H5N1亚型

H5N1亚型（共4篇）

H5N1亚型 篇1

AIV按其毒力和致病性可分为高致病性禽流感病毒 (HPAIV) 和低致病性禽流感病毒 (LPAIV) 。所谓的高致病性是指高感染性和高病原性, 高感染性体现在病毒经一定途径侵入机体后能在机体各组织器官内快速有效的复制和在不同个体间进行快速有效地传播, 并能在极短的时间内 (一般为48 h) 导致全群鸡发病死亡;高病原性是指少数的病毒粒子进入到机体后可引起全身感染, 导致多系统、器官功能衰竭, 最终导致死亡。历史上引发HPAI的均为H5和H7亚型的一些毒株, 而其余的大部分H5和H7亚型的毒株及其他亚型的毒株均为低致病性毒株, 其中最具有代表性的HPAIV为近些年来肆虐流行的H5N1亚型AIV, 这是一种“超级”病毒, 不仅能导致全群未免疫鸡及免疫力低下的鸡快速发病死亡, 还能感染水禽、候鸟及包括人在内的多种哺乳动物, 并导致高死亡率。

1 流行与传播

H5N1亚型HPAIV已在包括我国在内的东亚部分国家和非洲的部分国家多次发生, 给这些国家和地区的养殖业造成重大损失。

1.1 传播媒介

病毒可通过接触、雨水、粪便及其他被污染的物体传播。

1.2 传播途径

主要经口 (消化道) 传播, AIV是目前已知经口感染性最强的病毒。发病家禽喷嚏、咳嗽等喷溅而出的飞沫以及采食过程中形成的饲料粉尘和排出的粪便干燥后形成的粉尘中携带有大量的病毒粒子, 这些飞沫和尘埃可借助风力四处飘浮, 散落到饲料和饮水中, 鸡口服后引起感染发病。尽管目前尚不清楚这些浮着在飞沫和尘埃中的病毒粒子在风力的作用下播散的范围有多大, 但对于像H5N1亚型HPAIV这类“超级”病毒, 单纯的房舍隔绝作用显得微乎其微。

1.3传播效率

无论是试验数据还是田间数据都表明, H5N1亚型HPAIV的传播效率较H9N2亚型LPAIV的传播效率要低得多, 主要是因为H5N1亚型HPAIV的主要传播方式是通过接触经消化道传播, 而H9N2亚型LPAIV主要通过气溶胶经呼吸道传播。

1.4 传播方式

不恰当的养殖方式和人类活动是引发HPAI爆发的元凶, 有限的证据表明候鸟在将疫区的HPAIV携带至新的地区的过程中发挥重要作用。

1.5 传播载体

家禽羽毛有可能成为传播HPAIV的载体, 研究人员用分离到的目前流行的两种基因型的H5N1亚型HPAIV分别感染家鸭和家鹅, 除在皮肤上检测到病毒外, 在羽毛上皮中也检测到病毒抗原和观察到病毒的超微结构, 这表明通过家禽羽毛传播HPAIV已成为潜在的或现实的可能。节肢动物和老鼠在本病的传播过程中也起着重要作用。

1.6 H5N1亚型

HPAIV在不同禽类、不同动物及不同地区间存在着双向传播, 使得病毒基因库中的基因不断丰富、病毒变异速度加快、毒力不断增强、感染谱不断扩大, 这也是造成本病传播和流行的重要因素。

1.7 变异毒株引发的疫情

由变异毒株引起免疫禽群的发病情况与由类疫苗株的毒株引起的免疫禽群发病情况不同, 类疫苗毒株引起免疫禽群发病通常是免疫禽群抗体水平不高或是参差不齐, 常呈非典型发病, 对这样的禽群进行抗体检测常常有部分鸡只的抗体水平异常高 (≥212) ;而由变异毒株引起的发病在免疫抗体低或者高的禽群都可能发生, 因疫苗免疫后产生的抗体对变异毒株的攻击仅有部分交叉保护力, 因而禽群表现为发病急骤, 死亡率高。

2 病毒的遗传演化

2.1 地域性病毒亚系形成

H5N1亚型HPAIV在我国经10余年的传播流行, 病毒基因在不断地丰富和重组, 已演化出了带有地域特色的病毒亚群:南方 (水禽) 病毒 (类Re-1、类Re-5, 包括3个基因型) , 山西、宁夏鸡变异毒株 (类Re-4毒株, 包括2个基因型) , 新疆毒株 (包括2个基因型) , 青海毒株 (包括4个基因型) 。其中, 类Re-4毒株不感染水禽, 可感染哺乳动物, 但不发病, 在NS基因80～84位没有氨基酸的缺失。在4个地方亚群病毒中只有青海亚群的病毒的PB2基因的627位是对哺乳动物呈高致病性的赖氨酸 (K) , 而其他3个亚群的病毒的PB2基因的627位均为对哺乳动物呈低致病性的谷氨酸 (E) 。在特定的年份流行的基因型是一定的, 需要指出的是病毒的基因型与致病性没有必然的联系。病毒在不同的选择压力及自身进化强迫倾向的作用下, 不同地域的病毒沿着不同的路径向着各自不同的方向进行遗传演化, 进而形成多个病毒亚系;另一方面不同地方亚系的病毒在适宜条件下会发生基因重排, 从而产生新的病毒引发新的流行。

