抗病类基因（精选5篇）
抗病类基因 篇1
黑豆为豆科植物大豆[Glycine max (L.) merr]的干燥种子, 又称菜豆, 是重要的农作物之一, 与人们的生活息息相关。我国各地均有栽培, 尤以山西、河北、陕西较多, 资源优势明显。黑豆营养成分丰富, 陈颖等[1]对黑豆的营养成分进行分析, 发现黑豆不仅蛋白质含量高达45.70%, 其亚油酸和亚麻酸的含量也相当高, 不仅如此, 黑豆维生素E的含量为0.021 9 mg/g, 抗氧化能力极强。丛建明[2]对黑豆营养成分分析研究发现, 黑豆蛋白质含量高于40%, 脂肪含量高达15.9%, 脂肪酸主要成分为不饱和脂肪酸, 微量元素及维生素含量丰富。黑豆除营养成分丰富以外, 还含有花色苷等抗氧化剂和红色素等稳定性较好的色素, 宋岩[3]对黑豆花色苷的研究发现, 黑豆花色苷抗衰老作用明显, 并且具有较强的抗氧化作用。近年来, 还发现具有抗癌作用的黄酮类物质在黑豆中含量仅次于野生大豆[4]。黑豆医食价值优越, 但是病虫害严重威胁黑豆的产量, 而农药的使用会对生态环境造成威胁。因此, 抗病品种的选育成为解决这一问题的重要途径。随着分子生物学的深入研究, 分离克隆黑豆抗病基因对了解病害的发生机制和植物抗病分子机理有着非常重要的作用。
目前, 科学工作研究者们相继克隆了香蕉、甘薯、大豆及辣椒等大量植物抗病基因及其同源序列[5,6]。根据目前已克隆的植物抗病基因保守结构域的特征, 可分为四大类[7], 其中最大的一类为NBS-LRR类, NBS包含P-loop环、Kinase-2、Kinase-3激酶结构域及HD疏水结构域。NBS类保守序列已被用于从不同植物基因组中发掘新的抗病基因, 赵敬等从辣椒中分离出17个NBS-LRR类抗病基因同源序列, 这些序列都含有NBS-LR类基因的6个保守结构域, 其中基因Ca RGA01与来自番茄Solanum lycop-ersicum抗细菌性斑点病基因Bs4相似性为90%, 基因Ca RGA13与来自番茄Solanum sp.VFNT抗线虫基因Mi-1.4相似性为90%和91%, 推测这2个序列可能是相关抗病基因的一部分或与相关抗病基因属于同一家族[8]。王海燕等利用已克隆的抗病基因NBS-LRR保守结构域设计引物, 通过RT-PCR, 获得了3条通读的NBS-LRR类抗病基因同源序列, Northern杂交分析表明, 3个NBS-LRR类抗病基因同源序列在小麦的叶片中为低丰度组成型表达[9], 为从较为复杂的基因组中克隆出抗病基因打下了基础。王春玮[10]利用NBS-LRR基因家族的保守序列设计引物, 通过RACE-PCR获得了2个花生NBS-LRR类抗病基因的全长Pn AG1-1和Pn AG1-2, Pn AG1-2全长1 344 bp, 开放阅读框为1 098 bp, 编码365个氨基酸。Pn AG1-1全长1 088 bp, 开放阅读框为741 bp, 编码247个氨基酸。黑豆为四倍体, 其基因组比烟草、水稻等模式植物复杂, DNA及RNA提取难度大, 因此目前尚未见从黑豆中克隆出NBS-LRR类抗病基因的报道[11]。笔者根据P-loop和HD 2个保守结构域设计兼并引物, 利用RT-PCR从湖南黑豆 (HH) 中克隆出4个抗病基因同源序列, 其中2个片段可通读, 并分析其与其他抗病基因和抗病基因同源序列的关系, 以期为黑豆NBS类抗病基因的克隆打下基础。
1 材料与方法
1.1 试验概况
室内试验于2012年在福建农林大学生物楼进行。供试黑豆品种为湖南黑豆 (HH) , 由福建农林大学实验室提供。
主要试剂及仪器:大肠杆菌DH5α由该实验室保存。p MD18-T载体、限制性内切酶、Taq酶、反转录试剂盒和胶回收试剂盒均购自Ta Ka Ra公司;氨苄青霉素 (Amp) 购自生物工程有限公司 (Sangon) ;进口电泳琼脂糖 (Agarose) ;其他试剂国产分析纯。PCR反应在eppendorf公司Mastercycler®PCR扩增仪上进行;琼脂糖凝胶电泳检测在北京市六一仪器公司的DYY-6C型电泳检测仪上进行。
1.2 试验方法
1.2.1 黑豆总RNA的提取及c DNA第一链的合成。
黑豆总RNA的提取 (改良的Trizol法) :RNA提取采用Ta Ka Ra公司购买的RNA提取试剂盒说明书的方法。RNA的浓度和纯度检测:RNA的浓度和纯度用紫外分光光度计检测, 同时用1.0%的琼脂糖检测RNA的完整性。合成c DNA第一链:以黑豆嫩叶RNA为模板, 用购自Ta Ka Ra公司的反转录试剂盒合成c DNA第一链, 过程按Ta Ka Ra公司c DNA第一链合成说明书进行合成。
