基因亚型

基因亚型（精选6篇）

基因亚型 篇1

乙肝病毒(hepatitis B virus,H BV)会导致急慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌等肝脏疾病,每年全球约3.5亿人感染,约1.2亿人死于乙肝炎[1,2,3]。目前乙肝病毒按照全基因序列>8%的差异,可以分为A、B、C、D、E、F、G和H共8类,不同基因型有不同的地理分布:基因型B和C流行于亚洲,基因型A和D流行于非洲、欧洲和印度,基因型E流行于西非,基因型F流行于流行于中南非,基因型G流行于法国、德国和北美,基因型H流行于拉丁美洲。其中基因型B分为6类亚型,基因型C分为4类亚型。亚基因型Ba被认为是亚基因型Bj与基因型C型的重组,亚基因型Ba流行于中国大陆,亚基因型Bj流行于日本[4,5,6,7]。不同H BV基因型感染与临床症状和预期治疗效果有很大的关系。利用抗病毒核苷酸类药物拉米夫定和阿德福韦酯治疗乙肝,不同基因型有不同的疗效和耐药反应,由于治疗技术和乙肝病毒本身都在不断改进和进化,乙肝病毒产生许多突变体和重组类型,这给乙肝防治工作带来了更大挑战[8,9,10],分析中国乙肝病毒基因型和基因亚型比例和重组类型,有利于乙肝病的防治。

1 材料和方法

以现在已经正式在美国N CBI中登记的H BV全基因序列为研究对象,利用PubM ed工具,在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=nuccore&cm d=search&term=H BV中输入“hepatitis B virus,com plet nucleotide sequence,China”,检索出合计998条H BV全序列核苷酸,点击FA STA下载H BV全序列,随机抽取H BV全序列核苷酸111条,利用ClustalX 2.0软件分析中国乙肝病毒基因型和基因亚型比例。参照文献A nna K ram vis(2008)[11]等的系统发育图,选取H BV基因型A、B1、B2、B3、B4、B5、B6、C1、C2、C3、C4、D、E、F、G和H的标准核苷酸序列各一条做标准。为了图片清晰好看,将111条核苷酸分成3部分,分别与标准核苷酸进行系统发育聚类。

2 结果与分析

从附表可以看出,从N CBI上随机取出的111例H BV全基因序列,基因型A有4例,占总数的3.6%;基因型B有21例,占总数的18.9%,其中B1有4例,占总数的3.6%,B2有17例,占总数的15.3%;基因型C有65例,占总数的58.6%,其中C1有57例,占总数的51.4%,C2有6例,占总数的5.4%,C3有2例,占总数的1.8%;基因型D有3例,占总数的2.7%;基因型G有7例,占总数的6.3%;基因型E、F和H没有在随机样本中发现。

同时在随机取出的111例H BV全基因序列中,发现A/B重组型1例,A/G重组型1例,C/G重组型1例,C/D基因型3例。

3 讨论

在中国发现了A、D和G型乙肝病毒,基因型A和D原本流行于非洲、欧洲和印度,基因型G原本流行于法国、德国和北美,说明国际人员交流扩大,乙肝病毒的交流也“扩大”了。重组是乙肝病毒进化的重要原因之一,发现了6例重组株系,其中有A/B、A/G和C/G各1例,C/D重组3例。人员交流将A、D和G型原型带入中国,可能会不可避免其与流行于中国的乙肝病毒B和C型混合感染并发生重组。在中国,乙肝病毒主要以B和C型为主,没有发现E、F和H型,与其他人的研究结论一致。以上初步结论是基于利用ClustalX 2.0软件分析中国乙肝病毒基因型和基因亚型比例和重组得出的,较为粗糙;H BV发生重组,原因与H BV基因的表达和病毒复制的差错有关系,也可能与目前临床上普遍采用的核苷酸类药物如拉米夫定和阿德福韦酯等有关系,也就是乙肝病毒发生重组与其自身繁殖的环境改变有关系。中国乙肝病毒基因型和基因亚型比例和重组的准确而详细的信息应从乙肝病人血清中分离H BV,并测序比对。

在临床上,基因型A感染与性行为有一定关系,H CC患者中,基因型B的病毒载量高于C基因型患者,基因型C比基因型B感染更容易导致活动性肝病,基因型D感染者多无症状且H BeA g血清转换较早,基因型F感染者H BeA g阴性较多。不同基因型感染者具有不同的病症,药物的开发和个体给药就要有针对性。

参考文献

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基因亚型 篇2

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2011年9月至2012年8月在四川大学华西第二医院妇科门诊就诊和住院的女性患者29832例,年龄18~87岁,平均36±9岁。其中2398例具有宫颈活检组织病理诊断结果,并根据其组织病理学结果进行分组:慢性宫颈炎组599例,CINⅠ组437例,CINⅡ/Ⅲ组906例(其中CINⅡ338例,CINⅢ568例),宫颈癌组456例(其中宫颈鳞癌421例,腺鳞癌21例,腺癌14例)。

1.2 仪器与试剂

Life Pro PCR基因扩增仪TC-96/T/H购自杭州博日科技有限公司,亚能恒温杂交仪YN-H16和HPV基因分型检测试剂盒均购自深圳亚能生物技术有限公司。

1.3 研究方法

采用HPV基因分型检测试剂盒进行HPV检测,经过样本DNA的提取,反向PCR扩增,杂交,洗膜,显色,对所有宫颈脱落细胞进行23种HPV亚型检测,包括18种高危型HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4)和5种低危型HPV(HPV6、11、42、43、44)。判读标准:任何一种HPV亚型阳性为HPV感染,两种或以上HPV亚型阳性为HPV多重感染,高危型HPV阳性或高危型和低危型HPV同时阳性者为高危型HPV感染,仅低危型HPV阳性为低危型HPV感染。

