 min, 10 000 r/min离心5 min, 弃上清。在硅珠沉淀中加入500μL异硫氰酸胍洗液, 混匀后10 000 r/min离心5 min, 弃上清留沉淀, 重复上步骤一次。在沉淀中加入500μL 70%乙醇重新冲洗沉淀两次。室温晾干残余乙醇, 加入100μL TE, 涡旋震荡5 min洗脱DNA。最后12 000 r/min离心5 min, 移除80μL上清至新的1.5μL离心管内, -20℃冻存。
1.3.3 改进的液氮冻融法
根据Bao Y中的方法[4], 有改动。粪便前处理:称取200 mg粪便, 加入30 m L PBS (p H 7.0) 涡旋震荡, 充分混匀, 使样本均匀浑浊, 除食物残渣外无较大的固体颗粒。200 g离心5 min, 收集上清, 弃去沉淀。重复洗涤3次。9 000 g离心5 min, 重复洗涤3次。弃上清, 留沉淀。加入4 m L PBS缓冲液, 涡旋震荡混匀, 取1 m L移入1.5 m L离心管中, -20℃冻存。DNA提取:待前处理粪便样品融化后, 8 000 r/min离心5 min (4℃) , 弃上清收集沉淀。加入500μL TE缓冲液, 涡旋震荡使之重悬。立即至于液氮中完全冻结, 取出后放入65℃水浴中5 min融化, 反复冻融3次。再加入60μL 10%SDS和2μL 100 mg/m L RNase A, 55℃水浴30 min。再加入10μL 20 mg/m L蛋白酶K, 颠倒混匀后于37℃摇床摇4 h。加入80μL 2%CTAB和80μL 5 mol/L Na Cl, 颠倒混匀65℃水浴20 min, 得到DNA粗提取液。在粗提取液中加入750μL苯酚∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶1) , 颠倒混匀10 min, 12 000 g (4℃) 离心10 min。取上清, 加入750μL氯仿∶异戊醇 (24∶1) , 颠倒混匀。12 000 r/min (4℃) 离心10 min, 取上清, 重复上述步骤2次。在上清液中加入500μL预冷的异丙醇, 轻轻颠倒混合, 直至肉眼可见DNA沉淀下来。12 000 r/min离心10 min, 弃去上清, 在沉淀中加入1 m L 75%乙醇冲洗沉淀2次。在室温中自然晾干残余乙醇。最后用60μL TE溶解DNA。4℃放置过夜之后置于-20℃冻存。
1.3.4 粪便基因组DNA提取试剂盒法
按TIANamp StoolDNA Kit说明书进行。
1.4 DNA溶液浓度及纯度测定
粪便总DNA通过Nano Drop2000紫外微量分光光度计定量检测提取DNA浓度, 用OD260/280检测提取DNA的纯度。
1.5 提取DNA的PCR有效性分析
PCR反应体系 (50μL) :2×Taq PCR Master Mi X, 25μL;正向引物 (10μmol/L) , 1μL;反向引物 (10μmol/L) , 1μL;DNA模板, 2μL;dd H2O, 21μL。PCR反应条件:95℃预变性4 min;95℃变性45 s, 65℃退火1 min, 72℃延伸2 min (20个循环) ;95℃变性1 min, 55℃退火1 min, 72℃延伸2 min (10个循环) ;72℃再延伸10 min。将PCR产物采用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳, EB (10μL) 染色, 电压150 V/cm, 15 min。用凝胶成像分析系统观察并照相分析。
1.6 统计学方法
应用SPSS 13.0统计软件进行数据处理, 计数资料采用方差分析两两比较, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同方法提取粪便细菌基因组DNA产物纯度和浓度比较
采用4种不同方法提取的粪便DNA浓度不同, 不同方法提取的粪便DNA浓度在各组间差异均有统计学意义 (P<0.01) , 见表1。在提取DNA的纯度上, 对于核酸来说, OD值在1.8~2.0范围内较好。OD值小于1.8时, 说明蛋白质含量高, DNA受到蛋白质污染;OD值大于2.0时, 说明DNA被核糖核酸 (ribonucleic acid, RNA) 污染。
a为四组两两比较P<0.01
