抗病性鉴定（精选9篇）
抗病性鉴定 篇1
豌豆具有很好的利用价值, 可食用、饲用、肥用、工业生产, 更是传统的轮作倒茬的作物, 其产品具有很好的国际国内市场。但近年来由于根腐病的猖獗发生, 直接影响了豌豆的种植。豌豆根腐病是豌豆生产中最具有毁灭性的土传性病害, 于1920年在美国的Wisconsin州发现, 随后在世界豌豆种植区如北美地区、澳大利亚、新西兰、日本、欧洲等地相继发现。我国于20世纪50年代在青海发现此病, 现在全国大部分豌豆种植区普遍发生, 以西北和东北的局部地区比较严重。据国内外报道, 豌豆根腐病是由多种真菌复合侵染所致, 已经报道的病原真菌达到30多种, 其中常见的优势菌主要包括茄腐镰孢菌 (Fusarium solani (Mart.) Sacc.) 、尖孢镰刀菌 (Fusarium oxysporium Schlecht) 、根腐丝囊霉 (Aphanomyces euteiches Drechs) 、根串珠霉 (Thielaviopsis basicola (Berk.et Br.) Ferr.) 、立undefined
枯丝核菌 (Rhizoctonia solani Kühn) 和终极腐霉 (Pythium ultinum Trow) 等。国外以根腐丝囊霉为致病优势菌的的报道较为常见, 但也有人认为在不同的生长季节, 优势菌群会发生变化, 如美国的爱达荷州, 春季以根腐丝囊霉为优势菌, 而在夏季则以茄腐镰刀菌为主;国内的有关报道不太一致, 甘肃主要为茄腐镰刀菌和尖孢镰刀菌 (李乾坤等, 1990) , 黑龙江是尖孢镰刀菌 (邵红涛等, 2004) , 青海是茄腐镰刀菌 (刁治民等, 1996) , 宁夏是终极腐霉 (王宽仓等, 1995) , 福建是茄腐镰刀菌和根腐丝囊霉 (陈庆河等, 2004) 为优势菌。
定西是甘肃干旱地区豌豆主要种植地之一, 历年播种1.3余万hm2, 占粮食播种面积的15%, 占甘肃省豌豆播种面积的50%。近年来, 由于农民使用自留地且连续重茬种植, 豌豆根腐病在当地发生严重, 发病面积占到播种面积的35%, 有些田块甚至绝收。为提高定西地区豌豆产量, 增加农民收益, 对当地豌豆根腐病病原分离鉴定并进行品种抗病性筛选是非常必要的。
1 材料与方法
1.1 田间采样
在定西李家堡镇病害发生严重的豌豆田块中挖取症状典型的病株带回实验室供病原菌分离。
1.2 培养基配方
PDA培养基:新鲜马铃薯200g, 琼脂18g, 葡萄糖20g, 水1000mL。
PSA培养基:新鲜马铃薯200g, 琼脂18g, 蔗糖20g, 水1000mL。
WA培养基:琼脂18g, 水1000mL。
CLA培养基:琼脂18g, 水1000mL, 2cm长康乃馨叶片 (灭菌) 。
1.3 病原菌分离纯化
剪取带回实验室供分离的病株根部, 用蒸馏水冲洗, 晾干。将病根剪成2cm长小段, 用75%酒精进行表面消毒2min, 无菌水冲洗3次, 接入含链霉素的PDA培养基中 (每皿4段) , 25℃黑暗培养, 待长出菌落后, 分别接入PDA培养基中培养, 7d后观察, 取边缘小块置CLA培养基上, 光照下诱导产孢。制备孢子悬浮液接入WA培养基, 在30°斜面上培养18h后, 在实体显微镜下挑取萌发的单个孢子, 分别接在PDA培养基、CLA培养基 (光照条件) 上培养待用。
1.4 镰刀菌鉴定
根据BOOTH C.分类方法和标准, 参考王拱振等常见镰刀菌鉴定指南进行镰刀菌鉴定。CLA培养基光照条件下常温诱导产孢, 7d后观察小孢子形态、着生方式、分生孢子梗、大孢子形态、是否产生厚垣孢子及厚垣孢子形态, 以及在CLA培养基和康乃馨叶片上产生的分生孢子座的颜色, PSA培养基上菌落的颜色、菌丝生长状态, 测量接种4d后的菌丝生长速度。
1.5 致病性测定
1.5.1 供试品种
选在田间调查统计发病率较高的豌豆品种作为供试种。
1.5.2 供试菌株
分离鉴定后的豌豆根腐病病原菌的11个菌株。
1.5.3 平皿法培养
将供试11个菌株分别接在PSA培养基上培养3d后, 从培养皿中菌落边缘部位打菌饼, 置于事先准备好的浓度为0.7%的WA培养基中央, 然后将经75%酒精消毒过的豌豆种子5粒均匀排列在菌饼周围。在25℃培养箱中培养, 7d后检查豌豆胚根发病情况。试验设3个重复, 以不接菌的同样处理的5粒种子作为对照。
1.5.4 病害分级标准
参照苜蓿根腐病分级标准, 制定豌豆根腐病分级标准。分为5级, 0级:健康无病;1级:幼苗初生根尖端位置出现坏死斑症状, 但不软腐;2级:幼苗初生根上出现变软和腐烂症状;3级:坏死幼苗, 萌发种子幼苗胚根腐烂;4级:霉烂坏死的种子。
1.6 品种抗病性测定
1.6.1 供试品种
定西当地品种6个, 农科院品种7个, 临夏品种3个, 青海品种26个, 靖远品种2个, 加拿大品种2个, 共46个品种。
1.6.2 参试菌株
选用在致病性测定中测定的致病性最强的茄腐镰孢菌 6号、茄腐镰孢菌10号菌株。
1.6.3 测试方法
测试方法同1.5.3。
1.6.4 豌豆根腐病病害分级标准
豌豆根腐病病害分级标准同1.5.4。
1.6.5 豌豆种质抗病性评价标准
免疫:病情指数为0;高抗:病情指数≤5;抗病:病情指数在5.1～10.0;中抗:病情指数在10.0～20.0;感病:病情指数在20.1～70.0;高感:病情指数≥80。
2 结果与分析
2.1 室内分离结果
对采自定西李家堡镇的病样标本经分离、纯化, 获得镰刀菌菌株11个, 进一步对镰刀菌菌株的培养形状、孢子形态的生物学性状进行观察、鉴定, 将病原菌确定为茄腐镰孢菌、尖孢镰刀菌, 1个菌株待定。其中茄腐镰孢菌在定西李家堡镇豌豆发病植株上所占比例最高, 分离得到的11个菌株中9个菌株为茄腐镰孢菌菌株, 是定西李家堡镇豌豆根腐病的主要致病菌。
2.2 镰刀菌鉴定特征
茄腐镰孢:在25℃下, PSA培养基上生长7d观察结果, 产生白色、土黄色、青黑色至降紫色色素, 菌丝毯状、绒状、絮状, 茂密或稀疏。在CLA培养基上产生大量小型孢子和大型孢子, 有些可产生厚垣孢子。大型孢子马特型, 分生孢子较胖, 两端较钝, 顶孢稍尖, 有的基孢有圆形足跟, 壁厚;小型孢子形成在长的单瓶梗上, 头状或假头状聚生, 单胞或多胞, 多为椭圆形。
尖孢镰孢:在25℃下, PSA培养基上生长7d观察结果, 形成白色色素, 生长慢, 有同心轮环, 气生菌丝地毯状, 有白色颗粒物。CLA培养基上可产生大量小型孢子和大型孢子, 大型孢子美丽型, 稍弯, 两端较尖, 多数3个隔, 无足跟;小型孢子数量多, 假头状聚生, 卵圆形。可形成较多的厚垣孢子, 球形, 顶生或串生, 以顶生居多。产孢单瓶梗较短。
2.3 致病性测定结果
对11个菌株用平皿法致病性测定, 7d后检查发病率和病情指数。结果表明, 茄腐镰孢菌的6号菌株发病率最高达到100%, 发病程度严重, 病情指数达62.5%;其次为10号菌株发病率达到93.3%, 病情指数为65.0%;12号菌株致病性最弱, 发病率和病情指数最低;尖孢镰孢菌有致病性, 但致病性不强, 未达到极显著水平。
2.4 品种抗病性测定结果
用茄腐镰孢菌6号菌株处理过的46个豌豆品种中, G1997、9236-1病情指数低, 分别为6.3%、6.97%, 达到极显著水平, 表现为抗病;草原224病情指数最高达到81.3%, 表现为高感;绿豌豆、定豌1号、9129、MZ-1、9107、大白豆、G3109、G2985、G2878、G2970、G3669、中兴406、9431-白、定豌2号表现为中抗;草原24号、草原26号、G343表现抗病;其余品种都表现感病;在46个豌豆品种中尚未发现高抗和免疫茄腐镰孢菌6号菌株的品种。
用茄腐镰孢菌10号菌株处理过的46个豌豆品种中, 麻豌豆、G3081病情指数最低, 都为8.3%, 表现抗病;草原21号病情指数最高达60.4%, 表现感病。其余除草豌豆、定豌1号、9129、MZ-1、草原20号、G343、G2985、G1673、G2878、G3081、G2195、G3669表现中抗外, 其它品种都表现为感病。46个豌豆品种中无高感和免疫茄腐镰孢菌10号菌株的品种。
3 结论与讨论
