病毒亚型

病毒亚型（共7篇）

病毒亚型 篇1

禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)属正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒。禽流感又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟,被国际兽医局(OIE)列为A类传染病。AIV H9亚型为低致病性禽流感病毒,主要引起禽类产蛋量下降,肉鸡和蛋鸡的复合型呼吸道疾病乃至死亡,可使养禽业产生重大损失。

2007年11月,福建省某鸡场发现80~90日龄的大鸡出现精神萎顿、羽毛松乱、食欲减退、呼吸困难并伴有啰音为特征的病例,并很快地传染给小鸡,2 000羽鸡1周内连续死亡200羽。死亡鸡病理剖检可见肺部和支气管里有许多黄色干酪样栓塞,部分死亡鸡支气管剖开有白色分泌物。通过病毒分离、电镜观察、血清学和RT-PCR鉴定确定为H9亚型禽流感病毒,现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验胚及动物

番鸭胚、鸡胚、30日龄无母源抗体雏鸡等均来自非疫区。

1.2 标准阳性血清及单克隆抗体

抗新城疫病毒(NDV)阳性血清购于中国兽药监察所;抗减蛋综合征(EDSV76)阳性血清和抗H5、H7、H9亚型禽流感病毒阳性血清均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。抗新城疫病毒(NDV)单抗和抗鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)单抗均由实验室保存。

1.3 试验试剂

Tri Zol LS Reagent,RNasin,M-MLV购自Invitrogen公司,r Taq聚合酶、d NTPs、p MD18-T、感受态细胞DH5α购自大连宝生物工程公司。

1.4 病毒分离

1.4.1 病料采集及处理。

无菌采集死亡鸡的心、肝、脾、肺、肾,剪碎研磨,以Hank’s液制成1∶5匀浆,加双抗各1 000U,4℃过夜,冻融3次,7 000rpm离心10min,取上清液供接种病料。

1.4.2 病毒分离。

取处理的病料上清液经尿囊腔接种9日龄鸡胚3枚,0.1m L/枚,37℃孵化,观察2次/d,弃去24h内的死胚,收取24~120h的死胚或活胚,置4℃过夜后,收获鸡胚尿囊液,并观察胚胎病变。

1.5 血清学鉴定

1.5.1 间接免疫荧光抗体(IFA)试验。

取死胚的心脏冷冻切片,冷丙酮固定后,按常规方法[1]用抗NDV和IBDV单抗进行间接荧光抗体试验。

1.5.2 血凝价(HA)测定。

参照Allan等[2]的报道,测定鸡胚尿囊液的HA价。

1.5.3 血凝抑制试验(HI)。

用4个血凝单位的分离毒(第3代胚液毒)分别与抗新城疫、抗EDSV76和AIV H5、H7、H9等标准阳性血清,按微量法进行HI试验[3]。

1.6 分离毒生物学特性

1.6.1 血球凝集(HA)试验。

采集小白鼠、鸽、鸭和鸡的红细胞,按常规方法进行HA试验。

1.6.2 血凝素热稳定性试验。

将第3代胚液毒(YD3)分装于灭菌离心管,于56℃水浴分别作用0min、5min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min,测定各自的HA效价。

1.6.3耐热性试验。

将第3代胚液毒分装于灭菌离心管,于50℃水浴分别作用10min、20min、30min、60min,60℃水浴分别作用10min、20min、30min后,分别接5枚非免疫鸡胚,37℃培养,收集鸡胚尿囊液测定HA效价。

1.6.4 对鸡胚、番鸭胚的ELD50和最小致死量平均死亡时间(MDT)的测定。

将分离毒用Hank’s液作连续10倍倍比稀释,每个稀释度接种4枚9日龄鸡胚或12日龄番鸭胚,0.1m L/枚,37℃孵化,弃去24h内的死胚,以后每2h照蛋1次,记录胚胎死亡情况,按Karber氏法计算ELD50。根据文献计算全部胚胎死亡的最高稀释度MDT[4]。

1.7 RT-PCR鉴定

1.7.1 病毒RNA的提取。

取感染AIV H9N2鸡胚尿囊液250μL,加入750μL Tri Zol LS Reagent RNA提取液,混匀,室温放置15min,加入200μL氯仿,振荡混匀,4℃12 000rpm离心15min,取上清加入500μL异丙醇,室温放置10min后12 000rpm离心10min,弃上清,75%乙醇除盐,倒置滤纸上吸掉剩余液体,干燥后悬于25μL的DEPC水中,备用。

1.7.2 引物设计。

根据禽流感M基因全长序列,用Oligo 6软件设计1对引物如下:上游引物P1为5′-AGCAAAAGCA GGTAGATG-3′,下游引物P2为5′-AGTAGAAACAAGGTA GTTTTTTAC-3′,以上引物由大连宝生物TAKARA公司合成。

1.7.3 RT-PCR反转录聚合酶链式反应。

(1)RT采用20μL体系,在PCR反应管中分别加入7μL已制备的RNA,加入1μL下游引物(20pmo L),70℃热吸附10min,冰浴10min,继续加入5×First Standing Buffer 4μL,10m M d NTPs 2μL,0.5μL反转录酶(M-MLV)5U/μL,0.25μL RNA酶抑制剂(40U),用无RNA酶水调至总体积20μL,瞬时离心混匀。反应程序:30℃10min,42℃60min,99℃5min。(2)M基因的扩增用50μL体系。以制备好的c DNA 2μL作模版,加入相应的上、下游引物(20pmo L)各1μL,2.5m M d NTPs 4μL,10×Buffer 5μL,r Taq 1μL,灭菌水36μL,反应体系50μL。在PCR扩增仪内进行扩增,扩增条件为95℃预变性5min,然后94℃变性1min、53℃变性1min、72℃延伸2min,35个循环,最后72℃延伸10min。结束后取PCR产物4μL,在1%琼脂凝胶上电泳检查,然后在紫外灯下观察结果,自动凝胶成像扫描仪拍照及处理。

1.8 人工感染试验

将分离毒鸡胚尿囊液毒原液经腿肌注射30日龄雏鸡3羽,每羽0.5m L;另取3羽,注射生理盐水,每羽0.5m L,隔离饲养。观察发病情况和临床症状,并从病死鸡中进行病毒分离或测定耐过鸡血清抗体。