1.4 统计方法

运用SPSS 18.0进行统计学处理,对各年龄组及不同宫颈病变HPV感染率比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV感染率及基因亚型分布

HPV感染率为25.20%(7518/29832),高危型HPV感染率为21.03%(6275/29832),低危型HPV感染率为4.17%(1243/29832),多重感染率为5.94%(1772/29832)。所有样本检测到23种亚型中21种,未检测到HPV MM4和HPV44。高危型HPV亚型由高到低依次为HPV16(8.15%,2431)、58(4.40%,1312)、33(2.24%,668)、52(2.11%,628)、18(1.75%,521)、56(1.50%,447)、66(0.89%,265)、31(0.86%,257)、35(0.82%,245)、68(0.73%,219)、59(0.46%,137)、53(0.46%,137)、45(0.23%,68)、83(0.19%,56)、73(0.16%,47)、51(0.15%,46)、39(0.05%,14)。低危型HPV亚型由高到低依次为HPV43(3.14%,938)、6(2.84%,846)、11(1.33%,396)、42(0.60%,178)。2.2 HPV感染的年龄分布将29832例患者按不同年龄分成5组,<25岁组HPV感染率为25.27%(867/3431),25~34岁组HPV感染率为22.05%(2402/10892),35~44岁组HPV感染率为25.42%(2697/10611),45~54岁组HPV感染率为29.12%(1153/3959),≥55岁组HPV感染率为42.49%(399/939),各年龄组别HPV感染率差异有统计学意义(P<0.001)。除<25岁组外,HPV感染率随年龄增加而增高。HPV感染率在≥55岁组呈现感染高峰,感染率为42.49%。并且各年龄组HPV感染亚型均以高危型为主,尤其以HPV16最多见。

2.3 不同宫颈病变患者HPV感染率及亚型分布

在2398例宫颈病变患者中,HPV感染率为70.39%(1688/2398),在慢性宫颈炎中为38.90%(233/599),CINⅠ为59.73%(261/437),CINⅡ/Ⅲ为83.55%(757/906),宫颈癌为95.83%(437/456)。各组间比较,差异均有统计学意义(P<0.001)。宫颈癌中HPV感染率鳞癌为95.96%(404/421),腺癌为92.86%(13/14),腺鳞癌为95.24%(20/21)。随着宫颈病变的严重程度增加,HPV感染率增高。在2398例宫颈病变中,常见的高危型HPV依次为16、58、33、18、52,感染率分别为36.41%(873)、14.26%(342)、5.96%(143)、5.21%(125)、5.09%(122)。在宫颈癌中,宫颈鳞癌中常见的高危型HPV依次为HPV16、18、58、33、52,宫颈腺癌中仅检出3种HPV型别,依次为HPV16、33和18,宫颈腺鳞癌中也仅检出3种HPV型别,依次为HPV16、18和52;在CINⅡ/Ⅲ中依次为16、58、33、52、18;在CINⅠ中依次为HPV16、58、52、56、33,在慢性宫颈炎症中则为HPV58、16、52、33、56。见表1。

2.4 HPV单一感染和多重感染与宫颈病变的关系见表2。

在所有1688例HPV阳性的宫颈病变组中,单一感染比例为74.35%(1255/1688),多重感染比例为25.65%(433/1688)。HPV阳性的不同程度宫颈病变中均以单一感染为主。除慢性宫颈炎组外,单一感染比例随宫颈病变程度增加而增加,CINⅠ、CINⅡ/Ⅲ和宫颈癌的单一感染所占比例分别为69.73%,70.41%和84.67%,宫颈不同病变组相比,差异有统计学意义(P<0.001)。在1255例单一感染病例中,HPV为最常见的亚型,有637例,占单一感染病例的50.76%。

3 讨论

3.1 HPV感染率及亚型分布存在地区差异

本研究对29832例妇女进行了宫颈脱落细胞HPV分型检测,HPV感染率为25.20%,并且以高危型HPV感染为主,高于其他文献基于普通人群的调查报道,这可能与本研究中妇女多为门诊就医人群有关。从全世界范围内来看,最常见的HPV亚型为16,其次为18,其他亚型(如58、52、33等)分布存在地区差异。Munoz等[3]通过抽样调查研究发现,人群中HPV型别分布与导致宫颈癌的HPV型别分布类似,常见的HPV亚型是16、18、45、31、58、33、35。在本研究中,HPV16为最常见的亚型,HPV58和52同样较为常见,这与我国其他地区以往的报道相似[4,5]。而在西方国家较为常见的HPV18在本组病例中相对较少,并且不太常见的HPV33感染率也很高,这进一步说明了HPV感染型别分布存在一定的地区差异。本研究结果分析了女性感染HPV基因亚型分布和排序,为临床防治宫颈癌提供了流行病学依据,对提高宫颈癌防治水平和维护妇女健康具有重大意义。