通过对甘肃省定西地区李家堡豌豆根腐病病样分离, 得到11个菌株, 茄腐镰孢菌9个菌株, 尖孢镰刀菌1个菌株, 1个菌株鉴定特征不明显尚未鉴定出结果。平皿法致病性测定结果表明, 11个菌株都有致病性, 茄腐镰孢菌的6号和10号菌株为主要致病菌株, 发病率达到100%和93.3%, 是引起定西地区豌豆根腐病的主要病原菌;尖孢镰刀菌发病率相对较低为46.7%, 致病性相对较弱。对46个豌豆品种做了初步抗病性筛选, 结果表明, G1997、9236-1对6号菌株有显著抗病性, 草原224号对6号菌株感病程度达显著性差异, 麻豌豆、G3081对10号菌株有显著抗性, 草原21号对10号菌株显著感病。其余品种中除少数表现中抗外, 大部分都为感病品种。本次试验未发现免疫和高抗品种。
本次试验主要分离得到引起豌豆根腐病的病原为镰刀菌, 这与李乾坤等 (1990) 报道的结果基本一致。其它地区报道的引起豌豆根腐病的病原种类较多, 有些地区分离出了串珠镰刀菌、木贼镰刀菌、立枯丝核菌、腐霉菌等, 定西地区是否存在这些致病菌类有待进一步研究。试验抗病性测定筛选出的抗病品种尚未见报道。另外, 抗病性测定是采用室内平皿法测定的, 只适合幼苗期或早期抗病性, 其影响因子也与大田不同, 还需进一步与大田自然病圃环境下进行抗病性鉴定相结合。
参考文献
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抗病性鉴定 篇2
小麦NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定
根据已知植物抗病基因的保守区域设计引物,从抗锈病小麦品种西农88基因组DNA扩增出3条与植物抗病基因同源的序列,分别为WRGA1、WRGA2和WRGA14.这三条同源片段均含有典型的NBS-LRR类抗病基因所拥有的`保守性结构域Kinase-2a、Kinase-3a和疏水结构域(HD),它们与部分已知NBS-LRR类抗病基因的氨基酸序列同源性为46.0%-9.9%,三个片段间在氨基酸水平上的同源性为80.7%-56.8%.Northern杂交表明WRGA1在小麦中受水杨酸正调控,属诱导型表达.
作 者：黄萱 徐子勤 陈立余 王健 HUANG Xuan XU Zi Qin CHEN Li Yu WANG Jian 作者单位：西北大学,省级生物技术重点实验室,西安,710069刊 名：分子细胞生物学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF MOLECULAR CELL BIOLOGY年，卷(期)：200639(2)分类号：Q94关键词：小麦 NBS-LRR 同源克隆技术 抗病基因同源序列 水杨酸
抗病性鉴定 篇3
关键词：鸡；致病性大肠杆菌；耐药性
中图分类号： S852.61+2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0226-03
收稿日期：2013-10-10
基金项目：湖南省“十二五”重点建设学科（动物学）项目（编号：湘教发[2011]76 号）；湖南省高校科技创新团队项目（编号：2008244）；湖南省动物学重点实验室项目（编号：200824632）；湖南文理学院青年专项基金（编号：QNYX0811）。
作者简介：李娜（1977—），女，吉林长春人，硕士，讲师，研究方向为预防兽医学。E-mail：vetlina@163.com。大肠杆菌为临床上常见的病原菌，在腹泻畜禽的粪便中及各种原因引起的败血症畜禽中都能分离到致病性大肠杆菌。该病的主要特征包括心包炎、肝周炎、脐炎、气囊炎、败血症、眼炎、滑膜炎、卵黄性腹膜炎等，多继发新城疫、传染性喉气管炎等疾病，导致鸡群高死亡率，对养鸡生产的危害极大[1]。国内已有很多关于鸡大肠杆菌病流行病学的研究报道，主要针对我国的主要省（市），而对较小的市、县的研究报道并不多。由于大肠杆菌血清型多、抗原复杂，在小区域间也存在较大差异；同时随着抗生素的广泛应用，大肠杆菌的耐药性越来越强。为了能准确防治鸡大肠杆菌病，应在尽可能小的区域内对其进行病原血清型调查，并合理用药。目前，国内尚无对湖南省常德地区鸡场大肠杆菌耐药性监测的调查研究报道。为此，笔者从2006年10月至2012年12月对湖南省常德地区范围内的鸡大肠杆菌病流行情况和耐药情况进行了调查和监测，以了解湖南省常德地区的主要流行菌株的耐药规律，为兽医临床用药提供指导性参考意见。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1病料采集在2006年10月至2012年12月期间，选取105份湖南省常德地区饲养的疑似大肠杆菌病鸡的脏器。
1.1.2培养基及试剂普通琼脂平板培养基、三糖铁（TSI）琼脂培养基、伊红美兰（EMB）琼脂培养基、麦康凯（MAC）琼脂培养基，购自北京奥博星生物技术责任有限公司；生化试验微量发酵管，购自杭州微生物试剂有限公司；普通营养肉汤，自制。
1.1.3试验动物18～25 g/只的小白鼠，购自湖南农业大学小动物室。
1.1.4药敏纸片试验用药敏纸片共30种，包括阿莫西林、哌拉西林、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氨苄青霉素、苯唑青霉素、妥布霉素、庆大霉素、丁胺卡那霉素、链霉素、头孢哌酮、头孢他啶、头孢唑啉、头孢噻肟、头孢曲松、头孢氨苄、四环素、氯霉素、红霉素、新霉素、壮观霉素、强力霉素、林可霉素、乙酰螺旋霉素、氯洁霉素、呋喃妥因、氨曲南、复方新诺明、利福平等，购于杭州天和微生物试剂有限公司。
1.2试验方法
1.2.1细菌形态与分离培养将采集的新鲜病料分别划线接种于普通培养基、MAC、EMB培养基上，同时分别穿刺TSI琼脂管，置于37 ℃恒温箱培养18～24 h后观察；挑取疑似的单个菌落进行革兰氏染色镜检，将培养特性及形态、染色反应、排列均符合大肠杆菌特征的菌株划线接种于普通营养琼脂平板上进行细菌的数次纯化，然后将纯化的细菌接种于普通斜面培养基上，4 ℃保存备用。
1.2.2生化特性鉴定将分离的60个致病菌株接种于普通肉汤中，37 ℃恒温箱培养24～48 h后适量接种于葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、棉子糖、尿素、H2S、靛基质、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、MR、VP微量发酵管中，置于37 ℃恒温箱培养24 h后觀察生化反应结果。靛基质发酵管中滴加1滴靛基质试剂、MR发酵管中滴加1滴MR试剂即可观察结果；VP发酵管中滴加2滴VP甲液、1滴VP乙液，置于37 ℃培养2 h即可观察结果。
1.2.3大肠杆菌致病性试验取已鉴定的、生化反应符合大肠杆菌的各个菌株于37 ℃恒温箱培养18 h的普通肉汤培养物（菌液浓度为3.0×109 CFU/mL），经纯粹检验合格后分别腹腔接种18～25 g小白鼠，按0.2 mL/只的剂量接种，每个菌株接种6只；对照组按相同的途径接种0.2 mL普通肉汤培养液，共接种6只。接种后饲养观察120 h小白鼠的存活情况，记录小白鼠的死亡时间并对死亡小白鼠进行剖检取肝脏、心脏，用EMB平板进行接种菌回收试验以分离致病菌。
1.2.4分离菌药物敏感性试验采用WHO推荐的 Kriby-Bauer （K-B）法[2]对分离鉴定的75株大肠杆菌进行耐药性监测，判断标准参照美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）颁布的M100-S15药敏试验纸片扩散法法规[2]和相关文献[3-4]，以高敏、中敏、低敏或耐药3种形式对抑菌圈大小作出判定。先将菌株接种到普通营养琼脂斜面培养基上，37 ℃ 恒温箱培养18 h，用生理盐水洗下菌苔；将菌悬液稀释到麦氏比浊管中，相当于终浓度5×107～1×108 CFU/mL；将普通营养琼脂倾注于直径为10 cm的平皿上，制成厚4 mm的营养琼脂平板，15 min内用灭菌棉拭子蘸取上述浓度的菌悬液，在管内壁挤去多余菌液后在琼脂平板表面涂布接种3次，每次旋转70°，最后沿平板内缘涂抹1周；室温干燥3～5 min后，用无菌镊子将药敏纸片紧贴于营养琼脂平板表面，各纸片中心的距离应大于24 mm，纸片距平板内缘的距离应大于 15 mm；37 ℃恒温箱培养16～18 h后观察结果，记录各纸片的抑菌圈直径。
