辽宁病毒

辽宁病毒（共4篇）

辽宁病毒 篇1

猪圆环病毒2型 (PCV2) 是新近发现的一种圆环病毒, 可导致断奶仔猪多系统衰竭综合征 (PMWS) 的发生。1991年, 加拿大首次报道该病发生。目前, 该病已呈现出世界性蔓延的趋势。我国从2001年以来, 关于PMWS流行和发生有很多报道。PCV2与许多猪相关疾病的发生有关。除PMWS之外, 猪皮炎肾病综合征 (PDNS) 、PNP、猪呼吸道疾病综合征 (PRDC) 、繁殖障碍、CT和肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联。目前, PCV2已成为影响各国养猪业发展的主要因素。

本文对2009～2010年上半年辽宁省335个兽医门诊送检的具有典型PMWS症状病猪的病料样品进行PCV2荧光PCR检测, 从中选取6份阳性病料进行病毒DNA的分离、鉴定、测序, 分析6株PCV2辽宁省分离毒株的基因序列, 比较分离毒株互相之间的同源性, 再与Genbank中2004～2010年之间国内外不同地域发表的13个参考毒株的ORF1、ORF2基因序列之间进行比对, 进而分析国内外流行毒株之间的内在联系, 各毒株分子流行病学特点, 比较各毒株间的同源性和差异性, 为辽宁省防控PCV2相关疾病提供可靠的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

PK-15细胞由中国动物卫生与流行病学研究中心惠赠。病料为辽宁省各地区335个兽医门诊采集具有典型PMWS临床症状和剖检病变的病死猪的淋巴结、肝脏、脾脏、肺脏和扁桃体等组织器官。

1.1.2 主要试剂

DNA凝胶快速回收试剂盒购自广州东盛科技有限公司;Taq DNA聚合酶、25 mmol/L MgCl2、1 dNTPs、10×Buffer E、T4DNA连接酶和限制性内切酶EcoRI均购自上海华美生物工程有限公司;Proteinase K、pGEM-T Easy载体均购自Promega公司;大肠杆菌DH5α由中国动物卫生与流行病学研究中心惠赠;DNAMarker DL 2 000+DL 15 000、X-gal和IPTG均购自大连Takara公司。

1.1.3 主要仪器

台式高速冷冻离心机 (Z323K型) , 德国赫默公司;PCR仪 (T1型) , 德国Biomepra公司;凝脂成像分析仪 (UV-WHIPE型) , 美国Upv公司;电泳仪 (3000X1型) , 美国BIO-RAD公司;紫外分析仪 (UV-3000型) , 上海天能科技电子有限公司;恒温金属浴 (CHB-100型) , 杭州大和热磁电子有限公司

1.2 方法

1.2.1 PCV2的分离与鉴定

(1) 分离。将PCV2荧光PCR检测结果为阳性的病料中随机选取6份用研磨器研磨后, 反复冻融4次, 提取上清液, 用0.22μm的细菌滤器过滤除菌。培养过程中同时设立不接毒的细胞培养物作为阴性对照。将上述病毒滤液与PK-15细胞悬液按体积比1:9的比例充分混合, 37℃培养48 h。弃去生长液, 用200 mmol/L D-氨基葡萄糖37℃处理25 min。倒去D-氨基葡萄糖, 用Hank′s液洗涤细胞3次。再加入细胞生长液继续培养72 h, 将细胞反复冻融3次, 收集病毒液。 (2) 将接种PCV2病毒的PK-15细胞, 反复冻融3次以裂解细胞, 取待测样本各100μl, 分别加到0.5 ml离心管中;加入100μl试剂盒的DNA提取液1, 振荡混匀, 13 000 r/min离心10 min;吸弃上清;再加入25μl试剂盒的DNA提取液2, 振荡混匀, 2 000 r/min离心10 s;100℃干浴10 min;13 000 r/min离心10 min, 保留上清于-20℃备用。