3.2 HPV感染与年龄的关系

关于HPV感染与年龄分布是否具有相关性目前观点不一。国内外研究报道显示,HPV感染率随年龄的增长呈现“U”型分布,或者呈下降趋势[6]。本研究将所有妇女分为5个年龄组,HPV感染率在各年龄组中差异有统计学意义,除<25岁组外,HPV感染率随年龄增加呈现增高趋势,在≥55岁组中出现高峰,感染率高达42.49%。上述结果可能与≥55岁年龄段妇女样本量相对较少,多因明显异常前来就诊有关。本研究与周庆云等[7]报道结果相似,HPV感染率在>45岁组明显高于36~45岁组和<36岁组,HPV感染率随年龄增加而增高。而与Liu等[8]报道在广州地区HPV感染率在20~29岁组最高,在40~49岁组和>60岁组则相对较低,而在中国香港地区的宫颈癌人群和普通人群中HPV感染率均在20~29岁组最高,在40~49岁组最低。但无论HPV感染是否与年龄分布相关,本研究结果提示应重视对中老年妇女进行宫颈癌的筛查及防治教育。年轻女性由于机体自身免疫功能较强,HPV感染比较常见且容易清除,可积极进行定期随访,以免引起不必要的忧虑。而对于中老年妇女,随着年龄的增长,机体免疫功能减弱和雌激素水平降低,对病毒的清除功能减弱,故HPV感染几率增高,且高危型持续性感染的可能性较大;另外,可能自我保健的意识相对较弱,从而导致宫颈癌的发生。因此,加强中老年妇女宫颈癌筛查的力度及防治教育刻不容缓。

3.3 HPV感染与宫颈病变的严重程度有关

持续性高危型HPV感染是宫颈癌及其癌前病变发生的必要条件。Munoz等[3]发现,90%以上的宫颈癌伴有HPV感染,在宫颈癌及癌前病变中,主要感染型别为16、18型。我国的宫颈癌患者最常见的HPV感染为16、18型,其他型别依次为58、52、31、33、45型[9]。本研究结果显示,随着宫颈病变严重程度的增加,HPV感染率(特别是HPV16)均呈增高趋势,说明了HPV感染与宫颈病变的发生密切相关。本研究宫颈癌组HPV感染率为95.83%,病理类型多为宫颈鳞癌,常见的高危型HPV依次为16、18、58、33、52型,符合我国大部分地区的人群分布,与Li等[10]报道四川省成都市的宫颈癌患者HPV感染常见的型别16、58、18、31、33型有所不同,提示在本地区31和52型在宫颈癌中同样较为常见。此外,因腺癌和腺鳞癌较少,不能做相关评估和分析,待今后积累更多样本做进一步分析报道。本研究CINⅡ/Ⅲ中HPV感染率为83.55%(757/906),常见的高危型HPV依次为16、58、33、52、18,相比于宫颈癌组,HPV58比HPV18更为常见。在其他组中常见的类型与宫颈癌组和CINⅡ/Ⅲ组相似。目前商业化的HPV预防性疫苗针对宫颈癌只能保护HPV16、18两型的感染,因此,明确导致宫颈病变的主要型别,可为研制适合的HPV疫苗的应用提供充分的流行病学资料。

3.4 单一感染更易导致宫颈癌的发生

由于HPV型别众多,机体可以同时单一感染或同时感染多个型别。对于多重感染是否促进宫颈病变的发展目前研究观点不一。有的学者认为HPV的多重感染出现持续性感染的危险性更大,而HPV的持续感染是宫颈病变发生的直接原因,认为多重感染易导致宫颈病变[11]。有学者认为HPV多重感染并不增加宫颈癌的发生,HPV感染的型别数与宫颈病变的级别无关[3]。本研究结果与第二种观点较为一致。在HPV阳性的不同程度宫颈病变中,除慢性宫颈炎组外,单一感染所占比例随宫颈病变严重程度的增加而增高,由CINⅠ组的69.73%上升到宫颈癌组的84.67%,宫颈不同程度病变相比差异有统计学意义(P<0.001),在一定程度上可说明单一感染可能对宫颈癌的发展起促进作用,但具体机制尚待更多深入的研究。此外,本研究中单一感染中最常见的亚型为HPV16,占单一感染病例的50.76%,提示在临床工作中应该尤其重视对感染HPV16患者的密切随访和治疗,做到早发现、早治疗,降低宫颈癌的发生。

综上所述,本研究HPV感染最常见的亚型为16、58、33、52、18。HPV感染率随年龄增加而呈增高趋势。在不同宫颈病变中,HPV的感染率随宫颈疾病严重程度的增加而增高,并且型别分布有所不同。此外单一感染可能更易导致宫颈癌的发生。

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基因亚型 篇3

为了解江苏地区H9N2亚型AIV的遗传变异情况,本研究对2014年从江苏淮安地区禽类外环境中分离的7株H9N2亚型AIV的HA基因进行序列分析, 从分子生物学角度了解江苏淮安地区H9N2亚型AIV的变异情况,为有效降低该亚型禽流感在本地区的危害,控制禽流感的流行提供分子生物学数据支持。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1病毒和鸡胚7株毒株由本实验室于2014年1— 12月从淮安地区的活禽交易市场中污水、案板、禽类粪便中分离。这7株病毒分别为:A/environment/Jiang su/ha010/2014,A/environment/Jiangsu/ha012/2014,A/environment/Jiangsu/ha015/2014,A/environment/Jiangsu/ha 017/2014,A/environment/Jiangsu/ha302/2014,A/environ ment/Jiangsu/ha303/2014,A/environment/Jiangsu/ha306/2014。7株病毒名称简称为ha010,ha012,ha015,ha017, ha302,ha303,ha305。

采用10日龄SPF鸡胚进行病毒分离培养,SPF鸡胚购自南京乾元号生物制品有限公司。

1.1.2试剂和引物核酸提取采用台塑公司核酸自动提取试剂盒,荧光定量PCR检测采用硕士生物公司H9N2亚型试剂盒,ABI7300型PCR仪检测。逆转录用美国Super Script Ⅲ Reverse Transcriptase试剂盒 ,eppendoff恒温混匀仪。逆转录 - 聚合酶链反应(RT-PCR) 采用宝生物工程(大连)有限公司的Ta Ka Ra Ex Taq试剂盒,ABI Gene Amp 9700 PCR仪。PCR产物纯化用QIAGEN公司的Min Elute Gel Extraction Kit试剂盒。