nlc202309012234
2结果与分析
2.1细菌形态及生长情况
由细菌培养结果可知，在普通营养琼脂平板上的菌落生长良好、湿润，呈现半透明状态与灰白色，边缘光滑；在EMB琼脂培养基平板上的细菌形成中等大小、边缘整齐、表面光滑、黑紫色带金属光泽的菌落；在MAC琼脂培养基平板上的细菌长出圆形粉红色、表面光滑圆形中等大小的菌落；TSI管底及斜面培养的细菌均变黄色，产气而不产硫化氢；经过革兰氏染色镜检后，镜下均可见大量散在的红色、中等大小、两端钝圆的无芽孢G-短小直杆菌。
2.2分离菌的生化特性
分别对分离出的60株致病细菌进行生化试验，结果均符合大肠杆菌的生化特性，详见表1。
2.3大肠杆菌致病性试验
小白鼠在接种分离菌12 h后，均表现出精神不振，18 h后开始出现死亡，48 h后全部死亡；而对照组小白鼠健康活泼。剖检死亡的小白鼠可见肝脏肿大瘀血，表面散在针尖大小的出血点，心包膜、腹膜、肺、肾、脾脏均有不同程度的出血。从死亡小白鼠的肝脏、心脏中均可分离到分离菌。综合试验结果可知，分离菌株的培养特性、形态、染色反应均符合大肠杆菌特性，确定为致病性大肠杆菌。
2.4分离菌药物敏感性试验结果
以抑菌圈直径大小作为判定药物敏感性高低的标准，抑菌圈直径越大表明细菌对该药的敏感性越高。抑菌圈直径≥21 mm为高度敏感；在15.1～20.0 mm范围内为中度敏感；≤14 mm 为低敏或耐药。抑菌圈直径的测定结果见表2。研究表明，虽然常德地区3个不同养鸡场的大肠杆菌菌株对30种藥物的敏感性存在一定差异，但是同一养鸡场的大肠杆菌菌株对抗生素的敏感性几乎一致。
养殖户把药物防治作为控制大肠杆菌的主要手段，但药敏试验普及率很低，用药盲目性非常大，且在实际生产中有时用药不合理，如低剂量长时间使用，随意加大剂量或根据个人经验感觉盲目添加等，均会造成大肠杆菌严重耐药，从而导致药效下降甚至无效，药物控制难度增大，耐药菌株增多。75 株受试大肠杆菌均对除头孢曲松外的29种抗菌药物有多重耐药性，表现为对4种或4种以上药物耐药，8耐菌株所占比例最大，为14.67%；其次是5耐、9耐，分别占10.67%、9.33%。因此在临床用药方面或作为饲料添加药物时，有条件的应该进行药敏试验，尽量选择高效敏感的药物，尽量避免长期大量使用同一种药物，也可以几种药物交替使用，要足量、按疗程给药，以免产生耐药性。
参考文献：
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抗病性鉴定 篇4
张掖市作为全国最大的杂交玉米种子生产基地, 年制种玉米稳定在4万hm2以上, 2008—2009年达到5.33万hm2以上, 种子产量36万t以上, 参与制种的公司38家, 生产品种逾300个, 从事玉米制种的农户近9万户。在张掖地区制种玉米生产基地的主要3个县区即临泽县、高台县和甘州区, 其中以甘州区的玉米种植总面积最大, 一般每年均在2.67万hm2以上。据2007年调查, 甘州区玉米锈病普遍发生, 个别组合属中度偏重发生, 病株率31%以上, 面积1.81万hm2;玉米瘤黑粉病中度偏重发生, 部分组合和基地重度发生, 发生面积2.58万hm2, 其中豫玉22、郑单958等制种田内发生较重;玉米丝黑穗病发生较轻, 多种病害混合发生, 损失在10%~20%, 对玉米的产量和品质影响很大, 直接影响到农民的增产增收。因此, 笔者收集了当地种植的玉米亲本材料和品种采用人工接种方法, 鉴定对玉米黑粉病、丝黑穗病的抗病性表现, 旨在为当地选择种植抗病玉米亲本, 提高杂交玉米品种的制种产量和质量提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验概况
试验地选择在地势平整、精耕细作、地力均匀、连作3年以上的玉米地。供试品种为收集各制种公司的制种玉米品种和组合共45份材料, 分别为:德玉28♀, 德玉28♂, 吉单29♀, 吉单29♂, 豫奥2♂, 豫奥2♀, 吉单413♀, 吉饲8♂, 吉单413♂, 临奥2♀, 铁单16♀, 会单4号♀, 临奥2♂, 辽613♂, 临奥9♂, 会单4号♂, 辽613♀, 吉饲8♀, 铁单16♂, 屯玉88♂, 屯玉88♀, 北玉6号♂, 北玉6号♀, 屯玉98号♂, 屯玉98号♀, 屯玉99♀, 昌7-2♂, 郑58♀, 先丰335♀, A1♂, B2♀, 新—4♀, 潞玉13♂, 潞玉13♀, 莘州158♂, 莘州158♀, 奥23♀, 金海5号♂, 金海5号♀, 丰黎2008♀, 武科2号♀, 武科2号♂, 安隆4号♀, 粟玉1号♂, 粟玉1号♀。
1.2 试验设计
试验共设45个处理, 即每个品种为1个处理。每个处理设3次重复, 采用随机区组设计, 每个处理小区面积16.7 m2, 采用单垄双行, 株行距20 cm×50 cm, 行长3 m, 每行15株, 种植2垄4行, 共计60株, 共种植6垄12行, 每个重复面积4.5 m2, 两边增加隔离带, 宽70 cm, 每个处理共计面积4.5×3+0.7×2×3=16.7 m2。按45个品种计算, 需要751.5 m2的土地面积, 另外, 再加保护行, 行距50 cm, 采用单垄双行, 共种植3垄6行。
1.3 试验实施
播种前在田间堆积的玉米秸秆上采集瘤黑粉病和丝黑穗病的黑粉。播种前7 d分别将黑粉团块上的菌粉抖落, 用40目铜筛筛出冬饱子, 制作成冬孢子粉, 然后将瘤黑穗病菌和丝黑穗病菌冬孢子粉按1∶1混合成冬孢子粉备用;试验用田土采集于确定的试验田, 用网筛筛出大的颗粒及杂物, 将过筛的田土放入搪瓷盆, 置于105℃烘箱中灭菌备用。试验前将无菌水与灭菌田土混拌均匀后, 装入塑料种子发芽盒, 经3 d完全吸湿后, 按1份黑粉对10份细土搅拌均匀制成菌土备用。播种时先播下种子, 播种深度5~7 cm, 覆盖菌土100 g, 上面再覆田土。每穴播种2粒。
1.4 调查内容与方法
在玉米吐丝后调查瘤黑粉病和丝黑穗病发生情况, 每隔10 d调查1次, 各品种采取逐株调查, 分别记载病害始见期和发病株数, 计算病株率。成熟时, 每小区分未发病株及发病株单独收获果穗, 折算单位面积产量。并且随机从未发病穗及发病穗中各取5个果穗, 晒干后考种。测定秃顶率、穗长 (cm) 、穗粗 (cm) 、行粒数 (粒) 、粒行数 (行) 、穗重 (g) 、穗粒重 (g) 、百粒重 (g) 等项目, 说明瘤黑粉病和丝黑穗病对产量及其结构的影响。
1.5 抗病性划分标准
玉米瘤黑粉病和丝黑穗病的抗病性评价标准:高抗 (HR) ∶发病率<1%;抗病 (R) :发病率在1.0%~5.0%;中抗 (MR) :发病率在5.1%~10.0%;感病 (S) :病株率在10.1%~40.0%;高感 (HS) :病株率>40.1%。调查各小区每株瘤黑粉病、丝黑穗病发病率, 获得的数据经DPS统计分析, 结合小区产量, 综合评价各玉米品种抗病性[8]。
2 结果与分析
2.1 不同玉米品系农艺性状
从供试的45个品系看, 高秆品种系 (高度为200 cm以上) 有26个, 占供试品种57.8%, 中秆品系 (高度为200 cm以下, 180 cm以上) 有13个, 占供品种28.9%, 低秆品系 (180 cm以下) 有6个, 占供试品系13.3%;穗位在120 cm以上的品系有8个, 占供试品种17.8%, 穗位在100~120 cm的品系有13个, 占供试品种28.9%, 穗位在80~100 cm的有16个, 占供试品种35.6%, 穗位80 cm以下有8个, 占供试品种17.8%;穗长超过20 cm有2个, 占供试品种4.4%, 穗长15~20 cm有32个, 占供试品种71.1%, 穗长15cm以下有11个, 占供试品种24.4%;从株高和穗位看, 株高和穗位均降低 (表1) 。
