抗病基因（通用5篇）
抗病基因 篇1
大豆抗病基因 (Resistance gene, R基因) 的克隆一直被研究者所关注, 克隆抗病基因的经典方法主要是转座子标签法和图位克隆法。这对于基因组小, 且具有高分辨率物理图谱和遗传图谱的植物来说是可行的, 但大豆很难获得转座子突变体。大豆是古四倍体, 基因组复杂, 因此大豆抗病基因的克隆较其它植物发展慢。R基因保守区有助于对抗病基因克隆, 即利用R基因同源序列法来克隆抗病基因, 依此方法在大豆中获得了大量的抗病基因的同源片段。
Yu等 (1996) 根据烟草N基因和拟南芥RPS2基因的NBS区同源序列设计简并引物, 从大豆中扩增并克隆出11类含NBS序列的片段。同年Kanazin等根据烟草N基因、拟南芥RPS2基因和亚麻L6基因的NBS区同源序列设计简并引物, 从大豆中扩增并克隆出9类大豆抗病基因类似序列。定位分析表明, 这些同源片段成簇分布, 提供抗病基因的潜在位点, 有些还与已知抗病基因连锁。尽管这种方法对于鉴定潜在的基因位点是非常有效的, 但对于其功能的鉴定则是非常困难的。因为抗病基因家族的研究表明其中有些成员是无功能的。因而, 从中分离抗病基因同源序列则可以获得由功能的潜在抗病基因成员[1]。
贺超英等 (2001) 根据烟草抗花叶病毒N基因和拟南芥抗丁香假单胞杆菌RPS2基因设计兼并引物, 从大豆抗花叶病毒品种科丰1号的基因组中扩增获得358个克隆, 鉴定出4个通读的且与抗病基因NBS结构域同源的片段:KNBS1、KNBS2、KNBS3和KNBS4。构建了一个高质量的的大豆c DNA文库, 其滴度为4.2×107pfu/ml;并利用所获得的大豆抗病基因同源片段为混合探针, 进行文库筛选, 获得了两个阳性克隆KR1和KR2[2]。KR1长度为3672bp, 有一个完整的编码框, 编码1124个氨基酸的蛋白;KR2长度为1560bp, 为不完整编码框。KR1在结构上与烟草抗花叶病毒N基因具有较高的同源性。它具有TIR、NBS和LRR一系列抗病基因的分子特征, 因而它可能是大豆中具有功能的类似于N基因的一类抗病基因;同时KR1在羧基端具有两个潜在的跨膜区。从可能的细胞中分区上来看, KR1又是一类新的植物抗病基因。RT-PCR分析表明KR1受大豆花叶病毒 (SMV) Sa菌株接种和水杨酸处理的影响。跟N和L6一样, KR1也可通过不同的拼接形成两种m RNA。在正常情况下, 大片段 (KR1, 609bp) 在抗亲科丰1号中是唯一的转录本;而小片段 (NR1, 588bp) 在感亲南农1138-2中占优势, 大片段 (KR1, 609bp) 的丰度则相对较少。用大豆花叶病毒Sa株系分别接种抗感双亲, KR1和NR1均呈诱导表达。在科丰1号中仅有KR1;在南农1138-2中, KR1/NR1的比例随着SMV接种的时间而变化, 最终KR1占优势。此结果预示着KR1可能是一个新的抗花叶病毒基因, 它的表达受SMV的诱导。
利用所获得的大豆抗病基因同源片段为混合探针, 进行文库筛选, 又获得了两个阳性克隆KR3和KR4, 通过RACE方法获得了全长, 其中KR3长度为3672bp, 有一个完整的编码框, 编码1124个氨基酸的蛋白。KR3与烟草抗花叶病毒N基因具有较高的同源性 (相似度为28.1%) , 具有TIR和NBS等抗病基因具有的保守结构域。KR3的表达受水杨酸诱导, 因此可能是大豆中具有功能的类似N基因的一类抗病基因。KR4全序列为3818bp, 编码1211个氨基酸, 在GenBank中的注册号为AF502080。KR4在结构上与水稻抗白叶枯病基因Xa1有16.0%的相似性, 具有NBS、LRR等抗病基因的结构特征。Southern结果证明KR4在抗病材料科丰1号和南农1138-2中具有多态性, 连锁分析将KR4定位在E连锁群[3]。KR4的表达受水杨酸的诱导, 大豆花叶病毒株系Sa和N3的接种都能够诱导KR4的表达, 因此KR4可能参与大豆抗SMV的过程。
杨秀红 (2005) 根据拟南芥RPS2基因、烟草N基因和亚麻L6基因的保守结构域设计简并引物, 从大豆抗疫霉根腐病品种绥农10号的RNA中扩增获得了100个克隆, 从中鉴定了两个通读的且与抗病基因NBS结构域同源的序列RNEA-1和RNEA-2, 这两个序列长度均为513bp, 编码171个氨基酸, 编码产物在结构上均具有NBS结构域的P-环, Kinase-2a和Kinase-3a区及保守的疏水结构域HD[4]。序列与结构上的同源性表明RNEA-1和RNEA-2为大豆抗病基因同源片段。RNEA-1与从携带有抗疫霉根腐病基因 (Rps2) 的大豆近等基因系中获得的Class D类大豆同源序列在分类上比较近源, RNEA-1与Class D同源性高达91%。Class D被定位在大豆J连锁群上, 与大豆Rps2、rmd基因有关 (Yu, 1996) 。