HA基因的引物参照文献[4],由南京金斯瑞生物有限公司合成。上游引物F:5’-TATTCGTCTCAGGGAGGG AAAGCAGGGG-3’,下游引物R:5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3’。

1.2方法

1.2.1病毒的初步鉴定首先对采集来的各类外环境标本用H9N2亚型荧光PCR试剂盒进行检测,将阳性标本加双抗处理后接种鸡胚尿囊腔,3天后收集尿囊腔液体,提取病毒总RNA,再次检测H9N2亚型是否阳性。鸡胚接种在BSL-3实验室中完成。

1.2.2病毒的逆转录采用20 μl的c DNA合成体系, 取6 μl的RNA,加入1 μl Oligo(d T)Sz A,1 μl d NTP Mix,5 μl water,置65 ℃反应5 min,冰浴1 min,加入5×First-strand Buffer 4 μl,0.1 mol/L ILDTT 1 μl,RNase OUT Recombinant RNase Inhibitor 1 μl,SuperscriptⅢ RT 1 μl,置50 ℃反应45 min,70 ℃反应15 min,所得即为逆转录产物。

1.2.3 HA基因RT-PCR扩增采用50 μl反应体系, 取1.5 μl逆转录产物,加入上、下游引物各2 μl;,缓冲液2.5 μl,Mg Cl22.5 μl,Taq DNA聚合酶0.5 μl,DEPC水31 μl,置于PCR仪中进行扩增。94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性20 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸7 min,进行30个循环;72 ℃再延伸7 min。所得即为PCR扩增产物。

1.2.4电泳和纯化取25 μl扩增产物,用1%琼脂糖凝胶电泳后,切下目的片段,按纯化试剂盒说明操作,得20 μl回收产物。送上海生工生物技术有限公司测序。

1.2.5基因序列分析应用DNAstar7.1软件对所测序列拼接,登陆Gen Bank,下载H9N2亚型代表序列与所测毒株序列进行比较分析。

1.2.6系统进化树的构建应用Mega5.0软件构建HA基因核苷酸序列进化树,分析所测毒株的进化情况。

2结果

2.1病毒的初步鉴定结果本试验共采集各类外环境标本284份,荧光PCR检测出11份H9N2亚型阳性标本,经过鸡胚培养后,分离到7株H9N2亚型AIV毒株。

2.2 HA基因c DNA RT-PCR扩增以病毒RNA为模版,利用通用性引物,通过RT-PCR方法,扩增出约为1700kb大小的特异性条带,其长度与预期相符合。电泳结果见图1。

2.3 HA基因氨基酸序列分析经过测序,共获得7株H9N2亚型AIV的HA基因的c DNA全序列,总长度约为1 742 kb,包含了一个完整的开放读码框(ORF), 编码区由1 683 bp组成,编码560个氨基酸。通过对HA基因的氨基酸序列分析,7个毒株的HA裂解位点的序列均为RSSR↓GLF,裂解位点附近无连续性碱基插入,符合低致病性禽流感的特征。

2.4HA基因c DNA序列的同 源性比较这7株H9N2亚型AIV的HA基因核苷酸序列之间的同源性为97.6%~99.2%,其中ha302与ha305的HA相似度最高,为99.2%,与代表毒株A/Chicken/Beijing/1/94的HA核苷酸序列同源性为95.9%~96.6%, 与国外代表毒株A/Turkey/Wisconsin/66的HA核苷酸序 列同源性 为82.4%~83.2%。见表1。

2.5H9N2亚型HA基因的遗传发生关系见图2。从本研究建立的HA基因进化树发现,淮安地区分离的株H9N2亚型AIV属欧亚分支中的BJ94-like亚系,与临近地区分离毒株的亲缘关系较近。而与Y439-like亚系的亲缘关系较远。

注:对角线(a 的连线)右上方为核苷酸同源性结果;左下方为核苷酸差异性结果。

3讨论

通过基因序列分析,江苏淮安地区2014年禽类外环境中分离的7株H9N2亚型禽流感HA基因之间的同源性最高达到99.2%。禽流感病毒HA蛋白是病毒重要的表面糖蛋白,包含与病毒生物功能相关的多个功能域[5],当这些区域的氨基酸发生变化时,会导致病毒的某些生物学功能的改变[6]。已有研究发现,高致病性禽流感病毒的裂解位点附近会有多个碱性氨基酸的插入,而低致病性毒株的裂解位点附近一般只有1个或没有碱性氨基酸的插入[7],本研究中的7个毒株均为低致病性禽流感病毒。考虑到这几株毒株分离的时间和地点较近,推断他们可能有一个共同的起源。

Guo等[8]认为,H9N2亚型毒株在进化关系上可分为欧亚系和北美系,欧亚系又至少分为3个亚系,代表株分别 为A/Quail/Hong Kong/G1/97、A/Chicken/Beijing/1/94和A/Duck/Hong Kong/Y439/97 ,这3个亚系被称为G1-like、BJ94-like和Y439-like 。从进化树中可看出,此次分离的7株毒株与历年来江苏地区分离到的毒株亲缘关系很近,与相邻的上海、安徽地区的毒株进化关系较近,同属欧亚分支中的BJ94-like亚系,与我国大部分分离株亲缘关系较近。广东与广西地区的毒株也有较近的进化关系,可见禽流感病毒进化有比较显著的区域特点。近年来的HA基因进化分析显示, 我国南部的H9N2禽流感病毒已在鸡群中形成了较为稳定的繁衍体系[9]。另外,从系统进化树中还可看出,近年来江苏省所有分离的H9N2亚型禽流感病毒毒株都属同一亚系,提示HA基因现在可能处在一个比较稳定的进化过程。