从穗部基本特征看, 秃顶长超过5cm品系有2个, 占供试品种4.4%, 秃顶长在3~5cm品系有9个, 占供试品种20.0%, 秃顶长在1~3 cm品系23个, 占供试品种51.1%, 秃顶长在1 cm以下品系有11个, 占供试品种24.4%;穗粗在15~17 cm的品系有23个, 占供试品种51.1%, 穗长13~15 cm有品系有22个, 占供试品种48.9%;穗行数在10~18行不等, 其中, 13~14行间居多, 占供试品种64.4%, 行粒数在18~22粒居多, 占供试品种73.3%。
综合分析认为, 穗粗增加, 穗行数随之增加。穗长增加, 行粒数随之增多。秃顶长在1~3 cm, 穗行数、行粒数的关系呈正相关关系。
2.2 玉米亲本抗性鉴定结果
从表2可以看出, 在参试的45个玉米亲本中, 对玉米瘤黑粉病表现感病 (S) 的亲本有豫奥2♀、吉单413♀、吉单413♂、临奥2♀、辽613♀、屯玉88♀、屯玉98号♀、屯玉99♀、B2♀、新—4♀、莘州158♀、奥23♀、丰黎2008♀、安隆4号♀等14个, 发病率在10.1%~25.1%, 感病品种占供试亲本31.1%, 其中92.9%为母本, 少数为父本;表现中抗 (MR) 品种有豫奥2♂、铁单16♀、临奥9♂、吉饲8♀、铁单16♂、屯玉88♂、北玉6号♀、昌7-2♂、郑58♀、A1♂、武科2号♀等11个, 发病率在5.1%~8.4%, 占供试品种的24.4%;其余20个品种表现为抗病 (R) , 发病率在0~4.6%, 抗病品种占供试材料44.4%。
在参试的45个玉米亲本中, 玉米丝黑穗病表现感病 (S) 的亲本品种有吉单29♂、豫奥2♂、豫奥2♀、吉单413♀、吉单413♂、临奥2♂、屯玉98号♂、A1♂、辽613♂、临奥9♂、铁单16♂、屯玉88♂等12个, 发病率在10.3%~25.1%, 感病品种占供试亲本26.7%, 其中父本占感病品种的83.3%, 母本占感病品种的16.7%;表现抗病的品种有33个, 抗病品种占供试材料73.3%, 其中表现中抗 (MR) 的品种有临奥2♀、辽613♀、屯玉88♀、北玉6号♂、北玉6号♀、屯玉99♀、郑58♀、B2♀、新-4♀、丰黎2008♀、安隆4号♀等11个, 发病率在5.1%~9.4%, 占供试材料24.4%, 其中母本占中抗品种的90.9%, 父本仅占9.1%;抗病 (R) 品种有吉单29♀、铁单16♀、屯玉98号♀、先丰335♀、莘州158♂、金海5号♂等6个品系, 发病率在1.2%~4.6%, 占供试材料的13.3%, 其中母本占抗病品种66.7%, 父本占抗病品种33.3%;高抗 (HR) 品种有16个, 发病率在0~1.0%, 占供试材料35.6%, 其中父本占高抗品种的43.8%, 母本占56.3%。
在参试的45个玉米亲本中, 感染瘤黑粉病、丝黑穗病都表现为感病 (S) 的品种有豫奥2♀、吉单413♀、吉单413♂等3个, 占供试品种的6.7%。表现为中抗 (MR) 的品种有北玉6号♀、郑58♀等2个品种, 占供试品种的4.4%。表现为抗病 (R) 的有吉单29♀、先丰335♀、莘州158♂等3个, 占供试品种的6.7%。表现为高抗 (HR) 品种德玉28♀、德玉28♂、吉饲8♂、会单4号♂、潞玉13♂、武科2号♂、粟玉1号♂、粟玉1号♀等8个, 占供试材料的17.8%。因此, 抗2种黑粉病的品种占供试品种的28.9%。
3 讨论
关于玉米品种的田间抗病性鉴定与评价, 由于其研究目的不同, 采用的方法亦有差异, 有些学者采用人工接种的方法鉴定和评价品种的抗病性[9,10,11,12,13], 有些学者则采用自然发病研究其品种的抗病性[14,15,16]。笔者采取人工菌土接种对玉米各品种和组合进行抗病性研究, 其主要目的是在试验条件一致的情况下, 鉴定各玉米亲本品种对当地主要发生的瘤黑粉病、丝黑穗病的抗病性表现, 结合玉米亲本材料的主要农艺性状结果分析玉米瘤黑粉病和丝黑穗病对玉米植株高度、有效穗数、穗长、穗行数、行粒数、千粒重等方面都有一定的影响。本研究采用人工接菌方法, 在大田试验因受环境、气候及土壤条件等诸多因素限制, 与实际的抗病性可能有一定得差异, 有待于进一步研究。
摘要：通过对45份玉米亲本的抗病性鉴定结果表明:对玉米瘤黑粉病表现感病的有豫奥2♀等14个, 占供试亲本31.1%;表现中抗品系有豫奥2♂等11个, 占24.4%;其余20个品种表现为抗病, 占44.4%。玉米丝黑穗病表现感病的有吉单29♂等12个, 占26.7%;表现抗病的有33个, 占73.3%, 其中中抗品种有临奥2♀等11个, 占24.4%;抗病品种有吉单29♀等6个, 占13.3%;高抗病品种有16个, 占35.6%;对2种黑粉病均表感病的有豫奥2♀等3个, 占6.7%。表现为中抗的有北玉6号♀等2个, 占4.4%。抗病的有吉单29♀等3个, 占6.7%。表现为高抗品种德玉28♀等8个, 占17.8%。因此, 抗2种黑粉病的品种占28.9%。
抗病性鉴定 篇5
1 材料与方法
1.1 病鸡来源病鸡取自山东某鸡场饲养的商品肉仔鸡。
1.2 培养基普通营养琼脂和麦康凯琼脂培养基购自杭州天和生物制品有限公司, 按常规要求制备平板[5]。
1.3 病料涂片染色镜检分别从病鸡的心包液、肝脏取病料, 涂片, 用革兰氏染色法染色后, 镜检。
1.4 分离培养
无菌钩取病死鸡肝、肺和心包液, 分别接种于普通营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板上, 在37℃温箱培养24h。从普通琼脂平板上挑取单个菌落, 纯培养, 待用。
1.5 生化试验
将纯培养物分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇等20种生化试验管内, 37℃培养24h, 观察试验结果并记录。
1.6 药敏试验
在平板培养基上接种培养纯物, 再放入药敏纸片, 37℃培养24h, 记录结果。
2 结果
2.1 基本发病情况
山东某鸡场现饲养商品鸡2500只, 鸡舍结构为塑料大棚。该鸡群7日龄接种NDV—IB二联苗, 14日龄开始出现甩鼻现象, 食欲不良, 精神沉郁, 部分鸡粪便呈黄绿色, 每天死亡3~5只。剖解后, 发现心包积液乳白色, 肝肿大、有出血点、质脆。十二指肠内积满粘性液体, 局部肠系膜淤血。肾肿大, 腹腔轻度积水, 法氏囊萎缩, 腺胃溃疡。
2.2 菌体形态与培养特性
该菌为革蓝氏阴性, 粗短的小杆菌。在普通琼脂平板上呈光滑湿润、圆形凸起、灰白色、半透明的中等大小的菌落;麦康琼脂平板上看见圆形、边缘相对整齐、浅红色的菌落。
2.3 生化试验
该菌株的生化特征见表1, 基本符合大肠杆菌。
注:“—”表示无变化;“+”表示产酸”;“⊕”表示产酸又产气。
注:“—”表示对药物不敏感。
2.4 药敏试验
该株细菌对壮观霉素、氯霉素、新霉素、氧氟沙星、氟哌酸、链霉素高度敏感;对呋喃妥因、氨苄青霉素、青霉素、环并沙星、多粘霉素、恩偌沙星、红霉素、妥布罗霉素、庆大霉素、强力霉素、新生霉素、阿米卡星、头孢噻吩中毒敏感;对复方新偌明、麦迪霉素、磷霉素、甲氧氨嘧啶、先锋V、头孢拉定和痢特灵低度敏感 (见表2) 。
3 讨论与小结
通过临床症状、剖检病变和病原检查, 确诊为鸡大肠杆菌病。根据药敏试验结果, 首选高敏药物 (壮观霉素、氯霉素、新霉素、氧氟沙星) 进行治疗, 同时添加维生素等保健药品辅助治疗。
致病性的大肠杆菌常存在于健康家禽的肠道中, 一般情况下不易引起正常健康的鸡发病。疫苗虽然属于弱毒, 但仍能够造成一定的感染和免疫抑制。冬季使用大棚养鸡, 往往在通风与保温方面难以把握好平衡, 常常偏重于保温而通风不够, 使得鸡舍内不良气体增多, 损伤鸡体的黏膜等防御屏障。当鸡的防御机能降低时, 就容易引起大肠杆菌病的发生。饲养密度过大等应激因素, 与该病的发生也有着密切关系。因此, 防制大肠杆菌病要从源头抓起, 排除各种不利于鸡群的因素, 做好各个环节的卫生消毒工作, 在此基础上使用药物, 才能取得较好的疗效。
参考文献
[1]王双山, 张敬礼, 刘庆昌等.豫鲁冀接壤地区肉鸡大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验 (J) .河南农业大学学报, 2004, 38 (1) :120-122.