1.2.2 RT-PCR方法分离黑豆抗病基因同源序列。
以HH的c DNA第一链为模板进行扩增。试验引物根据已克隆的R基因的NBS-LRR的保守结构域设计, 其序列如表1。PCR反应体系为25μL, 包含2.5μL 10×PCR buffer, 1μL模板DNA (30 ng/μL) , 1μL引物 (10 pmol/μL) , 1μL d NTP (10 mmol/L) , 和5 U Taq DNA聚合酶。反应程序为:94℃预变性5 min, 35个循环为94℃变性45 s, 50℃退火50 s, 72℃延伸90 s, 最后72℃延伸10 min。
1.2.3 NBS类抗病基因同源片段的测序和分析。
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳, 目的片段采用PCR fragment recover kit回收纯化。连接PMD-18T载体, 转化大肠杆菌DH5α, 选取阳性菌落提取质粒, 测序委托上海生工完成, 同源检索和序列分析采用NCBI和DNAMAN等软件完成。
2 结果与分析
2.1 黑豆NBS-LRR类RGAs的分离与鉴定
采用Ta Ka Ra公司的RNA提取试剂盒提取黑豆品种HH的RNA, 用紫外分光光度计测定RNA的吸光值得出, OD260/OD280比值为2.08 (图1) , 琼脂糖凝胶电泳检测, 观察到28S、18S及5S共3条带, 并且RNA无DNA污染。结果表明RNA符合RT-PCR的要求, 以提取的HH的RNA为模板, 用Ta Ka Ra公司的反转录试剂盒合成c DNA, 再进行PCR, 得到1条500 bp左右的片段 (图2) , 结果表明获得的片段处于抗病基因的编码区。
注:1、2为福建黑豆。
2.2 黑豆NBS-LRR类抗病基因同源序列的测序和氨基酸序列及疏水性结构分析
根据设计的引物F1/F2, 利用RT-PCR从湖南黑豆 (HH) 中扩增出与预期相同的500 bp左右的片段, 连接PMD-18T载体后, 转化大肠杆菌DH5α, 经蓝白斑筛选, 挑选阳性克隆, PCR检测后, 选取20个样品测序, 得到了4个片段, 大小在500~540 bp。利用DNAMAN 6.0软件对4个片段进行分析, 其中2个序列可通读并且含有NBS类抗病基因保守结构域, 并命名为FNBS1、FNBS3, 另外2条片段含有终止子, 并命名为FZP2、FZP4。
2.2.1 黑豆基因FNBS1及FNBS3氨基酸序列分析。
黑豆抗病基因同源序列FNBS1及FNBS3均为通读的开放阅读框, FNBS1序列大小为534 bp, 编码178个氨基酸, FNBS3大小为513 bp, 编码169个氨基酸。在NCBI上进行BLAST发现, 在FNBS1蛋白中含有1个P-loop-NTPase超家族, 2个片段均含有NB-ARC结构域;并且包含P-loop、Kinase-2、Kinase-3、HD等NBS类抗病基因特有的结构域 (图3) , 从图3可以看出, FNBS1属于non-TIR类, 而FNBS3属于TIR类。结果表明, 黑豆中含有non-TIR与TIR等2类NBS类抗病基因。
2.2.2 黑豆FNBS1及FNBS3基因编码蛋白质的疏水性分析。
利用DNAMAN 6.0对黑豆FNBS1氨基酸序列的疏水性分析见图4。从图4可以看出, FNBS1基因在第3、30、43、51、74、84、122、144位氨基酸附近有明显的疏水结构域, 但还是亲水性较强, 从第168位氨基酸残基开始疏水性明显增强, 并且无亲水性, 这是NBS-LRR类抗病基因结构域 (HD) 存在的区域。FNBS3 (图5) 与FNBS1的输水结构域图相近, 与FNBS1的疏水性类似, 证明NBS-LRR类抗病基因同源序列保守结构域HD是疏水性的。
2.3 黑豆NBS类RGAs与其他植物抗病基因及其同源序列的氨基酸序列同源性分析
将黑豆NBS-LR类RGAs与搜索到的序列进行同源性分析, 进行对比的序列来自Genbank数据库, 甘薯中的TIR-1和TIR-2、大豆中的N-like (XP_003522161) 和RPM1-like (XP_003534302) 、烟草的N基因、亚麻的L6基因和拟南芥的RPS2基因。利用DNAMAN软件, 对黑豆NBS类抗病基因同源序列FNBS1、FNBS3与Genbank登陆的已知抗病基因同源片段进行比对 (图6) , 结果表明:基因FNBS1与大豆基因RPM1-like编码的氨基酸序列的同源性为98%, 基因FNBS3与大豆基因N-like编码的氨基酸序列的同源性为99%, 2个序列与拟南芥的同源性最低。表明双子叶植物抗病基因及同源序列同源性较高, 而与单子叶的同源性较低。