2 结果与分析

2.1 病毒分离

鸡胚接种病料96h后开始死亡,死胚的胚体呈弥漫性充血、出血,其HA效价为27。连续盲传3代,病毒增殖趋于稳定,接种分离毒36h开始死亡,其HA效价为29。分离毒按Karber氏法计算对鸡胚的ELD50为10-5.5。

2.2 血清学鉴定

2.2.1 IFA试验。

死胚心脏冷冻切片,经抗NDV和IBDV单抗染色后,均未发现有荧光病灶。

2.2.2 血凝抑制试验(HI)。

分离毒的血凝特性能被AIV H9标准阳性血清所抑制,但不被新城疫、减蛋综合征和AIV H5、H7标准阳性血清所抑制。

2.3 分离毒生物学特性

2.3.1 血球凝集(HA)试验。

分离毒YD3对小白鼠、鸽、鸭和鸡的红细胞均有凝集作用。其HA效价为小白鼠27、鸽29、鸭27、鸡28。

2.3.2 血凝素热稳定性试验和耐热性试验。

从表1可以看出,该分离株在56℃水浴处理10min,其HA效价下降2个滴度;在60℃处理30min后,具有HA效价的鸡胚数下降2枚。表明该分离株对热不稳定性。

注:分子表示尿囊液具有HA活性的鸡胚数,分母为试验鸡胚数。

2.3.3 ELD50和MDT的测定。

从表2可知,鸡胚尿囊液毒的HA效价和鸡胚半数感染量明显高于番鸭胚尿囊液毒;分离毒对鸡胚和番鸭胚的MDT分别为78h和70h,其最小致死量分别为10-7和10-6。

2.4 RT-PCR鉴定

从分离毒的鸡胚尿囊液中扩增出1 027bp片段,见图1。

2.5 人工感染试验

3羽30日龄雏鸡经腿肌注射分离毒后,在20d观察期内均未发现异常。血清HI抗体测定结果表明,攻毒前HI为阴性,攻毒10d后抗H9亚型HI均在28以上(见表3)。

3 结论与讨论

从肺部有黄色干酪样栓塞和支气管有白色分泌物的病死鸡肝、脾、肺、肾中分离到1株病毒,经鉴定为H9亚型禽流感病毒,命名为AIV-YD株。该分离毒AIV-YD具有血凝活性,并能被AIV H9标准阳性血清抑制,但不被新城疫、减蛋综合征和AIV H5、H7标准阳性血清所抑制。生物学试验表明:该分离毒具热不稳定性且对热敏感;分离毒在鸡胚尿囊液的HA效价和鸡胚半数感染量明显高于番鸭胚尿囊液;鸡胚和番鸭胚的MDT分别为78h和70h;而且分离毒YD3对鸡胚和番鸭胚的最小致死量分别为10-7和10-6;PCR结果表明,所扩增出的片段大小约为1 027bp,与预期长度相符。这些结果表明分离毒为H9亚型禽流感病毒。

陈伯伦等[5]于1994年首次从鸡中分离到了AIV H9亚型。Alexander[6]认为目前H9亚型流感病毒广泛存在于家禽中,对养禽业构成严重威胁,而1997年香港“禽流感”事件之后Peiris等[7]从类似流感症状的病人中分离到H9N2亚型流感病毒。近年来AIV H9亚型对全世界的威胁已经越来越严重,应引起广大学者的重视。

摘要：从临床表现呼吸困难并伴有啰音、肺部和支气管黄色干酪样栓塞为特征的病鸡肝脾肺混合匀浆中分离到1株病毒(YD株),该病毒能凝集鸡红细胞并能被AIV H9标准阳性血清抑制,对热不稳定且对热敏感;对鸡胚和番鸭胚的最小致死量分别为10-7和10-6,其MDT分别为78h和70h;鸡胚尿囊液毒的HA效价和EID50明显高于番鸭胚尿囊液毒;能扩增出大小约为1 027bp的特异性目的片段。结果表明,该分离毒为H9亚型禽流感病毒。

关键词：H9亚型禽流感病毒,分离,鉴定

参考文献

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[5]陈伯伦,张泽纪,陈伟斌.鸡A型流感病毒的分离与血清学初步鉴定[J].中国兽医杂志,1994,20(10):3-5.

[6]TAISUKE H,YOSHIHIRO K.Andemic threat pose by avain influenza A virus[J].Clinical Microbiology Reviews,2001(14):126-149.

[7]JOHNSON N P,MUELLER J.Updating the accounts:global mortality of the 1918-1920“Spanish”influenza Pandemic[J].Bull Hist Med,2002(76):105-115.

病毒亚型 篇2

关键词：猪流感病毒,纯化,鉴定

2009年,甲型H1N1流感爆发,很快便波及全球,造成了数千人的死亡,带来了巨大的经济损失,这无疑给人类敲响了警钟。 要控制猪流感病毒就需要对其进化流行趋势和遗传变化机制进行研究,而病毒的纯化无疑是其前提和基础。在实际中,猪因为其“混合器”作用可能会感染不同的流感病毒,因此简单有效分离、纯化病毒是所有科研人员面临的一个问题。噬斑分离法虽然是一种有效的方法,但是此种方法需要很高的试验条件并且操作复杂及不能处理大批量的样品,在实际操作应用中具有一定的局限性[1,2]。而鸡胚终点稀释法结合特异血清中和法则对试验要求简单[1],且能同时大批量地平行处理样品[3,4],具有很高的实际应用价值。

试验对鸡胚终点稀释法结合特异血清中和法进行了相关的研究,旨在为混合感染或者交叉感染的猪流感病毒的纯化和鉴定提供了相关参考。

1 材料

1.1 病毒

低致病性毒株A/Swine/Guangdong/L3/09、A/Swine/Guangdong/B5/09和A/Swine/Guangdong/L1/09(分别代表H1N1、H3N2和H9N2,简称L3、B5和L1),华南农业大学兽医学院农业部养禽与禽病防治重点实验室分离、鉴定和保存。

1.2 鸡胚

SPF鸡胚,购自北京梅里亚维通公司,在华南农业大学兽医学院农业部养禽与禽病防治重点实验室孵化至10日龄,用于毒种传代和毒力测定。

1.3 试剂

MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、rTap DNA聚合酶、pMD18-T载体、dNTPs、DNA-2 000 Marker,均购自TaKaRa公司;Trizol Reagent,购自Invitrogen公司;氯仿和无水乙醇,购自华美生物工程有限公司;琼脂糖胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒,均购自OMGA公司。

