病毒和亚病毒因子

病毒和亚病毒因子（共7篇）

病毒和亚病毒因子 篇1

原发性肝细胞肝癌是全球癌症相关死亡的第二病因,我国占全球死亡病例的50%[1,2]。脂多糖诱导肿瘤坏死因子释放因子( lipopolysaccharide-induced TNF-α factor,LITAF) ,基因定位于16p12 ~16p13. 3,mRNA大小为118 kb,高表达于脾、淋巴结与外周血白细胞。其翻译产物为一约23. 19 k Da大小、含228 aa的蛋白质[3]。LITAF在脂多糖诱导TNF-α 表达过程中起转录激活作用。既往研究发现在wtp53 功能缺失的结肠癌细胞中转入wtp53,通过基因表达系列分析获知LITAF的表达上调达10 倍以上[4,5]。目前LITAF与肿瘤关系的研究刚刚起步,在乳腺癌中发现LITAF的低表达; 在白血病研究中发现LITAF对血液系统肿瘤细胞有促进分化和凋亡的作用[6,7],我们在进行初步的LITAF与肝细胞肝癌hepatocellular carcinoma( HCC) 关系研究后发现LITAF在HCC表达显著下降并促进凋亡[8]。为此本研究构建了人LITAF重组慢病毒表达载体并鉴定,以期为进一步研究LITAF生物学功能提供基础。

1 材料与方法

1. 1 细胞及试剂

慢病毒表达穿梭质粒和包装质粒p Gag /Pol、pRev、PVSV-G购自中国上海吉玛公司,293T细胞、Hep G2 人肝癌细胞株购自中国科学院细胞库,EcoRI及Bam HI内切酶、T4DNA连接酶、质粒提取试剂盒、病毒纯化浓缩试剂盒购自美国Promega公司,DMEM培养液,胎牛血清FBS购自美国GIBCO公司,Lipofectamine 2000 购自美国Invitrogen公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 PCR扩增LITAF基因编码序列

根据Genbank中获取LITAF基因mRNA序列,5'端和3'端分别引入EcoRI和Bam HI酶切位点。

上游引物: 5'-GCGAATTCATGTCGGTTCCAGGACCTTACC-3'。

下游引物: 5'-ATGGATCCGCACGACTCCAAGCAGCA-3'。

以人肝c DNA文库质粒为模板,用引物扩增LITAF基因。 将连接获得的LITAF重组质粒用EcoRI、Bam HI进行酶切鉴定,鉴定正确的LITAF重组质粒分别作正反向测序。

1. 2. 2 慢病毒过表达质粒的构建与鉴定

把扩增好的片段通过胶回收,使用EcoRI、Bam HI分别双酶切LITAF扩增片段及穿梭质粒LV8,将酶切的线性化载体,PCR产物连接双酶切后的过表达质粒,形成重组载体。将连接完成后的过表达质粒转化入感受态细胞,重组阳性克隆扩增后提取质粒进行酶切鉴定及测序分析。

1. 2. 3 细胞培养

293T细胞、Hep G2 细胞在含10% 胎牛血清( FBS) 的DMEM培养基培养至对数生长期。

1. 2. 4 病毒包装

1. 5 m L无血清DMEM,加入LITAF过表达质粒和包装质粒( p Gag /Pol、pRev、p VSV-G) 。另一1. 5m L无血清DMEM加入300 μL RNAi-mate。两管混合。转染混合物逐滴加入15 cm 293T细胞培养皿中继续培养48 h。荧光显微镜观察GFP蛋白表达。将培养皿中细胞上清液4 ℃,4 000 r/min,4 min,低速离心后,上清液0. 45 μm过滤器过滤。滤液在离心机中进行超速离心,4 ℃ ,20 000 r/min,2 h,收集病毒浓缩液。

1. 2. 5 Hep G2 细胞感染及鉴定

将浓缩纯化后的重组病毒加入含Hep G2 细胞的培养基中培养,使用流式细胞仪筛选阳性表达细胞。实时定量RT-PCR检测LITAF mRNA表达。裂解后提取蛋白,Western blot方法检测LITAF蛋白表达水平。

1. 3 统计方法

细胞实验均重复3 次,统计数据使用SPSS 19. 0软件包,使用t检验对实验数据进行统计学分析。

2 结果

2. 1 慢病毒表达载体的构建

将PCR产物进行电泳,可见650 bp左右目的条带,送检测序。序列分析表明,所扩增的LITAF基因序列与登录在Gen Bank人LITAF c DNA序列一致( 图1) 。双酶切的线性LV8 载体连接目的基因片段,转化、扩增后,提取质粒进行酶切鉴定无误( 图2) 。