2.2 加强重点区域的系统监测

在对家禽实施全面免疫和保证有效免疫的前提下, 应对禽群进行严密系统的监测, 包括血清学监测和病原学监测。血清学监测的目的是检测有效免疫的情况及是否有异常高的抗体和新的抗原组合出现。例如, 抗体水平异常高 (>212) 说明有野毒感染 (类疫苗毒株) , 有异常的抗原组合出现说明病毒发生了变异。病原学监测的目的监测看病毒的污染及病毒的变异情况。

2.3 候鸟已成为HPAIV的重要基因整合宿主

2005年5月青海湖的候鸟爆发H5N1亚型HPAI, 研究发现分离自发病死亡候鸟体内的病毒是不同地域的病毒传播给候鸟, 在候鸟体内重新整合 (基因重排) 而产生的病毒, 病毒毒力之强是以前从没见过的。众多基因整合宿主的出现表明H5N1AIV的变异速度将大大加快, 病毒的抗性增强, 尤其是对热的抵抗能力增强。

3 疫苗

疫苗包括两大类:一类是利用反向基因操作技术生产的重组病毒灭活疫苗, 另一类是病毒载体活疫苗。

3.1 灭活疫苗

3.1.1 现有的灭活疫苗并不能清除已感染的病毒, 也不能完全阻止免疫后强毒的感染。有证据表明, 强毒入侵到免疫禽群后会产生持续的感染和排毒。现有的灭活疫苗用于非免疫禽的紧急接种存在免疫空白期长的缺点。

3.1.2 要正视现用的疫苗与流行毒株间的差异, 现用的疫苗与流行毒株间在血凝滴度上相差2个滴度以上。无论是从理论上解释还是从实际使用的效果来看, 流行株全病毒灭活疫苗都是最理想的, 因为其抗原成分完全与流行株间的血清型或基因型相符, 因而产生的免疫力更好。但是HPAIV却不能制成全病毒灭活疫苗, 原因是一方面考虑到对非目标生物的污染和有散毒的可能性, 另一方面鸡胚中含有一种类似于血凝因子的被称为Xa的酶类, 能裂解AIV的HA, 所有的AIV都能在鸡胚中增殖, 但是增殖的滴度却不一样, HPAIV由于其毒力强, 在较低的增殖滴度下就能致死鸡胚, 因而需要大量的SPF鸡胚来增值病毒, 即便是将鸡胚中增值的病毒抗原浓缩、灭活而制成流行株全病毒灭活疫苗, 但其昂贵的成本也是养殖场主难以承受的。

3.1.3 要及时发现流行毒株的变异, 以便及时研制新的疫苗。

3.2 病毒活载体疫苗

这类疫苗在使用时受母源抗体和免疫抗体的干扰, 在田间使用的效果一般。

3.3 疫苗的副反应

疫苗的副反应一直备受人们的关注, 近期的一项研究表明, HPAI灭活疫苗普遍存在着副反应。有人对我国6个疫苗生产厂家生产的21批次的灭活疫苗进行检验, 发现福尔马林含量严重超标, 最低的超出国际标准1.4倍, 最高的超出国际标准8.1倍, 超出国家标准0.7～4.5倍。福尔马林可影响母鸡雌二醇的分泌, 研究者测定母鸡雌二醇分泌量下降的比例与产蛋下降的比例一致, 应引起疫苗生产厂家和政府相关部门的高度重视。

4 免疫

针对某种动物疫病尤其是烈性传染病实施疫苗免疫, 是防控该种动物传染病的关键环节、主动措施和重要手段。对于大多数的动物传染病来讲, 仅仅依靠疫苗免疫来完全阻止感染和排毒是不可能的, 但通过免疫可以大大减少感染动物的数量和感染动物的排毒量, 使环境中的病原载量明显减少, 对易感动物感染的机率大大降低, 而那些经过免疫的动物即使再次感染, 症状也会明显减轻。

4.1 免疫原性 AIV HA蛋白抗原并不是一种免疫原性非常好的抗原, 需对家禽经过多次免疫才能持续产生有保护力的抗体。

4.2 有效免疫 现行使用的高致病性禽流感灭活疫苗一次免疫家禽, 普遍存在免疫不确实现象, 尤其是鹅, 需经加强免疫才能产生有效保护力。所谓的有效免疫是指家禽群体中的每一个个体都能产生有保护力的免疫 (至少有95%的个体具有保护力的抗体水平) 。大量的田间数据表明, 散养禽类必须保证每一个个体的抗体水平在26以上, 规模禽场要保证每一个个体的抗体水平在26, 产蛋鸡场和种鸡场要保证每一个个体的抗体水平达28以上才能避免生产上的损失。大量的事实表明, 当抗体水平在26或以上时, 能保护家禽不致死;当抗体水平在28或以上时, 不影响产蛋性能;任何时候抗体水平低于26, 只要是环境中有野毒存在, 就有被感染发病的可能。在具体实施免疫时, 若能结合抗体监测进行是最理想的, 建议产蛋鸡和种鸡每间隔3～4个月免疫1次。