1.2.2 PCV2基因测序与分析

1.2.2. 1 PCV2全基因引物设计及合成

参考GenBank中已发表的PCV2序列, 应用primer 5.0软件, 设计出一对PCV2全基因扩增引物 (P1/P2) 。

引物由大连宝生物工程公司合成。

1.2.2. 2 PCV2基因的PCR扩增

各自以病料组织和细胞抽提物获得的DNA为模板, 进行PCR扩增。

PCR反应体系 (20μl) 包括:10×PCR缓冲液2μl、模板DNA 1μl、P1 (20 pmol/μl) 0.4μl、P2 (20 pmol/μl) 0.4μl、ExTaq酶0.2μl、dNTP (2.5 mmol/ml) 1.5μl、灭菌ddH2O 14.5μl。将各成分瞬时离心混合。

反应条件:94℃5 min;93℃55 s;59℃1 min;72℃1.5 min, 进行30个循环;最后72℃10 min, 用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

1.2.2. 3 PCV2基因片段的回收

利用DNA凝胶快速回收试剂盒, 按照试剂盒说明书对PCR扩增产物进行基因片段的回收。

1.2.2. 4 连接反应

取新的经灭菌处理的0.5 ml eppendorf管, 编号。将pGEM-T easy 0.1μg载体DNA转移到无菌离心管中, 加等量 (可稍多) 的PCR产物。加蒸馏水至体积为8μl, 于45℃保温5 min, 以使重新退火的粘端解链。将混和物冷却至0℃。加入10×T4 DNA ligase buffer1μl、T4 DNA ligase 0.5μl, 混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底, 于16℃保温8～24 h。

1.2.2. 5 重组质粒转化

用CaCl2法制备感受态大肠杆菌DH5α, 冰浴3 h后供转化试验用。

1.2.2. 6 质粒DNA的少量制备

按照质粒提取试剂盒说明书操作, 并于-20℃保存。

1.2.2. 7 酶切鉴定

在10μl重组质粒中加入2μl 10×buffer E、0.5μl EcoRⅠ, 添加超纯水至20μl, 37℃温育1 h, 用1.5%的琼脂糖电泳。根据出现目的片段大小, 确定目的基因是否已插入到pGEM-T easy载体。

1.2.2. 8 PCV2基因的序列测定与分析

通过以上病毒分离培养的方法获得6个克隆菌株, 送交中国动物卫生流行病学研究中心完成PCV2基因序列测定。利用DNAstar软件, 结合相关的文献资料, 分析PCV2基因的序列及所编码的氨基酸, 与已发表的基因序列比较分析同源性。

2 结果与分析

2.1 PCV2全长基因鉴定结果

2.1.1 病毒分离培养PCR鉴定结果

PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳, 紫外光下观察可见, 6个PCR扩增产物都出现了与预期结果相符的位于1 767 bp附近的特异条带, 见图1。

1-6.6个PCV2分离株全长基因PCR扩增产物)

2.1.2 重组质粒酶切鉴定结果

共获得6个含不同PCV2毒株全基因组扩增片段的阳性重组质粒, 分别命名为PCV-LN33-08、PCV-LN73-10、PCV-LN02-10、PCV-LN07-10、PCV-LN101-10、PCV-LN19-09, 见图2。

(1-6.六个重组质粒T-pcv的双酶切产物)

2.2 序列分析结果

2.2.1 全基因组序列分析结果

本试验获得的6个PCV2辽宁分离株基因组全长均为1 767 bp, 与有关报道的一致。将这6个分离株与Genbank中2004～2010年以来分离的8株国内代表株以及5个国外代表株进行比较。应用DNAStar分析软件对这些序列进行全基因组序列同源性分析发现, 本试验6毒株与所选的其他参考毒株全基因核苷酸序列同源性介于94.6%～100%之间, 见图3。

2.2.2 ORF1序列分析结果

本试验6个PCV2分离株ORF1均为945 bp, 编码314氨基酸的蛋白质。通过对PCV2分离毒株ORF1核苷酸及推导的氨基酸序列同源性比较发现, 本试验6个分离毒株内部ORF1核苷酸同源性为96.8%～100%, 推导的氨基酸序列同源性为98.4%～100%, 见图4。