[2]张仕宝, 杨凤劲.肉鸡大肠杆菌病的诊断[J].中国兽医杂志, 2000, 26 (9) :41-42.
[3]管仁平, 祝仁铸.大肠杆菌病防治的浅析[J].山东畜牧兽医, 2009, 30 (11) :34-35.
[4]张汉成.黑山县鸡大肠杆菌病的诊治[J], 畜牧兽医科技信息, 2007, (03) .
抗病性鉴定 篇6
关键词：奇异变形杆菌,分离,鉴定,16SrDNA
变形杆菌 (proteusbacillus vulgaris) 是人和动物的寄生菌和病原菌。广泛分布在自然界中, 如土壤、水、垃圾、腐败有机物及人或动物的肠道内。变形杆菌属于肠杆菌科, 包括普通变形杆菌、奇异变形杆菌、莫根变形杆菌、雷极变形杆菌和无恒变形杆菌[1]。变形杆菌呈明显的多形性, 有球形和丝状形, 为周鞭毛菌, 运动活泼。有菌毛, 可粘附于植物和真菌细菌表面, 但不吸附动物组织细胞和红细胞。变形杆菌为条件致病菌, 多为继发感染, 当机体抵抗力下降时, 可引起人及动物的创伤感染、膀胱炎、尿道炎、败血症、食物中毒等, 一般健康人群带菌率为1.3%~10.4%[2]。奇异变形杆菌引起的感染有日益增长的趋势, 在美国, 医院内感染率约为3%[3]。因此, 快速准确地做出诊断, 对致病性变形杆菌的防控有重要的意义。本试验采用传统的病原学方法及16S r DNA测序技术结合起来进行菌株的鉴定, 从临床采集的病料中分离出一株致病性奇异变形杆菌。
1 材料与方法
1.1 样品的采集
病料来自于江苏某规模化猪场, 无菌取某猪的肺脏、肺门淋巴结作为待检材料。
1.2 培养基
试验所用培养基为普通营养琼脂平板、普通营养肉汤、麦康凯琼脂平板、血琼脂平板等按常规方法配制。
1.3 细菌学鉴定
1.3.1 细菌的分离培养
将无菌采集的病猪肺及肺门淋巴结分别接种于普通营养琼脂平板上, 分别在有氧和厌氧条件下37℃培养24h, 挑去优势菌落再分别接种于以上四种培养基直至得到菌落形态和镜检菌体形态一致的纯培养物。
1.3.2 细菌形态观察
将纯培养物按常规方法[4]进行革兰氏染色、显微镜观察。
1.3.3 生化鉴定
将培养24h的菌液按常量接种于生化微量鉴定管内, 37℃培养, 观察并记录结果。
1.3.4 药敏试验
采用标准的抗生素纸片法[5], 按2003年美国NCCLS (美国国立临床实验室标准化委员会) 药敏试验法规进行。
1.3.5 16Sr DNA的扩增及序列测定
从平板上挑取少许单菌落, 移入LB液体培养基扩大培养, 取1ml新鲜菌液, 离心收集菌体, 用超纯水重悬, 煮沸冰浴后离心, 其上清即为细菌的DNA。然后按照PCR扩增细菌16Sr DNA的试剂盒 (购自Takara公司) 将该菌的16Sr DNA前500bp进行PCR扩增, 16Sr DNA的前500 bp序列变化较大, 包含有丰富的细菌种属的特异性信息, 进行DNA测序时一个测序反应即可测通, 是一种较为经济便捷的16Sr DNA鉴定方法。反应产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测, 鉴定正确后根据胶回收试剂盒的操作说明进行纯化, 然后送上海生工测序。
2 结果与分析
2.1 细菌的培养特性
该分离菌在有氧和厌氧条件下均能生长, 打开平皿时具有腐败气味。在普通营养琼脂平板上和血琼脂平板上, 菌落呈圆形, 半透明的呈薄膜扩散状生长, 对光观察, 菌落周围呈淡蓝色, 血平板上不产生溶血;在麦康凯上长出均匀圆形、扁平、半透明的单个无色菌落;在普通营养肉汤中, 培养基混浊液面可见菌膜, 管底有少量沉淀。
2.2 细菌形态
经革兰氏染色后镜检可观察到, 该分离菌为革兰氏阴性, 两端钝圆, 呈单个或成对的球状、球杆状、长丝状等多形态的杆菌。
2.3 生化特性
注:+阳性;-阴性。
2.4 药物敏感试验
分离菌对庆大霉素, 新霉素, 四环素, 氯霉素, 卡那霉素, 链霉素, 氨苄霉素等多种抗生素均不敏感, 仅对阿米卡星敏感, 显示多重耐药性。
根据以上该菌的形态, 培养和生化特性及药敏试验结果, 可初步判定该菌为奇异变形杆菌。
2.5 16Sr DNA扩增结果及序列分析
1为阴性对照;2为该分离菌;3为100bp DNA Ladder Maker。
将这株菌的16Sr DNA序列测定结果提交到Gen Bank, 与Gen Bank中相关序列的BLAST比较, 结果表明与奇异变形杆菌菌种的同源性高达99%。可判定此分离菌株为奇异变形杆菌。
3 讨论
奇异变形杆菌广泛分布于自然界可以通过消化道、呼吸道等途径传播, 近年来不断有猪群爆发流行奇异变形杆菌的报道, 该病已成为危害我国养猪业的一种新的细菌性传染病。并且还可引起人类的原发性或继发性感染, 造成人类食物中毒, 其作为人畜共患传染病病原, 应引起高度重视。细菌培养是临床鉴定细菌的传统方法, 而本试验应用传统方法和16Sr DNA序列分析检测奇异变形杆菌相结合的技术, 更加快速、简便, 为该病的诊断提供了有效的途径。疫病的发生与机体的抵抗力密切相关, 预防该病的关键是加强猪群的饲养管理, 增强机体的防御能力。
参考文献
[1]陆承平.兽医微生物学[M].北京:中国农业出版社, 第3版, 2012.
[2]王福.一起因食用烧鸡引起的奇异变形杆菌食物中毒的调查报告[J].口岸卫生控制, 2001, 8 (1) :5.
[3]Mohr C, Brenner W, Miller JM.Classification, identification, and clinical significance of proteus, providencia, and morganella[J].Clin Microbiol Rev, 2000, 13 (4) :534.
[4]姚火春.兽医微生物实验指导[M].北京:中国农业出版社, 第2版, 2010.