4.3 疫苗质量 为家禽提供高质量的优质疫苗是保证免疫成功的根本前提, 所谓的“优质疫苗”是指免疫原性好、抗原含量足够、疫苗效力高并有利于家禽的吸收、无免疫副反应或只有轻微的免疫副反应、免疫家禽后能产生较高保护力且抗体水平均匀一致的疫苗。在免疫实践中发现有的疫苗生产厂家生产的个别批次的疫苗存在质量问题, 免疫家禽后产生的抗体水平低, 这样的疫苗在较大范围内使用或在受高致病性禽流感病毒严重威胁的地区使用会产生严重的后果。建议政府相关的职能部门应加大对疫苗产品质量监管的力度, 不合格的疫苗产品严禁出厂, 已经出场的疫苗应实行召回制度。

4.4 在关注HPAI对家禽的严重危害的同时, 不要忽视LPAI (H9N2) 的防控, H9N2亚型LPAI虽然不能导致鸡群的大批死亡, 但能严重危害鸡的生产性能, 且本身是一种免疫抑制病, 易导致机会菌的二次感染, 并具有为H5N1亚型HPAIV提供内部基因及感染人和哺乳动物的潜力, 同样会给家禽养殖业带来灭顶之灾并危及公共卫生安全。有研究表明, H9N2亚型AIV在不断地变异, 毒力在不断地增强, 因此同样不可忽视。

5 结语

H5N1亚型高致病性禽流感的爆发和流行促使人们对禽流感病毒进行更加系统的研究, 这对于人们深刻地认识和了解禽流感病毒无疑是个好的开端。随着系统研究的不断深入, 人们一定会找到更多对付这种具有高度变异性病毒的行之有效的方法, 为维护家禽业健康稳定的发展和人类自身的健康提供强有力的技术保障。

H5N1亚型 篇2

关键词：流感病毒A型, H5N1亚型,肺炎,放射摄影术,体层摄影术, X线计算机,随访研究,成年人

人禽流感是由禽流感病毒引起的一种急性传染病。高致病性禽流感病毒H5N1亚型肺炎病情危重, 死亡率高达60%[1,2]。胸部影像学对临床治疗、鉴别诊断及预后具有重要价值[3,4]。本文回顾性分析4例禽流感患者的临床及影像学资料, 总结H5N1亚型人禽流感远期随访的胸部影像学特点, 并探讨其影像学评分的价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2006~2011深圳市第三人民医院、沙井医院、建瓯市立医院及阜阳市第二人民医院4例人禽流感危重患者, 均符合《人禽流感诊疗方案 (2005版修订版) 》的诊断标准[5], 其中男2例, 女2例;年龄分别为26岁、31岁、31岁、44岁;临床表现均为高热39~40℃、咳嗽、咳痰、气促、腹泻;住院时间5~86 d。

1.2 检查方法

采用200 m A床旁摄片机或800 m ADR摄片机, 于患者发病早期及中期每天不同时间段摄胸部平片, 病情稳定或恢复期行常规CT及高分辨率CT (HRCT) 扫描。在患者深吸气终末屏气扫描, 扫描范围从肺尖到肺底肋膈角水平, 管电压120 k V, 管电流200 m A, 螺距1.2, 准直10 mm, 层间距12 mm。对感兴趣区行HRCT扫描, 准直2.5 mm, 间隔5 mm。图像观察采用标准肺窗 (窗宽1500, 窗位-500) 和纵隔窗 (窗宽350, 窗位50) 。

1.3 图像分析

由2名放射科主任医师分析胸片及CT图像, 并进行评分, 意见不同时协商达成一致。影像学评价包括肺内病灶的形态 (磨玻璃密度影、实变影、结节影、网格影、条索影, 小叶间隔增厚及混合影) 、分布及范围。采用半定量分析[6]评价肺组织的受损情况, 从肺尖到膈肌下1 cm, 每侧肺野分为3个区域, 每个区域约占1/3, 对肺的6个区域进行评分, 0分:累及面积为0, 代表正常组织;1分:累及面积<20%;2分:累及面积20%~49%;3分:累及面积50%~75%;4分:累及面积>75%。单侧肺的总分为0~12分, 两侧肺总分为24分。