自1966年在北美威斯康辛州火鸡中第1次分离到H9N2亚型AIV[10],之后在全球多地检测到H9N2亚型AIV,此亚型在亚洲的多个国家流行。1994年我国首次从广东省鸡群中分离到H9N2亚型AIV[11],此后该病毒成为了我国大陆家禽中广泛流行的AIV之一。根据研究发现,1997年中国香港地区感染人的H5N1病毒的基因片段部分来源于H9N2亚型[12]。1998年,我国大陆地区首先发现H9N2亚型AIV可以感染人类[13],1999年香港地区发生了人直接感染H9N2亚型AIV的病例[14]。2013年,安徽省和上海市发现了人感染的一种新型、重配的禽源性(H7N9)流感病毒,其内部6个基因均来自H9N2亚型AIV[15]。从以上情况可以看出, H9N2亚型AIV在禽类中是普遍存在的,感染率较高, 对人是低致病性的。因流感病毒的种型多样,变异性较大,特别是HA基因的突变频率最高,H9N2亚型作为其他流感病毒变异的基础毒株,其基因片段具有重排在新暴发的流感病毒中的趋势,变成对人类高致病性的禽流感病毒,而且这种基因重排现象十分复杂,人群对这类新型禽流感病毒普遍没有免疫力,这些新型病毒给人类带来的疾病负担会大大增加。因此,进行H9N2亚型AIV的分子生物学监测研究对禽流感流行的防控具有重要意义。

作者声明本文无实际或潜在的利益冲突

摘要：目的 了解江苏地区H9N2亚型禽流感病毒的遗传变异情况及分子生物学流行规律。方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术对7株从江苏淮安地区分离的H9N2亚型禽流感病毒的血凝素(HA)基因进行扩增和测序,并对所获得的HA基因序列与该亚型的代表毒株进行同源性分析,构建系统进化树。结果 7个分离株核苷酸同源性达97%以上,与临近省份分离毒株同属国内常见的BJ94-like亚系。7株毒株HA裂解位点的氨基酸序列均为RSSR↓GLF,为低致病性禽流感病毒。结论 2014年江苏省H9N2禽流感病毒进化相对比较稳定,此7株毒株可能有着相同的起源。

基因亚型 篇4

1 资料与方法

1.1 一般资料

2010年3月-2012年12月本院骨科门诊HLA-B27阳性的AS确诊患者100例 (符合1983年修订的纽约标准) , 男81例, 女19例, 年龄13~70岁, 平均 (29±8.37) 岁;HLA-B27阳性健康对照组30例, 男24例, 女6例, 年龄14~65岁, 平均 (30±6.45) 岁。两组年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 试验仪器与试剂

BDcanto2流式细胞仪由美国BD公司生产, HLA-B27荧光抗体F1 (FITC) 、CD3荧光抗体F2 (PE) 、校准微球和溶血素均来自BD公司。PCR仪器购自上海宏石SLAN, 高速离心机购自ACI公司, 型号PK121R。电泳仪购自Bio-Rad公司, 型号Pvower PAC200, 全血DNA提取试剂盒、PCR试剂盒购自宝生物大连有限公司, DNA测序仪由美国ABI公司生产, 型号3130。

1.2.2 应用流式细胞术定性检测外周血T淋巴细胞HLA-B27

定性检测:抽取HLA-B27阳性AS患者及HLA-B27阳性健康对照组外周静脉血100 u L, EDTA抗凝, 采用BD公司HLA-B27试剂盒, 按照说明书步骤进行, 在BDcanto2流式细胞仪上检测, 结果判断为阴性/阳性。

1.2.3 HLA-B27基因亚型测定

采用PCR-SSP (序列引物扩增法) 技术检测HLA-B27阳性AS患者及HLA-B27阳性健康对照组HLA-B27亚型的DNA。酚氯法提取外周血液细胞DNA, 按照WHO2009年公布的44个HLA-B27等位基因, 选择相关亚型的引物试剂盒, 进行DNA扩增, 凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终产物。

1.2.4 HLA-B27亚型的m RNA定量

荧光实时定量RT-PCR技术检测HLA-B27阳性AS患者及HLA-B27阳性健康对照组HLA-B27亚型的m RNA, Trizol法提取外周血液细胞RNA, 逆转录为c DNA, 荧光实时定量扩增, 观察和记录结果。1.3统计学处理采用SPSS 10.0统计软件, 计量资料用 (x-±s) 表示, 两组HLA-B27m RNA表达水平比较采用t检验, 对HLA-B27m RNA表达水平与强直性脊柱炎患者疾病活动指数进行Pearson相关统计分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 100例HLA-B27阳性AS患者检出HLA-B2704亚型5 5 例, HLA-B2705亚型45例, 30例HLA-B27阳性健康对照组检出HLA-B2704亚型13例, HLA-B2705亚型12例, HLA-B2706亚型3例, HLA-B2709亚型2例。

2.2 100例HLA-B27阳性患者HLA-B27m RNA表达水平最低值为1.16, 最高值为37.01, 均值 (7.77±6.19) , 30例HLA-B27阳性健康对照组表达水平最低1.05, 最高值2.10, 均值 (1.51±0.27) , 两组比较差异有统计学意义 (P=0.002) ;HLA-B27阳性患者HLA-B27m RNA表达水平与强直性脊柱炎患者疾病活动指数密切相关 (R=0.707) 。