以RNEA-1为靶序列, 采用RACE技术获得了全长3574bp的大豆抗病相关基因SR1, 该基因包括3411bp的开放读码框, 72bp的5′非翻译区, 68bp的3′非翻译区和20bp的多聚腺普酸尾。在73bp处有ATG起始密码子, 在3484bp处有TAA终止密码子, 编码1137个通读的蛋白质氨基酸序列。SR1基因是NBS-LRR类抗病基因:这类基因的共同特点是, 在它们编码蛋白的近氮端存在着NBS, 而在它们的近碳端则由LRR组成。SR1基因编码产物具有TIR、NBD、LRR等一系列抗病基因的保守结构。TIR结构域是高度同源于哺乳动物和果蝇的信号传导的受体, 可能与激活防卫基因的转录因子有关。与烟草的N基因、亚麻的L6基因及拟南芥的RPP5等基因类似, SR1基因N端有142个氨基酸序列为TIR结构, 可能在抗病反应中起着类似的作用。NBD结构域具有激酶活性, 此结构暗示着它们在发挥正常功能时有可能需要结合ATP或GTP可以激活其它的功能蛋白。LRR结构被认为在蛋白质的相互作用中起重要作用, 它不仅参与抗病反应的识别, 还与识别以后的抗病信号的传导有关。胞质LRR的保守序列模式为"Lxx Lxx Lxxxx CxxL", SR1基因的LRR区含有此保守序列, 可能位于胞质。
丁海等 (2003) 根据已知抗病基因的NBS保守序列区设计4对简并引物和1对特异引物, 以大豆农家种兴县灰布支黑豆为材料, 应用PCR方法获得了11条来自基因组DNA的RGA序列和2条来自c DNA的RGA序列, 序列长度在500-633bp之间, 其中8条来自基因组DNA和2条来自c DNA的RGA序列已在GenBank登录。这些序列都不同程度的含有NBS保守区的P-环 (GGVGKTT) , kinase-2 (VLDD) , kinase-3 (GSRII) 及跨膜区GLPL等特征结构的序列, 由此推导出的氨基酸序列同已知抗病基因L6, RPM1, RPS2, N编码的氨基酸序列表现出从25%~42%的同源性[5]。
Bhatta (2005) Rps1k位点, 克隆得到高同源性的四个基因Rps1k-1、Rps1k-2、Rps1k-3和Rps1k-4, 编码蛋白的保守结构域为CC-NBS-LRR[即卷曲结构 (Coiled Coil) 、和核苷酸结合位点 (Nucleotide Binding Site) 结构域、亮氨酸重复序列 (Leucine-Rich Repeat) ], 按照序列特征分类可分为两类:其中Rps1k-1, Rps1k-3和Rps1k-4为一类, Rps1k-2为第二类。经转基因验证Rps1k-1具有抗大豆疫霉根腐病功能[6]。
Lightfoot实验室从Forrest的BAC克隆73P6和100BI0中获得了Rhg1和Rhg4的全长c DNA序列, 随着这两个基因的克隆成功, 以及根据基因序列相应设计引物的合成, 相信会使人们对抗性机理有更深刻的理解和认识, 也会使抗大豆胞囊线虫病基因的分子标记辅助鉴定成为现实。
综上可知大豆中已有多个抗病基因被克隆, 为抗病机制研究奠定了基础。
面顶住工件, 增大摩擦力, 甚至把工件顶弯, 造成啃刀现象;过低, 则切削不宜排出, 车刀径向力的方向是工件中心, 加上横进丝杠与螺母间隙过大, 致使吃刀深度不断自动趋向加深, 从而把工件抬起, 出现啃刀。此时, 应及时调整车刀高度, 使其刀尖与工件的轴线等高 (可利用尾座顶尖对刀) 。在粗车和半精车时, 刀尖位置比工件的中心高出1%D左右 (D表示被加工工件直径) 。
2.2工件装夹不牢
工件本身的刚性不能承受车削时的车削力, 因而产生过大的挠度, 改变了车刀与工件的中心高度 (工件被抬高了) , 形成切削深度突增, 出现啃刀, 此时应把工件装夹牢固, 可使用尾座 (上接118页) 11751-11757.
[2]贺超英, 张志永, 陈受宜.大豆NBS类抗病基因同源序列的分离与鉴定[J].科学通报, 2001
摘要：抗病基因是在植物抗病反应过程中起抵抗病菌侵染及扩展的有关基因, 其是Flor经典遗传学基因对基因 (gene-for-gene) 假说中与病原菌无毒基因相对应的一类基因。它存在于植物特定品种中, 在植物生长周期或其中某个阶段进行组成型表达。随着生物技术发展已成功克隆许多大豆抗病基因, 使抗病基因工程出现了质的飞跃。
关键词：大豆,抗病基因,克隆
参考文献
[1]Yu Y G, Buss G R, Saghai-Maroof M A.Isolation of a Supperfamily of Candidate Dis-ease-Resistance Genes in Soybean Based on a Conserved Nucleotide-Binding Site.Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:11751-11757.