1.4 随访

患者出院后每3个月、6个月、1年、2年行胸部CT扫描及肺功能检查, 随访0.25~5.0年, 平均 (2.55±2.08) 年, 最长随访时间5年。

2 结果

2.1 疾病转归

4例患者均经咽式子PCR-RNA检测证实H5N1病毒阳性。病例1并发ARDS、多种细菌感染、气胸及皮下气肿, 病例2并发ARDS、脓毒性休克、多器官功能衰竭, 病例3并发ARDS、多种细菌及真菌感染、消化道出血、弥散性血管内凝血, 病例4并发ARDS、细菌感染、心肌损害、肝脏损害。病例3及病例4痊愈, 病例1及病例2死亡。

2.2 胸片及CT表现

病例1:胸片表现:发病5 d, 右上肺野见片状实变影, 左上肺野见少许淡薄磨玻璃影;发病7 d, 左肺野见大片实变影及磨玻璃影, 右中上肺野见大片状实变影;发病9 d, 左肺见大片实变影, 右中上肺野见片状磨玻璃影;发病10 d, 病变有吸收;发病18 d, 右侧出现气胸及皮下气肿 (图1A) , 两肺呈渗出性病变;发病20 d, 右侧气胸减少, 左侧出现少量气胸, 两肺仍见大片实变影;发病30 d, 双侧仍见局限性气胸, 见较多条索状、斑片状影, 胸膜稍增厚。CT表现:发病6 d, 两肺上叶均见大片状及斑片实变影及磨玻璃影, 左肺下叶后基底段见少许斑片影, 双侧胸腔少量积液;发病76 d, 右肺上叶、中叶毁损缩小, 呈实变影, 胸膜下局限性空腔, 左肺上叶见片状实变影, 其内见蜂窝状影, 两肺下叶均可见斑点、条索状影 (图1B、C) , 胸膜下小叶间隔增厚及胸膜下气肿改变。肺组织普遍透亮度降低, 呈磨玻璃影改变;随访3个月, 左侧气胸消失, 右侧可见胸膜下及纵隔旁局限性气胸。两肺呈普遍间质性改变, 表现为磨玻璃影及实变影, 胸膜下小叶间隔增厚及蜂窝状影。

图1女, 44岁, H5N1亚型人禽流感。发病16 d, 胸片显示左肺实变影, 右肺并发气胸 (箭) 及皮下气肿 (箭头, A) ;发病76 d, CT显示两肺均可见实变影与间质纤维化改变 (箭) , 双侧局限性气胸 (箭头) , 并可见引流管 (星号, B) ;发病85 d, CT显示同一层面, 两肺以间质性病变为主 (箭) , 纵隔旁局限性气胸 (箭头, C)

病例2:胸片表现:发病5 d, 右中肺见大片实变影;发病7 d, 两肺大片实变影及磨玻璃影, 呈广泛融合实变影;发病9 d, 双肺部分病变吸收变淡;发病10 d, 两肺呈广泛融合实变影 (图2) , ARDS及呼吸衰竭死亡。CT表现:发病6 d, 右肺上叶见大片实变影, 其内见充气支气管征。右肺中叶、下叶及左肺各叶见散在斑片、小片状磨玻璃影及实变影。右侧胸膜腔少量液体。

图2男, 31岁, H5N1亚型人禽流感。发病5 d, 胸片显示右肺中上肺野大片实变影 (箭) , 左下肺似见淡薄磨玻璃影 (箭头, A) ;发病6 d, 胸片显示两肺大部分实变影 (箭) 及磨玻璃影 (箭头) , 肋膈角消失 (B) ;发病8 d, 胸片显示双肺呈广泛融合实变影 (C)

病例3:胸片表现:发病6 d, 左中上肺野见大片状模糊影, 左肺门影增大、结构不清;发病8 d, 病灶迅速扩大到左下肺野、右上肺野及右中肺野内中带肺门处, 左肺呈大片实变影;发病10 d, 左下肺阴影吸收变淡, 右肺病灶范围明显扩大;发病12 d, 右肺病变扩大呈大片实变影, 左肺病变进一步吸收减少。随后胸片显示两肺大片密实阴影逐渐吸收变淡、缩小;发病23 d, 左上中肺野原病灶停止吸收, 片状阴影有增大趋势, 下肺野见斑片状密度增高影;发病56 d, 两肺呈斑片状影、纤维条状影及网格状影。CT表现:发病7 d, 两肺叶、段分布片状磨玻璃影及小片状、大片状实变影, 内见充气支气管征, 左侧胸腔内少量积液;发病35 d, 呈叶、段分布的磨玻璃影及实变影。受损肺叶、段纹理聚集, 体积缩小。出现胸膜下弧线影及小叶间隔增厚, 相邻胸膜稍增厚。可见蜂窝状影及数个小的囊状肺气肿改变;发病45 d, 两肺散在多处条索状影, 小叶间隔增厚及纵隔旁气肿。受损肺叶、段体积仍较小。两肺淡薄影部分较前有吸收;发病96 d, 两肺病灶仍以纤维条索状及网格状影等肺间质改变为主。