2.2 不同方法提取粪便细菌基因组DNA产物的PCR有效性分析
在200 bp处可扩增出特异性条带。1a~1c模板为改进的氯仿抽提的DNA, 采用改进的氯仿抽提法提取DNA样品60% (18/30) 扩增出条带, 但扩增出的条带不清晰、且不整齐。2a~2c模板为改进的CTAB提取的DNA, 采用改进的CTAB法提取的DNA样品30% (9/30) 扩增出条带, 但扩增出的条带颜色暗淡。3a~3c模板为液氮冻融法提取的DNA, 采用液氮冻融法提取的DNA样品90% (27/30) 扩增出条带, 扩增出的条带清晰明亮, 但有些有拖尾现象。4a~4c模板为粪便DNA提取试剂盒提取的DNA, 采用粪便细菌基因组DNA提取试剂盒提取的DNA样品100% (30/30) 扩增出条带, 可扩增清晰明亮的条带并无拖尾现象, 见图1。
2.3 不同方法提取粪便细菌基因组DNA产物所耗时间和费用对比分析
改进的氯仿抽提法和改进的CTAB法提取粪便DNA产物成本较低, 实验耗时较长。液氮冻融法提取粪便DNA前需要对粪便样品进行前处理清洗, 所以操作所耗时间延长。由于液氮冻融法是综合氯仿抽提、CTAB法以及液氮反复冻融法的实验提取技术, 因此, 在成本消耗上较改进的氯仿抽提法和改进的CTAB法高。而目前试剂盒提取方法是迄今为止最为快速方便的成熟提取DNA实验的方法, 可在短时间内完成大批样本的处理, 工作效率较高, 但成本也相应提高, 见表2。
3 讨论
本实验对粪便肠道菌群基因组DNA的提取方法进行了探讨, 结果表明, 改进的液氮冻融法提取的DNA产物浓度高于其他方法。结合本实验中的改进的液氮冻融法, 利用PBS缓冲液对冻存粪便进行预处理, 结果得到了高浓度的DNA产物相对其他三种方法, 但产物纯度没有得到提升。改进的CTAB法和改进的氯仿抽提法提取产物纯度不高, 且浓度不高, 稳定性不好, 这就造成这两种方法使用的局限性。由此可见, 在预处理方面的忽视会使在不同研究中结果差异明显, 同时提取效果也不好, 间接导致在相同实验个案中存在扩增成功率的差异。试剂盒法提取的产物浓度适中, 提取产物纯度较好。但由于成本和耗时的差异, 使得此种方法的选择要根据各自实验的特点来进行。
在探讨粪便DNA的PCR有效性上, 改进的CTAB法和改进的氯仿抽提法提取产物过程中加大提取蛋白质含量, 可能会相对提高DNA纯度。液氮冻融法和试剂盒法均能够充分满足下一步分析肠道菌群结构的条件。液氮冻融法的提取稳定性较好, 如果再加大核糖核酸酶的使用量则会减少RNA污染及电泳条带拖尾现象, 从而避免使用相对价格昂贵的试剂盒, 使粪便DNA检测技术更具廉价性。
本研究探讨粪便DNA的纯度, 不仅从PCR的有效性上, 同时测定浓度和纯度值, 统计起来更加客观、更容易量化。用浓度和纯度分别考察提取效果比仅凭PCR成功率为因素评估所有条件更为有利:PCR成功与否与纯度和浓度均有关系, 因此单纯PCR扩增条带分析方法不容易分离出主要影响因素。本实验结果显示不同的提取方法有着不同的结果, 通过产物纯度, 从而决定下游一切试验的效果。
从人粪便中提取高质量的肠道菌群总基因组DNA是研究分析肠道菌群与相关疾病发生机制的基础和前提。粪便样品中含有大量肠道菌, 同时也含有各种肠道脱落细胞、腐殖质以及多种无机物和有机物等[5]。改进的氯仿抽提法、改进的CTAB法和液氮冻融法提取的肠道菌群基因组DNA产物其中依然含有杂质, PCR抑制物也随之增多, 但经过改进的方法比以前的方法在浓度和纯度上有进一步提升。虽然可以满足对肠道菌群变性梯度凝胶电泳 (DGGE) 定量分析, 但对后续产物测序有一定局限性。由于目前粪便提取基因组DNA试剂盒在提取产物纯度和质量上的稳定性, 提高了粪便DNA提取效率的同时对肠道菌群DNA产物的测序工作奠定了研究基础。综上所述, 我们建议各实验室可根据具体的实验要求和特点、经费支持情况、人力物力来合理选择粪便DNA提取方法。
参考文献
[1]Boynton KA, Summerhayes IC, Ahlquist DA, et al.DNA integrity as a potential marker for stool-based detection of colorectal cancer[J].Clin Chem, 2003, 49 (7) :1058-1065.