[2]贺超英, 张志永, 陈受宜.大豆NBS类抗病基因同源序列的分离与鉴定[J].科学通报, 2001, 46 (12) :1017-1021.
[3]Wang Bang-jun, Zhang Zhi-Gang, Li Xue-Gang, et al.Cloning and Analysis of a Disease Resistance Gene Homolog from Soybean.Acta Botanica Sinica, 2003, 45 (7) :864-870.
[4]杨秀红, 陈庆山, 杨庆凯等.大豆NBS类抗病相关基因的克隆与序列分析[J].高技术通讯, 2005, 15 (2) :71-78.
[5]张文慧, 陈庆山, 杨庆凯.大豆灰斑病1号生理小种抗性基因的SSR标记分析[J].大豆科学, 2004, 23 (3) :169-173.
[6]Bhatta, Hongyu Gao, Narayanan N.Two Classes of Highly Similar Coiled Coil-Nu-cleotide-Binding Leucine-Rich-Repeat Genes Isolated from the Rps1-K Locus Encode Phy-tophthora Resistance in Soybean.MPMI, 2005, 10 (18) :1035-1045.
抗病基因 篇2
抗真菌转基因大豆对大豆疫霉根腐病抗病性鉴定
采用下胚轴伤口接种法,对Southern杂交阳性的.转菜豆几丁质酶基因和大麦核糖体失活蛋白基因的双价转基因大豆T2代的5个株系,进行了大豆疫霉根腐病抗病性检测,并通过比较接种后转基因大豆与对照组的死亡率来探讨两者的抗病性差异.结果表明,有4个转基因株系对大豆疫霉根腐病的抗性与非转基因对照组相比有明显提高,另外1个株系与对照组相比没有明显差异.
作 者：郭玉双 张艳菊 朱延明 刘佳 李杰 柏锡 张淑珍 GUO Yushuang ZHANG Yanju ZHU Yanming LIU Jia LI Jie BAI Xi ZHANG Shuzhen 作者单位：郭玉双,朱延明,李杰,柏锡,GUO Yushuang,ZHU Yanming,LI Jie,BAI Xi(东北农业大学生命科学学院,黑龙江,哈尔滨,150030)张艳菊,刘佳,张淑珍,ZHANG Yanju,LIU Jia,ZHANG Shuzhen(东北农业大学农学院,黑龙江,哈尔滨,150030)
刊 名：东北农业大学学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF NORTHEAST AGRICULTURAL UNIVERSITY 年，卷(期)： 37(6) 分类号：S565.1 Q78 S5/59|034| S435.651 关键词：转基因大豆 菜豆几丁质酶基因 大麦核糖体失活蛋白基因 大豆疫霉根腐病 抗病性鉴定抗病基因 篇3
1 水稻重要抗病基因定位及其在染色体上分布
总结了近些年来水稻的重要抗病基因包括抗稻瘟病基因、抗白叶枯病基因、抗褐飞虱基因、抗白背飞虱基因、抗纹枯病基因、抗黄矮病基因、抗稻曲病基因等共计46个主效基因和14个数量基因的定位研究进展。并在此基础上对水稻抗病基因在水稻染色体上的分布情况进行了初步探讨。
1.1 水稻重要抗病基因及与其连锁的分子标记
1.1.1 抗稻瘟病基因
稻瘟病是由子囊菌引起的广泛分布于世界各水稻栽培区的、最严重的真菌性病害。这里总结了水稻抗稻瘟病的28个主效基因和6个数量性状基因、所在的染色体、连锁标记以及与这些标记与抗性基因之间的距离[3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15], 见表1。
续表
1.1.2 抗白叶枯病基因
白叶枯病是全球范围内引起水稻严重减产的最主要细菌性病害。总结了18个水稻抗白叶枯病主效基因、所在的染色体及分子标记的定位进展[2,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27], 见表2。
1.1.3 抗纹枯病基因
纹枯病是世界范围内仅次于稻瘟病的第二大真菌性病害, 每年造成巨大的损失。归纳了11个水稻抗纹枯病数量性状基因的定位进展[28,29,30], 见表3。
1.1.4 抗黄矮病基因
黄矮病为叶蝉传播的水稻病毒病。Albar.L.等定位了一个抗黄矮病的隐性基因, 这个基因位于4号染色体长臂, SSR标记RM252和AFLP标记E-ACG/M-ACA位于其两侧, 遗传距离分别为1.8cM和1.9cM[31]。
1.1.5 抗稻曲病基因
水稻稻曲病是由稻曲病菌引起的水稻穗部真菌性病害。徐建龙等利用图示基因重叠的方法在第10、12染色体上定位了两个抗稻曲病QTL (QFsr10和QFsr1) , 分别与AK10150和RM277标记相连锁[32]。
1.2 抗病基因在染色体上分布情况探讨