1.4 标准阳性血清

H1N1亚型、H3N2亚型和H9N2亚型标准阳性血清,购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

2 方法

2.1 猪流感病毒混合感染的人工制备和鉴定

按照Reed-Muench方法计算3株猪流感病毒鸡胚半数感染量(EID50)。将3株猪流感病毒的病毒效价调至1×106 EID50。第1组取L3和B5各0.2 mL均匀混合;第2组取L1和B5各0.2 mL均匀混合;第3组取L3、L1和B5各0.2 mL均匀混合。3组混合毒分别用PBS在无菌条件下作10倍倍比连续稀释,取1×10-3,1×10-4,1×10-5 3个稀释度各接种5枚9日龄SPF鸡胚尿囊腔。收取24～72 h死亡的鸡胚以及72 h未死亡的鸡胚尿囊液,选择最低稀释度的尿囊液用H1、H3的标准阳性血清进行HI试验,同时进行RT-PCR试验,以验证混合感染的人工制备结果。

2.2 鸡胚终点稀释法结合特异血清中和法纯化人工制备的混合猪流感病毒

分别取2.1制备的3组人工混合感染的样品0.2 mL,向第1组和第2组各加入标准阳性H3血清0.1 mL,第3组加入0.2 mL标准阳性H1血清,无菌条件下用PBS 10倍倍比连续稀释,取1×10-6,1×10-7,1×10-8,1×10-9 4个稀释度分别接种5枚9日龄SPF鸡胚的尿囊腔,每个鸡胚接种0.2 mL。收取24～72 h死亡的鸡胚以及72 h未死亡的鸡胚尿囊液,选取稀释度最高的含毒尿囊液按照相同的方法进行传代,每代尿囊液放于-70 ℃冰箱保存,并对其进行HI试验检测其纯度。

2.3 纯化和鉴定方法的实际应用

为了分析华南地区猪群中的猪流感分布情况,对自2010年来分离的14株猪流感病毒HI阳性样品进行纯化,并对纯化得到的猪流感病毒进行HI和RT-PCR鉴定。

3 结果

3.1 猪流感病毒混合感染的人工制备和鉴定结果

第1组接种1×10-3稀释度病毒的5枚鸡胚72 h内都没有死亡,收集尿囊液并保存;第2组接种1×10-3稀释度,有1枚鸡胚在24～72 h死亡,另外4枚存活,将存活的鸡胚放入4 ℃冻死(下同),然后收集5枚鸡胚的尿囊液,置-70 ℃保存;第3组接种1×10-3稀释度,有1枚鸡胚死亡,收集尿囊液并保存。从3组鸡胚中随机挑选1枚取尿囊液进行HI试验,结果表明,3组鸡胚尿囊液的血凝性均能被H1和H3阳性血清抑制。RT-PCR检测结果表明:在检测HA片段时,3组均在1 700 bp出现H1和H3亚型条带(见图1)。说明人工制备3组混合病毒感染模型成功。

M.DL-2 000 Marker;1,7.L3(H1N1)HA片段; 2,5,9.B5(H3N2)HA片段;3,6,10.阴性对照; 4,8.L1(H9N2)HA片段。

3.2 鸡胚终点稀释法结合特异血清中和法纯化及鉴定结果

按2.2的方法对3组混合病毒进行纯化,并用HI试验检测纯化效果,结果见表1。由表1可见,第1组样品中的L3在第4代即被纯化出来;第2组样品中的L1也在第4代被纯化出来;第3组样品中的B5在第5代被纯化出来。结果见表1。纯化后连续传代1次并进行鉴定,结果证明样品已经被纯化。

注:-表示效价小于4,为阴性,空白表示传代跳过,无结果。

为了进一步验证经过鸡胚终点稀释法结合特异血清中和法纯化过的病毒纯化情况,应用PT-PCR方法对3组纯化后的病毒HA片段进行特异性扩增,结果见图2。由图2可见,第1组和第2组中只分别含有L3和L1病毒的HA片段,两组之中都没有B5的HA片段;相反,第3组中只含有B5的HA片段(第8泳道出现长约1 700 bp的条带),没有L3和L1的HA片段。

M.DL-2 000 Marker;1.L3(H1N1)HA片段; 2,5.无B5(H3N2)HA片段;3,6,9.阴性对照; 4.L1(H9N2)HA片段;7.无L3、L1 HA片段; 8.B5(H3N2)HA片段。

3.3 纯化和鉴定方法的实际应用

应用本试验的方法对14株HI阳性猪流感病毒进行纯化,得到了H1N1 4株、H1N2 1株、H3N2 5株、H4N8 1株、H6N6 1株和H9N2 2株,其中H6N6亚型为世界上第1株从猪体内分离的H6亚型流感病毒[5];H4N8为国内从猪体内分离的第1株H4亚型流感病毒。这些分离的病毒经鸡胚终点稀释法结合特异血清中和法纯化后,经HI和RT-PCR鉴定都达到了纯化。

4 结论与讨论

长期以来,猪流感病毒对养猪业造成的危害并不是很明显,因此人们对其不是很关注。随着2009年甲型H1N1人流感病毒的爆发,给人们敲响了警钟。这就要求人们对猪流感病毒必须进行有效的分子流行病学调查,深入探究猪流感病毒的变异趋势,以便更好地做好防控措施。首先要做好病毒的纯化工作。日益增多的不同亚型猪流感病毒混合感染迫使人们寻找一条简单、有效的纯化方法。鸡胚终点稀释法是S.Ciappi等[6]在研究A型流感病毒的O→D相变异时所创立的,之后G.B.Sharp等[7]用特异血清中和优势毒株,使用鸡胚终点稀释法将掩盖的毒株纯化出来,目前已经被广泛地应用于流感病毒纯化和变异株的选择等工作。国内有关于鸡胚终点稀释法应用于禽流感病毒的报道[8,9],但是还没有猪流感病毒的相关报道。本研究对鸡胚终点稀释法结合特异血清中和法纯化猪流感病毒的工作进行了系统、全面的分析和研究。

在我国,猪主要感染H1N1和H3N2亚型流感病毒,因此本试验人工制备了这两种病毒混合感染的模型,最大程度地还原了实际感染的情况。此外,由于HI试验有交叉保护的情况存在,本试验又使用RT-PCR方法对纯化结果进行鉴定,有效地提高了鉴定结果的准确性。