本研究用PCV2毒株 (包括试验株与参考毒株) 的ORF1核苷酸序列同源性为96.8%～100%, 推导的氨基酸序列同源性为97.5%～100%, 见图5。

2.2.3 ORF2序列分析结果

大部分PCV2病毒的ORF2有702个核苷酸组成, 推导氨基酸数目为233 aa。本试验的6个毒株内部ORF2核苷酸和氨基酸序列同源性分别为91.3%～100%和85.5%～100%, 见图6。

通过对PCV分离毒株ORF2核苷酸及推导的氨基酸序列同源性比较发现, 与ORF1相比, 不同PCV2毒株ORF2之间差异明显, 核苷酸和氨基酸序列同源性分别为90.6%～100%和80.4%～100%, 见图7。

2.2.4 PCV毒株的遗传学关系分析

从系统发生进化树可以看出 (见图8) , 所有PCV毒株大致可分为2个大分支, 试验株PCV-LN19-09单独位于其中的一个大分支内, 其他5株试验株共同位于另一大分支。每个大分支又明显分支为2个小亚群, 并在此基础上进一步分成细小的分支。

其中, 试验株PCV-LN19-09与2005年辽宁分离株LN05-EF524526以及2006年广西、河北、河南等地分离株同在一个小亚群内, 提示亲缘关系较近。试验株PCV-LN02-10、PCV-LN07-10与2005年上海分离株和2006年甘肃分离株同在一个小亚群, 亲缘关系较近。

试验株PCV-LN33-08、PCV-LN73-10、PCV-LN101-10与国外的2004年英国分离株、2010年西班牙分离株、2006年斯洛文尼亚分离株以及国内的2008年山东分离株、2004年浙江、江西分离株同在一个小亚群, 有较近的亲缘关系。2000年美国分离株和2000年加拿大分离株共同位于一个单独的小亚群, 且与试验株亲缘关系均较远。

3 讨论

本试验将6个PCV2辽宁分离株与Genbank中的国内外参考毒株的基因序列进行比较, 发现辽宁省与国内其他地区一样, 至少有2种差异较大的PCV2毒株同时存在, 共同流行。分析2004～2010年我国流行的PCV2毒株, 发现我国流行的PCV2同一谱系毒株之间亲缘关系很近, 相似度很高, 与美洲株亲缘关系较远, 差异较大;与欧洲株亲缘关系较近, 差异较小。

辽宁病毒 篇2

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料

采自辽宁某猪场疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征病死猪的组织 (包括淋巴结、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏) 。

1.1.2 试剂与菌种

PCRBuffer、dNTPMixture、DNA聚合酶、DL-2 000Marker、pMD 18-T载体、各种限制性内切酶、DNA凝胶回收试剂盒等, 均购自宝生物工程 (大连) 有限公司;氨苄西林 (Amp) , 购自Amresco公司;质粒小量提取试剂盒, 购自Axygen公司;大肠杆菌JM 109, 由沈阳农业大学传染病实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计和合成

根据国内发表的猪圆环病毒2型分离株的核苷酸序列设计了1对引物, 用于ORF2的扩增, 扩增目的片段大小为819bp。引物序列:ORF2上游引物5′-TGAACTTCGATATGAAATA-AATTA-3′;ORF2下游引物5′-CGATGTGCGCTGG-TAATACTTAC-3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。使用前溶于超纯水中, 稀释至100μmol/L, 工作浓度为20pmol/L, -20℃保存。

1.2.2 病料组织DNA的提取与PCR扩增

取1g病料组织, 放入玻璃匀浆器中匀浆2～3次, 使细胞充分破碎制成悬浮液反复冻融次于

6 000r/min离心15min;取上清液按照常规方法提取组织DNA。用提取的组织DNA做模板进行PCR扩增, PCR反应条件:94℃5min;94℃1min, 52℃1min, 72℃1min, 共30个循环;72℃7min。PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.2.3 PCR产物的克隆与酶切鉴定

用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物, 纯化后将回收的PCR产物与pMD 18-T载体连接, 转化大肠杆菌JM 109;使用质粒小量提取试剂盒按照说明书操作, 提取质粒, -20℃保存, 备用;将阳性重组质粒分别用XbaⅠ和EcoRⅠ进行单酶切鉴定;用适量的限制性内切酶和Buffer混匀, 37℃反应过夜;取10μL酶切产物于1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.2.4 序列的测定与分析