目前很少有关于水稻抗病基因在染色体上分布规律的研究, 开展这方面的探讨有利于从整体上认识水稻各个抗病基因之间的协调、互作关系。本文在归纳的基础上发现66个抗病基因中64个已经被定位于染色体, 统计结果表明这些抗病基因并非均匀分布于12条染色体上。具体分布情况为:12条染色体上均有抗病基因的分布分布, 其中11号染色体上分布有13个抗病基因, 占据了抗病基因总数的20.31%;10号染色体上抗病基因最少仅有一个抗稻曲病的数量性状基因;第1号、3号、9号染色体抗病基因也较少都为3个抗病基因所占比例仅为6.52%。这表明11号染在水稻抗病基因的发掘方面更具潜力。已有的研究结果表明抗白叶枯基因Xa3、Xa4、Xa10、Xa21都分布在11号染色体的短臂上, 而Xa22 (t) 、Xa26 (t) 、Xa23也均分布于11号染色体;Xa1、Xa2、Xa12、Xa14则是被定位在4号染色体的邻近区段。这表明水稻抗病基因有串联成簇分布的倾向。基因串联成簇分布的原因可能是便于快速、高效地对外界不利病害做出反应, 也有可能是因为这些基因的起源相同, 长时间的自然选择突变使其成为不同的基因, 但仍具有相似的功能。除了一部分串联成簇分布的基因外, 更多的抗病基因随机分布于各个染色体。这可能与引起植物病害的病原微生物的多样性及水稻抗病反应的多样性相关。
2 云南地方抗病稻种资源研究及其存在的问题
2.1 云南地方抗病稻种资源遗传多样性研究
云南省位于中国的西南边陲, 由于其复杂的地形、多样的气候、以及多民族耕作习惯的不同, 使其稻作资源异常丰富, 不仅是中国拥有全部三种野生稻的两个省份之一, 而且其地方品种也极其丰富多样。早在1998年云南省就考察收集了云南地方稻种6 000余份的, 整理保存了5 128份, 并通过品种的数量、类型特点等方面说明了云南稻作资源的多样性[33]。朱明雨等[34]通过对83份云南地方品种和3份标准样进行SSR分析的研究表明这些品种的遗传相似系数在0.152～0.900之间, 存在显著差异, 说明了云南地方稻种具有遗传的多样性。在这些遗传多样的云南地方稻种中, 很多都具有抗稻瘟病、白叶枯病等优良的抗病性状。1998年, 范静华[35]等对479份云南地方稻种进行抗瘟试验, 结果表明77%的稻种不同程度的表现抗性, 其中17.7%表现高抗。肖放华等[36]对74份云南地方稻种进行鉴定, 结果表明大白谷等云南四个地方稻种具有持久抗稻瘟性。梁斌等[37]采用自然诱发鉴定了74份云南地方稻资源的抗稻瘟性, 结果表明, 云南地方稻中的毫弄早、毫玉浪两个品种对稻瘟病的抗性比持久抗病品种Tetep、Moroborekan更强、更稳定。在抗白叶枯病方面, 钱君等[38]通过接种实验鉴定了300份云南稻种, 结果表明这些品种中17%对白叶枯病表现抗性, 是很好的抗原材料。
从以往对云南地方稻种资源的研究中, 可以发现云南地方稻种不仅具有及其丰富的遗传多样性, 而且在抗病资源发掘方面有着极大的潜力。这将为我们以后水稻育种工作中提供重要、宝贵的资源。
2.2 云南抗病资源研究和利用中存在的问题
虽然近年来分子标记技术在云南水稻资源遗传多样性评价和抗病品种的选育中发挥越来越大的作用, 但是在评价云南地方稻种资源遗传多样性、培育抗病品种中的实践应用仍存在一些问题。
2.2.1 抗病品种评价、选育多采用传统方法
以往对于云南地方稻种抗病资源的研究大多采用传统的田间实验分析其抗病性状, 而很少用分子标记技术进行研究。直接的栽培、接种试验不仅需要大量的人力物力、耗时长、容易受到客观环境的限制和影响, 而且实验结果重复性差。因此, 以后应该加快分子标记技术在云南抗病稻种资源调查和评价中的应用力度, 使分子标记技术更好地服务农业。
2.2.2 缺乏抗病资源的系统评价研究
云南具有丰富的稻种资源, 以往对于其遗传多样性的评价也曾有分析, 但是大多从抗病基因紧密连锁分子标记的角度, 目前还没有进行系统的评价、筛选研究。这将是以后云南稻种资源研究的一个基础而重要的方面。
2.2.3 病原菌与水稻寄主间间的互作关系研究较少
目前, 抗病品种的选育大多不具有持久的抗性, 要解决这一问题必须加强对水稻病原菌与其寄主间的互作关系的研究。利用不断丰富的分子标记克隆抗病基因序列, 分析病原菌与寄主之间的互作关系, 以指导抗病资源选育, 培育具有持久抗性品种是今后值得进一步研究的内容。
2.2.4 分子标记的鉴定与辅助育种相脱节
世界范围内虽然已经发掘出了相当数量的抗病相关基因的分子标记, 但是凭借分子标记辅助育种手段育成的新品种或品系还比较少, 利用分子标记辅助育种高效率、大规模培育优良抗病品种的期望仍未实现。这一方面是因为多数研究工作者把工作目标定位在抗病基因的定位上, 而忽视了抗病基因在实际品种选育中的应用。造成了重要抗病基因分子标记鉴定多, 而育成品种、品系少的局面。另一方面, 基因定位和分子标记在实用性和成本方面还有待进一步改进, 特别是在多基因控制的数量性状基因利用方面体系有待于进一步完善。这不利于发掘云南多样的水稻抗病资源, 培育优质的抗病品种。
3 前景展望
抗病基因 篇4
关键词：慢性乙肝,乙肝病毒,基因型,恩替卡韦