2.4 黑豆NBS-LRR类RGAs编码的氨基酸序列的系统发育树分析
利用DNAMAN 6.0软件对黑豆与拟南芥、甘薯、大豆等植物抗病基因及其同源序列进行系统发育树分析, 结果表明:黑豆NBS-LRR类抗病基因同源序列FNBS1与大豆的基因RPM1-like编码的氨基酸序列的亲缘关系最近, 与甘薯TIR-2基因亲缘关系较近;基因FNBS3与大豆的基因N-like编码的氨基酸序列的亲缘关系最近。FNBS1和FNBS3相比, FNBS3与烟草、亚麻的亲缘关系更近, 2个序列FNBS1、FNBS3与拟南芥亲缘关系最远 (图7) 。
3 结论与讨论
3.1 黑豆RGAs的分离与鉴定
随着生物技术的发展, 除传统的图位克隆法与转座子标签法外, 利用NBS-LRR类抗病基因保守结构域设计引物, 再克隆得到抗病基因的手段也得到运用。目前, 有大量NBS-LRR类抗病基因及抗病基因同源序列被克隆出来, 本试验利用已报道的植物抗病基因NBS-LRR区保守结构域设计简并引物, 通过RT-PCR扩增, 成功地从湖南黑豆的c DNA中分离得到2个可以通读并且具有NBS-LRR类抗病基因保守结构域的片段FNBS1和FNBS3, 表明序列FNBS1与FNBS3可能处于基因的编码区。另外, 还克隆出2条未知的片段, 大小为510 bp左右, 编码的氨基酸中含有终止子, 不予分析。
3.2 黑豆RGAs的核苷酸序列和氨基酸序列分析
利用DNAMAN 6.0软件对黑豆NBS-LRR类抗病基因同源片段进行分析, 发现2个片段中存在较多的疏水性氨基酸, 但整个蛋白质序列亲水性较强, 在第160位氨基酸后, 疏水性明显增强, 这可能与NBS-LRR类抗病基因保守结构域的疏水结构HD有关。FNBS1与FNBS3氨基酸序列分析表明, 2个序列包含P-loop、Kinase-2、HD等结构域, 并且FNBS1属于non-TIR类而FNBS3属于TIR类抗病基因, 说明黑豆中含有non-TIR与TIR 2类NBS类抗病基因, 这与前人已报道的双子叶植物含有non-TIR类和TIR 2类NBS类抗病基因相符;2个片段均具有NB-ARC结构域 (与植物抗病有关) 。2个序列的同源性分析结果表明:FNBS1与大豆抗病蛋白基因RPM1-like同源性为98%, FNBS3与大豆基因N-like的同源性为99%, 这表明这FNBS1、FNBS3可能是这些抗病基因的同源序列或者其中的某个功能片段。
本研究首次对黑豆中RGAs进行分离研究, 并对其序列进行了初步探讨, 还有许多问题有待进一步研究, 如分离得到的RGAs与黑豆抗病基因的关系等。
摘要：根据已克隆的抗病基因保守结构域设计简并引物, 以湖南黑豆 (HH) 为试材, 通过RT-PCR, 从cDNA中扩增抗病基因同源序列, 测序鉴定出2个含有通读阅读框的DNA片段:FNBS1、FNBS3。FNBS1大小为534 bp, 编码178个氨基酸;FNBS3大小为513 bp, 编码169个氨基酸。BLASTP分析表明, 2个片段均具有NB-ARC结构域 (与植物抗病有关) , 并且包含P-loop、Kinase-2、HD等结构域。基因FNBS1与大豆基因RPM1-like编码的氨基酸序列的同源性为98%, 基因FNBS3与大豆基因N-like编码的氨基酸序列的同源性为99%, 推测FNBS1、FNBS3可能是黑豆NBS-LRR类抗病基因的核心区域。
关键词：黑豆,NBS-LRR,抗病类基因,同源克隆,聚类分析
参考文献
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[11]石松青.大豆NBS类抗病基因同源片段的克隆及遗传转化的初步研究[D].福州:福建农林大学, 2013.
抗病类基因 篇2
抗真菌转基因大豆对大豆疫霉根腐病抗病性鉴定
采用下胚轴伤口接种法,对Southern杂交阳性的.转菜豆几丁质酶基因和大麦核糖体失活蛋白基因的双价转基因大豆T2代的5个株系,进行了大豆疫霉根腐病抗病性检测,并通过比较接种后转基因大豆与对照组的死亡率来探讨两者的抗病性差异.结果表明,有4个转基因株系对大豆疫霉根腐病的抗性与非转基因对照组相比有明显提高,另外1个株系与对照组相比没有明显差异.