单纯应用鸡胚终点稀释法对多种亚型流感病毒混合感染的样品进行纯化的结果往往都是毒力强的毒株被纯化出来,而且耗费的时间和精力也更多。此种方法也会造成强毒、弱毒混合感染后弱毒丢失的情况。而在实际情况中,猪这种“混合器”体内混合流感病毒的情况时有发生。为了增强对猪流感病毒纯化的针对性和目的性,研究对鸡胚终点稀释法结合特异血清中和法纯化猪流感病毒混合感染样品进行了探索。结果表明,可以使混合感染样品中任一期望获得的病毒被成功纯化出来。因此,同时设立针对不同亚型病毒的纯化组,可以使混合感染样品中的不同毒株逐一被纯化出来,特别是分离、纯化生长竞争能力弱、难以用鸡胚终点稀释法分离出来的猪流感病毒时,这种分离方法的优越性更能得以充分体现。

参考文献

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[2]郭元吉,程小雯.流行性感冒病毒及其实验技术[M].北京:中国三峡出版社,1997.

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病毒亚型 篇3

国家禽流感参考实验室成功研制出重组禽流感病毒灭活疫苗 (H7亚型, H7N9/PR8株) , 并通过了新兽药评价, 作为应急技术储备。

为进一步做好H7N9流感疫情应对工作, 及时发现、剔除家禽H7N9流感病毒, 保障动物产品质量安全和公共卫生安全, 农业部制定并实施《全国家禽H7N9流感剔除计划》。在科研人员的辛苦努力下, 成功研制出重组禽流感病毒灭活疫苗 (H7亚型, H7N9/PR8株) 。经试验该疫苗安全, 免疫效果良好, 可对H7N9禽流感病毒攻击提供有效保护, 能够100%阻止病毒复制和排泄, 对有效阻断病毒传播、降低病毒高致病力突变风险具有重要意义, 一旦疫病防控需要, 即可马上使用该疫苗对家禽实施免疫, 确保H7N9禽流感可防可控。

病毒亚型 篇4

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2011年9月至2012年8月在四川大学华西第二医院妇科门诊就诊和住院的女性患者29832例,年龄18~87岁,平均36±9岁。其中2398例具有宫颈活检组织病理诊断结果,并根据其组织病理学结果进行分组:慢性宫颈炎组599例,CINⅠ组437例,CINⅡ/Ⅲ组906例(其中CINⅡ338例,CINⅢ568例),宫颈癌组456例(其中宫颈鳞癌421例,腺鳞癌21例,腺癌14例)。

1.2 仪器与试剂

Life Pro PCR基因扩增仪TC-96/T/H购自杭州博日科技有限公司,亚能恒温杂交仪YN-H16和HPV基因分型检测试剂盒均购自深圳亚能生物技术有限公司。

1.3 研究方法

采用HPV基因分型检测试剂盒进行HPV检测,经过样本DNA的提取,反向PCR扩增,杂交,洗膜,显色,对所有宫颈脱落细胞进行23种HPV亚型检测,包括18种高危型HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4)和5种低危型HPV(HPV6、11、42、43、44)。判读标准:任何一种HPV亚型阳性为HPV感染,两种或以上HPV亚型阳性为HPV多重感染,高危型HPV阳性或高危型和低危型HPV同时阳性者为高危型HPV感染,仅低危型HPV阳性为低危型HPV感染。

1.4 统计方法

运用SPSS 18.0进行统计学处理,对各年龄组及不同宫颈病变HPV感染率比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV感染率及基因亚型分布

HPV感染率为25.20%(7518/29832),高危型HPV感染率为21.03%(6275/29832),低危型HPV感染率为4.17%(1243/29832),多重感染率为5.94%(1772/29832)。所有样本检测到23种亚型中21种,未检测到HPV MM4和HPV44。高危型HPV亚型由高到低依次为HPV16(8.15%,2431)、58(4.40%,1312)、33(2.24%,668)、52(2.11%,628)、18(1.75%,521)、56(1.50%,447)、66(0.89%,265)、31(0.86%,257)、35(0.82%,245)、68(0.73%,219)、59(0.46%,137)、53(0.46%,137)、45(0.23%,68)、83(0.19%,56)、73(0.16%,47)、51(0.15%,46)、39(0.05%,14)。低危型HPV亚型由高到低依次为HPV43(3.14%,938)、6(2.84%,846)、11(1.33%,396)、42(0.60%,178)。2.2 HPV感染的年龄分布将29832例患者按不同年龄分成5组,<25岁组HPV感染率为25.27%(867/3431),25~34岁组HPV感染率为22.05%(2402/10892),35~44岁组HPV感染率为25.42%(2697/10611),45~54岁组HPV感染率为29.12%(1153/3959),≥55岁组HPV感染率为42.49%(399/939),各年龄组别HPV感染率差异有统计学意义(P<0.001)。除<25岁组外,HPV感染率随年龄增加而增高。HPV感染率在≥55岁组呈现感染高峰,感染率为42.49%。并且各年龄组HPV感染亚型均以高危型为主,尤其以HPV16最多见。

2.3 不同宫颈病变患者HPV感染率及亚型分布

在2398例宫颈病变患者中,HPV感染率为70.39%(1688/2398),在慢性宫颈炎中为38.90%(233/599),CINⅠ为59.73%(261/437),CINⅡ/Ⅲ为83.55%(757/906),宫颈癌为95.83%(437/456)。各组间比较,差异均有统计学意义(P<0.001)。宫颈癌中HPV感染率鳞癌为95.96%(404/421),腺癌为92.86%(13/14),腺鳞癌为95.24%(20/21)。随着宫颈病变的严重程度增加,HPV感染率增高。在2398例宫颈病变中,常见的高危型HPV依次为16、58、33、18、52,感染率分别为36.41%(873)、14.26%(342)、5.96%(143)、5.21%(125)、5.09%(122)。在宫颈癌中,宫颈鳞癌中常见的高危型HPV依次为HPV16、18、58、33、52,宫颈腺癌中仅检出3种HPV型别,依次为HPV16、33和18,宫颈腺鳞癌中也仅检出3种HPV型别,依次为HPV16、18和52;在CINⅡ/Ⅲ中依次为16、58、33、52、18;在CINⅠ中依次为HPV16、58、52、56、33,在慢性宫颈炎症中则为HPV58、16、52、33、56。见表1。