2. 2 病毒感染

将LITAF-LV8 病毒包装后感染293T细胞,培养48 h后通过荧光显微镜观察荧光表达情况,示感染效率大于80% ( 图3) 。

2. 3 病毒感染Hep G2 细胞后检测LITAF表达

将病毒浓缩液加入Hep G2 细胞培养基,培养获得稳定感染的Hep G2 细胞。提取总RNA,实时定量RT-PCR检测LITAF mRNA的表达水平。结果显示LITAF mRNA水平在稳定转染的细胞中较未转染细胞显著增高( P < 0. 05) ,提示LITAF慢病毒载体能稳定整合到Hep G2 细胞基因组中( 图4) 。Western Blot检测LITAF蛋白表达水平,结果显示,稳定转染的Hep G2 细胞中LITAF有显著表达增加( 图5) 。

M为marker,1,2为LITAF基因片段

3 讨论

LITAF与肿瘤关系的研究报道目前很少,但是作为P53 诱导表达的基因,在理论上有理由猜测它与肿瘤的发生、分化以及预后可能具有相关性,可能是候选的抑癌基因[9—11]。在前期与HCC的相关研究中发现,LITAF在HCC与癌周组织中的表达存在显著差异,同时在HCC细胞株中高表达LITAF会致细胞凋亡增加。因而明确LITAF在HCC细胞发生、发展过程中的作用,可以进一步完善HCC的相关分子机制,从而为HCC治疗提供新靶点[12]。本实验构建了含有LITAF基因的慢病毒表达载体,将重组质粒及包装质粒共转染293T细胞,获得高滴度的重组慢病毒,感染Hep G2 细胞,实时定量RT-PCR及Western Blot鉴定基因及蛋白表达增加,并能稳定传代,完全满足后续实验需要,为进一步研究LITAF基因打下基础。

摘要：探讨构建人脂多糖诱导肿瘤坏死因子释放因子(LITAF)基因的过表达慢病毒载体的技术方法,并检测其体外表达目的基因的水平。设计LITAF基因引物,应用聚合酶链反应(PCR)的方法扩增LITAF基因片段;应用EcoRI、Bam HI酶切LV8载体,通过连接酶将LITAF基因片段连接至线性化的LV8载体上,应用酶切及测序方法鉴定LITAF-LV8重组质粒,将其包装慢病毒后感染293T细胞(人胚肾细胞),观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,验证后感染肝癌细胞株HepG2。RT-PCR和Westernblot鉴定感染后HepG2中LITAF的表达。LITAF基因在慢病毒感染的HepG2细胞中的表达显著高于对照组细胞。说明成功构建了过表达LITAF的HepG2细胞株,为后期研究提供了实验基础。

关键词：LITAF,慢病毒,载体构建,过表达,肝细胞肝癌

参考文献

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病毒和亚病毒因子 篇2

近日, 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪烈性传染病创新团队经过系统研究, 发现了一个新的调控猪瘟病毒复制的宿主分子丝裂原活化的蛋白激酶激酶2 (MEK2) , 并阐明了其调控病毒复制的分子机制。相关研究成果发表在国际著名病毒学专业期刊《Journal of Virology》 (病毒学杂志) 上, 并被编委评为该杂志的亮点文章。

据介绍, 猪瘟是猪的一种烈性传染病, 其传播快、死亡率高, 给世界各国的养猪业造成重大经济损失, 我国在国家中长期动物疫病防治规划中将其列为优先防治的一类动物疫病之一。猪瘟的病原是猪瘟病毒, 探究猪瘟病毒的复制机理, 对于防治猪瘟至关紧要。据该团队首席科学家仇华吉研究员介绍, 该团队经研究首次证实, MEK2与猪瘟病毒E2蛋白相互作用, 并通过抑制JAK-STAT信号通路而促进猪瘟病毒的复制。此项研究的发现不仅有助于深入了解猪瘟病毒如何利用宿主分子完成自身复制周期, 同时为猪瘟病毒分类所在的黄病毒科其他成员的病毒复制机制研究提供了参考。

(来源:黑龙江日报)

病毒和亚病毒因子 篇3

1 对象与方法

1.1 对象

将2013年8月~2014年8月期间我院收治的80例轮状病毒性肠炎患儿纳入研究, 所有患儿均结合临床症状、体征以及辅助检查确诊为轮状病毒性肠炎, 告知研究事项后签署知情同意书。根据治疗方法不同随机分为两组, 每组各40例。观察组患儿接受葡萄糖酸锌联合常规治疗, 其中, 男性24例、女性16例, 年龄 (5.92±0.83) 岁;对照组仅接受常规治疗, 其中, 男性25例、女性15例, 年龄 (5.83±0.76) 岁。两组患儿一般资料的差异无统计学意义 (P>0.05) 。

1.2 治疗方法

两组患儿均接受抗病毒、补液、营养支持等常规治疗, 观察组患儿在此基础上给予葡萄糖酸锌辅助治疗, 具体方法如下:给予葡萄糖酸锌片 (广州白云山制药股份有限公司, 国药准字H10880028, 产品批号1100008, 规格70mg×100片) 口服, 10mg/kg•d, 分两次服用。