3 讨论

AS是一种主要累及中轴关节的慢性进行性炎症疾病, 临床表现为腰、骶以及下肢关节疼痛, 晚期患者脊柱僵硬、活动受限。我国AS发病率约为0.3%, 多见于中青年男性。AS致残率高, 早期确诊对强直性脊柱炎患者非常重要。目前的AS确诊方法主要是依靠临床表现和影像学、实验室检查结果。AS与HLA-B27关系密切已被公认, 90%以上的AS患者HLA-B27呈阳性。1973年Brewerton和Schlosstein[1,2]首次报道HLA-B27与AS相关以来, AS是迄今已知的HLA-B27与疾病关联最强、最典型的疾病。因此临床研究中找出本地区HLA-B27基因亚型及基因亚型表达量与AS的病情关系, 为本地区AS的诊治提供理论和临床依据具有重要意义。

研究显示, HLA-B27亚型在不同的种族和地区中分布情况不同。2009年WHO正式命名的HLA-B27等位基因已达44个, 不同亚型有着不同的地域和人种分布特点[3], 如B2705亚型几乎见于所有人种, 但B2703亚型主要见于西非人群, 而B2704亚型则是中国汉族人的优势亚型。另外HLA-B27同一亚型在不同人群中与AS的关联也可不同。有报道认为, 2705、2704、2702亚型与AS的发生呈正相关, 而2703、2708、2709、2707与AS的发生呈负相关[4,5,6], 而2706亚型则被普遍认为是AS的保护性基因。本研究显示:本地区HLA-B27阳性患者仅发现2704与2705亚型, 且2704亚型占55%, 2705亚型占45%, HLA-B27阳性健康者发现4种亚型, 2704亚型占43.33%, 2705亚型占40%, 2706亚型占10%, 2709亚型占6.7%。揭示本地区主要亚型分布为2704亚型与2705亚型, 且2704亚型为优势亚型, 而2706亚型及2709亚型仅见于HLA-B27阳性健康者, 提示2706亚型及2709亚型为本地区保护亚型。

HLA-B27在AS发生中的病理作用目前尚不十分清楚。作为一种重要的免疫分子, HLA-B27主要功能是与抗原结合并将其提呈给T淋巴细胞, 这一功能在AS和正常人中都有表现。HLA-B27重链可以形成同源二聚体, 大多数AS患者T淋巴细胞都能表达这种二聚体的配体, 这说明HLA-B27重链二聚体可能参与了AS的病理发生过程, 而HLA-B27可能在免疫过程中具有重要作用[7,8]。因为通过检测HLA-B27基因亚型无法有效区分AS患者及HLA-B27阳性健康人, 采用定量PCR检测HLA-B27m RNA表达有可能解决这一问题。本研究对HLA-B27阳性AS患者及HLA-B27阳性健康对照组均进行了RT-PCR技术检测, 发现两组HLA-B27m RNA表达量差异有统计学意义 (P=0.002) , HLA-B27阳性AS患者呈现高表达, 而HLA-B27阳性健康对照组呈现低表达。这也说明了本地区虽然HLA-B27基因亚型无论是AS患者或是健康人均是2704及2705, 基因亚型高表达者患病, 低表达者未患病。同时提示基因型低表达的HLA-B27阳性健康者随着基因亚型表达量增加可能成为AS患者, 因此临床工作中对HLA-B27阳性健康人进行RT-PCR技术检测HLA-B27m RNA表达量, 作为一种辅助诊断的有效手段, 可以更早期发现AS患者, 使AS的防治真正达到早发现、早诊断、早治疗, 将AS的致残率降到最低。

AS患者关于其疾病活动性评价, 目前临床大多数专家认可的、应用最为广泛的是毕氏强直性性脊椎炎疾病活动指数 (BASDAI) , 它与腰椎MRI急性炎症评分有很好的一致性[9], 虽然新的直性脊柱炎病情活动度评分 (ASDAS) 在判断AS患者病情活动度时的敏感性稍高[10], 但毕氏法仅需患者对自身病情的主观评价, 无需MRI及过多的抽血化验等高成本检查, 在中国仍最常用, 能够反映患者的病变活动性。本研究发现HLA-B27阳性患者HLA-B27m RNA表达水平与AS患者毕氏疾病活动指数密切相关 (R=0.707) , 这也为进一步从分子水平治疗AS提供了有力证据, 未来可能通过转录水平的调控, 降低AS患者的HLA-B27m RNA表达量来减轻AS患者的病情。但HLA-B27是人类基因中的一个等位基因, 具有高度的多态性, 不同地区及种族中存在明显差异, 仍需进一步从转录、翻译调控等分子水平作更多的研究[11]。总之, 本研究揭示本地区HLA-B27基因主要致病亚型和可能的保护亚型, 并从分子转录水平揭示了HLA-B27基因动态表达量与强直性脊柱炎患者疾病活动指数相关性, 为临床及早防治AS提供了新的理论依据, 具有重要临床意义。