病例4:胸片表现:发病4 d, 右下肺野见片状淡薄磨玻璃状影;发病6 d, 两肺野中下肺野见大片状实变影及磨玻璃影;发病10 d, 病变范围有吸收;发病11 d, 两肺病变呈广泛融合实变影;发病19 d后病变逐渐吸收, 呈片状及结节状实变影;发病28 d, 两下肺见斑点、条索状影。CT表现:发病7 d, 以两肺背侧分布为主的小片状, 大片状磨玻璃影及实变影, 并见充气支气管征;发病39 d, 两肺实变影部分吸收, 病灶中出现较多的索条状影, 胸膜下小叶间隔增厚并散在多个小囊状肺气肿影;发病72 d, 实变病灶吸收明显变淡, 主要表现为网格状及条索状影, 胸膜下小叶间隔增厚;随访7个月, 两肺显示纤维条索状影、网格状影及小片状模糊影;随访1年, 两肺仅见少许纤维条索状影。

2.3 影像评分

2.3.1 胸部平片评分

发病早期 (4~6 d) , 胸片评分≤9分;进展期及高峰期 (7~12 d) , 其评分均≥16.5分, 其中病例2评分持续在21~24分;病情恢复早期 (13~18 d) , 病例1、病例3、病例4平均评分分别为 (19.50±2.43) 分、 (16.67±1.86) 分、 (14.33±1.63) 分;病情恢复中后期 (19 d至痊愈出院) , 病例1、病例3、病例4平均评分分别为 (18.69±1.89) 分、 (17.07±2.66) 分、 (12.78±3.63) 分。

2.3.2 CT评分

发病早期 (6~7 d) , 4例患者CT评分分别为12分、15分、14分、9分。病例1两肺组织损伤严重, 呈广泛肺纤维化、斑片实变及蜂窝影, 局限性气胸, 发病72 d、80 d、90 d其评分均在20~22分。病例3发病35 d、45 d、52 d、96 d、6个月、1年、2年、5年评分分别为18分、16分、11分、8分、6分、5分、3分、3分。病例4发病39 d、72 d、7个月、1年评分分别为11分、10分、3分、1分。4例患者的影像学评分变化见图3。

2.3.3 远期随访CT表现

病例4随访1年, 仅右肺下叶少许条索状影。病例3进行CT随访2年、5年, 其HRCT表现为条索状影、蜂窝状、串珠状及扭曲支气管扩张改变, 淡薄磨玻璃影、小叶间隔增厚、胸膜下气囊、间隔旁气肿等 (图4A、B) 。

图4男, 31岁, H5N1亚型人禽流感。随访5年, HRCT显示两肺可见条索影 (箭) 、磨玻璃影 (箭头) 及扭曲支气管扩张影 (星号, A) ;冠状位显示蜂窝状影 (箭) 及胸膜下气肿改变 (箭头, B)

3 讨论

3.1 H5N1流感肺炎的影像学特点

本组4例患者均行胸片及CT扫描, 其影像学特点为:发病初期 (4~6 d) 胸片多表现为局限性磨玻璃影, 并进展为实变影。进展及高峰期 (7~12 d) 病变迅速发展为两肺实变及磨玻璃影, 可出现单侧或双侧广泛融合实变影。恢复早期 (13~18 d) , 胸片表现为大片实变影及斑片状模糊影。恢复中后期 (19 d至痊愈出院) 表现为斑片状、结节状及纤维条索状影。CT早期表现为多叶段实变影及磨玻璃影, 其内可见充气支气管征。恢复期CT主要表现为实质性病变与间质性病变并存, 并出现毁损肺组织缩小、胸片气肿等改变。恢复后期及随访期间主要以间质性病变为主, 与既往研究结果[7,8,9,10,11,12,13]一致。但本组3例CT扫描出现少量胸腔积液, 仅1例胸片提示肋隔角消失。与Bay等[7]、金科等[9]报道的未发现胸水不同, 可能与其收集的病例均为15岁以下的少年儿童有关, CT能更多地发现少量胸水。本组病例1发病18 d出现气胸及皮下气肿, 可能与机械通气有关。本组病例均未见纵隔肿大淋巴结及病变内空洞, 以上表现与既往文献报道结果[7,9,10,11,12,13]一致。Qureshi等[8]报道2例出现纵隔淋巴结肿大, 但其出现几率仍较小, 可能与样本量较小有关。本组H5N1禽流感患者肺部病变较早出现纤维化, 可能与病毒性间质性肺炎有关, 其发生机制可能是:在肺泡透明膜形成和纤维素渗出的基础上, 渗出物的纤维化、机化和肺毛细血管内微血栓形成等使纤维组织和毛细血管增生[14]。