1.3 检测指标

1.3.1 心肌酶谱指标

采集两组患儿的外周血5ml, 离心后采用电化学发光仪检测高敏心肌肌钙蛋白 (hsc Tn T) ;采用全自动生化分析仪检测天门冬氨酸氨基转移酶 (AST) 、乳酸脱氢酶 (LDH) 、肌酸激酶 (CK) 、肌酸激酶同工酶 (CK-MB) 。

1.3.2 免疫功能指标

采集两组患儿的外周血5ml, 孵育细胞表面对应的分子后用流失细胞仪检测CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD19+CD5+CD1dhi B细胞以及CD11b、CD40含量。

1.3.3 炎性因子指标

采集两组患儿的外周血5ml, 离心后采用酶联免疫吸附法检测NF-k B、HMGB-1、IL-6、IL-8、IL-17、IL-23含量。

1.4 统计学方法

采用SPSS18.0软件录入和分析数据, 计量资料采用t检验, 按照P<0.05判断差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌损伤指标

轮状病毒感染会造成心肌细胞损伤, 而心肌酶谱是反应心肌损伤程度的理想指标。为此, 笔者在葡萄糖酸锌辅助治疗后1周时, 采集外周静脉血、离心后取血清, 采用电化学发光仪检测了心肌酶谱指标;t检验分析的结果显示:观察组患儿血清中AST、LDH、CK、CK-MB、c Tn T、c Tn I含量低于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。

2.2 免疫功能指标

轮状病毒感染会影响机体免疫功能, 包括T淋巴细胞、B淋巴细胞以及多种CD分子含量均存在异常。为此, 笔者采集外周血、分离单个核细胞, 孵育不同标志物后采用流式细胞仪检测免疫功能指标;t检验分析的结果显示:观察组患儿外周血中CD4+T淋巴细胞、CD19+CD5+CD1dhi B细胞含量以及CD4+/CD8+比例高于对照组, CD8+T淋巴细胞、CD11b和CD40含量均低于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。

2.3 炎症因子

轮状病毒感染后的炎症反应是造成肠道黏膜上皮细胞和心肌细胞损伤的病理基础, 体内炎症反应由炎症因子直接介导。为此, 笔者在葡萄糖酸锌辅助治疗后1周时, 采集外周静脉血、离心后取血清, 采用酶联免疫吸附法检测炎症含量;t检验分析的结果显示:观察组患儿血清中NF-k B、HMGB-1、IL-6、IL-8、IL-17、IL-23含量低于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。

3 讨论

抗病毒、维持水电解质平衡、营养支持等方式是临床治疗轮状病毒性肠炎的常用方法, 但是仍有部分患儿的疗效不佳、病情迁延, 不仅会影响儿童的生长发育, 还会引起其他脏器的损伤[3]。近年来的研究显示, 轮状病毒性肠炎所造成的持续腹泻会影响锌元素的吸收, 这与病情的发展以及疾病的治疗有关。锌元素能够参与细胞内DNA复制、RNA翻译以及蛋白质合成等过程, 同时也是多种关键酶活性基团的组成部分;当腹泻造成锌元素过度丢失后, 会影响蛋白质的生物合成以及生物酶的催化活性, 也会影响免疫功能、降低机体的抗病毒能力[4]。因此, 越来越多的学者主张将补锌治疗作为轮状病毒性肠炎常规治疗方式[5]。本研究通过葡萄糖酸锌进行补锌来与常规药物联合治疗轮状病毒性肠炎, 旨在改善疾病的转归和预后情况。轮状病毒感染后不仅会出现消化道症状, 还会造成心肌细胞损伤, 心肌细胞破裂后胞浆中大量酶类物质释放入血, 表现为血浆心肌酶谱含量升高[6]。AST、LDH、CK是常规的心肌酶谱指标, 存在包括心肌细胞在内多种细胞的细胞浆中, 可以反应心肌细胞的损伤程度。CK-MB是在心肌细胞中特异性存在的同工酶;而c Tn T、c Tn I则是心肌细胞中特异性表达的结构蛋白, 只有在心肌细胞损害和破裂时才会释放入血, 三者均能较为灵敏的反应心肌细胞损伤[7]。笔者在用葡萄糖酸锌是治疗后检测了血清中心肌酶谱的含量, 结果显示:观察组患儿血清中AST、LDH、CK、CK-MB、c Tn T、c Tn I含量低于对照组。这就说明葡萄糖酸锌辅助治疗有助于减少心肌细胞受到的损伤。