作 者：郭玉双 张艳菊 朱延明 刘佳 李杰 柏锡 张淑珍 GUO Yushuang ZHANG Yanju ZHU Yanming LIU Jia LI Jie BAI Xi ZHANG Shuzhen 作者单位：郭玉双,朱延明,李杰,柏锡,GUO Yushuang,ZHU Yanming,LI Jie,BAI Xi(东北农业大学生命科学学院,黑龙江,哈尔滨,150030)张艳菊,刘佳,张淑珍,ZHANG Yanju,LIU Jia,ZHANG Shuzhen(东北农业大学农学院,黑龙江,哈尔滨,150030)
刊 名：东北农业大学学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF NORTHEAST AGRICULTURAL UNIVERSITY 年，卷(期)： 37(6) 分类号：S565.1 Q78 S5/59|034| S435.651 关键词：转基因大豆 菜豆几丁质酶基因 大麦核糖体失活蛋白基因 大豆疫霉根腐病 抗病性鉴定大豆抗病基因克隆的研究进展 篇3
Yu等 (1996) 根据烟草N基因和拟南芥RPS2基因的NBS区同源序列设计简并引物, 从大豆中扩增并克隆出11类含NBS序列的片段。同年Kanazin等根据烟草N基因、拟南芥RPS2基因和亚麻L6基因的NBS区同源序列设计简并引物, 从大豆中扩增并克隆出9类大豆抗病基因类似序列。定位分析表明, 这些同源片段成簇分布, 提供抗病基因的潜在位点, 有些还与已知抗病基因连锁。尽管这种方法对于鉴定潜在的基因位点是非常有效的, 但对于其功能的鉴定则是非常困难的。因为抗病基因家族的研究表明其中有些成员是无功能的。因而, 从中分离抗病基因同源序列则可以获得由功能的潜在抗病基因成员[1]。
贺超英等 (2001) 根据烟草抗花叶病毒N基因和拟南芥抗丁香假单胞杆菌RPS2基因设计兼并引物, 从大豆抗花叶病毒品种科丰1号的基因组中扩增获得358个克隆, 鉴定出4个通读的且与抗病基因NBS结构域同源的片段:KNBS1、KNBS2、KNBS3和KNBS4。构建了一个高质量的的大豆c DNA文库, 其滴度为4.2×107pfu/ml;并利用所获得的大豆抗病基因同源片段为混合探针, 进行文库筛选, 获得了两个阳性克隆KR1和KR2[2]。KR1长度为3672bp, 有一个完整的编码框, 编码1124个氨基酸的蛋白;KR2长度为1560bp, 为不完整编码框。KR1在结构上与烟草抗花叶病毒N基因具有较高的同源性。它具有TIR、NBS和LRR一系列抗病基因的分子特征, 因而它可能是大豆中具有功能的类似于N基因的一类抗病基因;同时KR1在羧基端具有两个潜在的跨膜区。从可能的细胞中分区上来看, KR1又是一类新的植物抗病基因。RT-PCR分析表明KR1受大豆花叶病毒 (SMV) Sa菌株接种和水杨酸处理的影响。跟N和L6一样, KR1也可通过不同的拼接形成两种m RNA。在正常情况下, 大片段 (KR1, 609bp) 在抗亲科丰1号中是唯一的转录本;而小片段 (NR1, 588bp) 在感亲南农1138-2中占优势, 大片段 (KR1, 609bp) 的丰度则相对较少。用大豆花叶病毒Sa株系分别接种抗感双亲, KR1和NR1均呈诱导表达。在科丰1号中仅有KR1;在南农1138-2中, KR1/NR1的比例随着SMV接种的时间而变化, 最终KR1占优势。此结果预示着KR1可能是一个新的抗花叶病毒基因, 它的表达受SMV的诱导。
利用所获得的大豆抗病基因同源片段为混合探针, 进行文库筛选, 又获得了两个阳性克隆KR3和KR4, 通过RACE方法获得了全长, 其中KR3长度为3672bp, 有一个完整的编码框, 编码1124个氨基酸的蛋白。KR3与烟草抗花叶病毒N基因具有较高的同源性 (相似度为28.1%) , 具有TIR和NBS等抗病基因具有的保守结构域。KR3的表达受水杨酸诱导, 因此可能是大豆中具有功能的类似N基因的一类抗病基因。KR4全序列为3818bp, 编码1211个氨基酸, 在GenBank中的注册号为AF502080。KR4在结构上与水稻抗白叶枯病基因Xa1有16.0%的相似性, 具有NBS、LRR等抗病基因的结构特征。Southern结果证明KR4在抗病材料科丰1号和南农1138-2中具有多态性, 连锁分析将KR4定位在E连锁群[3]。KR4的表达受水杨酸的诱导, 大豆花叶病毒株系Sa和N3的接种都能够诱导KR4的表达, 因此KR4可能参与大豆抗SMV的过程。
杨秀红 (2005) 根据拟南芥RPS2基因、烟草N基因和亚麻L6基因的保守结构域设计简并引物, 从大豆抗疫霉根腐病品种绥农10号的RNA中扩增获得了100个克隆, 从中鉴定了两个通读的且与抗病基因NBS结构域同源的序列RNEA-1和RNEA-2, 这两个序列长度均为513bp, 编码171个氨基酸, 编码产物在结构上均具有NBS结构域的P-环, Kinase-2a和Kinase-3a区及保守的疏水结构域HD[4]。序列与结构上的同源性表明RNEA-1和RNEA-2为大豆抗病基因同源片段。RNEA-1与从携带有抗疫霉根腐病基因 (Rps2) 的大豆近等基因系中获得的Class D类大豆同源序列在分类上比较近源, RNEA-1与Class D同源性高达91%。Class D被定位在大豆J连锁群上, 与大豆Rps2、rmd基因有关 (Yu, 1996) 。