2.4 HPV单一感染和多重感染与宫颈病变的关系见表2。

在所有1688例HPV阳性的宫颈病变组中,单一感染比例为74.35%(1255/1688),多重感染比例为25.65%(433/1688)。HPV阳性的不同程度宫颈病变中均以单一感染为主。除慢性宫颈炎组外,单一感染比例随宫颈病变程度增加而增加,CINⅠ、CINⅡ/Ⅲ和宫颈癌的单一感染所占比例分别为69.73%,70.41%和84.67%,宫颈不同病变组相比,差异有统计学意义(P<0.001)。在1255例单一感染病例中,HPV为最常见的亚型,有637例,占单一感染病例的50.76%。

3 讨论

3.1 HPV感染率及亚型分布存在地区差异

本研究对29832例妇女进行了宫颈脱落细胞HPV分型检测,HPV感染率为25.20%,并且以高危型HPV感染为主,高于其他文献基于普通人群的调查报道,这可能与本研究中妇女多为门诊就医人群有关。从全世界范围内来看,最常见的HPV亚型为16,其次为18,其他亚型(如58、52、33等)分布存在地区差异。Munoz等[3]通过抽样调查研究发现,人群中HPV型别分布与导致宫颈癌的HPV型别分布类似,常见的HPV亚型是16、18、45、31、58、33、35。在本研究中,HPV16为最常见的亚型,HPV58和52同样较为常见,这与我国其他地区以往的报道相似[4,5]。而在西方国家较为常见的HPV18在本组病例中相对较少,并且不太常见的HPV33感染率也很高,这进一步说明了HPV感染型别分布存在一定的地区差异。本研究结果分析了女性感染HPV基因亚型分布和排序,为临床防治宫颈癌提供了流行病学依据,对提高宫颈癌防治水平和维护妇女健康具有重大意义。

3.2 HPV感染与年龄的关系

关于HPV感染与年龄分布是否具有相关性目前观点不一。国内外研究报道显示,HPV感染率随年龄的增长呈现“U”型分布,或者呈下降趋势[6]。本研究将所有妇女分为5个年龄组,HPV感染率在各年龄组中差异有统计学意义,除<25岁组外,HPV感染率随年龄增加呈现增高趋势,在≥55岁组中出现高峰,感染率高达42.49%。上述结果可能与≥55岁年龄段妇女样本量相对较少,多因明显异常前来就诊有关。本研究与周庆云等[7]报道结果相似,HPV感染率在>45岁组明显高于36~45岁组和<36岁组,HPV感染率随年龄增加而增高。而与Liu等[8]报道在广州地区HPV感染率在20~29岁组最高,在40~49岁组和>60岁组则相对较低,而在中国香港地区的宫颈癌人群和普通人群中HPV感染率均在20~29岁组最高,在40~49岁组最低。但无论HPV感染是否与年龄分布相关,本研究结果提示应重视对中老年妇女进行宫颈癌的筛查及防治教育。年轻女性由于机体自身免疫功能较强,HPV感染比较常见且容易清除,可积极进行定期随访,以免引起不必要的忧虑。而对于中老年妇女,随着年龄的增长,机体免疫功能减弱和雌激素水平降低,对病毒的清除功能减弱,故HPV感染几率增高,且高危型持续性感染的可能性较大;另外,可能自我保健的意识相对较弱,从而导致宫颈癌的发生。因此,加强中老年妇女宫颈癌筛查的力度及防治教育刻不容缓。

3.3 HPV感染与宫颈病变的严重程度有关

持续性高危型HPV感染是宫颈癌及其癌前病变发生的必要条件。Munoz等[3]发现,90%以上的宫颈癌伴有HPV感染,在宫颈癌及癌前病变中,主要感染型别为16、18型。我国的宫颈癌患者最常见的HPV感染为16、18型,其他型别依次为58、52、31、33、45型[9]。本研究结果显示,随着宫颈病变严重程度的增加,HPV感染率(特别是HPV16)均呈增高趋势,说明了HPV感染与宫颈病变的发生密切相关。本研究宫颈癌组HPV感染率为95.83%,病理类型多为宫颈鳞癌,常见的高危型HPV依次为16、18、58、33、52型,符合我国大部分地区的人群分布,与Li等[10]报道四川省成都市的宫颈癌患者HPV感染常见的型别16、58、18、31、33型有所不同,提示在本地区31和52型在宫颈癌中同样较为常见。此外,因腺癌和腺鳞癌较少,不能做相关评估和分析,待今后积累更多样本做进一步分析报道。本研究CINⅡ/Ⅲ中HPV感染率为83.55%(757/906),常见的高危型HPV依次为16、58、33、52、18,相比于宫颈癌组,HPV58比HPV18更为常见。在其他组中常见的类型与宫颈癌组和CINⅡ/Ⅲ组相似。目前商业化的HPV预防性疫苗针对宫颈癌只能保护HPV16、18两型的感染,因此,明确导致宫颈病变的主要型别,可为研制适合的HPV疫苗的应用提供充分的流行病学资料。

3.4 单一感染更易导致宫颈癌的发生

由于HPV型别众多,机体可以同时单一感染或同时感染多个型别。对于多重感染是否促进宫颈病变的发展目前研究观点不一。有的学者认为HPV的多重感染出现持续性感染的危险性更大,而HPV的持续感染是宫颈病变发生的直接原因,认为多重感染易导致宫颈病变[11]。有学者认为HPV多重感染并不增加宫颈癌的发生,HPV感染的型别数与宫颈病变的级别无关[3]。本研究结果与第二种观点较为一致。在HPV阳性的不同程度宫颈病变中,除慢性宫颈炎组外,单一感染所占比例随宫颈病变严重程度的增加而增高,由CINⅠ组的69.73%上升到宫颈癌组的84.67%,宫颈不同程度病变相比差异有统计学意义(P<0.001),在一定程度上可说明单一感染可能对宫颈癌的发展起促进作用,但具体机制尚待更多深入的研究。此外,本研究中单一感染中最常见的亚型为HPV16,占单一感染病例的50.76%,提示在临床工作中应该尤其重视对感染HPV16患者的密切随访和治疗,做到早发现、早治疗,降低宫颈癌的发生。

综上所述,本研究HPV感染最常见的亚型为16、58、33、52、18。HPV感染率随年龄增加而呈增高趋势。在不同宫颈病变中,HPV的感染率随宫颈疾病严重程度的增加而增高,并且型别分布有所不同。此外单一感染可能更易导致宫颈癌的发生。

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[10]Li J,Zhang D,Zhang Y,et al.Prevalence and genotype distribution of human papillomavirus in women with cervical cancer or high-grade precancerous lesions in Chengdu,western China[J].Int J Gynaecol Obstet,2011,112(2):131-134.