轮状病毒性肠炎患儿持续腹泻所造成的锌离子缺乏会影响蛋白质的生物合成, 进而导致免疫功能受到抑制。T淋巴细胞是介导免疫功能的重要细胞, 通过辅助性T细胞、抑制性T细胞等参与杀伤性T细胞所介导的细胞毒作用, 促进B淋巴细胞产生抗体。CD4+T淋巴细胞是重要的辅助性T细胞, 可以加强机体免疫功能[8];CD8+T淋巴细胞是重要的抑制性T细胞, 能够抑制机体免疫功能。轮状病毒感染会影响T淋巴细胞的亚群, 具体表现为CD4+T淋巴细胞含量降低、CD8+T淋巴细胞含量增多, 且CD4+/CD8+比例升高[9]。B淋巴细胞也是调节免疫功能的重要细胞, 其中CD19+CD5+CD1dhi B细胞是新近发现的具有负性调节作用的B淋巴细胞亚群。动物研究显示, CD19+CD5+CD1dhi B细胞可以抑制肠道黏膜内IFN-γ、TNF-α、IL-6等多种炎症因子的释放[10];当该亚型B细胞含量不足时, 会造成局部炎症反应亢进, 进而导致肠黏膜上皮损伤。除了上述T淋巴细胞亚群和B淋巴细胞亚群外, 还有多种CD分子参与免疫反应的调节以及炎性细胞的激活。CD11b和CD40是与炎症反应密切相关的CD分子, 在单核巨噬细胞、自然杀伤细胞等炎性细胞表面高表达, 能够激活中性粒细胞、增强炎症反应[11]。本研究通过分析免疫功能指标可知, 观察组患儿外周血中CD4+T淋巴细胞、CD19+CD5+CD1dhi B细胞含量以及CD4+/CD8+比例高于对照组, CD8+T淋巴细胞、CD11b和CD40含量均低于对照组。这就说明葡萄糖酸锌辅助治疗有助于增强机体免疫功能。

病毒和亚病毒因子 篇4

研究表明, EB病毒相关肿瘤的形成和发展与细胞因子活性的不平衡相关[9,10]。首先, 细胞因子能够加强细胞的固有防御机制以消灭病毒, 其次, 细胞因子与EBV相关肿瘤的病理生理学研究有重要作用[9]。研究已经发现, 在肿瘤细胞中EBV编码的LMP1可以上调IL6、IL10等细胞因子的表达[11,12,13], 因此, 有理由推测LMP1在NPC中可能促进细胞因子的分泌, 从而有助于NPC发生、生长与转移。在本研究中, 笔者利用LMP1的表达质粒为工具, 探讨鼻咽癌细胞中LMP1与IL1、IL2、IL3、IL4、IL6、IL8、IL10、TNF-α等分泌的关系, 从而为阐明LMP1分子致瘤机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞系

鼻咽癌细胞CNE2和HNE2分别来源于中南大学湘雅医学院肿瘤研究所和中国医学科学院肿瘤所建立的EB病毒阴性的低分化鳞癌细胞系[13,14]。

1.2 试剂

转染试剂Lipofect 2000购自美国生命技术公司 (GIBCOBRL) ;细胞因子ELISA kit购自晶美生物工程有限公司;LMP1表达质粒pc DNA3-LMP1由英国Birminghanm大学医学院Young Lawrence S教授馈赠。

1.3 Lipofect 2000介导的瞬间转染

按Lipofect 2000转染说明书操作, 转染前24 h将细胞种植于24孔细胞培养板中, 待细胞生长至50%~80%的融合度时弃培养基。取2μg质粒DNA稀释到100μL无血清培养基中, 加入4μL Lipofect2000, 混匀后室温静置30 min。加入800μL 15%血清培养基至DNA-Lipofect 2000混合物中, 混匀。培养细胞经D-Hanks液漂洗干净后, 再将DNA-Lipofect 2000混合物加入, 混匀。5%二氧化碳 (CO2) 培养箱37℃培养4 h后, 用D-Hanks液洗涤细胞, 加入15%血清培养基继续培养直到收获。

1.4 蛋白抽提与Western blotting分析

转染细胞孵育48 h后, 用1×PBS洗3、4次, 细胞裂解液[50 mmol/L Tris HCl, p H 8.0, 1 mmol/L ED-TA, 140 mmol/L Na Cl, 5 mmol/L二硫苏糖醇 (DTT) , 1 mmol/L苯甲基磺酰氟 (PMSF) , 1×蛋白酶抑制剂, 1 mmol/L钒酸钠]冰上裂解30~60 min。13 000 r/min离心去细胞碎片, 留含全蛋白质的上清液, 用BCA试剂测定蛋白质浓度。取各组细胞50μg总蛋白进行不连续SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳, 电转移至硝酸纤维膜上, 用5%脱脂奶粉加PBST在室温下封1~2h, 加入单抗, 过夜孵育, 洗膜, 加入相应Ig G HPR二抗, 孵育1 h, ECL化学发光法检测, 以β-actin作为内参照。

1.5 ELISA

按ELISA kit说明书操作。将转染后的CNE2和HNE2细胞以5×104个/孔种植于24孔板, 每样品种植3孔, 24 h后收集上清, 4 000 r/min离心10min。除空白孔外, 分别将不同浓度标准品或不同上清液, 以20μL/孔加入相应孔中, 再加入生物素化抗体工作液 (100μL/孔) , 室温孵育2 h, 洗板4次。除空白孔外, 以100μL/孔加入酶结合物工作液, 室温孵育30 min。洗板4次, 加底物A、B各1滴/孔。避光室温10 min, 加入终止液, 1滴/孔, 混匀后即刻测量450 nm吸光度 (A) 值, 绘制标准曲线, 通过标本A值查出其浓度。