[2]Tsai YL, Olson BH.Rapid method for direct extraction of DNA from soil and sediments[J].Appl Environ Microbiol, 1991, 57 (4) :1070-1074.
[3]Reed JZ, Tollit DJ, Thompson PM, et al.Molecular scatology:the use ofmolecular genetic analysis to assign species, sex and individual identity to seal faeces[J].Molecular Ecology, 1997, 6:225-234.
[4]Bao Y, Wang ZL, Zhang Y, et al.Effect of Lactobacillus plantarum P-8 on lipid metabolism in hyperlipidemic rat model[J].European Journal of Lipid Science and Technology, 2012, 114 (11) :1230-1236.
[5]Gillan DC, Speksnijder GC, Zwart G.Genetic diversity of the biofilm covering Montacuta ferruginosa (Mollusca, Bivalvia) as evaluated by denaturing gradient gel Electrophoresis analysis and cloning of PCRamplified gene fragment coding for 16S r DNA[J].Appl Environ Microbiol, 1998, 64 (9) :3464-3472.
基因组脱氧核糖核酸 篇2
Taqman荧光定量PCR是核酸水平对管家基因GAPDH进行定量的好方法
目的比较Taqman荧光定量PCR法、SYBR Green I荧光定量PCR法和普通PCR法制作3-磷酸甘油醛(GAPDH)标准曲线的检出下限、线性范围的差异,确定一种较好的`GAPDH绝对定量方法.方法构建含GAPDH全长的质粒,经PCR和EcoR I限制性酶切鉴定确认后,紫外定量并连续稀释10倍作为标准品.分别用Taqman法和SYBR Green I法于荧光定量PCR仪上制作标准曲线,同时用普通PCR结合琼脂糖凝胶电泳利用Quantity One软件定量并制作标准曲线.结果Taqman法检出GAPDH的下限为2.0×104拷贝,线性范围:2.0×104～2.0×1010拷贝;SYBR Green I法检出GAPDH的下限为2.0×107拷贝,线性范围:2.0×107～2.0×1010拷贝;普通PCR检出GAPDH的下限为2.0×106拷贝,线性范围:2.0×107～2.0×109拷贝.结论Taqman荧光定量PCR法比SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR法和普通PCR法的灵敏度高,线性范围宽,是核酸水平对GAPDH定量的好方法.