以RNEA-1为靶序列, 采用RACE技术获得了全长3574bp的大豆抗病相关基因SR1, 该基因包括3411bp的开放读码框, 72bp的5′非翻译区, 68bp的3′非翻译区和20bp的多聚腺普酸尾。在73bp处有ATG起始密码子, 在3484bp处有TAA终止密码子, 编码1137个通读的蛋白质氨基酸序列。SR1基因是NBS-LRR类抗病基因:这类基因的共同特点是, 在它们编码蛋白的近氮端存在着NBS, 而在它们的近碳端则由LRR组成。SR1基因编码产物具有TIR、NBD、LRR等一系列抗病基因的保守结构。TIR结构域是高度同源于哺乳动物和果蝇的信号传导的受体, 可能与激活防卫基因的转录因子有关。与烟草的N基因、亚麻的L6基因及拟南芥的RPP5等基因类似, SR1基因N端有142个氨基酸序列为TIR结构, 可能在抗病反应中起着类似的作用。NBD结构域具有激酶活性, 此结构暗示着它们在发挥正常功能时有可能需要结合ATP或GTP可以激活其它的功能蛋白。LRR结构被认为在蛋白质的相互作用中起重要作用, 它不仅参与抗病反应的识别, 还与识别以后的抗病信号的传导有关。胞质LRR的保守序列模式为"Lxx Lxx Lxxxx CxxL", SR1基因的LRR区含有此保守序列, 可能位于胞质。
丁海等 (2003) 根据已知抗病基因的NBS保守序列区设计4对简并引物和1对特异引物, 以大豆农家种兴县灰布支黑豆为材料, 应用PCR方法获得了11条来自基因组DNA的RGA序列和2条来自c DNA的RGA序列, 序列长度在500-633bp之间, 其中8条来自基因组DNA和2条来自c DNA的RGA序列已在GenBank登录。这些序列都不同程度的含有NBS保守区的P-环 (GGVGKTT) , kinase-2 (VLDD) , kinase-3 (GSRII) 及跨膜区GLPL等特征结构的序列, 由此推导出的氨基酸序列同已知抗病基因L6, RPM1, RPS2, N编码的氨基酸序列表现出从25%~42%的同源性[5]。
Bhatta (2005) Rps1k位点, 克隆得到高同源性的四个基因Rps1k-1、Rps1k-2、Rps1k-3和Rps1k-4, 编码蛋白的保守结构域为CC-NBS-LRR[即卷曲结构 (Coiled Coil) 、和核苷酸结合位点 (Nucleotide Binding Site) 结构域、亮氨酸重复序列 (Leucine-Rich Repeat) ], 按照序列特征分类可分为两类:其中Rps1k-1, Rps1k-3和Rps1k-4为一类, Rps1k-2为第二类。经转基因验证Rps1k-1具有抗大豆疫霉根腐病功能[6]。
Lightfoot实验室从Forrest的BAC克隆73P6和100BI0中获得了Rhg1和Rhg4的全长c DNA序列, 随着这两个基因的克隆成功, 以及根据基因序列相应设计引物的合成, 相信会使人们对抗性机理有更深刻的理解和认识, 也会使抗大豆胞囊线虫病基因的分子标记辅助鉴定成为现实。
综上可知大豆中已有多个抗病基因被克隆, 为抗病机制研究奠定了基础。
面顶住工件, 增大摩擦力, 甚至把工件顶弯, 造成啃刀现象;过低, 则切削不宜排出, 车刀径向力的方向是工件中心, 加上横进丝杠与螺母间隙过大, 致使吃刀深度不断自动趋向加深, 从而把工件抬起, 出现啃刀。此时, 应及时调整车刀高度, 使其刀尖与工件的轴线等高 (可利用尾座顶尖对刀) 。在粗车和半精车时, 刀尖位置比工件的中心高出1%D左右 (D表示被加工工件直径) 。
2.2工件装夹不牢
工件本身的刚性不能承受车削时的车削力, 因而产生过大的挠度, 改变了车刀与工件的中心高度 (工件被抬高了) , 形成切削深度突增, 出现啃刀, 此时应把工件装夹牢固, 可使用尾座 (上接118页) 11751-11757.
[2]贺超英, 张志永, 陈受宜.大豆NBS类抗病基因同源序列的分离与鉴定[J].科学通报, 2001
摘要：抗病基因是在植物抗病反应过程中起抵抗病菌侵染及扩展的有关基因, 其是Flor经典遗传学基因对基因 (gene-for-gene) 假说中与病原菌无毒基因相对应的一类基因。它存在于植物特定品种中, 在植物生长周期或其中某个阶段进行组成型表达。随着生物技术发展已成功克隆许多大豆抗病基因, 使抗病基因工程出现了质的飞跃。
关键词：大豆,抗病基因,克隆
参考文献
[1]Yu Y G, Buss G R, Saghai-Maroof M A.Isolation of a Supperfamily of Candidate Dis-ease-Resistance Genes in Soybean Based on a Conserved Nucleotide-Binding Site.Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:11751-11757.
[2]贺超英, 张志永, 陈受宜.大豆NBS类抗病基因同源序列的分离与鉴定[J].科学通报, 2001, 46 (12) :1017-1021.
