基因筛查（精选6篇）
基因筛查 篇1
耳聋是严重影响人类健康, 影响交流和生活的常见病。据2006年中国第2次残疾人抽样调查结果显示[1]:我国听力言语残疾者2780万, 占残疾人总数的33.52%, 更为严重的是每年以3万聋儿的速度在增长。因此, 做好耳聋的预防与出生缺陷干预关系到我国社会经济长远发展。据统计, 约1%的儿童有先天性听力损害, 其中一半与遗传有关。在遗传性耳聋中, 30%伴其他症状, 称为综合征型耳聋;70%不伴其他症状, 称为非综合征型耳聋 (NSHL) 。国内耳聋分子流行病学研究表明, 大部分NSHL仅由为数不多的几个基因突变引起, 如GJB2、SLC26A4、线粒体DNA (mtDNA) 12SrRNA及GJB3等[2]。在本研究中, 使用博奥生物有限公司的遗传性耳聋基因诊断芯片, 检测门诊咨询耳聋患者及家族中的亲属共41例, 现报告如下。
1资料与方法
1.1 临床资料
41例来自巨鹿县医院就诊者21例, 年龄:出生2个月～25岁;10岁以下患者11例。同时进行家族病史调查20例。在咨询门诊经解释宣教的基础上, 同意接受筛查者或亲属签署知情同意书, 再进行采集标本。
1.2 方法
1.2.1 采血:
采集受检者外周血3～5ml, 血液放入EDTA抗凝剂的真空采血管, 统一编号。应用小剂量全血基因组DNA提取试剂盒提取DNA, 进行定量和纯度检测。
1.2.2 耳聋基因突变筛查:
选用常见耳聋致病基因有:GJB2 (235delC、35delG、176 del16、299delAT) 、GJB3 (538C>T) 、SLC26A4 (PDS) (2168A>G、IVS7-2A>G) 、线粒体DNA 12SrRNA (1494C>T、1555A>G) 四个基因9个位点。测试由北京博奥生物有限公司提供。
2结果
应用基因芯片方法检测耳聋21例及其家系中相关亲属20例, 发现携带235delC突变5例, 携带GJB2 299delAT突变6例, 携带SLC26A4 2168A>G突变2例, 携带SLC26A4 IVS7-2A>G突变、2168>G位点杂合突变各1例, 耳聋及亲属中检出基因突变阳性率为36.59%。患者同时2～3个基因突变携带者3例, 占突变基因的20.00%。
3典型病例
患儿, 女, 3岁, 重度耳聋, 携带GJB2 235delC杂合突变, 同时携带SLC26A4 IVS7-2A>G杂合突变和2168A>G位点杂合突变。但家族病史调查中没有找到她的父母。GJB3基因和线粒体DNA12SrRNA基因未检出突变, 其基因突变阳性率为32.56%。
4讨论
本研究的中国常见4个基因9个位点筛查, 中国人的热点突变为233-235delC[3], 河北省巨鹿县重度耳聋调查结果发现GJB2基因235delC杂合突变检出率高达41.67%。其次GJB2基因299delAT杂合突变检出率为33.33%。SLC26A4基因2168A>G杂合突变检出率为16.67%。SLC26A4基因IVS7-2A>G杂合突变检出率为8.33%。本研究数据显示了该地区基因突变的重要地位及特点, 对今后开展耳聋的遗传咨询、婚前咨询、产前诊断有非常重要的指导意义。
进行聋病易感基因筛查, 目前能够进行致病基因突变筛查的方法有很多, 常用的有直接测序、目标基因位点特异性筛查, 如酶切、基因芯片、变性高效液相色谱分析、飞行时间质谱、四引物扩增受阻PCR等, 检测单位会根据筛查的不同需要选择最合适的方案, 既要保证良好的经济效益比, 也要尽力保证筛查方案的快速和准确。
我国有听力语言障碍的残疾人约1700万。耳聋给正常生活、学习和社会交往带来不便。从预防出生缺陷角度考虑应从婚前检查对高危人群进行耳聋基因检测, 目前基因芯片检测阳性率高, 通过基因芯片, 我们发现基因携带者较高, 高危人群耳聋基因筛查, 易标准化, 结果快速可靠, 适合在临床应用中推广, 这必将产生大的社会效益。
关键词：耳聋病因,基因芯片,基因突变,遗传性耳聋
参考文献
[1]第二次残疾人抽样调查办公室.全国第二次残疾人抽样调查主要数据手册[M].北京:华夏出版社, 2007:2, 38.
[2]刘学忠, 欧阳小梅, Yah D, 等.中国人群遗传性耳聋研究进展[J].中华耳科学杂志, 2006, 4 (2) :81-89.
[3]Dai P, Yu F, Ham B, et al.The pmvalence ofthe235delC GJB2mutation in a Chinese deaf population[J].Genet Med, 2007, 9 (5) :283-289.