病毒亚型 篇5

河北省作为国内生猪生产的主要省区之一, 近年来不断有类似于猪流感的疾病发生, 但由于一些其他类似呼吸疾病的存在使其诊断较为困难, 由此带来的严重经济损失。因此, 应加强对河北省内猪流感疫情的监控, 旨在了解河北地区SIV毒株的变异和流行趋势, 为河北省乃至全国SI疫情监测及科学防制提供依据。

1 材料

H3、H5、H9亚型流感病毒单因子抗血清, 购自农业部哈尔滨兽医研究所;SPF鸡胚、SPF级Balb/c小鼠, 购自北京实验动物研究中心。

2 方法

2.1 病料的采集与处理

采集河北省某猪场有呼吸道症状的30～60日龄仔猪的鼻腔棉拭子36份, 放于5 mL 50%甘油生理盐水中保存, 以2 000 r/min进行离心, 取其上清液, 备用。

2.2 病毒的增殖

取每份样品上清液接种10日龄SPF鸡胚2枚 (于尿囊腔接种上清液0.1 mL) , 共接种72枚, 然后于37 ℃培养72 h, 弃去24 h内死亡的鸡胚。将24 h后死亡和72 h未死亡的鸡胚置于4 ℃冰箱中保存4 h, 收集鸡胚的尿囊液。

2.3 微量红细胞凝集 (HA) 与凝集抑制 (HI) 试验

取收集的尿囊液用微量法做HA试验, 测定该尿囊液是否对公鸡、豚鼠、猪、小白鼠、绵羊等动物的0.5%红细胞悬液有凝集活性。如凝集则测定其血凝效价 (血凝单位) , 分别用H3N2、H5N1、H9N2亚型流感病毒单因子抗血清进行HI试验, 进行病毒亚型鉴定。

2.4 病毒的部分理化特性的研究

2.4.1 血凝素热稳定性试验

将分离毒株分为8组, 分装于灭菌离心管中, 置56 ℃水浴中分别处理0, 5, 15, 30, 60, 90, 120, 150 min和过夜, 处理后迅速置于4 ℃冰箱5～10 min, 分别测定其HA效价。

2.4.2 耐热性试验

每个分离毒株设5个组, 每组取鸡胚尿囊液1 mL分别于4 ℃作用60 min, 50 ℃作用15, 30, 60 min及60 ℃作用10 min。每个处理接种3枚鸡胚, 37 ℃培养, 收集24～96 h死亡或未死亡鸡胚尿囊液, 测定HA效价。

2.4.3 乙醚敏感试验

取鸡胚尿囊液1 mL, 加入0.25 mL乙醚, 4 ℃作用24 h;同时用灭菌生理盐水代替乙醚作对照。每个处理接种3枚鸡胚, 37 ℃培养, 收集24～96 h死亡或未死亡鸡胚尿囊液, 测定HA效价。

2.4.4 氯仿敏感试验

取鸡胚尿囊液1 mL加入终浓度为48 mL/L的氯仿, 4 ℃ 作用10 min;同时用灭菌生理盐水代替氯仿作对照。每个处理接种3枚鸡胚, 37 ℃培养, 收集24～96 h死亡或未死亡鸡胚尿囊液, 测定HA效价。

2.4.5 耐酸性试验

取0.5 mL鸡胚尿囊液平均分为2份, 一份用0.1 mol/L盐酸调至pH 值为3.0, 室温下作用3 h, 再用56 g/L NaHCO3溶液将pH值调至7.0;另一份加入灭菌生理盐水, 室温下放置1 h。以上2份尿囊液经10倍稀释后, 每个处理接种3枚鸡胚, 37 ℃培养, 收集24～96 h死亡或未死亡鸡胚尿囊液, 测定HA效价。

2.5 小鼠感染试验

将含SIV的鸡胚尿囊液作10倍稀释, 经鼻腔接种8只小鼠, 0.1 mL/只;另设对照组, 接种等量、相同稀释倍数的正常鸡胚尿囊液。逐日观察其症状及死亡情况。24 h内死亡者为非特异性死亡;采集24 h后死亡小鼠病料分离病毒;未死亡小鼠在接种病毒后第14 天采集血清进行HI试验。

3 结果

3.1 SPF鸡胚培养试验结果

结果表明:鸡胚接种24 h以内死亡10枚, 胚体无明显变化, 尿囊液混浊;24～48 h死亡3枚, 胚体出血明显, 尿囊液澄清、透明;48～72 h死亡2枚, 胚体有出血点, 尿囊液澄清、透明;72 h人工致死鸡胚21枚, 胚体无明显变化, 尿囊液澄清、透明。

3.2 HA试验与HI试验结果

对公鸡、豚鼠、猪、小白鼠、绵羊等动物的0.5%红细胞悬液有凝集活性的尿囊液有6份, 分别为24～48 h死亡鸡胚尿囊液3份, 血凝效价为26;48～72死亡鸡胚尿囊液2份, 血凝效价为28;72 h人工致死鸡胚尿囊液1份, 血凝效价为28。应用H3N2、H5N1、H9N2亚型流感病毒单因子抗血清进行HI试验, 只有H3N2抗血清能够抑制红细胞凝集, 因此判定该分离病毒的血清亚型为H3N2。

3.3 血凝素热稳定性试验结果

SIV分离株在56 ℃水浴5 min, 其血凝效价下降了2个单位, 且血凝素均为热不稳定型。

3.4 耐热性试验结果

SIV毒株在4 ℃放置60 min, 对鸡胚的感染性不变;经50 ℃处理30 min, 接种的鸡胚尿囊液已检测不到血凝效价;60 ℃处理10 min, 接种鸡胚尿囊液则完全测不到血凝效价。说明该毒株均对热敏感。