摘要：目的:探讨不同HLA-B27基因亚型与强直性脊柱炎的相关性及其动态表达量与强直性脊柱炎疾病活动指数 (BASDAI) 的关系。方法:收集骨科门诊强直性脊柱炎患者应用流式细胞术定性检测HLA-B27阳性100例, HLA-B27阳性健康对照组30例, 通过PCR-SSP (序列引物扩增法) 技术检测HLA-B27基因亚型;荧光实时定量RT-PCR技术检测HLA-B27阳性AS患者及HLA-B27阳性健康对照组HLA-B27亚型的mRNA, 统计分析两组HLA-B27mRNA表达量及HLA-B27阳性患者HLA-B27mRNA表达水平与强直性脊柱炎患者疾病活动指数的相关性。结果:100例AS患者检出HLA-B2704亚型55例, HLA-B2705亚型45例, 30对照组检出HLA-B2704亚型13例, HLA-B2705亚型12例, HLA-B2706亚型3例, HLA-B2709亚型2例;HLA-B27阳性患者HLA-B27mRNA表达水平最低值为1.16, 最高值为37.01, 均值7.77, HLA-B27阳性健康对照组表达水平最低1.05, 最高值2.10, 均值为1.51, 两组差异有统计学意义 (P=0.002) ;HLAB27阳性患者HLA-B27mRNA表达水平与强直性脊柱炎患者疾病活动指数密切相关 (R=0.707) 。结论:本地区AS患者HLA-B27基因亚型以B2704和B2705为主, B2706及B2709可能为保护亚型;HLA-B27阳性患者HLA-B27mRNA表达水平高于HLA-B27阳性健康者;HLAB27阳性患者HLA-B27mRNA表达水平与强直性脊柱炎患者疾病活动指数呈正相关。

基因亚型 篇5

资料与方法

2014年6月-2015年10月筛选在我院进行常规体检的健康妇女800例作为研究对象, 年龄22~80岁, 平均48.2岁。

方法:结合安捷伦Mx3000P实时定量荧光聚合酶链反应检测仪和HP-HPV分型核酸测定试剂盒对宫颈高危型乳头状瘤病毒的感染情况进行检测, 同时分析其基因亚型分布状况, 并结合妇女的年龄分组分析其感染率[2]。首先取得组织样本后, 在样本管中加入1 m L生理盐水, 吸取液体后将其转移至1.5 m L EP管中进行离心5 min, 离心力设置为6 000 g, 弃上清后再加无菌生理盐水1 m L进行同离心力离心5 min, 进行样本洗涤[3], 将得到的沉淀加入提取液50μL, 混匀后在100℃下裂解10 min后进行离心5 min、离心力6 000 g, 然后取上清4μL作为反应模板, 然后在PCR检测仪上进行扩增, 得到相应的Ct值后进行数据统计分析[4]。

统计学方法:采用SPSS 21.0软件包对数据进行分析统计, 计量资料采用 (±s) 表示, 组间对比则采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

结果

800例妇女中, 88例妇女有HPV病毒感染, 其感染率11.0%, 在亚型分布中居于前5位的分别是HPV 52、HPV39、HPV 58、HPV 68、HPV 56, 见表1。

年龄分段分析中显示, 50~59岁的年龄检出率明显高于20~29岁年龄段, 差异具有统计意义 (P<0.05) , 见表2。

讨论

HPV是一种具有约8 000个碱基对的双链闭环的小DNA病毒, 是具有外壳蛋白质抗原的嗜上细胞病毒的总称, 其主要分为高危型和低危型HPV, HPV病毒包含八个早期的开放读码框以及两个晚期读码框和一个非编码长链区。早期的不同亚型编码区对细胞的生长刺激、蛋白抑制以及抑癌基因的促进结合等作用导致细胞增殖失调, 同时DNA损伤修复功能受到损伤, 从而引发患者出现癌前病变并进一步转变为癌症病症。晚期编码区则是主要形成衣壳蛋白而组装成病毒的衣壳。目前HPV的亚型较为众多, 同时由于其生物学功能的差异, 将其分为高危型和低危型, 高危型病症与患者的癌前病变密切相关, 在宫颈癌的发生发展过程中, 高危型HPV感染在宫颈癌的诱发中起着重要作用[5], 而低危型则主要与生殖系统和泌尿系统的病变相关, 主要是引起女性外生殖器部位的湿疣类病变[6]。在宫颈癌病症的早期筛查和诊断中加强HPV的检测非常关键, 是防控宫颈癌发生的重要监测指标。HPV感染是一种全球卫生健康问题, 在女性宫颈癌的防治中起着重要作用, 目前HPV疫苗已经在美国认证上市, 主要在预防亚型16和18感染中有较好的作用, 对宫颈癌前病变和宫颈癌有较好的预防作用, 同时HPV的基因分布在不同的国家也不同, 其流行病学调查资料目前还没有统一数据, 因此建立HPV感染的完整的基因分布数据库非常关键。根据分布差异实施有针对性的病症防控, 对女性生殖健康有更重要的意义。

本研究中, 800例妇女中有88例妇女检测到HPV病毒感染, 其感染率11.0%, 在亚型分布中居于前五位的分别是HPV 52、HPV 39、HPV 58、HPV68、HPV 56, 同时在年龄分段分析中显示50~59岁的年龄检出率明显高于20~29岁年龄段, 差异具有统计意义 (P<0.05) 。因此, 在妇女健康体检中对高危型人乳头状瘤病毒的筛查显示随着年龄的增加, 其发病率有所增加, 在20~30岁阶段的女性感染率较高与其频繁的性生活有关, 免疫系统受到刺激而出现HPV感染, 而在60岁以上的女性中, 其感染率增高与其机体内的免疫力消失和激素水平的紊乱导致很多处于病毒感染潜伏期的女性出现复活状态, 而在同时, 本研究也显示出感染比率最高的亚型HPV 52, 在临床宫颈癌的筛查和诊断中具有一定的参考意义。

参考文献

[1]岑尧, 张翠英, 张雅丽, 等.中国女性人乳头瘤病毒感染状况及高危型别分布的Meta分析[J].癌症进展, 2013, 11 (1) :75-81.

[2]陈颖, 蓝海鹰, 黄紫艳, 等.健康体检妇女宫颈高危型人乳头状瘤病毒感染情况及基因亚型分析[J].检验医学, 2013, 28 (5) :434-435.