基因筛查 篇2
生长激素(Growth hormone,GH)通过与细胞表面受体结合激活胞内信号转导途径反应,调控细胞生长和分化。GH信号通路由细胞表面的生长激素受体(Growth hormone receptor,GHR)二聚体化引发,进入JAK-STAT信号通路引发磷酸化级联反应,GHR活化后导致JAK2激酶磷酸化,进而磷酸化下游的STAT蛋白,STAT作为转录因子调控相关基因表达[7]。CIS和SOCS2通过直接与磷酸化的GHR结合抑制GH信号途径[8]。SOCS1过表达可能导致GH信号通路活性完全失活,SOCS1蛋白强烈抑制GHR依赖的JAK2酪氨酸磷酸化而减弱GH活性[9]。
SOCS1基因多态性分析集中在人类肿瘤和糖尿病等研究[10,11],牛SOCS1基因多态性研究少有报道,NCBI中牛SNP数据库仅有一条记录。DNA池是将同一种属样本调整为相同浓度,一定数量的样本混合成DNA池的方法,具有提高检测效率,降低成本等优点[12]。本试验为研究SOCS1基因在牛生长调控中作用,利用务川黑牛构建DNA池,直接测序后DNAStar软件进行序列拼接和校正,BLAST分析SOCS1基因多态性,在牛SOCS1基因中筛查到共3个单核苷酸多态性(SNPs),其中在SOCS1基因外显子编码区有1个SNPs,C645T(Tyr→Tyr)为同义突变;3′-非翻译区有C815A 和C900T 2个SNPs,3个SNPs等位基因频率分别为0.893 7、0.658 5和0.867 9。
1 材料与方法
1.1 DNA提取
32个务川黑牛血样采自贵州务川仡佬苗族自治县仡佬牧业公司种牛场。血液基因组提取试剂盒(生工生物工程(上海)有限公司)提取DNA,用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测提取效果,紫外分光光度计测量DNA样品浓度,将基因组DNA浓度调到100 ng/μL,每个样品各取5μL混合构成DNA池。
1.2 引物设计和DNA扩增
以牛SOCS1 DNA序列(GenBank登录号:AC_000182.1)用Primer Premier 5.0设计引物,引物由生工生物工程(上海)有限公司合成,引物信息见表1。PCR扩增得到SOCS1基因全部外显子序列和3′-UTR。构建DNA池以进行PCR反应,PCR反应总体系为25 μL:基因组DNA 2.5μL,上下游引物(10 pmol/μL)各1.5μL,2×Taq PCR Master Mix试剂12.5μL,三蒸水7μL。反应条件:94℃预变性4min;(94℃变性40s,67.1℃/61.9℃退火45s;72℃延伸50s)35个循环,72℃延伸10min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像系统观察、拍照。
1.3 序列分析
将特异性好的PCR产物经DNA纯化回收试剂盒(北京博迈德科技发展有限公司)纯化后的产物委托诺赛基因组研究中心有限公司双向测序。DNAStar软件对测序结果进行校正,BLAST分析确定SNPs。
1.4 测序图峰高测量和等位基因频率估算
运用Chromas.exe、MWSnap软件测量各SNP位点等位基因峰高,并根据公式估算等位基因频率[13]。
fi=hi/(h1+h2),i=1,2
公式中fi:SNP位点某等位基因频率,h1:测序图上该SNP等位基因1峰高度,h2:测序图上该SNP等位基因2峰高度。
2 结果与分析
2.1 DNA提取
提取的DNA经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,结果见图1。由图1可知,所提取基因组DNA条带整齐、亮度均一,完整性较好,经紫外分光光度计检测,基因组DNA的OD260 /OD280在1.6～1.8范围,表明基因组DNA纯度较高,可直接用于PCR扩增实验。
2.2 DNA池PCR扩增结果
将用2对引物扩增得到的PCR产物取2μL进行电泳检测,见图2。图2显示出现两条大小分别约为766bp和835bp的明亮条带,可见扩增得到的片段与目的片段大小一致,特异性较好。
M:DL2000 Marker;1:SOCS1基因外显子编码区DNA池PCR产物;2:SOCS1基因3′-UTR DNA池PCR产物。
M:DL2000 Marker;1:DNA pool PCR products of exon coding region in SOCS1 gene;2:DNA pool PCR products of 3′-UTR in SOCS1 gene.
2.3 DNA池的PCR产物测序
设计2对引物分别扩增出SOCS1外显子编码区和3′-UTR。扩增产物胶回收纯化后进行双向测序,BLAST分析共发现3个SNPs,见图3。以SOCS1基因外显子第一位为+1位,SOCS1基因中SNPs分别为:C645T、C815A 和C900T。其中C645T为同义突变,C815A 和C900T 两个SNPs位于3′-UTR,3个SNPs等位基因频率分别为0.893 7、0.658 5和0.867 9。
2.4 SNPs等位基因频率估算
使用MWSnap软件的标尺分别测量SOCS1基因的3个SNPs等位基因峰高,根据公式对各SNPs位点等位基因频率进行估算。C645、C815A 和C900T 三个SNPs等位基因频率分别为0.893 7、0.658 5和0.867 9。
3 讨论