3.2 影像学评分特点及应用价值

本组4例患者影像学评分动态观察特点: (1) 早期病变进展快, 4例早期评分均≤9分, 在随后1~2 d内达16分以上, 提示局限性病灶进展至双肺分布。 (2) 危重期评分持续较高, 病情控制后评分降低。随后评分呈曲线波动, 可能与合并感染、气胸等并发症有关。发病7~12 d, 胸片评分均在16分以上, 其中病例2评分持续在22~24分, 尽管患者发病9 d病变出现吸收, 随后又出现ARDS、感染及多器官功能衰竭而至死亡, 与Qureshi等[8]报道的病变持续4个肺野以上、合并ARDS最终导致死亡一致。H5N1患者由于免疫系统损害, 再加上机械通气, 易并发肺部感染。病例3和病例4于发病10 d出现病变吸收, 由于合并感染, 病情加重, 评分分布曲线出现波动。病例1出现气胸、肺气肿及皮下气肿改变, 可能与细菌感染或呼吸机通气等有关。 (3) 病变吸收缓慢, 住院时间长。本组3例患者痊愈出院, 其中2例评分>13分, 其CT扫描病灶以间质纤维化为主, 1例患者出现肺叶缩小、气胸等损伤。 (4) CT评分优于胸片, 本组患者发病早期CT评分均高于胸片评分, 可能与HRCT能更早期发现磨玻璃影有关[15]。另外, HRCT能够详细地显示病变的分布范围。然而, 本影像学评分仅能反眏病变的分布范围, 很难评价后期及随访患者病变纤维化的变化情况。

目前, 影像学评分已经应用于SARS、H1N1流感肺炎的相关研究, 并取得较好的临床效果[6,13,16]。通过观察肺部实变影、磨玻璃影、间质纤维化及结节等影像学特征, 根据肺部病变范围进行评分, 可以更直观地显示病灶的分布范围及发展趋势。影像学评分是主要针对病灶范围及程度的一种评价手段, 但不能显示病变的性质, 如空洞、实变、空腔等, 也难以观察纵隔淋巴结肿大、胸腔积液、气胸等。对于H5N1患者病情后期影像学评分仍较高、但临床症状较轻, 或处于恢复期者, 可能与病灶的纤维化改变等有关。

3.3 H5N1患者的远期随访CT表现

目前对于H5N1亚型禽流感的长期随访报道较少。对SARS及H5N1随访时间多在1年以内, 纤维化病变仍有吸收减少[8,15], 但远期随访病变吸收程度及影像学特点仍需要进一步分析。本组病例3随访5年并行HRCT扫描, 显示肺部病灶长期存在, 其影像学特征为: (1) 网格状、线条影及条索状影, 可能与肺间质及小叶间隔等纤维化有关; (2) 蜂窝状、串珠状及扭曲支气管扩张改变, 可能由于肺组织损伤所致; (3) 淡薄磨玻璃影, 是晚期肺纤维化的一种表现; (4) 胸膜下气囊、纵隔旁及胸膜下气肿等。然而在H5N1重症肺炎对肺功能的影响方面, 对该患者进行长期随访发现肺通气功能正常, 显示肺部有较好的代偿功能。病例1在治疗过程中出现严重并发症, 发生肺部广泛纤维化及局限性气胸, 随访肺功能检查提示肺通气功能严重障碍, 并出现感染后呼吸衰竭致死亡, 提示肺功能的受影响程度与肺组织损伤程度有关。

H5N1亚型 篇3

1鸡场基本情况

该养殖户从事养鸡多年, 具有一定的管理经验和诊病用药知识, 存养规模4 000羽。该场建在山坡树林下, 与村庄和主要交通道路较远, 自然隔离条件较好, 但林中常年均有野鸟, 近三年生产经营正常。该场的免疫程序为:1日龄接种马立克氏病疫苗、11日龄接种法氏囊病疫苗、18日龄接种新-支二联苗、23日龄进行法氏囊病疫苗二免、27日龄接种禽流感疫苗、33日龄进行新-支二联苗二免、65日龄肌注新城疫Ⅰ系疫苗、75日龄肌注禽霍乱疫苗、95日龄进行禽流感疫苗二免。

2疫苗来源

疫苗为政府统一采购的哈尔滨维科生物技术开发公司生产的重组禽流感病毒灭活疫苗 (H5N1亚型、Re-6株) , 生产批号:2012048, 生产日期:20121114, 有效期12个月。其他疫苗为业主从市场采购。

3检测方法

随机抽取鸡只采血, 待检血样经当天离心后立即用血凝与血凝抑制试验方法检测。检测试剂为哈尔滨维科生物技术开发公司生产, 生产批号:2012002, 生产日期:20120605, 有效期24个月。红细胞采自自备的未接种任何疫苗的公鸡, 现配现用。

4结果与分析

放养鸡群禽流感免疫效价测定结果见表1。

1) 1日龄血样检测结果:免疫效价≥1:16的有12份, 占60.0%, 表明该批鸡的母源抗体水平较低。

2) 14日龄和32日龄的检测结果:免疫效价≥1:16的分别占检测样品的27.5%和6.0%, 表明该批鸡处于高度风险状态。

3) 47日龄检测结果:免疫效价≥1:16的占94.0%, 表明该批鸡已经获得理想的免疫保护效价。62日龄、77日龄、92日龄的检测结果免疫效价≥1:16的占比分别为98.0%、94.0%、90.0%, 表明该批鸡保持高滴度的免疫抗体效价。