1.6 统计学方法

实验数据采用SPSS 11.0统计软件进行数据处理, 计量资料采用均数±标准差 (±s) 表示, 组间差异用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NPC细胞系中LMP1表达质粒促进LMP1的表达

利用CNE2和HNE2为材料, 以空白质粒pc DNA3为对照, 将LMP1表达质粒pc DNA3-LMP1瞬时导入实验细胞系中, 通过蛋白抽提与Western blotting分析细胞中LMP1蛋白。结果显示, 与对照质粒比较, CNE2和HNE2转染后, 明显上调LMP1的蛋白表达 (见图1) 。

2.2 NPC细胞系中LMP1不影响IL1、IL2、IL3、IL4的表达

利用ELISA方法确定LMP1是否促进细胞因子的分泌, 结果发现 (见图2) , 在CNE2细胞中, 空白组、转染对照组和转染组细胞上清中, IL1的表达分别为 (20.0±3.5) 、 (43.0±3.7) 和 (41.0±7.1) pg/m L;IL2的表达分别为 (97.0±13.4) 、 (101.0±11.8) 和 (111.0±14.3) pg/m L;IL3的表达分别为 (47.0±6.3) 、 (57.0±7.4) 和 (51.0±6.7) pg/m L;IL4的表达分别为 (112.0±17.8) 、 (169.0±19.6) 和 (173.0±25.4) pg/m L, LMP1转染组和转染对照组比较差异无统计学意义。同样发现, 在HNE2细胞中, 空白组、转染对照组和转染组细胞上清中, IL1的表达分别为 (43.0±4.1) 、 (67.0±5.2) 和 (69.0±7.9) pg/m L;IL2的表达分别为 (121.0±13.7) 、 (141.0±14.3) 和 (157.0±16.3) pg/m L;IL3的表达分别为 (21±2) 、 (31.0±3.9) 和 (33.0±3.7) pg/m L;IL4的表达分别为 (54.0±6.5) 、 (67.0±5.9) 和 (72.0±8.5) pg/m L, LMP1转染组和转染对照组比较差异无统计学意义。

2.3 NPC细胞系中LMP1促进IL6、IL8、IL10和TNF-α的表达

利用ELISA方法确定LMP1是否促进细胞因子的分泌, 结果发现 (见图3) , 在CNE2细胞中, 空白组、转染对照组和转染组细胞上清中, IL6的表达分别为 (156.0±17.1) 、 (197.0±16.9) 和 (1 321.0±121.4) pg/m L;IL8的表达分别为 (341.0±23.7) 、 (432.0±33.8) 和 (2 016.0±145.6) pg/m L;IL10的表达分别为 (132.0±11.7) 、 (178.0±13.5) 和 (654.0±33.9) pg/m L;TNF-α的表达分别为 (23.0±2.4) 、 (67.0±3.3) 和 (231.0±16.4) pg/m L, 转染组和转染对照组比较, IL6、IL8、IL10、TNF-α分别上调了6.7、4.6、3.6和3.4倍, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。同样发现, 在HNE2细胞中, 空白组、转染对照组和转染组细胞上清中, IL6的表达分别为 (77±6.9) 、 (131.0±7.8) 和 (872.0±75.4) pg/m L;IL8的表达分别为 (210.0±21.3) 、 (289.0±24.6) 和 (1765.0±127.9) pg/m L;IL10的表达分别为 (44.0±1.7) 、 (77.0±4.7) 和 (651.0±71.2) pg/m L;TNF-α的表达分别为 (33.0±4.1) 、 (56.0±5.6) 和 (178.0±11.9) pg/m L, 转染组和空白组比较, IL6、IL8、IL10、TNF-α分别上调了6.6、6.1、7.2和3.1倍, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。说明NPC细胞系中LMP1能够促进IL6、IL8、IL10和TNF-α的表达。

3 讨论

研究发现, 细胞因子与肿瘤的高危险性密切相关。一般来说, 细胞因子可分为促炎型 (即, IL1、6、8、11、12、18、23, IFNγ, TNF-α及MIF) 和抗炎型 (即, IL4、10, IFNα, IFNβ, TGF-β) , 然而其中许多分子都具有双重作用。多种恶性肿瘤细胞和组织中发现肿瘤自发性产生促炎症细胞因子, 如在结肠癌中IL6与炎症介导的肿瘤启动和增殖有关。IL6诱导上皮细胞中的STAT3可导致肿瘤启动, 也可以通过介导p Rb高度磷酸化且诱导抗凋亡基因Bcl2和Bcl-XL的表达促进肿瘤生成[16]。肺鳞状细胞癌自发产生IL8促进血管生成和肿瘤生长、转移[17]。研究发现, 含大量细胞因子表达的独特免疫应答标记对肝细胞癌的转移具有重要意义, 肺环境中11个细胞因子表达标记提示癌细胞的淋巴结转移, 其中IL8和TNF-α更是肺腺癌的预后指标, IL8在非小细胞肺癌 (NSCLC) 等癌症中具有促血管生成活性且通过正向自分泌方式发挥功效[18]。