细胞因子信号抑制子家族在JAK-STAT信号通路中起负调控作用,该家族主要包含SOCS1-7和CIS 8个成员[14]。在JAK/STAT信号通路中细胞因子首先诱导细胞膜受体二聚体化导致JAK激酶磷酸化而激活。JAK磷酸化受体酪氨酸残基吸引STAT蛋白与受体结合,激活的STAT蛋白形成二聚体进入核内诱导SOCS1基因在内的相关基因表达。SOCS1蛋白结合到JAK激酶激活的酪氨酸残基抑制其活性,终止JAK/STAT信号通路[15]。SOCS1对生长激素、白介素4、白介素6、干扰素、催乳素、红细胞生成素诱导的信号转导途径均有抑制作用[16]。SOCS1蛋白C端靠近SH2结构域的2个氨基酸对生长激素介导的基因转录有最强抑制作用,与JAK2激酶直接结合而减弱其信号活性[17]。
目前,对SOCS1研究集中在人糖尿病、免疫缺陷和肿瘤等其他疾病[18,19]。Guillem V等[20]在人SOCS1基因中鉴定到1个SNP(rs243327),与慢性粒细胞性白血病患者对治疗药物伊马替尼耐受性显著相关。Gylvin T等[21]考察SOCS1基因多态性位点与人Ⅱ型糖尿病相关性状关联性。通过对超过8 100个丹麦人SOCS1基因直接测序,鉴定SNPs及确定基因型。证实rs33977706多态性位点与身体质量指数显著相关。Zhang JG等[22]通过致死性免疫疾病的小鼠研究SOCS1负向调控功能,SOCS1 Box选择性缺失的小鼠具有严重淋巴球减少症等症状而在3周龄死亡。 SOCS1甲基化消除对JAK/STAT通路的抑制作用,肿瘤细胞存在SOCS1基因的异常甲基化。Yoshikawa H等[23]发现,SOCS1基因解除甲基化状态后通过引起细胞凋亡而抑制细胞生长以及锚非依赖性生长。
基因筛查 篇3
本课题组收集到1 个5 代共68 例的常染色体显性遗传性CCD家系成员,前期研究结果发表在2009 年第6 期的《中国心脏起搏与心电生理杂志》。该家系诊断为Lenègre-Lev病,但心电图特征提示Lenègre-Lev病可能存在第3 型,即最初发病部位在心房内传导系统,以后病变逐步沿心脏特殊传导系统向His束发展,并演变为Ⅲ度房室传导阻滞(atrial ventricular block,AVB)。该家系特殊的起病方式是否与上述已知基因突变或其他基因相关尚不清楚。本课题组通过直接测序方法对已知的CCD相关候选基因进行突变筛查,以期找到致病基因,有利于研究发病机制,筛选出家系中的潜在患者,提醒其采取防范措施,避免猝死发生,现报道如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象
笔者收集到湘潭市的1 个CCD家系,该家系有5 代共68 例家系成员。其中7 例为CCD患者(现存4 代60 例,5 例患者)。先证者(Ⅲ19)为57 岁男性,37 岁时因心悸短暂晕厥就诊,心电图(electrocardio-gram,ECG) 检查为Ⅰ度AVB,超声心动图(ultra-sound cardiogram,UCG) 检查提示心脏4 个腔室大小正常;41 岁时进展为Ⅲ度AVB和房颤,UCG检查提示心脏扩大,47 岁时行右心室按需型起搏器植入术。对该家系中患者及其亲属共22 例成员进行病史询问、心肺检查、ECG检查,并抽取外周静脉血5~10ml用于基因组DNA的提取。本实验由湘潭市中心医院生殖中心及心内科共同完成,对该家系的分子遗传学研究通过医院伦理委员会的论证。
应用Cyrillic 3.0 软件绘制图谱。通过系谱图分析得知,该CCD家系表现为4 代连续遗传(其中Ⅰ1突然猝死,原因不详,疑为CCD患者,第5 代因年龄小,未见发病);男女发病几率相同,而且患者后代有50%左右的发病率;家系中已经明确诊断的患者有7 例,其中男性5 例,女性2 例。Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1、Ⅱ3、Ⅱ7 在50~75 岁猝死,死因不详。见图1。
1.2 临床心电图检查
根据《新编临床医学数据手册》对家系内成员进行心肺检查,检查内容包括体表心电图。完全性右束支阻滞(right bundle branch block,RBBB)3 例(其中1 例演变为Ⅰ度AVB),Ⅰ度AVB 2 例(其中1例演变为Ⅲ度AVB),Ⅱ度AVB 2 例,Ⅲ度AVB 2例,Ⅱ度窦房传导阻滞(sinoatrial block,SAB)2 例,均表现为CCD。其中,先证者Ⅲ19 的心电图检查由完全性RBBB演变为Ⅲ度AVB伴有RBBB和Ⅱ度SAB。接受检查的家系成员心电图检查结果见表1。
先证者(Ⅲ19)ECG检查提示Ⅲ度AVB、窦性心动过缓、交界性逸搏心率(见图2A)。先证者堂兄(Ⅲ5)2001 年ECG提示完全性RBBB、窦性心动过缓、Ⅰ度AVB,UCG及核素心肌扫描正常,临床诊断为原发性传导束退化症;2007 年ECG提示Ⅲ度AVB、完全性RBBB、Ⅱ度SAB,冠状动脉造影正常,UCG检查双心房扩大(见图2B)。先证者堂姐妹(Ⅲ31)ECG提示窦性心动过缓和完全性RBBB。先证者侄子(Ⅳ14)ECG提示窦性心动过缓、Ⅱ度AVB、ST-T改变、房性早搏未下传。先证者之子(Ⅳ21)ECG提示Ⅱ度Ⅰ型房室传导阻滞。
1.3 研究方法
1.3.1 样本采集及DNA的提取按照血液基因组DNA提取试剂盒(Qiagen)说明书抽提外周血白细胞的基因组DNA。取适量DNA经紫外分光光度计进行定量和纯度检测,于-80℃冰箱保存备用。
1.3.2 候选基因的选择和引物设计参考美国国立生物技术信息中心基因数据库的基因组和m RNA序列信息,结合已发表的文献,设计覆盖已知的CCD发生相关基因SCN5A、NKX2.5 和LMNA的全部外显子及其剪切位点区域的引物,其中SCN5A有2 个外显子,NKX2.5 有28 个外显子,LMNA有12 个外显子,引物序列见表2。所有引物由上海生物工程股份有限公司合成。