4) 110日龄的检测结果:免疫效价≥1:16占比为86.0%, 表明禽流感二免2周后仍没有提高免疫效价。

5) 125日龄和143日龄的检测结果:免疫效价≥1:16的占比均为94.0%, 表明禽流感二免使得抗体免疫效价维持在较高和均衡的水平。

5结论与建议

1) 该次免疫效价跟踪检测的结论是: (1) 规模化林下放养鸡群在1月龄左右接种重组禽流感病毒灭活疫苗 (H5N1亚型、Re-6株) , 经20 d后能获得较高的免疫效价, 约4周时达最高值, 之后以每2周4个百分点的速率下降。 (2) 禽流感二免加强免疫后不能在2周内使免疫效价提高, 但在1个月后能重新获得较高的免疫效价, 并保持比较均衡的状态。 (3) 在母源抗体较低的情况下, 1月龄左右接种禽流感疫苗, 在产生有效免疫抗体前有比较长时间的感染野毒风险 (约1个月) 。

2) 该次免疫效价跟踪检测的1日龄血样偏少, 是由于采血样需剪断鸡颈部、畜主考虑经济效益所致。免疫程序也是畜主自行制定。该批次鸡于150日龄后销售, 约10 d售完。

3) 建议畜主以禽苗的母源抗体水平来确定禽流感的首免时间。鉴于目前广大家禽饲养者的条件所限, 每批苗种进行母源抗体检测不现实, 建议种禽场和动物防疫主管部门应制定禽苗中禽流感母源抗体水平强制检测制度, 以便真正使禽流感的强制免疫制度达到预期效果。

H5N1亚型 篇4

禽流行性感冒(简称禽流感,AI)是由正黏病毒科、流感病毒属、A型流感病毒引起的以禽类为主的传染性疾病。根据病原体类型的不同,禽流感分为高致病性(HPAI)和低致病性(MPAI)禽流感,其中高致病性毒株主要有H5和H7两个血清亚型。本研究所用的毒株 (GSGD/1/96)是我国分离鉴定的第1株高致病性禽流感病毒株[4]。笔者在miRNA组学测序的基础上,分析了差异显著两组间的miRNA,其中miRNA-17a*在3月龄SPF鸭感染与非感染病毒状态下的免疫器官中的表达存在极显著差异。为了探讨该miRNA在感染和非感染病毒状态下SPF鸭不同组织中的表达规律,本研究对3月龄的SPF鸭采用滴鼻法感染H5N1亚型禽流感病毒,检测miRNA-17a*在感染与非感染H5N1亚型禽流感病毒状态下SPF鸭的各组织中的表达情况,以期为在感染H5N1亚型禽流感病毒状态下,miRNA-17a*在水禽中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物和样品处理

3月龄SPF鸭和H5N1亚型禽流感病毒株(GSGD/1/96),均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。将20只SPF鸭随机分成2组,即试验组和对照组,每组10只,分别隔离饲养在负压隔离器中。试验组SPF鸭采用滴鼻法人工感染1×106EID50/0.1 mL的H5N1亚型禽流感病毒,感染病毒后每2 d采血1次,并分离血清检测SPF鸭感染H5N1亚型禽流感病毒后抗体水平的变化,当抗体水平稳定至平台期时,对试验组和对照组SPF鸭进行屠宰,采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、气管和肌肉组织,立即置于液氮中, -80 ℃冰箱中保存,备用。

1.2 cDNA的获得

采用Trizol法提取试验组和对照组SPF鸭不同组织的总RNA,样品全部在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所P3实验室内处理,同时电泳检测总RNA的质量,应用紫外分光光度计检测总RNA的浓度。按照ReverTra Ace qPCR反转录试剂盒的要求,先将RNA样品于65 ℃加热5 min备用。调整各样品总RNA的浓度均为250 ng,使反转录体系中总RNA量一致,以减少定量中的误差。反转录体系:5×RT Buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 0.5 μL、miRNA-specific stem-loop RT primer 0.5 μL、Total RNA 250 ng,添加Nuclease-free water至10 μL。反应条件:42 ℃ 15 min;98 ℃ 5 min。所得产物于-80 ℃保存,备用。

1.3 引物设计

试验所用miRNA-17a*序列为前期鸭高通量测序工作所得结果中获得序列,同时以5S rRNA作为内参对照。根据参考文献[5]中引物设计原则设计特异性反转录引物及荧光定量PCR上、下游引物(见表1),在长春华大中天生物技术有限公司合成。

1.4 荧光定量RT-PCR反应

根据SYBR Green荧光定量PCR试剂盒的要求,研究在感染与非感染H5N1亚型禽流感病毒状态下SPF鸭不同组织中miRNA-17a*的表达情况。反应体系:2×SYBR混合物12.5 μL、上游引物和下游引物各1 μL、cDNA(按照1∶10比例稀释)2.5 μL、RNase free H2O 8 μL。反应条件:95 ℃ 1 min;94 ℃ 1 min,60 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s,共40个循环。同时扩增5S rRNA作为内参对照,用2-△△CT法计算miRNA-17a*的表达量,以脾脏组织的表达量作为标准进行相对表达分析,应用SPSS软件对所得数据分析。