LMP1是EB病毒编码的重要致瘤蛋白, 在肿瘤的多个阶段发挥重要的生物学功能, 其主要是通过上调抗细胞凋亡蛋白和生长信号[19], 研究证明了LMP1能够通过NF-k B信号通路调节细胞凋亡[20,21]。本研究结果表明, 在鼻咽癌细胞系中高表达的LMP1对IL1、IL2、IL3及IL4的表达影响不明显, 但明显促进IL6、IL8、IL10及TNF-α等细胞因子的分泌, 提示在鼻咽癌的发生、发展中, EB病毒编码的重要致瘤蛋白LMP1可能通过IL6、IL8、IL10、TNF-α等细胞因子参与肿瘤发生、生长与转移, 其深入的分子机制还有待进一步的研究。

摘要：目的 探讨EB病毒LMP1的分子致瘤机制, 对LMP1是否促进IL1、IL2、IL3、IL4、IL6、IL8、IL10、TNF-α等细胞因子分泌进行研究。方法 鼻咽癌细胞系CNE2和HNE2以LMP1的表达和对照质粒处理, 利用Western blotting方法从蛋白水平上确定LMP1的表达;利用细胞因子的ELASA试剂盒测定细胞上清中IL1、IL2、IL3、IL4、IL6、IL8、IL10、TNF-α的浓度。结果 鼻咽癌细胞在转染LMP1的表达质粒pcDNA3-LMP1后, 细胞内的LMP1表达明显上调;在上调LMP1的细胞内, 发现IL1、IL2、IL3、IL4的表达变化不明显 (无统计学意义) , 在CNE2细胞中, 转染组与转染对照组比较, IL6、IL8、IL10、TNF-α分别上调了6.7、4.6、3.6和3.4倍;在HNE2细胞中IL6、IL8、IL10、TNF-α分别上调了6.6、6.1、7.2和3.1倍 (P<0.05) 。结论 鼻咽癌细胞系中LMP1对IL1、IL2、IL3、IL4的表达影响不明显, 但明显促进IL6、IL8、IL10、TNF-α等细胞因子的分泌。

病毒和亚病毒因子 篇5

关键词：干扰素调节因子1,呼吸道合胞病毒,气道神经源性炎症

支气管哮喘是由多种细胞(如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞和气道上皮细胞等)和细胞组分参与的一种气道慢性炎症性疾病,其发病机制尚不完全清楚,可能与变态反应、气道炎症、气道反应性增高及神经等因素及其相互作用有关。大量的流行病学资料表明婴幼儿反复呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染与以后的气道高反应性和哮喘发生率增高密切相关[1]。近年来,越来越多的研究提示多种因素可刺激气道和肺分泌过多神经营养因子,引起气道神经末梢释放速激肽,引起神经源性炎症和传入神经易感性的增加,从而参与气道高反应和哮喘的发生。目前已证实参与气道高反应性的神经营养因子有NGF、BD-NF、NT3等[2]而已证实的气道高反应发生过程中气道神经源性炎症的重要介质有P物质(SP)、降钙素基因相关肽(CGRP)、感觉神经肽A/B(NKA/NKB)等[3,4]。

IRF-1是1988年MIYAMOTO等[5]从鼠L929细胞株中发现了是一种可结合在干扰素β因基因上游调控序列的转录正调控因子。潘频华等[6]在体外细胞实验中发现,NGF可以通过IRF-1调控神经元细胞内SP及i NOS的合成参与呼吸道神经源性炎症。本实验研究IRF-1在RSV感染所致的哮喘大鼠体内参与发挥气道神经源性炎症的调控作用。

1 对象与方法

1.1 实验对象

2周龄的SPF级别SD大鼠40只(购自中南大学湘雅医学院实验动物中,雌雄各半)。

1.2 实验方法

1.2.1 SD大鼠RSV感染模型的建立

制备RSV病毒悬液及阴性对照:将接种培养了RSV病毒的Hela单层细胞培养瓶中DMEM培养基上清液和细胞溶解产物离心,收集上清病毒悬液,分装成1 m L/管,-70℃保存备用。RSV病毒株滴度被测定并稀释为终滴度5×104TCID 50/0.1 m L。收集无病毒的Hela单层细胞培养瓶中DMEM培养基上清液和细胞溶解产物,离心,分装同上程序,从而获得无病毒基质作为阴性对照。