抗病性鉴定 篇7
广西某大型鸭场使用大肠浆膜炎疫苗后,40日龄种鸭群出现精神沉郁、食欲减退或废绝、渴欲增加、 呼吸困难的症状,并伴有明显的神经症状,每天有0. 5% ~ 1. 0% 的鸭只死亡。为有效遏制该种鸭场的疫情,对病鸭脑部进行病原菌的分离鉴定,并开展了病原菌的分离纯培养、革兰染色镜检、PCR分子生物学鉴定、血清型鉴定、致病性分析等工作[2],以期为制定综合性的防控措施提供科学依据。
1材料
革兰染液、TSA血平板,由山东省滨州预防兽医学与动物生物技术重点实验室制备、保存; 鉴定引物参照文献[3]设计; 常见革兰阴性杆菌多重PCR引物由生工生物工程( 上海) 有限公司合成; 药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司; O抗原标准血清购自中国兽医药品监察所; 体重18 ~ 22 g的昆明系小白鼠购自山东大学实验动物中心。
2方法
2.1细菌的分离鉴定
对鸭头进行表面消毒,无菌开鸭脑,挑取部分脑组织涂布TSA血平皿,37 ℃恒温箱培养36 ~ 48 h后观察结果,选取优势菌落纯培养备用。
2.2病原菌的PCR鉴定
在纯培养的TSA平皿上,挑取典型菌落进行菌落PCR鉴定,程序参照文献[3]。
2.3药物敏感性试验及鸭群敏感药物的临床治疗
将鉴定完毕的病原菌密集划线接种于新的TSA培养皿,无菌操作放置干燥抗菌药敏纸片,紧贴于密集划线的培养基表面,每个直径为90 mm的平皿贴7个药敏纸片,盖上平皿,倒置平皿,置37 ℃ 温箱培养24 h,取出测量观察结果。判断标准按《抗微生物药物敏感性试验执行标准》( 2010 CLSI M100 - S20) 执行。使用筛选到的敏感药物对鸭群进行治疗。
2.4血清型鉴定
大肠杆菌普通肉汤培养液37 ℃ 振荡培养24 h, 培养基呈均匀浑浊生长,121 ℃ 高压2 h制成高压抗原,使用比浊管调整至100亿/m L。在微量反应板中,参照李书光等[4]试验操作,将多种标准阳性血清按照1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640倍稀释,将等体积调整好菌液浓度的高压抗原加入微量反应板中,振荡混匀,置37 ℃水浴箱中水浴4 h或在室温中过夜,观察结果。
2.5小鼠致病性试验
将12只体重18 ~ 22 g健康的昆明系小白鼠随机分为2组,每组6只。试验组每 只腹腔注 射0. 2 m L菌悬液( 菌液浓度为5 × 108cfu / m L) ; 另一组每只小白鼠腹腔注射0. 2 m L灭菌生理盐水作为对照。观察7 d,记录死亡小鼠的发病情况,并做病原菌的分离鉴定。
3结果
3.1致病性病原的分离鉴定
使用鸭头部的脑组织分离细菌,在TSA血平皿中仅有单一形态的菌落,其边缘整齐、中央隆起,直径为2 ~ 3 mm,革兰染色镜检显示其为革兰染色阴性, 两端钝圆,多数呈单个散在、个别成双排列、无芽孢的杆菌,如164页彩图1所示。使用菌落多重PCR鉴定,挑取的2个单菌落均在264 bp处出现目的条带 ( 见图2) ,确定为大肠杆菌。
3.2药物敏感试验及鸭群敏感药物的临床治疗
药敏试验结果显示: 强力霉素、头孢曲松为高敏药物; 丁胺卡那霉素、环丙沙星、林可霉素为敏感药物,阿莫西林、氟苯尼考为低敏药物; 替米考星、氧氟沙星、新霉素耐药,具体见表1。选用能透过血脑屏障的敏感药物盐酸环丙沙星替换原先使用的药物,每1 g药加水20 ~ 30 kg饮用,每天1次,连用3 d,迅速控制了鸭群的持续性死亡。
3.3血清型鉴定
该菌株能够凝集O154血清型。
3.4小白鼠致病性试验
试验组的6只小白鼠均在攻毒后24 h内死亡, 未出现典型的临床症状; 取病死鼠的肝脏做病原菌的分离鉴定,使用PCR和O154血清凝集试验检测,能够分离到原致病菌株。接种生理盐水的正常对照组并无异常和死亡。
4结果与讨论
在常规的病例诊断中,出现典型神经症状并有包心包肝存在,一般怀疑为大肠杆菌和鸭疫里默杆菌混合感染[5],进行病原菌的分离鉴定和药物敏感性试验,确定下一步的防控方案[6]。在本次研究中,直接取病死鸭的脑部组织进行病原菌分离鉴定,以期能分离到鸭疫里默杆菌和大肠杆菌,试验结果显示脑部组织分离菌株形态单一,经鉴定为大肠杆菌,无鸭疫里默杆菌的存在。分离的病原菌相对单一,可能有以下几个因素: 一是病原菌的分离部位为脑部,病原菌的侵入机会相对较少; 二是该种鸭场使用过鸭疫里默杆菌和大肠杆菌多联苗; 三是该种鸭场环境控制和常规药物保健做的比较好,分离的菌种具有多重耐药性能够很好地说明这一点。根据临床症状,选择病原菌的分离部位为鸭头部,使用TSA血平皿进行病原微生物的分离纯化,借助分子生物学方法进行细菌的PCR鉴定,较常规的生化试验大大缩短了病原菌的检出周期,为后续疾病综合防控措施的制订提供了科学依据,也为疾病的快速控制节约了大量的时间。
注: - 表示不敏感; + 表示低度敏感; + + 表示中度敏感; + + + 表示高度敏感。抑菌圈直径≤5 mm 为不敏感; > 5 mm ~ ≤10 mm 为; > 10 mm≤20 mm 为中度敏感; > 20 mm 为高度敏感。
病原性大肠杆菌在病理状态下能够透过鸭的血脑屏障,引起病鸭精神沉郁、食欲减退或废绝、渴欲增加、呼吸困难,伴有明显的神经症状,在治疗的过程中有些敏感药物的脑脊液通透性不好,不能够有效杀灭脑脊液中的病原菌,造成短期内敏感药物的使用能够控制该病的发生,但是用药周期结束以后又复发,从而造成该病难以有效控制和彻底根除。本病例中,根据药物敏感性试验结果选用脑脊液通透性好的敏感性药物进行治疗,取得了理想的治疗效果,控制了鸭群的持续性死亡。
依据该病例的诊断,下一步的综合防控措施应在以下几个方面开展: 一是鸭场流行血清型大肠杆菌 + 区域内常见流行血清型大肠杆菌疫苗的使用; 二是出现临床病例后,应及时进行药物敏感性试验,筛选高敏药物,选择脑脊液通透性好的敏感药物进行多种联合应用和轮换用药,迅速控制该病的蔓延; 三是注意环境卫生,注意进行常规消毒和应急消毒,切断病原菌的传播途径。
抗病性鉴定 篇8
1 材料
1.1 病料来源
来自干海乡一鸡苗场30日龄有典型气囊炎、包心包肝及败血症的病死肉鸡。
1.2 试验器材与仪器
普通光学显微镜(XSZ-G,上海光学仪器五厂有限公司,编码:B01370107005)、恒温培养箱(KXM-150,上海科析试验仪器厂,编码:950HZP06123)、高压蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司医疗设备,编码:848WP Z78500)、微量移液器(10～50μL)、电炉(天津市泰斯特仪器有限,22V,AC)、电子天平(JA1203,上海精科)、一次性灭菌注射器、离心机、游标卡尺等。
1.3 试验试剂
甲基红试剂、VP试剂、靛基质试剂、溴麝香草酚蓝指示剂、0.2%新洁尔灭、生理盐水、草酸结晶紫溶液、革兰氏碘溶液、95%酒精、75%酒精、石碳酸复红、酒精灯、3%来苏尔溶液等。
1.4 细菌培养基
水解酪蛋白培养基(MH)购自杭州天和微生物试剂有限公司,批号081103;麦康凯琼脂培养基购自北京三药技术开发公司,批号为080608;商品化微量发酵管购自杭州天和微生物试剂有限公司,批号均为:081114。普通营养肉汤、普通营养琼脂培养基、普通琼脂斜面、蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、枸橼酸盐培养基、三铁糖琼脂培养基、伊红美兰琼脂培养基等按常规方法配制。
1.5 大肠杆菌标准菌株
ATCC25922,购自中国药品生物制品鉴定所。
1.6 大肠杆菌标准抗O型血清
大肠杆菌标准抗O血清O2、O3、O8、O9、O20、O45、O60、O64、O78、O101、O138、O139、O141、O147、O149、O157等20种,购自中国兽医药品监察所。