乙型病毒性肝炎为世界性传染疾病,其发病原因为乙肝病毒(HBV)感染,可引起多器官损害,严重危害人体健康。中国是乙肝广泛流行地区,虽经多年宣教和乙肝疫苗免疫管理,中国乙肝感染率与过去相比已显著下降,但血清学调查显示,2014年中国乙肝感染率为4.38%[1],仍处于较高水平,需要积极防治。该院近年来以恩替卡韦对乙肝患者行抗病毒治疗取得良好效果,文章现以2014年5月—2016年6月于该院接受治疗的50例慢性乙型肝炎患者为例进行分析和探讨,现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
随机选取于该院接受治疗的50例慢性乙型肝炎患者为研究对象,患者入院时多表现为食欲不振、乏力疲劳、上腹不适、肝区隐痛等症状,通过血清学检查乙肝病毒标记物,临床判定患者病症均符合《慢性乙型肝炎防治指南》[3]中关于慢性乙型病毒性肝炎的相关诊断标准。该次研究入选病例均江苏盐城地区居民,患者年龄35~67岁,平均年龄(52.4±6.4)岁。病例入选标准:1HBs Ag阳性≥6个月;2乙肝病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)>1 005 cps/m L;3治疗周期≥48周。病例排除标准:1合并其它类型肝炎;2合并酒精性肝病或肝脏代谢障碍性疾病;3合并药物性肝损害;4HIV感染;5病毒用药史;6恩替卡韦过敏者。所有患者治疗前均签署知情同意书,对此次临床研究知情同意。
1.2方法
治疗前全部患者均行乙肝HBV基因分型检测。治疗期间以恩替卡韦(国药准字H20100064)进行抗病毒治疗,0.5 mg/次,1次/d,空服口服。用药期间,患者不使用拉米夫定等其他抗病毒药物,单纯行保肝、纠正水电解质平衡、防治并发症等常规治疗。治疗前和连续治疗第48周以后,分别以全自动化学发光免疫分析仪检查患者HBe Ag等乙肝5项,以荧光定量聚合酶链式反应(PCR法)定量检查HBV-DNA,以全自动生化分析仪及配套试剂测定患者谷丙转氨酶(ALT)水平,分析恩替卡韦抗病毒疗效及其与HBV基因型间的关系。
1.3 HBV基因分型
HBV基因分型能够反映原型病毒株之间的自然特异性。该次临床研究所用基因分型以全基因序列为金标准[5],基于全基因核苷酸序列比较,根据全基因核苷酸序列异源性≥8%的原则,将HBV基因分为A~H 8个类型。
1.4疗效判定标准
1HBe Ag转阴:HBe Ag<1.0 COI;2HBV-DNA定量检查正常值100 cps/m L;阴性<1 000 cps/m L;3ALT正常参考值:0~40 U/L[4]。
1.5统计方法
全部数据均以SPSS 19.0统计学软件进行统计分析,计数资料以[n(%)]表示,采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 HBV基因分型
50例患者的乙肝HBV基因分型检测结果显示,C基因型乙肝患者37例,占病例总数的74.0%,其他基因型乙肝患者13例,共占病例总数的26.0%,提示江苏盐城地区HBV主要基因型为C型。
2.2抗病毒疗效比较
C基因型乙肝患者HBe Ag阴性率为26例(70.27%)和其他基因型乙肝患者抗病毒治疗前的HBe Ag阳性率为92例(69.23%)且HBV-DNA定量值和ALT水平差异无统计学意义(P>0.05),详见表1。
经恩替卡韦抗病毒治疗后,C基因型患者HBV-DNA低于检测下线率明显高于其他基因型,差异有统计学意义(P<0.01);C基因型患者ALT复常率、HBe Ag转阴率和HBe Ag血清学转换率则高于其他基因型,差异有统计学意义(P<0.05),详见表2,提示恩替卡韦对C基因型HBV的抗病毒疗效优于B其他基因型HBV,适合在盐城地区使用并推广。
3讨论
不同HBV基因型的核苷酸序列存在差异,通过全基因序列测定、S基因序列测定、ELISA、PCR-RFLP等分型法,HBV基因可分为A~H型,共计8种。研究发现,HBV基因分布在世界范围内呈明显地域特点,在我国区域间分布也具有明显差异性,如北方HBV基因分型以C型为主,南方多见于B型,D型分布于西北少数民族区域,其他类型则十分少有或尚未发现[5]。江苏盐城地区地处长江三角洲北翼,其地理位置虽处于长江以北,但属中国HBV基因C型和基因B型过渡地带。该次研究入选病例均为江苏盐城当地居民,乙肝HBV基因分型检测结果显示,50例患者中有37例为HBV基因C型(74.%),11例为HBV基因B型(22%),其他类型基因2例(4.0%),提示江苏盐城乙肝患者以HBV基因C型者居多,与国内关于北方HBV基因C型居多的报道结论一致。
合理使用抗病毒药物抑制HBV复制是现阶段临床治疗慢性乙肝的首选方法,常用抗病毒药物为干扰素和核苷(酸)类似物。近年临床研究发现,乙肝抗病毒疗效除了与患者免疫状况有关外,也与HBV不同基因型的基因特征有关[6]。该次临床选用恩替卡韦对乙肝进行抗病毒治疗,该品为鸟嘌呤核苷类似物,可通过磷酸化成为三磷盐酸,实现对HBV多聚酶的抑制功效,具有抗病毒起效快、作用强等优势,不仅安全性高,且耐药率低,具备长期服用疗效。此次临床研究结果显示,以此治疗HBV基因C型乙肝患者,其疗效优于其他基因类型乙肝患者,HBV-DNA低于检测下线率30例(81.08%),ALT复常率34例(91.89%),HBe Ag转阴率12(38.71%),HBe Ag血清学转换率6(16.22%),各项指标均优于其他基因型乙肝患者(P<0.05),与街小霞[7]报道的HBV-DNA低于检测下线率(82.52%)和ALT复常率(90.92%)基本一致,略低于谷茂林[8]报道的HBe Ag转阴率(45.86%)和HBe Ag血清学转换率(27.52%),但不影响研究有效性,考虑HBV基因型可能对核苷(酸)类似物的抗病毒疗效存在影响,但各研究入选病例的特性和研究方法存在差异性。