3.5 乙醚、氯仿、酸敏感试验结果

结果表明, 该毒株对乙醚、氯仿和酸均敏感。

3.6 小鼠感染试验结果

用该毒株对小鼠进行感染, 第5天有1只死亡, 其余小鼠精神沉郁, 采食量和体重明显下降, 剖检可见肺脏水肿、出血, 可从肺脏、脾脏中分离到H3N2病毒。病理组织学检查可见肺部呈现以弥漫性肺泡损伤变化为特征的病毒性肺炎。接种病毒后第14天, 可在小鼠血清中检测到抗H3N2亚型流感病毒抗体。

4 讨论

(1) 研究在对河北省SI进行流行病学调查的基础上, 采集河北省某猪场出现呼吸道症状的猪鼻拭子样品接种SPF鸡胚进行病毒分离, 分离到H3N2-SIV的分离株, 推测其可能是河北省流行的SIV的主要亚型。

(2) SIV血凝特性是流感病毒的一个重要的生物学特性。试验分离获得的H3N2-SIV对多种动物的红细胞具有血凝性。

(3) 虽然SIV血凝素热稳定性与致病力之间无明显的相关性, 但在生态学和流行病学方面却有一定的意义。血凝素热稳定性强的毒株在自然条件下存活的能力相对较强, 会有更多的机会通过不同途径在同一宿主或不同宿主间传播。试验分离获得的SIV河北分离株的血凝素均为热不稳定型, 证实SIV对热敏感, 60 ℃、10 min即可被灭活。

(4) 研究证实, 河北省部分猪场存在H3亚型SIV, 虽然所分离的病毒未表现出很强的致病力, 且采集样品的猪场饲养的猪仅表现轻微的呼吸症状, 并没有造成严重的发病或死亡, 但流感病毒作为呼吸系统疾病的一个重要诱因, 在混合感染、并发感染和继发感染中具有一定的作用, 给养猪业带来巨大的经济损失。在我国, 多个省区均有不同亚型的猪流感病毒存在[2], 同时还发现SIV重组毒株[3,4], 因此加强河北省SI的监测和研究、部署相应的防制措施十分必要。

参考文献

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病毒亚型 篇6

本研究从福州市某活禽市场采集的泄殖腔棉拭子样品中分离出1株鸡源禽流感病毒, 经血清学分析和分子生物学检测, 确定该AIV分离株为H9N2亚型AIV。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

9~10日龄SPF鸡胚购自福州大北农生物技术有限公司;病料采自福州市某活禽市场。

1.1.2 仪器和试剂

凝胶成像分析系统为为○○RR BIO-RAD公司产品;PCR仪为Eppendorf公司产品;TIANamp Virus RNA Kit病○RR毒毒○RNA提取试剂盒购自天根生化科技 (北京) 有限公司;Trans Script OneStep g DNA Removal and c DNA Synthesis Super Mix反转录试剂盒、2×Easy Taq PCR Super Mix、Trans5αChemically Competent Cell均购自北京全式金生物技术有限公司;p MD18-T Vector、DNA Marker均购自Ta Ka Ra公司;AIV型特异性血清、抗禽流感病毒HA亚型 (H5、H7、H9亚型) 血清购自哈尔滨兽医研究所, ND、EDS-76阳性血清购自中国兽医药品监察所。

1.1.3 引物

参照Gen Bank数据库上已发布的禽流感病毒M基因序列, 运用Oligo 7软件设计A型禽流感病毒检测引物, 参照已发布的HA和NA基因序列, 设计H9亚型和N2亚型基因特异性引物, 引物的具体信息见表1, 引物由生工生物工程 (上海) 有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 样品采集与处理

用无菌棉拭子采集鸡群泄殖腔内容物, 浸泡于1 m L含青霉素 (2 000 IU/m L) 和链霉素 (2 000 IU/m L) 的无菌PBS缓冲液 (p H7.4) 中, 充分振荡混匀后, 于8 000 r/min离心15 min, 取上清经0.22μm滤器抽滤后保存于-80℃备用。

1.2.2 病原的分离培养

将处理好的样品经尿囊腔接种2枚10日龄SPF鸡胚, 每枚0.3 m L, 37℃孵育, 每日观察3次, 无菌收集48~72 h的胚液, 无菌检验后继续传3代, 无菌回收尿囊液, -20℃低温保存备用。

1.2.3 病毒的血凝活性测定及血凝抑制试验

按照文献[4]的方法对病毒分离株进行血凝 (HA) 试验, 然后以4个血凝单位的病毒液分别与抗NDV、EDSV-76及H5、H7、H9亚型禽流感病毒等标准阳性血清进行微量血凝抑制试验 (HI) 。

1.2.4 病毒PCR鉴定

1.2.4. 1 病毒核酸的提取和反转录

将病毒尿囊液按照TIANamp Virus RNA Kit病毒RNA提取试剂盒操作说明提取病毒核酸, 再用Trans Script○ROneStep g DNA Removal and c DNA Synthesis Super Mix反转录试剂盒按照说明书步骤反转录成c DNA。

1.2.4. 2 目的基因的PCR扩增

以c DNA作为模板, 进行PCR反应。PCR反应体系50μL:2×EasyTaq○RPCR Super Mix 25μL, 上、下游引物各1μL, 模板3μL, dd H2O 20μL。PCR扩增程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s, 54℃退火30 s, 72℃延伸40 s, 35个循环;72℃延伸7 min, 10℃保温。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4. 3 PCR产物克隆及序列分析

将扩增的目的片段连接到p MD18-T载体, 克隆到Trans5α感受态细胞, 挑选阳性克隆菌送上海生工生物工程技术公司测序。测序结果进行BLAST比对分析, 并用Lasergene软件包和MEGA6软件进行基因序列分析。

2 结果与分析

2.1 病毒的分离及血凝活性测定

病毒分离株接种SPF鸡胚传代后, 72 h内出现死亡, 回收的胚液按常规方法测定血凝活性, 结果表明可凝集1%鸡红细胞, 血凝效价为25。

2.2 病毒血凝抑制试验

按常规方法对SPF鸡胚尿囊液进行血凝抑制试验, 结果表明含毒尿囊液仅被抗禽流感病毒H9亚型标准阳性血清特异性抑制, 而不被抗EDSV-76、NDV和H5、H7亚型禽流感病毒等标准阳性血清所抑制。