1.3.3 聚合酶链反应以基因组DNA为模板,采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法扩增目的DNA片段。本研究采用的PCR反应体系为50μl,其中包括100μg基因组DNA,10 mol/L引物,200 mmol/L d NTP和Tag酶。PCR反应在DNA热循环仪(美国Bio-rad公司)上进行,反应条件如下:95℃预变性2 min,94℃变性10 s,65℃退火30 s,68℃延伸2 min,共35个循环。取5μl PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳,100 bp DNA Marker鉴定扩增片段。
1.3.4 测序分析PCR产物送深圳华大生物技术有限公司纯化后直接测序(ABI377 自动DNA测序仪)。测序引物与PCR引物相同。参考已报道的致病基因突变位点和美国国立生物技术信息中心提供的候选基因SCN5A、NKX2.5 和LMNA的标准基因序列,应用DNAman软件对测序结果进行序列分析比对,判断是否存在突变位点及氨基酸序列的变化。若发现可疑突变,重新稀释DNA模板,对基因外显子进行重复实验和反向测序予以验证。
2 结果
选取Ⅲ5、Ⅲ7、Ⅲ19、Ⅳ14 及Ⅳ21 共5 例患者进行LMNA和SCN5A、NKX2.5 基因全部外显子和部分剪切位点区域DNA片段的PCR扩增,凝胶电泳分析可见特异性条带,与预期结果相符。PCR扩增片段产物纯化后经直接测序分析,未发现与已报道的候选基因一致的突变位点。
3 讨论
本课题组黄河等[2]证实遗传性CCD家系疾病被诊断为Lenègre-Lev病。Lenègre-Lev病是以心房和心室内传导系统异常为特征的一种疾病;主要特点为希浦系的心脏内传导系统出现进行性传导异常,导致房室或室内传导阻滞;病因不明,该病具有一定的异质性,病情严重时可导致晕厥或猝死[1，3]。因此,筛查致病基因对该家系疾病的分子机制研究及预防猝死极为重要。
CCD是一种多重病因的遗传异质性疾病,其中遗传学因素在CCD发病中的作用日益受到重视。该病一般以常染色体显性的方式遗传[4]。该家系患者双亲之一为CCD患者或疑似患者,男女均可发病,有连续传代的特点,符合常染色体显性遗传病的特征,与文献报道一致。
近年来,国内外研究发现多种基因异常与CCD有关,其中较多的是3 个主要候选基因SCN5A、NKX2.5 和LMNA突变能够引发进行性CCD的证据。
3.1 SCN5A基因
SCN5A基因位于染色体3p21,编码心肌细胞膜上的钠离子电压门控通道Nav1.5。其突变后可引起Navl.5 结构异常,造成快钠通道功能障碍,快反应细胞动作电位0 期钠离子内流减少,去极化速率以及幅值减小,从而降低传导速度,引起传导阻滞。SCN5A基因突变后可引起病态窦房结综合征(sick sinus syndrome,SSS)[5]、进行性以及非进行性CCD[6,7,8,9]等多种心脏传导疾病。周熙惠等[10]发现1 个CCD家系SCN5A基因新突变L1001Q。功能研究显示,该突变主要通过改变钠通道门控特性,引起钠通道功能减弱,导致CCD。邓尧等[11]通过全外显子测序发现一心脏传导疾病家系的SCN5A新的杂合突变P.Y1495X。此外,国外多位学者发现,SCN5A多个位点的错义突变、无义突变、移码突变等可导致CCD。
3.2 NKX2.5 基因
人类CSX/NKX2.5 基因定位于染色体5q34 和5q35,有972 bp的开放阅读框,编码含324 个氨基酸的蛋白质。人类CSX/NKX2.5 蛋白同源结构域HD含有高度保守的60 个氨基酸残基,是与DNA结合的必需结构。NKX2.5 基因是心脏发育过程中重要的转录因子,是所有脊椎动物心脏发生中最早表达的转录因子之一,参与心脏前体细胞的分化、心脏环化、房室分隔、房室流出道和传导系统的形成[12]。多篇文章报道NKX2.5 基因的突变可导致CCD[13,14,15,16]。
3.3 LMNA基因
LMNA基因位于染色体1q21.2~q21.3,基因组序列全长56.7 kb其中编码区域约24 kb,包含l2 个外显子[17]。LMNA基因编码蛋白产物为Lamin A和C,是组成细胞核纤层的重要成分,在心脏传导系统形态学的发生、发育和功能维持方面发挥重要的调控作用,突变可导致多种遗传性疾病,包括CCD[18,19,20,21]。
基因筛查 篇4
1 资料与方法
1.1 一般资料
该研究对象是选择在该市 (大部分是该院) 出生的6 057例新生儿, 其中男3 104例, 女2 953例。6 057例新生儿出生后经过详细检查无慢性疾病、无新生儿黄疸、无明显畸形, 均为正常新生儿。在征得新生儿家属和医院伦理委员会的认可后, 由新生儿家属签订知情同意书, 接受新生儿作为研究对象。同时使用动态筛查及基因检测两种方式对新生儿实施检查。
1.2 动态筛查方法
对6 057例新生儿实施动态听力筛查, 具体以快速脑干诱发电位 (AABR) 为主要筛查方式, 第一次筛查时间是在新生儿出后48~72 h内, 二次筛查是在新生儿足月至42 d。对于二次筛查后仍未通过的新生儿在筛查后的3个月内转送至专业听力进行检测评估、诊断。
1.3 耳鼻喉科诊断
听力评估诊断方案根据不同的患儿, 采用如畸变产物耳声发射 (DPOAE) , 脑干听觉诱发电位 (ABR) , 声导抗、多频稳态反应 (ASSR) 、CT等检查进行综合评估, 通过这些专业的检测方法准确的对新生儿是否存在听力障碍进行评估。