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取(结果见图1)

M.DNA Marker;1～6.分别为心脏、肝脏、脾脏、 肾脏、肌肉、气管。

由图1可知,各组织提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测完整性较好,基本无降解。紫外分光光度计检测发现,OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间。说明样品无DNA或蛋白污染,能够满足试验的要求。

2.2 在非感染状态下SPF鸭不同组织中miRNA-17a*的相对表达(结果见图2)

由图2可知,在SPF鸭的不同组织中均能检测到miRNA-17a*表达,其中在肺脏中的相对表达量最高,其次为心脏、肌肉、脾脏、肾脏和气管,而在肝脏中miRNA-17a*的相对表达量最低。

2.3 在感染H5N1亚型禽流感病毒状态下SPF鸭不同组织中mi RNA-17a*的相对表达(结果见图3)

由图3可知,经荧光定量PCR分析,在SPF鸭感染H5N1亚型禽流感病毒后的不同组织中均能检测到miRNA-17a*表达,其中在肌肉中相对表达量明显高于其他组织,其次为心脏、脾脏、肾脏、肺脏和气管,而在肝脏中miRNA-17a*相对表达量最低。

2.4 在感染与非感染H5N1亚型禽流感病毒状态下SPF鸭不同组织中mi RNA-17a*相对表达情况的比较(结果见图4)

由图4可知,感染H5N1亚型禽流感病毒的SPF鸭气管中miRNA-17a*相对表达量是非感染SPF鸭气管中miRNA-17a*相对表达量的1.2倍,而在其他组织中,感染H5N1亚型禽流感病毒后miRNA-17a*相对表达量相对低于非感染SPF鸭。

3 讨论

MiRNA是近年来发现的一类对基因表达调控具有重要调节作用的小分子RNA。在细胞核内,在多种酶的作用下编码miRNA的基因经过转录、加工和转运过程剪切为成熟的miRNA[6]。近年来,关于miRNA在不同生物过程中的作用越来越受到人类的关注,有学者曾报道miRNA-17能够作用于靶基因PKD2的3′非翻译区,在转录后抑制该基因的表达,从而促进细胞的增殖[7],但是研究分析miRNA-17a*的作用还未见报道。

禽流感病毒呈世界性分布,是危害养禽业健康发展的主要疫病,1997年,人们首次发现禽流感病毒能够感染人,使禽流感成为一种能够引起人类感染的新型传染病,对人类健康造成了巨大威胁。目前,人类除了从传统的编码蛋白基因及其相关通路角度研究禽流感病毒的分子作用机理,miRNA作为一类对mRNA转录后调控的非编码小RNA越来越受到关注[8]。

本研究选择前期鸭高通量测序工作中检测到的miRNA-17a*,研究其相对表达量,并分析感染H5N1亚型禽流感病毒后的SPF鸭与对照组SPF鸭相同组织间的相对表达差异。结果表明,在对照组SPF鸭的肺脏中miRNA-17a*的相对表达量较高,推测miRNA-17a*可能对禽类的呼吸系统具有一定的调节作用。感染H5N1亚型禽流感病毒后,miRNA-17a*在气管中的相对表达量与非感染SPF鸭气管的相对表达量相比升高,表明感染H5N1亚型禽流感病毒后miRNA-17a*及其对应的靶基因主要对禽类的呼吸系统产生影响,这与其在SPF鸭不同组织中的表达结果相一致,因此预测miRNA-17a*可能在水禽的呼吸系统中具有重要的调节作用,其调控的靶基因可能在水禽中起到抑制病毒复制的作用。但是这还需要进一步预测miRNA-17a*的靶基因,分析靶基因与miRNA-17a*的作用机理。

参考文献

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[2]LEE R C,FEINBAUM R L,AMBROS V.The C.elegans hetero-chronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complemen-tarity to lin-14[J].Cell,1993,75(5):843-854.

[3]REINHART B J,SLACK F J,BASSON M,et al.The 21-nucleo-tide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditiselegans[J].Nature,2000,403(6772):901-906.

[4]于康震,陈化兰,唐秀英.’97香港禽流感[J].中国畜禽传染病,1998,20(3):187-191.

[5]CHEN C,RIDZON D A,BROOMER A J,et al.Real-time quan-tification of microRNAs by stem-loop RT-PCR[J].NucleicAcids Res,2005,33(20):e179.

[6]KIM V N,NAM J W.Genomics of microRNA[J].Trends Genet,2006,22(3):165-173.

[7]吴珏,刘芬,阮琼芳,等.miRNA-92a在缺血再灌注肾操作中的表达变化[J].实验与检验医学,2010,28(1):9-11.