作 者：王萍 丛敏 李忆梅 唐淑珍 刘晓明 王宝恩 贾继东 尤红 Wang Ping Cong Min Li Yimei Tang Shuzhen Liu Xiaoming Wang Baoen Jia Jidong You Hong 作者单位：首都医科大学附属北京友谊医院肝病研究中心刊 名：首都医科大学学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF CAPITAL UNIVERSITY OF MEDICAL SCIENCES年，卷(期)：27(2)分类号：Q503关键词：PCR GAPDH 荧光定量
基因组脱氧核糖核酸 篇3
1 材料与方法
1.1 病料、菌株和质粒
病料为临床采集的辽宁地区疑似PRRS死亡猪的肺脏和淋巴结; pMD 18-T 载体、pMD18-T Simple载体, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;转化宿主菌E.coli DH5α和质粒pIRES - neo , 均由沈阳农业大学畜牧兽医学院预防专业实验室保存。
1.2 主要试剂
Taq 聚合酶、限制性内切酶 (EcoR Ⅰ、Bam H Ⅰ) 、反转录酶 (M-MLV) 、T4 DNA 连接酶以及胶回收试剂盒, 均为宝生物工程 (大连) 有限公司产品;质粒小量抽提试剂盒, 购自Axygen公司。
1.3 引物的设计
参照国内发表的PRRSV分离株的核苷酸序列自行设计引物 (由上海生工生物工程技术服务有限公司合成) , 其中P1、P2扩增产物1 101 bp, 包含ORF6基因的全部开放阅读框;P3、P4扩增产物分别引入EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ酶切位点 (下划线部分) , 扩增产物为525 bp。引物序列为P1 5′-ggCggTATgTCTTgAgTAgC -3′, P2 5′-ACTCCACAgTgTAACTTATCCTC -3′;P3 5′-gAATTCATggggTCgTCTCTA- 3′, P4 5 ′-ggATCCTTATTTggCATATTTA- 3′。
1.4 RNA 的提取
研磨病料, 取上清液按Trizol试剂说明书提取PRRSV RNA 。
1.5 RT - PCR
以提取的总RNA 为模板、 P2为引物 (工作浓度为10 pmol/μL) 进行反转录, 反应条件:42 ℃ 45 min;95 ℃ 5 min。再以反转录产物cDNA为模板, 以 P1、P2 为引物进行PCR 扩增, 反应条件: 94 ℃ 预变性3 min;94 ℃ 变性1 min , 58 ℃退火 1 min , 72 ℃再延伸1 min, 共30个循环;72 ℃再延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳, 利用DNA凝胶回收试剂盒回收含1 101 bp 的ORF6基因片段, 置于-20 ℃保存, 备用。
1.6 PCR产物的克隆、测序
按照pMD18 - T 载体说明书将目的基因ORF6与pMD18 - T 载体连接、转化。碱裂解法提取质粒DNA并进行PCR鉴定。用BamHⅠ、Hind Ⅲ双酶切鉴定得到预期目的片段。选取阳性克隆质粒委托北京华大生物有限公司进行测序, 并将阳性克隆质粒命名为pMD18-T-ORF6。
1.7 序列分析
应用DNAStar软件对测序正确的ORF6基因进行序列分析, 并与国内外已发表的PRRSV毒株相应区域核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比较。
1.8 重组质粒pIRES-ORF6的构建
以P3、P4为引物 (工作浓度为10 pmol/μL) , 采用PCR方法从pMD18-T-ORF6上扩增目的基因ORF6片段, 将其连入pMD18-T Simple载体, 获得pMD18-T Simple-ORF6质粒, 进行EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切鉴定和PCR鉴定, 结果得到预期大小 (525 bp) 的目的片段, 说明构建正确。鉴定正确后用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ分别对pMD-18T Simple-ORF6质粒和pIRES-neo 载体酶切, 回收目的基因片段ORF6 (525 bp) 和pIRES载体片段 (5 290 bp) , 用T4 DNA 连接酶连接过夜, 转化, 提取质粒, 对重组质粒pIRES - ORF6进行PCR和EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切鉴定。
2 结果
2.1 RT-PCR结果
用设计的特异性引物P1、P2进行RT - PCR , 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳, 结果可见大小为1 101 bp特异性扩增片段, 与预期相符, 见图1 。
M.DL-2 000 Maker; 1, 2.RT-PCR产物。
2.2 ORF6基因序列的测定结果 (见图2)
注:下划线部分为编码区 (525 bp) 。