此次临床研究表明,江苏盐城地区乙肝病毒主要基因分型为C型,以恩替卡韦对该分型患者进行抗病毒治疗,其效果优于其他基因分型患者,值得在本地乙肝抗病毒临床治疗中使用推广。
参考文献
[1]何紫琪,李从荣,童永清,等.200例乙型肝炎患者HBV基因型分布及临床意义[J].现代检验医学杂志,2013,28(6):125-127.
[2]郭斯敏,王晖,周惠娟,等.接受恩替卡韦治疗的e抗原阳性慢性乙型肝炎患者短程加用聚乙二醇干扰素-α-2a的抗病毒疗效和影响因素[J].中华传染病杂志,2015,33(1):14-19.
[3]夏红,周智,杨玉霞,等.乙型肝炎患者恩替卡韦抗病毒治疗后外周血T淋巴细胞PD-1的表达及其与HBe Ag血清学的关系[J].海南医学院学报,2016,22(7):655-657.
[4]陈爱英.太原地区乙肝患者HBV基因分型与细胞免疫功能研究[J].微生物学杂志,2013,33(4):62-65.
[5]江必武,叶丽华,王平,等.HBV复制及其基因分型与HBV相关慢性肝病关系的临床研究[J].华中科技大学学报:医学版,2013,42(2):231-233.
[6]林江,邓正华,温先勇,等.乙型肝炎病毒基因分型及其与肝脏疾病的关系[J].中国现代医学杂志,2013,23(1):44-47.
[7]街晓霞.多种核苷类药物联合使用对于延缓耐干扰素药物的乙肝病人病情的价值分析[J].航空航天医学杂志,2015,26(12):1460-1463.
抗病基因 篇5
到目前为止, 大多数实验室都采用大肠杆菌系统对鸡Mx蛋白进行表达[5,6]。该表达系统虽然具有遗传背景清楚、所需成本相对低等优点, 但存在表达产物缺乏翻译后加工, 得到的蛋白质可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性等缺点。而巴斯德毕赤酵母是一种使用广泛的外源表达系统, 它具有高效表达、高稳定、高分泌等特点, 而且可以对表达产物进行类似真核细胞的翻译后修饰和加工等。试验利用酵母表达系统表达鸡抗病毒Mx蛋白, 实现了该蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达, 进而为鸡抗病毒Mx蛋白基因的进一步研究和应用奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒与菌株
鸡抗病毒Mx蛋白基因真核表达质粒pcDNA-MMx, 由动物遗传繁育与分子设计江苏省重点实验室构建;大肠杆菌DH5α感受态细胞、酵母表达载体pPIC9K、宿主菌GS115, 由动物遗传繁育与分子设计江苏省重点实验室保存。
1.1.2 主要试剂
各种限制性内切酶、DNA聚合酶、TaKaRa LA TaqTM、pMD19-T Simple载体试剂盒、低分子质量蛋白标准, 均为宝生物工程 (大连) 有限公司产品;DNA回收试剂盒、T4 DNA连接酶, 购于MBI公司;胰蛋白胨、酵母浸出粉, OXID公司产品;特异性引物, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;其他试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 目的基因片段的扩增
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游引物P1 5′-GC-TACGTAATGAACAATCCATGGTCC-3′ (下划线部分为SnaBⅠ酶切位点) , 下游引物P2 5′-TTGCGGCCGCTTACAGAGACTTAAAGTC-3′ (下划线部分为NotⅠ酶切位点, 斜体为酵母偏爱终止密码子) 。
以pcDNA-MMx为模板扩增出鸡抗病毒Mx蛋白编码序列。PCR反应体系: 10×LA PCR Buffer (Mg2+ Plus) 5 μL, dNTPs Mixture (各2.5 mmoL/L) 4 μL, 引物P1、P2 (10 μmoL/ L) 各1.5 μL, pcDNA-MMx质粒模板1 μL、TaKaRa LA TaqTM (5 U/μL) 0.5 μL, 加灭菌纯化水至50 μL。反应条件:94 ℃预变性10 min ;94 ℃变性40 s, 52 ℃退火40 s , 72 ℃延伸150 s, 共30个循环;72 ℃延伸10 min。扩增产物经0.8 %琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收目的片段, 将回收后的目的片段与pMD19-T Simple载体连接, 用连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 挑取阳性克隆进行PCR、酶切及测序鉴定, 将鉴定正确的质粒命名为pMD-Mx。