1.7 试验动物
试验用小白鼠:由成都达硕生物科技有限公司提供的清洁级小白鼠30只(雌雄各半)。
1.8 药敏纸片
由四川鼎尖动物药业有限公司提供的氨苄青霉素、庆大霉素、四环素、磷霉素、新霉素、土霉素、链霉素、红霉素、氟苯尼考、氧氟沙星、头孢曲松、阿莫西林药敏纸片若干。批号均为:080910。
“⊕”表示产酸产气;“+”表示产酸不产气;“-”表示不产酸不产气
2 方法
2.1 病料采集
2010年3月7号采自干海乡杨氏鸡苗场30日龄有典型气囊炎、包心包肝及败血症的病死肉鸡的肝脏、脾脏、心血、粪便等。
2.2 细菌的分离鉴定
2.2.1 细菌的培养:
以无菌操作取病料少许接种于营养琼脂培养基上。置于37℃恒温培养箱中培养24 h,观察结果。
2.2.2 细菌的分离培养:
在普通营养琼脂板上,选取有圆形、光滑、隆起、湿润、半透明的近无色的菌落,分别划线接种于麦康凯琼脂平板上,37℃恒温培养箱中培养24 h,观察结果。
2.2.3 细菌的纯分离培养:
将划线分离培养37℃,24 h的麦康凯琼脂平板从恒温箱中取出,用接种环挑取单个红色中等大小光滑菌落,经涂片、革兰氏染色镜检,观察其形状、大小等,确定无杂菌后,再接种于营养肉汤培养基、三铁糖琼脂培养基、伊红美兰琼脂培养基上,置37℃恒温箱内培养24 h,观察结果。
2.3 细菌的生化试验
选取麦康凯琼脂上长出的红色的菌落,作糖(醇)发酵试验、靛基质形成试验、甲基红试验、V-P试验、枸橼酸盐利用试验。
2.4 细菌致病试验
取接种于普通营养肉汤在37℃培养18 h后的纯种菌液,先用麦氏比浊法粗略记数,然后用生理盐水倍比稀释,以平板表面涂布法记数菌落总数(CFU/mL)。然后将菌液稀释至1.5×109CFU/mL。腹腔注射健康小鼠每只0.2 mL,每株细菌接种5只小鼠,对照组5只,注射生理盐水每只0.2 mL,将接种的小鼠隔离饲养,观察7 d,并记录其发病及死亡情况。死亡的立即剖检,无菌采取肝脏、血液等。涂片、革兰氏染色、镜检,并在麦康凯平板上划线分离培养,并观察其生长情况。
2.5 细菌血清学鉴定
将纯培养的被检菌挑取3个在普通琼脂上密集划线,37℃培养24 h后,以0.3%的甲醛盐水洗下后2 000 r/min离心5 min,再将其上悬液8 000 r/min离心10 min后,将其沉淀物配制成约30亿/mL的菌悬液,121℃高压2 h,除去K抗原和H抗原,制成浓稠的O凝集原。吸取多价因子血清50μL,滴加于洁净的玻片上,再吸取40μL制备好的凝集原用牙签与之充分混匀,于3 min内观察结果,呈“++”以上的凝集判为阳性。用凝集原与可凝集的多价血清内的每一单价因子作同样的凝集试验,同时以高压抗原与0.5%石碳酸生理盐水混合物作对照,观察有无自凝现象。最终确定每株致病性大肠杆菌的血清型。
2.6 药敏试验
用接菌环挑取单个鸡致病性大肠杆菌菌落,接种于肉汤培养基中,置37℃恒温培养12 h。用无菌棉拭子蘸取肉汤培养基,在管壁上挤压去掉多余肉汤后,涂抹于整个MH培养基表面,反复几次,每次将平板旋转60°,最后沿周边绕2圈,保证涂均匀。然后用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面,纸片一贴上就不可再拿起。每个平板贴4张纸片,每张纸片间距为25 mm,纸片中心距平皿边缘为16 mm。在菌接种后15 min内贴完纸片。将平板倒扣,放到37℃恒温箱培养24 h后取出,用游标卡尺测量抑菌圈直径。重复以上试验1次,取平均值。在每次测定分离菌种耐药性的同时,测定质控菌株对12种抗菌药物的敏感性,只有当质控菌株的敏感度在允许范围内测试菌株的结果才可确认为准确。结果判断:抑菌圈直径在15 mm以上为高敏,抑菌圈直径在10～14 mm为中敏,抑菌圈直径在10 mm以下为耐药。
mm
mm、%
3 结果
3.1 病料采集结果
在干海乡杨氏鸡苗场,大群鸡精神状态不好,粪便不成形,有3只病死鸡。通过解剖,其中两只鸡包心包肝比较严重,另一只肝脏呈绿色,胸肌充血,根据现场情况,初步诊断为大肠杆菌的感染。为了进一步确诊,采取其心脏、血液、粪便送实验室进行检验。
3.2 细菌分离培养及病原形态
经37℃恒温箱培养24 h后,在平板上形成了圆形凸起、光滑、湿润、半透明、灰白色,直径1～3 mm的菌落8个,将其接种于麦康凯培养基上培养24 h,出现砖红色菌落5个,经涂片革兰氏染色镜检,发现呈杆状,两端钝圆,散在成对,颜色呈红色,证明该细菌为革兰氏阴性杆菌。在伊红美蓝琼脂上产生黑色带金属闪光的菌落。在肉汤中培养24 h,呈均匀浑浊,管底有黏性沉淀,液面管壁有菌环。
3.3 细菌生化试验结果
由表1可知,所分离的5株大肠杆菌的生化试验结果表明,基本确定所采菌株为大肠杆菌。细菌致病性试验结果。
试验组小白鼠基本上都在48 h内死亡,而对照组全部正常生长,说明接种菌株为致病性菌株。从死亡的小白鼠心血中分离到与接种菌培养形态相同的细菌,确定小白鼠死亡是由接种菌株所致,从病料中分离的菌株均为致病性大肠杆菌。
3.4 细菌血清学检测结果
见表3。
3.5 药敏试验结果
见表4。
3.6 耐药性分析
见表5。
4 讨论与小结
4.1 血清学试验结果
结果说明本地区大肠杆菌血清型是比较传统的常见血清型O1、O2、O78,并进一步证明所分离菌株为大肠杆菌。
4.2 药敏试验总结
5株致病性大肠杆菌对红霉素、氨苄青霉素耐药率达80%;对庆大霉素四环素、土霉素、链霉素、氟苯尼考耐药率达到100%,说明该鸡场大肠杆菌已对四环素、土霉素、链霉素、红霉素、氧氟沙星等药物已经产生严重的耐药性,因此在该鸡场不应采用这些药物进行大肠杆菌病的防治。但对阿莫西林,新霉素100%高度敏感,对磷霉素、头孢曲松也是极为敏感,所以在该地区鸡场应采用阿莫西林、新霉素、磷霉素、头孢曲松等药物进行治疗和预防鸡致病性大肠杆菌病。为了减少耐药菌的产生,应交替用药,最好不要单一使用某种药。由于大肠杆菌病有很多类型,在选择用药上要有针对性。
4.3 大肠杆菌病的合理防治措施
4.3.1 科学的饲养管理:
大肠杆菌是条件性致病菌,如养殖场畜禽密度过大,通风不良,转群应激,突然变换饲料等原因均可导致大肠杆菌病的发生。因此建立科学的饲养管理制度,加强饲养管理,消除诱因,是减少大肠杆菌病发生的有效措施。
4.3.2 加强消毒措施:
养殖场的消毒措施是否得当,能很大程度的影响大肠杆菌病的发生。因此加强环境消毒、畜禽舍及食、水槽的消毒可以有效遏制大肠杆菌病的发生与蔓延。
4.3.3 疫苗预防:
由于大肠杆菌的血清型较多,给该病的疫苗预防工作带来较大难度。因此,在发生大肠杆菌病的养殖场可从发病畜禽中分离致病菌,做成自家大肠杆菌疫苗,结合本场情况制定合理的免疫程序,按时使用疫苗预防接种,才能得到好的防治效果。
4.4 小结
通过本次试验,初步了解了干海乡杨氏生态鸡鸡苗场中常见致病性大肠杆菌的耐药情况,筛选出4个大肠杆菌最敏感的药物,它们是阿莫西林,新霉素和磷霉素,头孢曲松。并且简要的提出了大肠杆菌病的合理防治措施。目前,我县在县委政府的关心和支持下、在畜牧局领导的带领和畜牧局全体职工的努力下,养鸡业不断在发展。做好疾病预防和医治是养鸡业不断发展的重要前提。
摘要：以干海乡一生态鸡鸡苗场中分离得到的鸡致病性大肠杆菌病原菌为试验对象,采用细菌形态学观察以及生化试验、动物试验和血清学试验等方法,表明所分离到的5个菌株为致病性大肠杆菌。用氨苄青霉素、庆大霉素、四环素、磷霉素、新霉素、土霉素、链霉素、红霉素、氟苯尼考、氧氟沙星、头孢曲松、阿莫西林等12种药物对5个不同菌株进行药敏试验比较。结果表明:5个菌株均对新霉素、阿莫西林、头孢曲松和磷霉素高度敏感。对庆大霉素、四环素、土霉素等抗菌药物耐药性极强。
抗病性鉴定 篇9
1 材料与方法
1.1 细胞与病毒的分离鉴定