1.4 易感基因检测方案
在新生儿出生时采取脐带血并保留, 送至基因实验室检测易感基因线粒体12S r RNA、SLC26A4 (PDS) 、GJB2。
1.5 随访调查
对于听力异常的新生儿进行定期的随访调查, 为预防聋提供相关指导和建议。
1.6 统计方法
采用SPSS13.0软件对所得数据进行统计学分析处理, 计数资料采用χ2检验。
2 结果
2.1 动态听力筛查结果
动态听力筛查未合格新生儿375例, 所占比例6.25% (375/6 057) 。
2.2 耳鼻喉科诊断
耳鼻喉科诊断有120例中度听力损失、131例重度听力损失、80例极重度听力损失、44例听力正常。
2.3 基因筛查结果
在筛查的6 057例新生儿中, 193例阳性新生儿中1例为1494C>T纯合突变、2例1555A>G杂合突变、16例1555A>G纯合突变、7例2 168A>G杂合突变、46例IVS7-2A>G杂合突变、1例IVS7-2A>G纯合突变、101例235del C杂合突变、4例235del C纯合突变、11例299_300del AT杂合突变、4例176_191del16杂合突变。
2.4 听力初次筛查和基因筛查结果对比
听力初次筛查结果显示5 682例新生儿通过, 6 057例新生儿中基因筛查结果中显示193例异常, 所占比例为3.19%, 两种筛查方法结果差异有统计学意义 (χ2=15.371, P<0.05) , 说明这两种方法不能被任何一方取代, 可在临床同时使用以进一步确诊。见表1。
3 讨论
随着我国医学技术不断发展, 新生儿父母对新生儿身体健康的重视, 越来越多的新生儿父母及家属主动参与新生儿的听力检查[2], 通过听力和基因的联合筛查来了解新生儿是否存在听力障碍和迟发性听力损失的危险因素。研究发现, 新生儿基因检测m.1555A>G阳性时, 听力筛查结果显示正常, 这说明听力筛查和基因筛查结果存在一定的差异, 需同时使用动态筛查及基因检测两种方式对新生儿实施检查以获得更好诊断结果。而单纯的使用一种筛查方法难免有一定的局限性, 对于此类尚未确诊的新生儿不可盲目展开治疗, 若使用了氨基糖苷类抗生素, 会造成新生儿不可逆的耳聋[3], 所以治疗时一定要慎重。听力筛查中8例新生儿是GJB2基因c.235del C纯合突变, 且均为重度的感音神经性聋, 提示临床新生儿GJB2基因c.235del C纯合突变是新生儿及婴幼儿重度的听力障碍的原因之一。同时有11例新生儿CT结果表示有前庭水管扩大, 通过基因筛查发现属于SLC26A4基因c.919-2A>G的杂合携带, 也就表明新生儿存在前庭水管扩大和存在SLC26A4基因c.919-2A>G纯合突变两者之间没有确定的联系, 前庭水管扩大也可能是其他基因发生突变[4,5], 所以很多报道认为SLC26A4基因c.919-2A>G纯合突变无法诊断前庭水管扩大[6]。m.1555A>G、GJB2、SLC26A4是最为常见的3个聋病易感基因, 生育后新生儿出现听力障碍的几率较高[7]。通过基因和听力联合筛查可以有效了解相关的易感基因, 了解是否属于高危人群, 从而给予相应的指导和建议, 预防后代出现聋病[8,9]。相关文献报道称听力筛查和基因筛查的结果关联性不明显, 两者检测结果差别较大, 因此建议采用听力和聋病易感基因联合筛查方案, 弥补各自的不足[10], 提高筛查的准确性, 大大降低和预防新生儿听力损失的出生, 符合优生优育原则。
综上所述, 很多听力筛查不通过、存在不同程度的听力障碍的新生儿, 以及听力筛查正常的新生儿, 均存在迟发性听力损失的危险因素, 单纯靠听力筛查的方法无法准确的筛查出存在或有潜在听力障碍的新生儿, 只有通过听力与聋病易感基因的联合筛查才能将筛查准确率达到最高。
摘要：目的 探讨新生儿听力和聋病易感基因联合筛查的临床实践的可行性。方法 选择从2012年9月—2013年7月在该市出生的6 057例新生儿进行听力和聋病易感基因的联合筛查, 同时进行动态筛查及基因检测, 新生儿听力动态筛查分初筛和复筛, 初筛以快速脑干诱发电位 (AABR) 为主要筛查方式, 如果不通过, 30~42 d复筛, 复筛不通过转诊该院耳鼻喉科诊断, 采用如畸变产物耳声发射 (DPOAE) , 脑干听觉诱发电位 (ABR) , 声导抗、多频稳态反应 (ASSR) 、CT等检查进行综合评估;同时对新生儿进行基因筛查, 采取6 057例新生儿脐带 (或足跟血) 以检测常见易感基因 (线粒体12S rRNA、SLC26A4 (PDS) 、GJB2) 的突变情况。结果 动态听力筛查未通过新生儿375例, 所占比例6.19%;耳鼻喉科诊断有120例中度听力损失、131例重度听力损失、80例极重度听力损失、44例听力正常。对6 057例新生儿行基因检测显示193例新生儿基因异常, 其中1例为1494C>T纯合突变、2例1555A>G杂合突变、16例1555A>G纯合突变、7例2168A>G杂合突变、46例IVS7-2A>G杂合突变、1例IVS7-2A>G纯合突变、101例235delC杂合突变、4例235delC纯合突变、11例299_300delAT杂合突变、4例176_191del16杂合突变, 阳性率为3.19%。结论 新生儿听力和聋病的易感基因联合筛查作用显著, 可以发现新生儿中存在和聋病相关的遗传基因, 从而弥补其他筛查不能发现聋病新生儿的不足。
关键词：新生儿,听力,聋病,易感基因
参考文献
[1]胡书君, 历建强, 张鹏, 等.新生儿听力与聋病易感基因联合筛查的临床研究[J].听力学及言语疾病杂志, 2010, 18 (3) :222-224.