[3]郑鲤榕.治糜灵栓联合LEEP术治疗宫颈上皮内瘤变伴高危型人乳头状瘤病毒感染的临床研究[D].福建中医药大学, 2013.

[4]刘玉萍, 沈太敏, 帅平, 等.成都市健康体检妇女人乳头状瘤病毒感染及基因亚型分析[J].实用医院临床杂志, 2015, 12 (6) :52-54.

[5]韩英.荧光原位杂交技术检测h TERC基因扩增在新疆部分地区宫颈癌早期筛查中的临床意义研究[D].新疆医科大学, 2010.

基因亚型 篇6

1 对象与方法

1.1 甲3亚型病毒及抗血清

25株均来自流感监测哨点医院 (吉林大学第一医院) 的临床标本, 接种MDCK细胞进行培养[5], 并用标准血清 (国家流感中心提供) 进行型别鉴定为H3N2亚型的流感病毒, 且经国家流感中心复核鉴定。

1.2 病毒RNA的提取

新鲜病毒细胞培养液采用德国QIAGEN公司RNeasy Mini Kit提取, 具体步骤参考产品说明书。

1.3 RT-PCR

RT-PCR所用的引物由invitrogen公司合成, 引物1:5’-AGCAAAGCAGGGGATAAT T-3’;引物2:5’-CCTGGATTGCGCCGAAT-3’;引物3:5’-AGCAAAAGCAGGGGAAAAT-3’;引物4:5’-GTAATCCCGTTAATGGCA-3’。逆转录酶、RNAsin、Taq DNA聚合酶均购自美国Promega公司。RT-PCR方法见参考文献[4]。

1.4 PCR产物的纯化及序列测定

RT-PCR产物按照德国QIAGEN公司QIAquick Gel Extraction Kit中QIAquik Spin Handbook所提供的方法进行纯化。

1.5 核苷酸序列测定

纯化产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序, 测序仪为ABI PRISM3730。

1.6 序列分析

序列分析种系发生树的绘制采用Mega 5.10软件中Neighbor Joining方法。并从GenBank中摘录2011-2012年WHO推荐的疫苗株A/perth/16/2009, A/Victoria/361/2011病毒的HA1序列分析, 其收录号为GQ293081、KC306165。

2 结果

2.1 病毒分离和鉴定

2012年1月-2013年6月共采集流感样病例标本695份, 经MDCK细胞分离到病毒58株, 其中H3N2亚型流感病毒24株, 占分离毒株的41.38%。

2.2 基因特性分析

所测定的毒株HA1区蛋白质序列均含329个氨基酸, 与2011-2012年流感H3N2亚型国际疫苗株A/perth/16/2009 (H3N2) 相比, 测定2012年的H3N2亚型流感病毒的HA1序列共有15个氨基酸发生了变异 (见表1) , 其中共同变异的位点7个:62K>E、144K>N、198A>S、212T>A、214S>I、223V>I、312N>S;与2012-2013年流感H3N2亚型国际疫苗株A/Victoria/361/2011相比, 笔者测定2013年的H3N2亚型流感病毒的HA1序列共有13个氨基酸发生了变异 (见表2) , 其中共同变异的位点8个:33Q>R、128T>A、142R>G、145N>S、156Q>H、186V>G、219Y>S、278N>K;2012年2-3月分离的毒株与2012年11月-2013年3月分离的毒株在进化树上处于不同的两个侧枝, 见图1。

3 讨论

流行性感冒是至今尚无法完全控制的急性呼吸道病毒传染病, 是人类面临的主要公共健康问题之一, 也是世界卫生组织第一个列为全球监测的传染病。血凝素 (HA) 和神经氨酸酶 (NA) 是流感病毒的主要表面抗原, HA蛋白可识别靶细胞受体并与受体结合, 具有与宿主细胞融合性, 并能诱导产生保护性中和抗体。HA基因具有高度易变性, 是流感病毒发生抗原性漂移的主要原因。一般认为HA1蛋白分子的氨基酸替换发生4个以上并分布在两个以上的抗原决定簇上具有流行病学意义[1]。

长春地区2012年分离到的H3N2亚型毒株, 有15处位点发生变异, 其中共同变异的位点144K>N涉及抗原决定簇A, 198A>S涉及抗原决定簇B[5];2013年分离到的H3N2亚型毒株有13处位点发生变异, 其中共同变异的位点142R>G、145N>S涉及抗原决定簇A, 156Q>H涉及抗原决定簇B, 278N>K涉及抗原决定簇C[2], 说明长春地区H3N2亚型流感病毒的基因特性已经发生改变, 这种变异具有流行病学意义。同时流感HA抗原性变异的幅度与其引起的流行程度有关, 密切注意流感病毒的抗原性变异情况, 对及时预测其流行情况有着重要的意义[1]。

参考文献

[1]张烨, 温乐英, 李梓, 等.2000-2002年我国流行的甲3 (H3N2) 亚型流感病毒抗原性及基因特性的研究[J].中华实验和临床病毒学杂志, 2004, 18 (1) :16-19.

[2]董丽波, 张烨, 温乐英, 等.1995-2005年中国H3N2亚型人流感病毒血凝素基因变异与流行相关研究[J].病毒学报, 2007.23 (5) :345-349.

[3]许爽, 吴东林, 李响, 等.2007-2008年吉林省H3N2亚型流感病毒HA1基因序列分析[J].中国卫生工程学, 2009, 8 (1) :5-7.

[4]Saiki RK, Gelfand DH, Stottels A, et al.Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase[J].Science, 1988, 239:487-491.