将SD大鼠按雌雄各半随机分成4组,空白对照组、RSV感染组、IRF-1干扰组和IRF-1基因沉寂组,每组10只。处理方法如下:(1)空白对照组:用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后,根据大鼠体质量每一个鼻孔内滴入0.4μL/g无病毒培养基。(2)RSV感染组:用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)剂量腹腔注射麻醉大鼠后,每一个鼻孔内滴入0.4μL/g滴度为5×104TCID 50/0.1 m L的RSV病毒悬液。(3)IRF-1干扰组:向大鼠腹腔内注射IRF-1,3 h后用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)剂量腹腔注射麻醉大鼠,每一个鼻孔内滴入0.4μL/g滴度为5×104TCID50/0.1 m L的RSV病毒悬液。(4)IRF-1基因沉寂组:向大鼠腹腔内注射IRF-1-shRNA,3 h后用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)剂量腹腔注射麻醉大鼠,每一个鼻孔内滴入0.4μL/g滴度为5×104TCID 50/0.1 m L的RSV病毒悬液。病毒接种后立即将大鼠隔离饲养,每3 d换笼消毒1次。以上操作每周重复1次。6周后将大鼠进行气道阻力测定其气道反应性,并处死取材。

1.2.2 标本的处理

大鼠处死后,取其左肺行HE染色,右肺行免疫组化检测SP、CGRP。

1.2.3 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件包进行统计学分析。所有数据以均数±标准差表示,不同组间资料的比较采用t检验,检验水准取α=0.05,以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 气道反应性

将大鼠行气道阻力测定,其结果显示:(1)RSV感染组与空白对照组相比,气道反应性明显增高,差异具有显著性(P<0.05);(2)IRF-1干扰组与RSV感染组的气道反应性无明显区别,差异无显著性(P>0.05);(3)IRF-1基因沉寂组与RSV感染组相比,气道反应性明显降低,差异具有显著性(P<0.05)。详细情况见附表。

2.2 气道炎细胞浸润

大鼠左肺HE染色后在显微镜下观察,结果显示:(1)RSV感染组与空白对照组相比,小气道周围中性粒细胞和淋巴细胞等炎性细胞浸润明显增多;(2)IRF-1干扰组与RSV感染组相比,炎性细胞浸润无明显区别;(3)IRF-1基因沉寂组与RSV感染组相比,炎性细胞浸润明显降低(图1)。

2.3 气道神经源性炎症介质的表达

大鼠右肺免疫组化染色后在显微镜下观察,结果显示:(1)RSV感染组与空白对照组相比,神经源性炎症介质SP和CGRP的表达明显增多;(2)IRF-1干扰组与RSV感染组相比,SP和CGRP的表达无明显区别;(3)IRF-1基因沉寂组与RSV感染组相比,SP和CGRP的表达明显降低(图2、3)。

3 讨论

支气管哮喘的发病机制目前尚不完全清楚,可能与变态反应、气道炎症、气道反应性增高及神经等因素及其相互作用有关。而大量的流行病学资料表明婴幼儿反复呼吸道合胞病毒(RSV)感染与以后的气道高反应性和哮喘发生率增高密切相关。

SP是一种神经肽,可促进嗜酸性粒细胞的增殖和活化,并激活肥大细胞使其释放组胺、白细胞三烯、IL-6、TNFl及前列腺素D2等,并具有强烈收缩支气管作用,在气道高反应发生过程中构成气道神经源性炎症的主要介质,在联系神经免疫循环中起着重要作用[7]。CGRP可促进大鼠肺内嗜酸性粒细胞浸润,增加淋巴细胞的趋化性和黏附力,并且可打破Thl/Th2间的细胞平衡使Th2细胞占优势[8]。既往研究表明CGRP具有使气道平滑肌收缩、促进淋巴细胞增殖、血管扩张、通透性增加及黏膜腺体分泌增多等多种作用,这些作用可能使气道产生变应性炎症反应或使已有的炎症反应加剧[9]。在本实验中,RSV感染组与空白对照组相比,感染组SD大鼠的气道反应性明显增高,肺组织中炎性细胞浸润明显增多,说明哮喘动物模型建立成功;肺组织神经源性炎症介质SP和CGRP的表达明显增多,说明哮喘模型中神经源性炎症介质起了重要作用。