[2]李隽, 历建强, 王智楠, 等.678例新生儿听力和聋病易感基因联合筛查结果分析[J].听力学及言语疾病杂志, 2010, 18 (5) :419-422.
[3]历建强, 纪育斌, 李倩, 等.新生儿听力与聋病易感基因联合筛查对新生儿听力随访的意义[J].听力学及言语疾病杂志, 2010, 18 (5) :415-418.
[4]周佳霖, 历建强, 罗仁忠, 等.听力复筛未通过的新生儿常见聋病易感基因筛查结果分析[J].听力学及言语疾病杂志, 2011, 19 (1) :14-17.
[5]温瑞金, 李琰, 罗仁忠, 等.听力筛查未通过婴幼儿相关高危因素及听力评估结果转归分析[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2009, 23 (19) :865-868, 871.
[6]李红辉, 林墨菊, 唐柳巧, 等.新生儿聋病易感基因筛查3 045例分析[J].中国妇幼保健, 2009, 24 (11) :1498-1500.
[7]李红辉, 赵恒静.新生儿聋病易感基因筛查[J].中国康复理论与实践, 2009, 15 (1) :99-100.
[8]纪育斌, 韩东一, 王大勇, 等.山东省聋哑学校485例耳聋患者易感基因突变检测分析[J].中华医学杂志, 2009, 89 (36) :2531-2535.
[9]赵恒静, 纪育斌, 李红辉, 等.柳州地区161例先天性聋患者易感基因突变检测分析[J].听力学及言语疾病杂志, 2010, 18 (1) :11-13.
基因筛查 篇5
慢性宫颈炎是生育年龄妇女最常见的妇科病, 常由链球菌、肠球菌、葡萄球菌及特殊的病原微生物沙眼衣原体、淋球菌、乳头状瘤病毒和单纯疱疹病毒感染引起。临床表现为白带增多。我院现采用薄层液基细胞学 (TCT) 检测细胞分级和基因芯片技术检测法人乳头状病毒 (HPV) 基因进行分型, 评估我院1060例不同年龄组宫颈分泌物标本, HPV阳性组与阴性组的宫颈细胞学的分级改变, 结果予以分析。
1 资料与方法
1.1 一般资料
2009年10月至2010年10月湖北省洪湖市人民医院妇科门诊已检测的慢性子宫颈炎1060例。年龄20~69岁, 所有患者均采用薄层液基细胞学 (TCT) 检测细胞分级和基因芯片技术检测人乳头状病毒 (HPV) 基因进行分型。
1.2 薄层液基细胞学 (TCT) 检测细胞分级标本采集方法
妇科医生采用长度和形状符合宫颈解剖结构的特制小刷子收集宫颈口的脱落细胞, 将所收集的细胞立即注入盛有细胞保存液的瓶中, 经AZP-B型自动液基薄层细胞制片机系统程序化处理, 制成薄层细胞涂片, 使用改良巴氏染色, 采用中性树胶封片。
结果分析:采用薄层液基细胞学检测和TBS (The Bethesda System) 分级报告诊断标准, 它是目前国内外各大医院病理科评估宫颈病变的金标准。具体评判方式为:子宫颈鳞状上皮细胞呈良性反应或炎性改变、未确定意义的非典型鳞状细胞改变 (ASCUS) 、低度鳞状上皮内病变 (LSIL) 、高度鳞状上皮内病变 (HSIL) 、宫颈癌 (HCC) 。所有涂片均由我科资深细胞学医师审阅。
1.3 人类乳头状瘤 (HPV) 病毒检测实验方法采用基因芯片分型检测系统
检测完TCT的剩余标本, 以1300 min离心2 min, 去上清夜;磷酸盐缓液 (PBS) 漂洗、1500转高速离心和无水乙醇漂洗, 留底层沉淀物真空干燥后加入细胞裂解液悬浮沉淀、100度水浴加热。人类乳头瘤基因芯片试剂盒购自上海复星公司, 同时检测23型HPV基因型, 低危型HPV6、11、42、43、44;高危型包括HPV16、18、31、33等18种基因型, PC为质控点, 显色阳性为实验结果可靠, 以最常用的人类乳头状瘤通用引物进行PCR扩增。PCR参数50°CUNG酶消化15 min, 扩增40个循环。观察结果并统计, 各组HPV感染率及基因型分布。
1.4 统计学分析
采用SPSS 10.0统计软件进行分析, 计数资料以百分率表示。组间比较采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 检查结果
慢性子宫颈炎患者HPV阳性组和阴性组液基细胞学检查结果表1显示发生宫颈上皮内病变的机率, HPV阳性组明显大于阴性组 (χ2=209.8, P<0.01) , HPV阴性组没有发现在高级别上皮内病变 (HSIL) 和宫颈癌 (HCC) , HPV阳性组低级别 (LSIL) 明显多于阴性组。
2.2 癌前病变与HPV分型的关系
486例HPV阳性者液基细胞形态学检查结果显未确定意义的非典型鳞状细胞改变示ASCUS118例, 其中68例为HPV高危型, LSIL与HSIL均为高危型感染, 可见癌前病变与HPV高危型感染关系密切。
3 讨论