2.3 病毒的RT-PCR鉴定

用禽流感病毒A型特异性引物、H9亚型HA和N2亚型NA基因特异性引物扩增该分离株的反转录产物c DNA, 1%琼脂糖凝胶电泳分析表明, 扩增产物均与预期结果相符 (见图1) 。

(M:DL 2000 DNA Mrker;1:NA基因扩增产物, 517 bp;2:HA基因扩增产物, 581 bp;3:M基因扩增产物, 263 bp)

2.4 目的基因测序结果及进化分析

在Gen Bank基因库中对病毒株 (A/chicken/Fujian/05/2015) 的3个基因目的片段的测序结果进行BLAST比对分析, 3个基因均属于H9N2亚型禽流感病毒的基因, 该结果与血清学试验结果相符。HA基因遗传进化分析表明, 该病毒分离株与代表株DK/HK/Y280/97处于同一分支, 与上海的鸡源分离株A/chicken/Shanghai/06/2015 (H9N2) 同源性最高, 同源性为99.5%;与常用疫苗株CK/SH/F/98、CK/SD/6/96、CK/GD/SS/94的同源性依次为87.4%、87.9%、88.2% (见图2-图3) 。

3 讨论

目前, H9N2亚型禽流感病毒已在家禽中建立了稳定的种系, 广泛分布在世界各地[5,6], 虽然H9N2亚型AIV对养殖业的影响一般不表现为感染家禽导致大批死亡, 该病毒感染家禽后, 仅引起轻微的临床症状, 有的则无临诊表现, 但该型病毒感染容易引起继发感染并降低生产能力, 给家禽养殖业造成严重经济损失[7,8]。尤其是对近年来新发感染人的H7N9亚型AIV的研究发现, 其6个内部基因均含有H9N2亚型AIV的6个内部基因的重组痕迹[9], 提示我们在关注H5N1亚型高致病性禽流感病毒的同时, 还应该加强对H9N2亚型低致病性禽流感病毒的研究和防控。

本研究分离的1株鸡源禽流感病毒, 经血清学分析和分子生物学检测, 确定该AIV分离株为H9N2亚型AIV。该病毒与中国近期流行于家禽中的H9N2亚型禽流感病毒的同源性较高, 所扩增的3个片段均为禽源H9N2流感病毒的相应基因片段。Guan等[10]将欧亚种系H9N2亚型AIV的HA基因分为3个群系, 其代表毒株分别为A/quail/Hong Kong/G1/97、A/Duck/Hong Kong/Y280/97和A/Duck/Hong Kong/Y439/97;本研究分离的病毒株HA基因遗传进化分析表明, 该AIV分离株与代表株A/Duck/Hong Kong/Y280/97处于同一分支, 与常用疫苗株的同源性较高。以上结果表明, 流行于鸡群中的H9N2亚型流感病毒仍然处于一个较稳定的遗传演化过程。

参考文献

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病毒亚型 篇7

1材料

1.1 试验动物

疑似感染肉鸡由重庆市武隆县某鸡场提供。

1.2 试剂

2×Taq PCR Master Mix、DL2 000核酸marker、病毒DNA提取试剂盒、以及胶回收试剂盒均由天根生化科技 (北京) 有限公司提供;禽白血病病毒ELISA抗原检测试剂盒购自北京维德维康生物技术有限公司。参照NCBI中公布的最常见A、B、和J亚型禽白血病病毒序列设计特异性引物扩增其保守序列, 引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列信息见表1。

2方法

2.1 样品的处理

无菌采集送检鸡只的刚脏组织, 加入适量PBS, 充分研磨制成1∶5 组织研磨液, 1 000r/min离心10 min, 取上清, 经0.22 μm滤器过滤后制成悬液, 备用。

2.2 Elisa检测

参照禽白血病Elisa抗原检测试剂盒说明书, 对肝脏组织研磨液进行禽白血病的抗原检测, 并对结果进行分析。

2.3 PCR检测

参照病毒DNA提取试剂盒说明书提取Elisa检测结果为阳性的患病鸡肝脏组织病毒悬液基因组, 并利用设计的特异性引物扩增鸡白血病病毒保守序列。 25 μL反应体系为:2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL, 上下游引物各0.5 μL, DNA模板2 μL, dd H2O 9.5 μL。反应条件为:95℃预变性5min, 95℃ 45 s, 58℃ 45 s, 72℃45 s, 30 个循环, 72℃延伸10 min, 4℃结束反应。 并将PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序分析。

3结果

3.1 Elisa检测结果

对送检鸡只的肝脏组织研磨液进行Elisa检测后, 发现送检的10只鸡中, 有6只为阳性, 阳性检出率为60%。

3.2 PCR检测结果

通过PCR检测发现, Elisa检测结果为阳性的样本分别在分别在900 bp和700 bp的位置出现特异性条带, B和J亚型出现预期条带, 结果见图1。

3.3 测序结果

将PCR扩增产物送出测序, 发现鸡白血病病毒B亚型扩增产物共997 bp, J亚型共717 bp, 结果见图2和图3。

4讨论

禽白血病病毒是危害家禽养殖业的一种主要病原, 其病毒亚型多样, 虽然, 禽白血病病毒一般抵抗力不强, 普通的消毒剂即可将其杀灭, 且该病毒对热较为敏感, 高温下极易灭活, 但该病的防治依然面临着巨大的困难[6]。目前, 对禽白血病的检测常用的方法是PCR和Elisa检测, PCR技术在禽白血病的检测方面具有发挥着重要作用, 其可以对禽白血病病毒进行准确的鉴定, 通过对特异性序列的扩增, 可对病毒所有亚型进行精确鉴定, 但由于其对样品要求严格, 且成本相对较高, 不适合对家禽进行大规模的检测[7]。 禽白血病病毒的Elisa检测是目前最为常用的检测方法, 其被广泛应用于禽类的白血病的检测[8]。

本研究建立的鸡白血病高效的PCR检测方法, 从送检的样品中共检测到了鸡白血病病毒的B和J两种亚型。 而重庆地区最常见的感染类型为J亚型, B亚型较为少见, 研究表明该养殖场存在鸡白血病B和J亚型共感染的现象。 本研究为该养殖场鸡白血病的及时防控提供了有力证据, 也为鸡白血病治病机理的研究和疫苗的研发奠定了理论基础。

参考文献

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