将阳性重组质粒送宝生物工程 (大连) 有限公司进行核酸序列测定。应用DNASTAR对ORF2基因序列进行分析, 并与国内外已发表的猪圆环病毒2型毒株相应区域核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比较。

2 结果

2.1 PCR扩增结果

PCR扩增结果为1条约800bp的特异性片段, 与预期大小 (819bp) 相符 (见图1) 。

2.2 阳性重组质粒的酶切鉴定

将经回收纯化后的扩增产物与pMD 18-T载体连接重组质粒分别用和XbaⅠ进行单酶切鉴定, 分别切出500bp和400bp左右目的片段, 与预期片段 (497bp和408bp) 大小相符 (见图2) 。

2.3 序列测定结果与分析

测序结果表明, 辽宁株ORF2基因长度为705bp, ORF2基因所推导的氨基酸 (234个) 。将目的基因ORF2与GenBank中的其他已知部分国内外猪圆环病毒2型分离株ORF2基因序列进行比较, 应用DNASTAR软件进行同源性分析, 结果表明:该核苷酸序列与其他猪圆环病毒2型ORF2的同源性为89.6%～97.9%;氨基酸序列同源性为89.7%～97.9% (见图3, 4) 。

3 讨论

辽宁病毒 篇3

作者以辽宁农业职业技术学院兽医站确诊的CD病犬的肺脏、肝脏等脏器作为研究对象, 在实验室隔离的情况下, 进行了病料的分离鉴定、部分核苷酸序列的测定和与疫苗株的比较分析, 现将结果报道如下。

1 材料

1.1 病料

病料为辽宁农业职业技术学院兽医站确诊的CD病犬的肺脏、肝脏等脏器。

1.2 主要试剂

TRIzol试剂, 购自Molecular Research Center, Inc.;Ta KaRa TaqTMDNA聚合酶、核糖核酸酶抑制因子 (Ribonuclease Inhibitor) 、d NTP、p MD18-T载体连接试剂盒、DL-2 000 Marker, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;鼠源反转录酶, 购自Promega Corporation公司;胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒, 购自上海华舜生物技术有限公司。

1.3 主要仪器

高速离心机, 购自上海卢湘仪离心机仪器有限公司;电子天平, 购自上海精科天美贸易有限公司;无菌滤器, 购自北京伯乐生命科学发展有限公司;培养瓶, 购自Corning细胞培养瓶公司。

2 方法

2.1 CDV的分离培养

向病料中加入PBS溶液 (p H值7.2) , 充分研磨后制成5倍匀浆, 反复冻融3次, 4℃、10 000 r/min离心10 min;用无菌滤器 (直径为0.22μm) 过滤除菌, 检菌阴性后于-20℃保存, 备用;待Vero细胞长成单层, 将处理的病料4倍稀释后按照培养量的1/10接种Vero细胞, 当细胞病变达到80%时收毒;收毒后反复冻融3次, 5 000 r/min离心30 min;取上清液备用, 将分离得到的病毒命名为LN0701。

2.2 引物的设计与合成

对Gen Bank中公布的CDV全基因组序列进行比较分析, 选择其高度保守区, 应用Oligo 6.0软件设计2条引物, 引物序列:CDV上游引物P1 5'-AAATC-CTGTGTTACCCGCTC-3', CDV下游引物P2 5'-ACGTCCTGGACCCTAAGTTTTG-3', 预期扩增产物大小为600 bp, 引物由宝生物工程 (大连) 有限公司合成。

2.3 总RNA的提取

按照TRIzol试剂使用说明书提取样品总RNA。

2.4 反转录

按照鼠源反转录酶使用说明书进行反转录:取总RNA 5~10μL, 加到20μL反转录体系中, 内含5×First-Strand Buffer 4μL、d NTP 3μL、引物P1 (50 pmol/L) 1μL、反转录酶M-MLV 1μL和Ribonuclease Inhibitor 1μL, 用去离子水补至20μL。42℃水浴1 h;70℃10 min;-20℃保存, 备用。