1.2.2 重组穿梭质粒pPIC9K-Mx的构建和鉴定
分别用SnaBⅠ和NotⅠ双酶切pMD-Mx质粒并回收目的片段 (Mx基因) , 将其与同样酶切回收的pPIC9K载体16 ℃连接过夜, 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 筛选阳性重组质粒, 经PCR、酶切及测序鉴定后将阳性重组质粒命名为pPIC9K-Mx。
1.2.3 重组表达质粒pPIC9K-Mx的线性化及其电转化
制备酵母菌GS115感受态, 将其与10 μg经SalⅠ酶切线性化的重组表达质粒混合, 转入0.2 cm电击杯中冰浴5 min;用Eppendorf Multiporator®*1于1 500 V、5 ms条件下电转化, 立即向电击杯内加入1 mol/L冰浴山梨醇, 30 ℃静置培养2 h;取200 μL菌液涂于MD平板上, 30 ℃倒置培养2～3 d, 观察其生长情况。
1.2.4 多拷贝整合转化子的筛选
将在MD平板上生长的菌斑用双蒸水重悬, 涂于G418浓度逐步增高 (0.5, 1, 2, 3, 4 mg/mL) 的YPD平板上, 30 ℃培养2～3 d, 筛选出具有高抗性且生长良好的单菌株。
1.2.5 MM (minimal methanol medium) 与MD (minimal dextrose medium) 对比生长试验
将在4 mg/mL G418-YPD平板上生长的单菌落分别点在MM、MD平板上, 30 ℃倒置培养2～3 d, 筛选出His+、Mut+型菌株。
1.2.6 转化子的鉴定
挑取高拷贝单菌落接种至5 mL YPD液体培养基中, 30 ℃培养16～18 h;取1.5 mL菌液离心收集菌体, 弃上清液, 用双蒸水洗涤、离心;取沉淀悬浮于100 μL TE中, 沸水煮5～8 min, 冰浴10 min;离心收集上清液, 以2 μL上清液为模板, PCR鉴定阳性克隆。
1.2.7 表达菌株的诱导表达
将筛选出的高拷贝菌株菌落接种于50 mL BMGY培养液中, 30 ℃振荡培养至OD600值为4～6;离心收集菌体, 弃上清液, 将菌体重悬于原培养液1/5的BMMY中诱导表达, 期间每隔24 h加甲醇1次, 使其终浓度分别保持在0.5%、1%;分别在24, 48, 72, 96, 120 小时取出1 mL培养物, 12 000 r/min离心2 min, 取上清液进行SDS-PAGE检测。
2 结果
2.1 鸡抗病毒Mx蛋白基因的克隆
以P1 (含SnaBⅠ酶切位点) 和P2 (含NotⅠ酶切位点) 为引物, 以真核表达载体pcDNA-MMx为模板扩增鸡抗病毒Mx蛋白基因的编码区 (见图1) 。
M.1 kb DNA Marker;1.Mx 基因PCR产物。
2.2 重组质粒pMD-Mx的构建与鉴定
回收目的片段后与pMD19-T Simple载体连接, 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 挑取阳性克隆参照试剂盒提取质粒, 经SnaBⅠ和NotⅠ双酶切鉴定, 酶切结果见图2。该结果与预期结果一致, 将鉴定正确的质粒命名为pMD-Mx。
1.重组质粒酶切结果;M.1 kb DNA Marker。
2.3 重组穿梭质粒pPIC9K-Mx的构建与鉴定
重组穿梭质粒pPIC9K-Mx的构建结果见图3, pPIC9K双酶切结果见图4, 重组质粒阳性克隆双酶切鉴定结果见图5。构建及测序结果显示, Mx的序列及插入位置正确。
1.pPIC9K酶切;M.1 kb DNA Marker。
1.重组质粒pPIC9K-Mx酶切结果;M.1 kb DNA Marker。
2.4 重组酵母菌株的筛选
将pPIC9K-Mx重组质粒及pPIC9K空载体分别用SalⅠ酶切线性化后, 回收目的产物转化GS115, 经MD、G418梯度筛选及MD与MM平板对比生长试验, 挑选出生长快并且菌落饱满的菌株, 制备其PCR鉴定模板, 进行PCR鉴定, 筛选含有目的片段的重组子, 结果见图6。
1～4.重组质粒检测结果;5.阴性对照;M.1 kb DNA Marker。
2.5 诱导表达产物的SDS-PAGE检测
从高抗G418平板挑取菌株, 经PCR鉴定后进行甲醇诱导, 用1%的甲醇连续诱导5 d, 取诱导后上清液进行SDS-PAGE检测, 目的产物鸡抗病毒Mx蛋白的表达情况见图7。与阴性对照比较, 诱导表达上清液在4～8 h、约75 ku处有明显特异性条带出现, 与预期的鸡Mx蛋白相对分子质量基本一致, 并且在96小时达到高峰。扫描结果显示, 目的蛋白约占上清液总蛋白的39.2%。
1～5.1%甲醇诱导24, 48, 72, 96, 120 h;M.低分子质量蛋白标准;6.阴性对照。
3 讨论
在人、小鼠、大鼠、猪、牛等哺乳动物体内都发现了类似的Mx蛋白, 并且都具有能够抑制RNA病毒复制的活性。鸡Mx蛋白属于诱导表达型蛋白, 其天然来源十分有限, 远不能满足对其抗病毒机理及作用机制研究的需要, 因此采用基因工程技术制备鸡抗病毒Mx蛋白十分重要。