Vero细胞由山东畜牧兽医职业学院保存, 其生长液为含10%胎牛血清的DMEM (p H7.2) , 细胞维持液为含2%胎牛血清的DMEM (PH7.2) 。病料来源于寿光市某动物门诊, 经诊断试纸确诊为感染犬瘟热, 采集死亡犬的肝脏、脾脏、淋巴结等器官组织一部分保存于-80℃备用, 剩余组织剪碎研磨后与PBS缓冲液以1:10混合, 反复冻融3次, 于5000r/min在4℃下离心10min, 取上清液, 再放入离心机以12000r/min在4℃下离心20min。取上清液以0.22ul滤器过滤后接种于Vero细胞培养, 37℃2h后换为维持液, 同时设有空白细胞对照组。将出现病变的细胞培养液、CDV阳性血清和无血清培养物进行双向琼脂扩散, 同时设置对照组, 将出现稳定病变的病毒以终点稀释法将病毒液 (第4代) 按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释接种于24孔板, 每个梯度重复3孔, 收集病变的细胞孔培养液, 冻融3次后再接种细胞作扩大培养。
1.2 分离病毒的理化特性测定
将初步培养纯化的病毒接种Vero细胞后9d收获病毒, 冻融3次后在4℃下12000r/min离心15min, 取上清液保存于-80℃冰箱中。将病毒液的p H调至9.0后在37℃下作用2h, 再用0.5%HCI调节p H至7.2左右, 每孔加入100µl的DEME (2%FBS, p H7.4) 作10倍梯度稀释, 每个稀释度重复3孔, 于37℃下培养并观察细胞病变以判断病毒的耐碱性。将病毒液用0.5%HCI调p H至4.5, 37℃作用2h后, 再用1.4%Na HCO3调p H到7.2左右, 其余操作同上, 确定病毒的耐酸特性。将病毒液稀释至10-6, 56℃下作用30min后, 接种新长满单层细胞的96孔板, 每个梯度12孔, 并在37℃下培养观察, 同时设有对照组。
1.3 分离病毒的血凝性测定
将病毒液做倍比稀释至1:640后分别吸取25µl滴加于96孔V型板中, 依次加入25µl生理盐水和50µl 1%鸡红细胞混匀, 于4℃和37℃下作用1-2h后观察血凝性, 并设对照孔。按同样的方法, 观察病毒对绵羊和兔子红细胞的血凝性。结果判定标准:++++:为100%凝集, 红细胞均匀铺于孔底, 呈伞状或荷叶状卷边。+++:为75%凝集, 与上基本相同, 但边缘有少量红细胞小凝块。++:为50%凝集, 红细胞呈圆盘状沉于孔底, 周围有明显小凝块。+:为25%凝集, 红细胞沉于孔底, 周围有少量小凝块。-:为不凝集, 红细胞沉于孔底, 呈圆点状。
1.4 分离病毒的TCID50测定
在经胰酶消化后长满的单层Vero细胞中加入含10%FBS的DMEM充分吹打均匀, 放置于37℃培养, 取100µl经10倍梯度稀释的病毒液进加入上述长成的单层细胞中, 并设定对照, 在37℃吸附1h后补足营养液并培养。逐日观察记录病变至10d后, 按照Reed-Muech法计算分离病毒的TCID50。按照同样的方法计算接毒细胞在2d、4d、7d、9d和12d的TCID50。
1.5 分离病毒的致病性试验
选1月龄未免疫经诊断为阴性的健康幼犬8只, 分为4组, 每组2只, 隔离饲养。第1-3组为试验组, 分别注射滴度为1×105.0TCID50、3×105.0TCID50、6×105.0TCID50病毒液1ml, 第4组为空白对照组。接毒后每日测体温2次并观察临床症状, 出现症状并死亡后立即采集肺脏、肝脏和脾脏, 浸泡于10%的甲醛中, 用于病理切片, 同时取膀胱粘膜上皮细胞, 自然干燥后用甲醇固定3min, 苏木精染色20min, 0.1%伊红染5min, 干燥后检查包涵体, 同时检测发病犬的眼睛和鼻中浆性分泌物。
2 结果
2.1 病毒的分离培养
将病毒液接种于Vero细胞上, 在37℃培养下约第5d开始出现CPE, 细胞逐渐圆缩、折光性增强, 第6-7d的CPE范围扩大, 呈现空泡化, 第8d开始出现细胞拉网脱落, 第9-11d细胞出现大面积拉网脱落。琼脂扩散试验表明, 分离毒株与CDV阳性血清呈清晰的沉淀带, 为强阳性, 将该毒株定名为CDV-sg株。
2.2 分离病毒的理化特性
CDV-sg株在p H7.0~8.0下病毒活性不受影响, 而p H6.0以下和p H9.0以上病毒活力受到一定影响, 说明CDV-sg较耐酸碱, 但是过酸过碱均不利于病毒的生长。该试验接种CDV-sg株病毒液在56℃下作用30min的细胞均未出现CPE, 而未处理的细胞观察10d发现各稀释度的细胞均出现不同程度的CPE, 可知CDV-sg株对温度敏感, 30min就可将其灭活。
2.4 分离病毒的血凝试验
鸡、兔、绵羊红细胞与各稀释度的CDV-sg病毒液与在37℃分别作用1-2h, 红细胞均沉于孔底, 呈圆点状, 表明CDV-sg对鸡、兔、绵羊红细胞等均具备有血凝性。
2.5 分离毒株的致病性试验
接种6×105.0TCID50的2只犬临床症状明显, 第4~7d出现体温呈双相热、-食欲废绝、眼角有脓性分泌物, 最终衰竭死亡, 其中一只病死犬呈角弓反张势;接种3×105.0TCID50的两只犬均出现精神沉郁、厌食, 于接种后7d出现轻微的体温升高, 但未死亡;接种1×105.0TCID50的两只犬临床症状不明显, 而未接种的犬均正常。对发病犬只的眼和鼻的脓性分泌物检测为CEV阳性。将死亡的犬进行剖检, 发现肺尖出血、肝肿和淋巴结肿大、腹腔积液、肠系膜充血脱落。病理切片显示肺泡结构消失, 有大量的炎性细胞, 肺泡壁增厚, 上皮细胞中出现包涵体;脾小体坏死, 脾小梁平滑肌变性, 内皮细胞出现包涵体。
3 讨论
CDV虽然具有脂囊膜, 但易被光和热灭活, 对环境的抵抗力也较弱, 病毒的分离成功率很低, 所以病料采集的部位、时间、样品的处理方式、发病动物的病程类型和抗体水平等因素都会影响病毒的分离。据报道分离培养CDV的传代细胞系包括非洲绿猴肾细胞系 (Vero) 、猫胚胎细胞系 (FE) 、犬肾细胞系 (MDCK) 、猫肾细胞系 (CRFK) 等细胞, 但传代细胞具有传代不稳定的缺点, 易发生毒力降低或细胞病变等现象。目前研究中培养CDV最常用的传代细胞是Vero细胞, Vero细胞在接种后逐日可观察到细胞变圆, 胞质内颗粒增多, 胞浆空泡化, 部分细胞坏死、脱落, 呈拉网状等现象。病毒纯化一直是病毒研究中的难点, 病毒纯化方法归结起来主要有物理和化学的方法, 而不损害病毒粒子活性才是纯化的关键。
CDV病毒的抵抗力不强, 对热和干燥敏感, 50~60℃经30min可灭活, 炎热季节CDV在犬群中不能长期存活, 但在-10℃可存活几个月, 在-70℃或冻干条件下能长期存活, 这是CD多流行于冬春季节的最主要原因。CDV属于RNA病毒, 对热和干燥敏感, 对环境的抵抗力弱, 0℃以上感染力减弱, 10℃感染力能迅速丧失, 且极易被32℃以上的高温和可见光灭活。CDV的分离比较困难, 采样的时间、部位、样品处理、病程的类型等因素对病毒的分离都有一定的影响。为了防止脏器中RNA酶对CDV的降解, 本试验在患病犬死后立即采取新鲜脏器, 并马上接种于vero细胞中进行分离培养。虽有报道犬肺巨噬细胞 (DLM) 对CDV的初次分离非常有效, 但DLM的分离和培养较难, 容易受到污染, 不利于试验的进行, 而Vero细胞对大多数动物病毒具有广嗜性, CDV能在该细胞上进行复制, 因此本试验采用Vero细胞对CDV进行分离培养。
本试验中接种6×105TCID50的试验犬于接种后4-6d出现体温升高, 在第一次发热后6~8d再次出现体温升高, 与田克恭、遇秀玲报道的一致。而本次试验通过犬出现食欲废绝、鼻卡他、体温呈双相热、腹泻, 眼、鼻出现脓性分泌物, 剖检见病犬肺尖出血、肝脏肿大、淋巴结肿大、腹腔有积液、肠系膜充血脱落、脾脏边缘出血梗死等病变, 病理切片还观察到了肺脏、肝脏和脾脏的明显病变均显示了典型的临床症状。
参考文献
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