2.5 PCR试验

PCR反应体系:取反转录产物2μL, 试管内加入10×PCR Buffer 2.5μL, d NTP 2μL, 10 pmol/L的引物P1、P2各1μL, Ta KaRa TaqTMDNA聚合酶0.25μL, dd H2O 16.25μL。PCR反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性30 s, 55℃退火35 s, 72℃延伸40 s, 共35个循环;72℃再延伸5~10 min。

2.6 产物的回收与质粒DNA的测序

采用相应的试剂盒回收PCR产物, 并克隆到p MD18-T载体上, 由上海生工生物工程技术服务有限公司对质粒DNA进行测序。

3 结果与分析

3.1 RT-PCR扩增结果 (见图1)

1.阳性对照;M.DL-2 000 Marker;2.LN0701;3.阴性对照。

由图1可知, CDV LN0701分离株经RT-PCR扩增得到1条长约600 bp的目的片段, 与预期结果相符。

3.2 序列测定结果

对CDV LN0701分离株的PCR产物克隆后测序, 序列如下:ACG TCC TGG ACC CTA AGT TTT GAT TAA TTA TTA ACG ATT GGT GAT AGA AAG ATA GAC AGT CAT AAT TTC GTG AAA CAG GAC TAC TAQ TAA TAQ CTT GAG ATC AGG CAA GCG CGT GGA GGT ATA ATT GGT TAA GTG AGA TTC CTA GAG GTG AAT TTC AAA ACC CCA AGC ATC CAT ACA TTT CTT GGT CCG ATA ATG ATC AAC CTA CTC TTG AGC ATG AAT TGG TTT GAT TCA GCT GTC TTC ATA TTG CAG AGT CAC CAG AAT AGT AGG CAC GAA TGA GCA GTT TAQ AAA CCT ATA GAA CAT GCT TAA AAT GCA GGA GCA ACA CCG AGA CAA TTG ACA CTT GTA GCC TCA ATC CTT GTT TGA GAG GAT TAA GGG ATC CTG GAC AAT GCC ACC AAG GCA TTT GAG TTT TAQ TTC ATG AAC TAA TGA TTT AGA GAA TTT TGA AAA GAC CCT GAT CAT CAC TGA TGA TAA CAT CAT TAT AAA TTC TGA AAT CTT GTG GGA CTG ATG GTT GCA AGA CTG CTT GGA TTC TTA CTA TTT TGC ACT CTA ATC TCC ATA GAA ATC GAT TCA AAT CTT CGT TGA TCT CCA TGA GCG GGT AAC ACA GGA TTT。

3.3 序列分析结果

根据所测得的CDV LN0701分离株部分序列, 与Gen Bank中5个CDV疫苗株, 即Wyeth-ledele (AF014953) 、UK (AF305419) 、OND-M (M12669) 、OND-Mi (AB250738) 、Onderstepoort (AF378705) 的基因序列进行比较, 结果核苷酸的同源性仅为84.8%, 说明该毒株不是弱毒株。CDV M基因的系统进化树见图2, M基因的同源性比较结果见表1。

%

4 讨论

应用DNAStar软件对所测得的CDV基因部分序列与Gen Bank中5个CDV疫苗株全基因组序列进行同源性比较, 并绘制出系统进化树, 使用Clustal方法计算核苷酸序列的同源性, 核苷酸同源关系的比较结果表明, 该毒株与疫苗株的核苷酸序列同源性不高, 仅为84.8%, 可鉴定该毒株不是弱毒株。根据目前国际通用的CDV M基因的分型图, 可将CDV分为疫苗株和野毒株两大基因型, 野毒株可根据流行地域的不同分为亚洲1型 (Asia-1) 、亚洲2型 (Asia-2) 、欧洲型 (Europe) 、美国型 (USA) 、北极型 (Arctic) 等5大基因型[8]。分离株虽属于CDV强毒株, 但根据目前所测序列的分型来看, 本试验得到的分离株并不属于这两种类型, 还需要进一步对M基因测序进行同源性比较分析, 从而确定分离株的基因型。