随着TCT级别的升高, HPV感染率明显升高。HPV基因分型检测是有重要价值的辅助诊断技术, 与细胞学联合, 是最佳的宫颈癌筛查的方案。人类乳头状瘤高危病毒检测是各年龄组妇女早期发现宫颈CIN变、宫颈癌最有效的检测方法, 以上研究得出高危型人类乳头状瘤病毒持续感染是宫颈上皮病变各个阶段的主要感染诱因。伴随病理学技术的发展, 目前可以对HPV进行分型, 已有近200种人类乳头状病毒亚型, 与妇女宫颈上皮内瘤变有关的病毒亚型有40余种[1,2]。病理学家们根据病毒致病力的强弱分为高危型、低危型两大类。高危型16、18、31、33、66等18种, 是导致高级别子宫颈上皮内瘤变 (CINII、CINIII) 和宫颈癌发生的罪魁祸首。该文评估慢性子宫颈炎妇女高危人类乳头状瘤病毒阳性和阴性两组病例表示:高危HPV阳性组发生子宫颈低级别及高级别发生的概率明显高于HPV阴性组, 显示高危HPV阳性者更容易出现各级别的子宫颈上皮内瘤变和宫颈癌病变。故HPV筛查是目前早期发现宫颈癌和癌前病变的有效手段。
适龄女性应定期做HPV和脱落细胞学检查, 单一类型的人类乳头状瘤 (HPV) 持续感染与宫颈CIN尤其与宫颈鳞状细胞的形成具有因果关系, 是一个缓慢渐进的过程, 是由渐变到突变, 即为CINI→CINII→CINIII→早期浸润癌→浸润癌。众所周知, 宫颈病变越早期治疗效果越佳[3], 如能在前驱病变阶段给予治疗干预, 这无论是经济上还是精神上都为患者减轻了负担。故对适龄女性同时HPVC和定期做薄层液基细胞学 (TCT) 检测和基因芯片技术检测人乳头状病毒 (HPV) 基因对防止子宫颈联合鳞状细胞癌的发生具有非常重要的临床意义。同时HPV和TCT联合检测作为子宫颈鳞状细胞癌早期筛查手段和宫颈癌术后评估浓缩高风险人群, 可根据感染的HPV亚型类型[4]预测受检者的宫颈发病率风险度, 以便进一步确定其宫颈筛查的时间, 对于二者联合检测均是阴性的患者, 阴性预测值可达到99%~100%, 评估其子宫颈病变风险率及低。建议有3年以上性行为或20岁以上有性行为的女性应每年联合做一次薄层液基细胞学 (TCT) 和基因芯片技术人乳头状病毒 (HPV) 检测。对连续两次细胞学正常可改至3年后复查;连续2次HPV检测和TCT正常可延至5~8年后复查。
参考文献
[1]Zur Hause H.Cervical carcinoma and human pap illoma virus:On the road to preventing amajor human cancer[J].J Natl Cancer lnst, 2001, 93 (4) :252-253.
[2]朗景和.子宫颈病变防治的几个问题[J].世界医学杂志, 2004, 8 (11) :1-3.
[3]朗景和.迎接子宫颈癌预防的全球挑战与机遇[J].中华妇产科杂志, 2002, 37 (3) :129-131.
基因筛查 篇6
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2009年1月~2012年1月北京市顺义区妇幼保健院门诊机会性筛查的宫颈疾病患者并按自愿原则采用TCT联合HPV基因分型检测的不同年龄妇女2400例宫颈脱落细胞标本,年龄25~55岁,平均(39.64±8.24)岁。所有患者均有性生活史,无急性生殖道炎症,无子宫切除等病史,无妊娠、无盆腔放射治疗史,基本排除混杂因素。纳入标准:①年龄在25~55岁曾有过性生活史的妇女。②知情同意,自愿参与该项研究,配合临床调查。
1.2 检测指标
1.2.1 第二代基因杂交捕获技术检测
采用美国Digence公司的HC2技术试剂盒,利用对抗体捕获信号的放大和化学发光信号的检测,一次性检测操作和结果判读按试剂盒要求进行,21种HPV分为高危型和低危型2类,高危型15种,包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68,低危型6种,包括HPV6、11、41、42、44、81,有2型或2型以上者为多型感染(不论是高危型或低危型)。具体如下:①DNA双链释放并分解成核苷酸单莲;②DNA单链与RNA组合探针结合为RNA-DNA杂交复合物;③捕获特异性抗体与DNA-RNA杂交复合物并固定在微孔壁上;④第二抗体与RNA杂合体结合反应;⑤冲洗并收集信号;⑥判读结果。RLU/CO≥1.0即为阳性结果,即相对于标本中检出的DNA负荷量≥1.0 ng/L,反之为阴性。
1.2.2 TCT检测
采用美国新柏氏公司TCT技术取材制片。由细胞病理学主治以上专科医生阅片,按2001年国际癌症协会TBS分级系统作出诊断报告。①正常范围。②意义不明的不典型鳞状细胞和腺细胞(ASC-US、AGUS)。③不除外高度鳞状上皮病变不典型鳞状细胞(ASC-H)。④低度鳞状上皮内病变(HSIL)。⑤鳞状细胞癌和腺癌。本研究将低度鳞状上皮内病变(LSIL)以上定为细胞学异常。
1.2.3 病理组织学诊断
专人负责对TCT异常和HPV阳性和患者进行阴道镜下宫颈多点活检及宫颈管搔刮组织病理学诊断。在阴道镜图象异常区及碘实验阴性区多点活检,如为正常转化区,则在转化区3、6、9、12时点处取活检。
1.3 统计学方法
采用统计软件SPSS 13.0对数据进行分析,正态分布的计量资料以均数±标准差表示,计数资料以率表示,采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 受检阳性者年龄分布