pMD18-T-ORF6测序结果表明:PRRSV辽宁分离株ORF6基因cDNA编码区为525 bp, 可编码174个氨基酸 (见图3) 。
2.3 ORF6基因与其他分离株ORF6基因序列同源性比较和遗传进化分析
运用DNAStar软件将ORF6基因以及推导的氨基酸序列与PRRSV欧洲株LV、北美洲株VR-2332和其他部分国内外分离株的核苷酸和氨基酸序列进行同源性比较, 并进行了遗传进化分析, 结果见图4～6。结果表明, PRRSV辽宁分离株ORF6 (LN-ORF6) 与VR-2332株的核苷酸、氨基酸同源性分别为94.9%和97.1%, 与LV株的核苷酸、氨基酸同源性分别为69.6%和79.9%, 与南韩株 (Korea) 的核苷酸、氨基酸同源性分别为94.9%和97.1%, 与国内分离株AY262352 HB-2的核苷酸、氨基酸同源性分别高达96.6%和97.7%, 与AY032626 CH-1a的核苷酸、氨基酸同源性分高达为97.0%和97.1%。遗传进化树分析结果表明, 该分离株与AY032626 CH-1a、AY262352 HB-2等同属于PRRSV 美洲株的一个分支。据此可以推测PRRSV辽宁分离株属于北美型毒株。
2.4 重组质粒pIRES-ORF6的酶切及PCR鉴定结果
重组质粒pIRES-ORF6分别用EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切鉴定, 切出目的片段大小525 bp, 与预期相符, 见图7。
1.DL-5 000 Marker; 2.pIRES-ORF6质粒;3.EcoR Ⅰ+BamH Ⅰ酶切产物;4.ORF6基因PCR产物。
3 讨论
PRRS是由PRRSV引起的以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难为特征的动物传染病。该病于1987 年首次在美国发现, 之后迅速在全球蔓延。目前, 使用的PRRS 疫苗均存在一定程度的缺陷, 灭活苗在灭活过程中造成抗原表位的缺失或抗原性减弱, 不能产生足够的免疫保护, 常导致免疫失败[2]。减毒疫苗虽可以很好地刺激机体产生细胞免疫和体液免疫, 但驯化的PRRSV 弱毒株会出现返强现象, 造成苗毒散播[3], 故不提倡使用减毒疫苗。基因疫苗可同时诱导细胞免疫和体液免疫, 克服了传统疫苗的缺点, 以其安全、高效、廉价的特点为PRRS 疫苗的研制展现了一个崭新的平台。研究表明, PRRSV ORF6基因编码的基质膜 (M) 蛋白是欧洲型和美洲型毒株间最保守的蛋白[4], 并且M蛋白不但能够诱导产生部分中和抗体, 而且与细胞免疫应答有关。因此, 试验以pIRES - neo 为表达载体, 构建了PRRSV ORF6基因的核酸疫苗, 为今后PRRS新型疫苗的研究提供思路和理论基础。
参考文献
[1] WENSVOORT G.Lelystadvirus and the porcine epidemi -cabortion and respiratory syndrome [J].Vet Res, 1993 (24) :117-124.
[2] NIELSEN T L , NIELSEN J , HAVE P , et al. Examination of virus shedding in semen from vaccinated and frompreviously infected boars after experimental challenge with Porcine reproductive and respirat-ory syndrome virus[J]. Vet Microbiol , 1997 , 54 :101 - 112.
[3] STORGAARD T , OLEKSIEWICZ M , BOTNER A. Examination of the selective pressures on a live PRRS vaccine virus[J]. Arch Vi rol , 1999 , 144 : 2389 - 2401.
注射用核糖核酸Ⅱ说明书 篇4
注射用核糖核酸Ⅱ一般为3个月为1疗程。注射用核糖核酸Ⅱ可静脉注射或肌内注射。以5%葡萄糖注射液或0.9%氯化钠注射溶解后静脉注射，100～300mg(2～6支)，一日1次;以2ml无菌生理盐水或无菌注射用水溶解后肌肉注射，50～100mg(1～2支)，一日1次。
注射用核糖核酸Ⅱ注射期间应注意，给药后十分钟内如出现荨麻疹、体温升高者应停止使用。注射部位红肿直径在10cm以上者应停止使用。过敏性体质患者慎用注射用核糖核酸Ⅱ。
注射用核糖核酸Ⅱ是免疫调节药，适用于胰腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、软组织肉瘤及其它癌症的辅助治疗，对乙型肝炎的辅助治疗有较好的效果。注射用核糖核酸Ⅱ亦可用于其他免疫机能低下引起的各种疾病。注射用核糖核酸Ⅱ具有提高机体细胞免疫功能和抑瘤作用。动物实验表明核糖核酸可明显抑制带瘤小鼠肿瘤的生长，使实体瘤体积缩小或消失，其抑瘤率为68.3%。病理组织学证实，注射用核糖核酸Ⅱ能引起瘤细胞空泡样变性和液化性坏死，在其周围有大量增生纤维芽细胞、巨噬细胞和淋巴细胞，甚至以结缔组织代替瘤组织。