分离株病毒是在原有CDV基础上发生变异, 而且变异的程度很大。目前, 对CDV宿主保护性抗原F和H蛋白基因的研究是CD防治研究中的热点。到目前为止, 虽然没有发现CDV有第2个血清型, 但时有免疫接种犬发生CDV感染的报道[9], 经分析, 分离株可能为原典型CDV在犬瘟热疫苗长期控制下分离出的一种新型病毒[10], 但还需进一步对该毒株的抗原性进行研究, 解决是否因为现在我国流行毒株与传统疫苗株抗原产生了差异而导致CDV流行的问题[11], 是否因为辽宁省营口市境内的CDV流行株和疫苗株抗原存在较大差异, 尚需对更多病例进一步研究和确证。

参考文献

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辽宁病毒 篇4

通过对核酸疫苗进行研究, Kamstrup等[2]发现在第2次免疫后小鼠体内即可检出PCV2特异性抗体, 第3次免疫后小鼠体内的抗体滴度可显著增加, 说明ORF2蛋白可诱导小鼠产生一定水平的抗体。郑连军等[3]扩增病毒ORF2基因, 将ORF2基因插入到真核表达载体中构建重组质粒, 并免疫小鼠, 试验结果表明, 第1周小鼠便开始产生特异性抗体, 第4周体内抗体水平达到最高, 抗体可维持10周以上。

目前用于本病防制的疫苗主要是灭活苗和弱毒苗, 虽然疾病的防制上起到了一定的作用, 但是由于免疫原性低、安全性差、易受母源抗体干扰等影响而存在一定的缺陷, 因此一些PCV2新型疫苗已经用于试验研究[4]。为了进一步研究Cap蛋白的免疫功能, 本研究在对辽宁分离株ORF2基因进行克隆的基础上, 以pIRES为真核表达载体, 以PCV2的ORF2基因为目的基因, 构建一个真核表达质粒pIRES-ORF2, 为接下来进行动物试验, 及探索PCV2核酸疫苗的免疫效果奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌种及细胞

含有PCV2目的基因ORF2的质粒p MD18-T-ORF2由本人构建;质粒pIRES、E.coli JM109由本实验室保存;p MD18-T-Simple Vector克隆载体购自TaKaRa宝生物工程 (大连) 有限公司;Hela细胞由本实验室保存, 用于质粒转染、表达产物的检测。

1.1.2 酶与试剂

脂质体转染试剂 (lipofectamineTM Reagent) 购自Invitrogen公司;异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记的山羊抗猪IgG购自基因公司;猪抗PCV2阳性血清本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成

分别在上游克隆引物、下游克隆引物的5'端加上EcoRⅤ、BamHⅠ酶切位点并加上保护性碱基。ORF2上游引物:5'-gCgATATCATgACgTA-TCCAAg-3', ORF2下游引物:5'-gCggATCCTTA-AgggTTAAgTg-3'。

1.2.2 ORF2基因的PCR扩增

将已经构建成功并测序正确的重组质粒pMD18-T-ORF2进行PCR扩增。PCR反应条件为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min, 52℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 30个循环;72℃延伸7 min。PCR产物于1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.2.3 PCR产物的克隆与酶切鉴定

回收纯化PCR产物, 与pMD18-T-Simple载体连接, 转化JM109, 提取质粒, -20℃保存备用。将阳性重组质粒用EcoRⅤ和BamHⅠ进行双酶切鉴定。

1.2.4 阳性重组质粒p IRES-ORF2的制备与酶切鉴定

将阳性重组质粒pMD18-T-Simple-ORF2用EcoRⅤ和BamHⅠ进行酶切, 与酶切后的真核表达载体pIRES连接。转化、纯培后提取阳性重组质粒p IRES-ORF2, 并用EcoRⅤ和Bam HⅠ进行双酶切鉴定, 送生物公司进行核酸序列测定。

1.2.5 重组质粒转染Hela细胞与间接免疫荧光试验 (IFA)

采用脂质体法将重组质粒转染Hela细胞, 于37℃5%CO2中培养。3 d后取出, 用PBS液冲洗, 冷丙酮固定, 牛血清白蛋白 (BSA) 封闭。加入一抗 (猪抗PCV2阳性血清) 37℃作用2 h, 冲洗后加入二抗 (异硫氰酸荧光素标记羊抗猪IgG) 室温避光作用1 h, 滴加50%甘油水溶液, 倒置于载玻片上, 荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1 重组质粒p IRES-ORF2的构建及鉴定