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抗病类基因 篇4
关键词：慢性乙肝,乙肝病毒,基因型,恩替卡韦
乙型病毒性肝炎为世界性传染疾病,其发病原因为乙肝病毒(HBV)感染,可引起多器官损害,严重危害人体健康。中国是乙肝广泛流行地区,虽经多年宣教和乙肝疫苗免疫管理,中国乙肝感染率与过去相比已显著下降,但血清学调查显示,2014年中国乙肝感染率为4.38%[1],仍处于较高水平,需要积极防治。该院近年来以恩替卡韦对乙肝患者行抗病毒治疗取得良好效果,文章现以2014年5月—2016年6月于该院接受治疗的50例慢性乙型肝炎患者为例进行分析和探讨,现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
随机选取于该院接受治疗的50例慢性乙型肝炎患者为研究对象,患者入院时多表现为食欲不振、乏力疲劳、上腹不适、肝区隐痛等症状,通过血清学检查乙肝病毒标记物,临床判定患者病症均符合《慢性乙型肝炎防治指南》[3]中关于慢性乙型病毒性肝炎的相关诊断标准。该次研究入选病例均江苏盐城地区居民,患者年龄35~67岁,平均年龄(52.4±6.4)岁。病例入选标准:1HBs Ag阳性≥6个月;2乙肝病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)>1 005 cps/m L;3治疗周期≥48周。病例排除标准:1合并其它类型肝炎;2合并酒精性肝病或肝脏代谢障碍性疾病;3合并药物性肝损害;4HIV感染;5病毒用药史;6恩替卡韦过敏者。所有患者治疗前均签署知情同意书,对此次临床研究知情同意。
1.2方法
治疗前全部患者均行乙肝HBV基因分型检测。治疗期间以恩替卡韦(国药准字H20100064)进行抗病毒治疗,0.5 mg/次,1次/d,空服口服。用药期间,患者不使用拉米夫定等其他抗病毒药物,单纯行保肝、纠正水电解质平衡、防治并发症等常规治疗。治疗前和连续治疗第48周以后,分别以全自动化学发光免疫分析仪检查患者HBe Ag等乙肝5项,以荧光定量聚合酶链式反应(PCR法)定量检查HBV-DNA,以全自动生化分析仪及配套试剂测定患者谷丙转氨酶(ALT)水平,分析恩替卡韦抗病毒疗效及其与HBV基因型间的关系。
1.3 HBV基因分型
HBV基因分型能够反映原型病毒株之间的自然特异性。该次临床研究所用基因分型以全基因序列为金标准[5],基于全基因核苷酸序列比较,根据全基因核苷酸序列异源性≥8%的原则,将HBV基因分为A~H 8个类型。
1.4疗效判定标准
1HBe Ag转阴:HBe Ag<1.0 COI;2HBV-DNA定量检查正常值100 cps/m L;阴性<1 000 cps/m L;3ALT正常参考值:0~40 U/L[4]。
1.5统计方法
全部数据均以SPSS 19.0统计学软件进行统计分析,计数资料以[n(%)]表示,采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 HBV基因分型
50例患者的乙肝HBV基因分型检测结果显示,C基因型乙肝患者37例,占病例总数的74.0%,其他基因型乙肝患者13例,共占病例总数的26.0%,提示江苏盐城地区HBV主要基因型为C型。
2.2抗病毒疗效比较
C基因型乙肝患者HBe Ag阴性率为26例(70.27%)和其他基因型乙肝患者抗病毒治疗前的HBe Ag阳性率为92例(69.23%)且HBV-DNA定量值和ALT水平差异无统计学意义(P>0.05),详见表1。
经恩替卡韦抗病毒治疗后,C基因型患者HBV-DNA低于检测下线率明显高于其他基因型,差异有统计学意义(P<0.01);C基因型患者ALT复常率、HBe Ag转阴率和HBe Ag血清学转换率则高于其他基因型,差异有统计学意义(P<0.05),详见表2,提示恩替卡韦对C基因型HBV的抗病毒疗效优于B其他基因型HBV,适合在盐城地区使用并推广。
3讨论
不同HBV基因型的核苷酸序列存在差异,通过全基因序列测定、S基因序列测定、ELISA、PCR-RFLP等分型法,HBV基因可分为A~H型,共计8种。研究发现,HBV基因分布在世界范围内呈明显地域特点,在我国区域间分布也具有明显差异性,如北方HBV基因分型以C型为主,南方多见于B型,D型分布于西北少数民族区域,其他类型则十分少有或尚未发现[5]。江苏盐城地区地处长江三角洲北翼,其地理位置虽处于长江以北,但属中国HBV基因C型和基因B型过渡地带。该次研究入选病例均为江苏盐城当地居民,乙肝HBV基因分型检测结果显示,50例患者中有37例为HBV基因C型(74.%),11例为HBV基因B型(22%),其他类型基因2例(4.0%),提示江苏盐城乙肝患者以HBV基因C型者居多,与国内关于北方HBV基因C型居多的报道结论一致。
合理使用抗病毒药物抑制HBV复制是现阶段临床治疗慢性乙肝的首选方法,常用抗病毒药物为干扰素和核苷(酸)类似物。近年临床研究发现,乙肝抗病毒疗效除了与患者免疫状况有关外,也与HBV不同基因型的基因特征有关[6]。该次临床选用恩替卡韦对乙肝进行抗病毒治疗,该品为鸟嘌呤核苷类似物,可通过磷酸化成为三磷盐酸,实现对HBV多聚酶的抑制功效,具有抗病毒起效快、作用强等优势,不仅安全性高,且耐药率低,具备长期服用疗效。此次临床研究结果显示,以此治疗HBV基因C型乙肝患者,其疗效优于其他基因类型乙肝患者,HBV-DNA低于检测下线率30例(81.08%),ALT复常率34例(91.89%),HBe Ag转阴率12(38.71%),HBe Ag血清学转换率6(16.22%),各项指标均优于其他基因型乙肝患者(P<0.05),与街小霞[7]报道的HBV-DNA低于检测下线率(82.52%)和ALT复常率(90.92%)基本一致,略低于谷茂林[8]报道的HBe Ag转阴率(45.86%)和HBe Ag血清学转换率(27.52%),但不影响研究有效性,考虑HBV基因型可能对核苷(酸)类似物的抗病毒疗效存在影响,但各研究入选病例的特性和研究方法存在差异性。