到目前为止, 外源基因的表达及其蛋白的获取大多都采用大肠杆菌表达系统而酵母表达系统作为一种有效的表达系统, 已逐渐成为基因工程领域外源基因蛋白获取的重要途经[7]。毕赤酵母表达系统兼具有原核和真核表达系统以及高效发酵并对表达产物进行类似真核细胞的翻译后修饰和加工 (如糖基化、二硫键的形成以及肽链的正确折叠) 等显著优点[8,9]。毕赤酵母利用甲醇作为唯一的碳源, 它有2个醇氧化酶基因AOX1和AOX2, 该基因具有很强的启动活性。毕赤酵母表达载体正是利用该启动子来启动外源蛋白表达的, 并将其分泌到培养基中, 分离、纯化简便, 是一种理想的外源基因表达系统[10]。试验将鸡Mx基因编码序列和α-分泌信号肽融合表达, 使重组蛋白在α-分泌信号肽的引导下穿过细胞膜并分泌到培养基中, 易于分离和纯化, 可获得高活性重组蛋白。由于酵母分泌的内源性蛋白比较少并且酵母培养基的成分相对简单, 这有利于表达的目的蛋白分离和纯化。
影响外源蛋白在毕赤酵母中表达的因素很多, 它不仅受整合位点、mRNA非翻译区、cDNA的AT含量等影响, 也受宿主菌、糖基化、培养基、重组质粒拷贝数的影响。一般来说, 高拷贝质粒表达外源蛋白的能力相对较强, 但不是绝对的。在试验中, 采用5个G418浓度 (0.5, 1, 2, 3, 4 mg/mL) 梯度对转化子进行筛选。结果显示, 高拷贝重组质粒表达效果明显高于低拷贝数转化子, 单拷贝及低拷贝转化子的表达效果不明显甚至不表达。经SDS-PAGE检测无特异性条带出现, 提示重组转化子拷贝数对鸡抗病毒Mx蛋白在毕赤酵母中表达的影响很大。
试验首次利用毕赤酵母表达系统表达了鸡抗病毒Mx蛋白, 这对该蛋白体外获取及其活性检测研究提供了很好的思路。
参考文献
[1] LINDENMANN J, LANE C A, HOBSON D. The resistance of A2G mice to orthomyxoviruses[J]. J Immunol, 1963, 90: 942-951.
[2] JIN H K, TAKADA A, KON Y, et al. Identification of the murine Mx2 gene: interferon-induced expression of the Mx2 protein from the feral mouse gene confers resistance to vesicular stomatitis virus[J]. J Virol, 1999, 73 (6) : 4925-4930.
[3]AEBI M, FAHJ, HURTN, et al.cDNA structures and regulation of two interferon-induced human Mx proteins[J].J Mol Cell Bi-ol, 1989, 9:5062-5072.
[4]WEBER F, HALLER O, KOCHS G.MxA GTPase blocks reporter gene expression of reconstituted thogoto virus ribonucleoprotein com-plexes[J].J Virol, 2000, 74 (1) :560-563.
[5] YIN C G, DU L X, ZHAO G P , et al .Optimizing the expression of Mx gene in escherichia coil based on rare codon and mRNA structure [J]. Hereditas, 2009, 31 (1) :75-82.
[6]CHEN L, JIANG G T, CHANGE W S.Cloning and expression of MxA gene fromchickens inE.coliand identification of biological ac-tivity of MxA[J].Chinese Journal of Immunology, 2006, 11 (22) :1018-1020.
[7] CEREGHINO J L, CREGG J M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J]. FEMS Microbiology Reviews, 2000, 24 (1) : 45-66.
[8]ZHENG M, ZHANGF X, LIUL.Progress of yeast system express-ing heterogene[J].Journal of Capital Normal University, 1999, 20 (4) :73-77.
[9]HONG F, MEINANDER N Q, JONSSON L J.Fermentation strate-gies for improved heterologous expression of laccase inPichia pasto-ris[J].Biotechnol Bioeng, 2002, 79 (4) :438-449.