共526例出现阳性结果,其中HPV(+)者426例,患者发病年龄以25~44岁为主;TCT(+)者89例,患者发病年龄以35~55岁为主;HPV和TCT均(+)者11例,占2.09%。因此,本地区宫颈疾病多发于青中年。
2.2 TCT异常与宫颈活检的比较
89例TCT异常者中,随着宫颈活检病理级别的升高,TCT阳性率亦呈上升趋势。TCT的TBS分级中LSIL占26.97%,但其中50.0%的病理结果却是正常或慢性炎。见表1。
注:ASC-US:意义不明的不典型鳞状细胞;AGUS:意义不明的不典型腺细胞;ASC-H:非典型鳞状细胞;LSIL:低度鳞状上皮内病变;HSIL:高度鳞状上皮内病变;CIN:宫颈上皮内瘤变;TCT液基薄层细胞
2.3 HPV阳性与宫颈活检的比较
将HPV阳性者按高危型、低危型、其余类型分类,再与宫颈活检比较。高危型HPV的阳性率随着病理级别的升高而呈上升趋势。低危型及其余HPV感染则集中于CINⅠ~Ⅱ及慢性炎。尖锐湿疣与高危型、低危型HPV都相关。HPV阳性病理确诊为CIN者200例,HPV阴性确诊为CIN者14例,两者差异有统计学意义(χ2=38.28,P<0.05)。见表2。说明HC2联合TCT检测能最大程度地发现宫颈异常细胞并及时发现宫颈癌的诱因,但需以宫颈活检病理为标准来验证其筛查异常结果。
注:HC2:第二代基因杂交捕获法;CIN:宫颈上皮内瘤变
2.4 HPV各亚型的分布
HPV16、18、58等亚型在CINⅢ及宫颈癌的阳性率多见,且阳性率较高,说明CINⅢ及宫颈癌主要与高危型HPV感染密切相关。在单一亚型和多种亚型感染中,均以高危型HPV16最常见;而在多种亚型感染中,高危型HPV58感染率仅次于HPV16,以下依次是HPV33、56、18等和低危型中的HPV11、43、6等。
3 讨论
宫颈癌是女性中发病率第二高的癌症,仅次于乳腺癌。2008年德国科学家Harald zur Hausen因发现HPV与宫颈癌的关系而获得诺贝尔生理学或医学奖,他在颁奖礼上说:“宫颈癌是一种可通过性传播的疾病,通过HPV传播。从古至今,上百万人殁于此。其病原体的确定,使得开发疫苗成为可能,在全球范围内降低了死亡率”。宫颈癌的早期筛查方式是采用巴氏涂片以及改进后的TCT技术,这些方法只能从细胞学病变的角度来评估宫颈癌的发病情况,也就是说,要等到遭受病毒感染的细胞开始出现明显变化时才可以检测出来。随着对HPV感染导致宫颈癌的认识加深以及分子诊断技术的发展,HPV基因检测作为宫颈癌的一种筛查手段得到了更广泛的应用。
HPV是一种嗜上皮性病毒,主要寄宿于人体皮肤及黏膜。性接触是其主要的感染途径,除此之外,不干净的手、不卫生的公共浴池等都可能成为HPV的感染途径[4]。HPV主要包括低危型和高危型两大类,低危型HPV感染可能会引起生殖道湿疣病变,高危型HPV感染则与宫颈癌、阴道癌相关[5,6]。目前已经发现的HPV有200多种型别,不同型别与不同疾病的相关性也不一样,其中14种高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)与宫颈癌密切相关[7],因此,在检查是否遭受HPV病毒感染的同时,做好HPV基因分型检测也十分必要[8]。
HC2检测是目前临床HPV检测领域的金标准[9],HC2阴性预测值很高,因此对于HPV阴性的人群,其筛查宫颈病变的时间可以延长到3~5年,对于持续高危,适当缩短筛查时间至半年,因为这一人群有20%~25%在4年内发展为CINⅢ和浸润癌。20~39岁生育年龄段女性为高发年龄段,另外,50岁以上免疫力低下,易感染HPV,因此必须定期筛查[10,11]。本研究中结果显示,罹患宫颈癌及癌前病变的女性以青中年为主。TCT检查、HPV检测与病理的符合率是随着病理级别的上升而上升的。单次TCT检查的假阳性率达38.89%,假阴性率高达41.25%。CINⅢ及宫颈癌与高危型HPV感染密切相关,其中以HPV16、18、58为主。结果表明高危HPV感染是宫颈癌及癌前病变发病的主要致病因子,HPV16型感染易导致宫颈高度病变;HC2联合液基细胞学检测能最大程度地发现宫颈异常细胞并及时发现宫颈癌的诱因。
摘要：目的 探讨第二代基因杂交捕获(HC2)法检测人乳头瘤病毒(HPV)分型基因对宫颈癌前病变的诊断作用及意义。方法 选择北京市顺义区妇幼保健院2009年1月～2012年1月不同年龄妇女宫颈脱落细胞标本2400例,采用HC2法检测高危型HPV-DNA,并与液基薄层细胞检测(TCT)进行对比,异常患者行病理组织学检查,以病理结果为金标准,比较HC2法与TCT的诊断效果。结果 罹患宫颈癌及癌前病变的女性以青中年为主。TCT检查、HPV检测与病理的符合率是随病理级别的上升而上升。CINⅢ及宫颈癌与高危型HPV感染密切相关,其中以HPV16、18、58为主。结论 高危HPV感染是宫颈癌及癌前病变发病的主要致病因子,HPV16型感染易导致宫颈高度病变;HPV-DNA联合TCT能最大程度地发现宫颈异常细胞并及时发现宫颈癌的诱因。