此次临床研究表明,江苏盐城地区乙肝病毒主要基因分型为C型,以恩替卡韦对该分型患者进行抗病毒治疗,其效果优于其他基因分型患者,值得在本地乙肝抗病毒临床治疗中使用推广。
参考文献
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抗病类基因 篇5
到目前为止, 大多数实验室都采用大肠杆菌系统对鸡Mx蛋白进行表达[5,6]。该表达系统虽然具有遗传背景清楚、所需成本相对低等优点, 但存在表达产物缺乏翻译后加工, 得到的蛋白质可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性等缺点。而巴斯德毕赤酵母是一种使用广泛的外源表达系统, 它具有高效表达、高稳定、高分泌等特点, 而且可以对表达产物进行类似真核细胞的翻译后修饰和加工等。试验利用酵母表达系统表达鸡抗病毒Mx蛋白, 实现了该蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达, 进而为鸡抗病毒Mx蛋白基因的进一步研究和应用奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒与菌株
鸡抗病毒Mx蛋白基因真核表达质粒pcDNA-MMx, 由动物遗传繁育与分子设计江苏省重点实验室构建;大肠杆菌DH5α感受态细胞、酵母表达载体pPIC9K、宿主菌GS115, 由动物遗传繁育与分子设计江苏省重点实验室保存。
1.1.2 主要试剂
各种限制性内切酶、DNA聚合酶、TaKaRa LA TaqTM、pMD19-T Simple载体试剂盒、低分子质量蛋白标准, 均为宝生物工程 (大连) 有限公司产品;DNA回收试剂盒、T4 DNA连接酶, 购于MBI公司;胰蛋白胨、酵母浸出粉, OXID公司产品;特异性引物, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;其他试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 目的基因片段的扩增
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游引物P1 5′-GC-TACGTAATGAACAATCCATGGTCC-3′ (下划线部分为SnaBⅠ酶切位点) , 下游引物P2 5′-TTGCGGCCGCTTACAGAGACTTAAAGTC-3′ (下划线部分为NotⅠ酶切位点, 斜体为酵母偏爱终止密码子) 。
以pcDNA-MMx为模板扩增出鸡抗病毒Mx蛋白编码序列。PCR反应体系: 10×LA PCR Buffer (Mg2+ Plus) 5 μL, dNTPs Mixture (各2.5 mmoL/L) 4 μL, 引物P1、P2 (10 μmoL/ L) 各1.5 μL, pcDNA-MMx质粒模板1 μL、TaKaRa LA TaqTM (5 U/μL) 0.5 μL, 加灭菌纯化水至50 μL。反应条件:94 ℃预变性10 min ;94 ℃变性40 s, 52 ℃退火40 s , 72 ℃延伸150 s, 共30个循环;72 ℃延伸10 min。扩增产物经0.8 %琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收目的片段, 将回收后的目的片段与pMD19-T Simple载体连接, 用连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 挑取阳性克隆进行PCR、酶切及测序鉴定, 将鉴定正确的质粒命名为pMD-Mx。
1.2.2 重组穿梭质粒pPIC9K-Mx的构建和鉴定
分别用SnaBⅠ和NotⅠ双酶切pMD-Mx质粒并回收目的片段 (Mx基因) , 将其与同样酶切回收的pPIC9K载体16 ℃连接过夜, 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 筛选阳性重组质粒, 经PCR、酶切及测序鉴定后将阳性重组质粒命名为pPIC9K-Mx。
1.2.3 重组表达质粒pPIC9K-Mx的线性化及其电转化
制备酵母菌GS115感受态, 将其与10 μg经SalⅠ酶切线性化的重组表达质粒混合, 转入0.2 cm电击杯中冰浴5 min;用Eppendorf Multiporator®*1于1 500 V、5 ms条件下电转化, 立即向电击杯内加入1 mol/L冰浴山梨醇, 30 ℃静置培养2 h;取200 μL菌液涂于MD平板上, 30 ℃倒置培养2～3 d, 观察其生长情况。
1.2.4 多拷贝整合转化子的筛选
将在MD平板上生长的菌斑用双蒸水重悬, 涂于G418浓度逐步增高 (0.5, 1, 2, 3, 4 mg/mL) 的YPD平板上, 30 ℃培养2～3 d, 筛选出具有高抗性且生长良好的单菌株。
1.2.5 MM (minimal methanol medium) 与MD (minimal dextrose medium) 对比生长试验