重组质粒p IRES-ORF2的构建过程如图1。重组质粒pIRES-ORF2的酶切鉴定结果如图2。重组质粒pIRES-ORF2分别用EcoRⅤ和BamHⅠ进行双酶切鉴定, 切出705 bp目的片段, 与预期相符。

2.2 重组质粒p IRES-ORF2的序列测定

将阳性重组质粒pIRES-ORF2送TaKaRa宝生物工程 (大连) 有限公司进行核酸序列测定, 经测定质粒核酸序列正确, 本次实验构建的质粒为所需要的正确的质粒。

2.3 IFA检测PCV2抗原结果

将处理好的细胞玻片置于荧光显微镜下观察, 可以看到转有p IRES-ORF2质粒的细胞玻片上有明显的黄绿色荧光, 而细胞对照则没有特异性的荧光 (见图3) 。

A.重组质粒组B.空白对照组

3 讨论

核酸疫苗是近年来随着基因治疗技术的发展而产生的一种全新疫苗。由于体液免疫作用的靶点是病毒本身, PCV2病毒粒子的核心是由ORF2编码的衣壳蛋白, 并且不同的分离株的结构基因具有保守性, 因此研究单型疫苗的可能性很大。核酸疫苗比常规免疫有更多优点:既具有减毒疫苗的长处, 又无逆转的危险;节省了常规抗原收集的时间;可以诱导而无需考虑母源抗体的干扰;由于质粒可以比较容易的从蛋白中提纯, 所以其免疫原能够非常的纯化。

在结构上核酸疫苗主要由载体DNA和目的基因DNA两部分组成。载体DNA可由细菌质粒DNA、噬菌体DNA及病毒DNA或c DNA改造而成, 在结构上主要有5个基本的元件组成:一个细菌复制起点, 一个强的真核细胞启动子/增强子, 一个多克隆插入位点 (供外源基因插入) , 一个PolyA/末端信号, 一个抗生素抗性基因 (在细菌培养时供选择的) 。在功能上, DNA疫苗的载体部分也有免疫原性, 可分为两个功能单元:即控制基因表达的转录单元和增强免疫效果的佐剂单元, 前者主要是启动子, 后者主要是指存在于DNA中的未甲基化的CpG回文序列。另外有研究发现, 在质粒表达载体中, 氨苄西林抗性选择基因比其他抗性选择基因能够更好地诱导免疫反应。深入的研究证实了氨苄西林抗性选择基因中包含有回文序列:5'-AACGTT-3'。该结构被证明能够刺激单核细胞产生白细胞介素12, 刺激细胞分泌干扰素, 增强NK细胞的活性, 所以称该序列为单链免疫刺激DNA序列。在表达载体中一个影响表达的重要因素为启动子类型。在多数DNA疫苗中, 源于CMV的启动子应用最多, 表达效果也最好。

p IRES为CLONTECH公司研制开发的新一代真核表达载体质粒, 已通过美国FDA认证, 其采用氨苄青霉素抗性。它携带细菌复制起点, 可以在细菌 (如DH5和JM109) 中复制和扩增。同时具有来源于人巨细胞病毒CMV的复合启动子PCMV和来源脑心肌炎病毒的单一启动子IRES, 可以在转染的哺乳动物细胞中表达外源基因。p IRES的最大的优点是在同一个表达载体上含有两个启动子, 可以将两个外源基因分别插入两个不同的启动子下游, 同时进行表达, 为两种疾病的联合免疫提供了方便。

本试验中, 将PCV2的ORF2基因插入真核表达载体pIRES的多克隆位点, 成功构建一个真核表达质粒pIRES-ORF2。为进一步研究真核表达质粒p IRES-ORF2的表达和在动物体内的免疫效果奠定了基础。

免疫荧光检测结果表明, 所构建的核酸疫苗pIRES-ORF2中的PCV2目的基因ORF2在真核细胞Hale细胞中得到表达。

参考文献

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