将在4 mg/mL G418-YPD平板上生长的单菌落分别点在MM、MD平板上, 30 ℃倒置培养2～3 d, 筛选出His+、Mut+型菌株。
1.2.6 转化子的鉴定
挑取高拷贝单菌落接种至5 mL YPD液体培养基中, 30 ℃培养16～18 h;取1.5 mL菌液离心收集菌体, 弃上清液, 用双蒸水洗涤、离心;取沉淀悬浮于100 μL TE中, 沸水煮5～8 min, 冰浴10 min;离心收集上清液, 以2 μL上清液为模板, PCR鉴定阳性克隆。
1.2.7 表达菌株的诱导表达
将筛选出的高拷贝菌株菌落接种于50 mL BMGY培养液中, 30 ℃振荡培养至OD600值为4～6;离心收集菌体, 弃上清液, 将菌体重悬于原培养液1/5的BMMY中诱导表达, 期间每隔24 h加甲醇1次, 使其终浓度分别保持在0.5%、1%;分别在24, 48, 72, 96, 120 小时取出1 mL培养物, 12 000 r/min离心2 min, 取上清液进行SDS-PAGE检测。
2 结果
2.1 鸡抗病毒Mx蛋白基因的克隆
以P1 (含SnaBⅠ酶切位点) 和P2 (含NotⅠ酶切位点) 为引物, 以真核表达载体pcDNA-MMx为模板扩增鸡抗病毒Mx蛋白基因的编码区 (见图1) 。
M.1 kb DNA Marker;1.Mx 基因PCR产物。
2.2 重组质粒pMD-Mx的构建与鉴定
回收目的片段后与pMD19-T Simple载体连接, 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 挑取阳性克隆参照试剂盒提取质粒, 经SnaBⅠ和NotⅠ双酶切鉴定, 酶切结果见图2。该结果与预期结果一致, 将鉴定正确的质粒命名为pMD-Mx。
1.重组质粒酶切结果;M.1 kb DNA Marker。
2.3 重组穿梭质粒pPIC9K-Mx的构建与鉴定
重组穿梭质粒pPIC9K-Mx的构建结果见图3, pPIC9K双酶切结果见图4, 重组质粒阳性克隆双酶切鉴定结果见图5。构建及测序结果显示, Mx的序列及插入位置正确。
1.pPIC9K酶切;M.1 kb DNA Marker。
1.重组质粒pPIC9K-Mx酶切结果;M.1 kb DNA Marker。
2.4 重组酵母菌株的筛选
将pPIC9K-Mx重组质粒及pPIC9K空载体分别用SalⅠ酶切线性化后, 回收目的产物转化GS115, 经MD、G418梯度筛选及MD与MM平板对比生长试验, 挑选出生长快并且菌落饱满的菌株, 制备其PCR鉴定模板, 进行PCR鉴定, 筛选含有目的片段的重组子, 结果见图6。
1～4.重组质粒检测结果;5.阴性对照;M.1 kb DNA Marker。
2.5 诱导表达产物的SDS-PAGE检测
从高抗G418平板挑取菌株, 经PCR鉴定后进行甲醇诱导, 用1%的甲醇连续诱导5 d, 取诱导后上清液进行SDS-PAGE检测, 目的产物鸡抗病毒Mx蛋白的表达情况见图7。与阴性对照比较, 诱导表达上清液在4～8 h、约75 ku处有明显特异性条带出现, 与预期的鸡Mx蛋白相对分子质量基本一致, 并且在96小时达到高峰。扫描结果显示, 目的蛋白约占上清液总蛋白的39.2%。
1～5.1%甲醇诱导24, 48, 72, 96, 120 h;M.低分子质量蛋白标准;6.阴性对照。
3 讨论
在人、小鼠、大鼠、猪、牛等哺乳动物体内都发现了类似的Mx蛋白, 并且都具有能够抑制RNA病毒复制的活性。鸡Mx蛋白属于诱导表达型蛋白, 其天然来源十分有限, 远不能满足对其抗病毒机理及作用机制研究的需要, 因此采用基因工程技术制备鸡抗病毒Mx蛋白十分重要。
到目前为止, 外源基因的表达及其蛋白的获取大多都采用大肠杆菌表达系统而酵母表达系统作为一种有效的表达系统, 已逐渐成为基因工程领域外源基因蛋白获取的重要途经[7]。毕赤酵母表达系统兼具有原核和真核表达系统以及高效发酵并对表达产物进行类似真核细胞的翻译后修饰和加工 (如糖基化、二硫键的形成以及肽链的正确折叠) 等显著优点[8,9]。毕赤酵母利用甲醇作为唯一的碳源, 它有2个醇氧化酶基因AOX1和AOX2, 该基因具有很强的启动活性。毕赤酵母表达载体正是利用该启动子来启动外源蛋白表达的, 并将其分泌到培养基中, 分离、纯化简便, 是一种理想的外源基因表达系统[10]。试验将鸡Mx基因编码序列和α-分泌信号肽融合表达, 使重组蛋白在α-分泌信号肽的引导下穿过细胞膜并分泌到培养基中, 易于分离和纯化, 可获得高活性重组蛋白。由于酵母分泌的内源性蛋白比较少并且酵母培养基的成分相对简单, 这有利于表达的目的蛋白分离和纯化。
影响外源蛋白在毕赤酵母中表达的因素很多, 它不仅受整合位点、mRNA非翻译区、cDNA的AT含量等影响, 也受宿主菌、糖基化、培养基、重组质粒拷贝数的影响。一般来说, 高拷贝质粒表达外源蛋白的能力相对较强, 但不是绝对的。在试验中, 采用5个G418浓度 (0.5, 1, 2, 3, 4 mg/mL) 梯度对转化子进行筛选。结果显示, 高拷贝重组质粒表达效果明显高于低拷贝数转化子, 单拷贝及低拷贝转化子的表达效果不明显甚至不表达。经SDS-PAGE检测无特异性条带出现, 提示重组转化子拷贝数对鸡抗病毒Mx蛋白在毕赤酵母中表达的影响很大。
试验首次利用毕赤酵母表达系统表达了鸡抗病毒Mx蛋白, 这对该蛋白体外获取及其活性检测研究提供了很好的思路。
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