A:空白对照组;B:RSV感染组;C:IRF-1干扰组;D:IRF-1基因沉寂组

A:空白对照组;B:RSV感染组;C:IRF-1干扰组;D:IRF-1基因沉寂组

A:空白对照组;B:RSV感染组;C:IRF-1干扰组;D:IRF-1基因沉寂组

IRF-1是1988年MIYAMOTO等从鼠L929细胞株中发现了是一种可结合在干扰素β因基因上游调控序列的转录正调控因子。近来研究显示发现IRF-1其具有多种生物学功能,它不仅可激活I类干扰素基因的表达,还参与细胞周期的调控、诱导细胞生长的阻抑和细胞凋亡。有研究表明:IRF-1对于细胞内NGF所致的SP的表达具有调控作用。本实验结果显示:IRF-1干扰组与RSV感染组的气道反应性及肺组织中炎性细胞浸润情况无明显区别,说明IRF-1并不能直接引起气道高反应性及炎症反应;但IRF-1基因沉寂组的气道反应性则明显降低,肺组织中炎性细胞浸润明显减轻,提示IRF-1在RSV感染引起气道高反应性及炎症反应的过程中起关键性的调节作用。而IRF-1干扰组与RSV感染组肺组织神经源性炎症介质SP和CGRP的表达无明显差别,IRF-1基因沉寂后SP和CGRP的表达明显降低,提示IRF-1在RSV感染引起气道高反应性的过程中可能是通过参与调节神经源性炎症介质的表达、调节神经源性炎症通路来参与调控。IRF-1有望成为哮喘气道神经源性炎症一个新的治疗靶点。

参考文献

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[2]李秋根,王爱平,夏莺,等.支气管哮喘大鼠肺内神经营养因子对气道高反应性影响的研究[J].中华神经医学杂志,2012,11(1):31-36.[2]LI QG,WANG AP,XIA Y,et al.Effect of the lung's neu-rotrophins on airway hyperresponsiveness in a rat model of asth-ma[J].Chinese Journal of Neuromedicine,2012,11(1):31-36.Chinese

[3]尚云晓,韩晓华,程云威,等.P物质与哮喘的关系[J].中国当代儿科杂志,2003,5(3)185-188.[3]SHANG YX,HAN XH,CHENG YW,et al.Relationship be-tween substance p and asthma[J].Chinese Journal Of Contempo-rary Pediatrics,2003,5(3):185-188.Chinese

[4]刘燕燕,李强,刘令忠,等.降钙素基因相关肽与哮喘的关系[J].中国现代医学杂志,2000,10(2):22.[4]LIU YY,LI Q,LIU ZL,et al.The correlation between calcitoningene relative peptide and asthma[J].China Journal Of ModernMedicine,2000,10(2):22.Chinese

[5]MIYAMOTO M,FUJITA T,KIMURA Y,et al.Regulated ex-pression of a gene encoding a nuclear factor,IRF-1,thatspecifically binds to IFN-beta gene regulatory elements[J].Cell,1988,54(6):903-913.

[6]PAN PH,HUANG SY,HU CP.Nerve growth factor induced ex-pression of iNOS and substance P in dorsal root ganglion sensoryneuron and interferon regulatory factor-1[J].Journal of CentralSouth University Medical Science,2011,36(5):386-391.Chinese

[7]RAMALHO R,ALMEIDA J,BELTRO M,et al.Substance Pantagonist improves both obesity and asthma in a mouse model[J].Allergy,2013,68(1):48-54.

[8]ROCHLITZER S,VERES TZ,KHNE K,et al.The neuropep-tide calcitonin gene-related peptide affects allergic airway inflam-mation by modulating dendritic cell function[J].Clin Exp Allergy,2011,41(11):1609-1621.

病毒和亚病毒因子 篇6

1 材料与方法

1.1 质粒

pcDNA-RTA编码全长RTA的真核表达载体。pGL3-Bcl-2为含Bcl-2基因全长启动子的荧光素酶报告质粒。pGL3-△P1是采用PCR定点突变技术构建的突变了Bcl-2基因P1启动子的报告质粒,构建方法如下:先将启动子片段(-346～+1)插入pGL3载体MluⅠ/HindⅢ双酶切位点处(pGL3-P2),再将片段(核苷酸-2 867～-1 545)插入pGL3-P2的MluⅠ/HindⅢ双酶切位点处。pGL3-△RRE1、2是在pGL3-△P1基础上突变了第1个和第2个CCN9GG RRE的报告质粒,克隆所用引物见表1。

1.2 抗体与细胞

RTA抗体由上海巴斯德研究所蓝柯实验室惠赠。Bcl-2小鼠单克隆抗体购自Santa Cruz公司,GAPDH抗体购自Novus Biologicals公司,偶联IR Dye 800的羊抗鼠IgG二抗购自Rockland公司。HEK 293是原代人胚肾细胞转染腺病毒DNA的永生化细胞。BJAB为KSHV、EBVA均阴性的B细胞淋巴瘤细胞,BC3和BCBL1是感染KSHV的人体腔淋巴瘤细胞系。

1.3 细胞转染及KSHV的诱导

采用Bio-Rad公司的Gene Pulser电穿孔仪进行细胞转染。用20 ng/mL佛波酯、1.5 mmol/L丁酸钠诱导KSHV。所有细胞均在诱导后培养48 h收集。

注:“*”表示此栏引物序列中酶切位点以下划线标出

细胞收集后加入RIPA缓冲液裂解,用Bradford比色法测定蛋白质浓度。取相同质量的细胞裂解液上样,聚丙烯胺凝胶电泳结束后,转移蛋白样品至PVDF膜,用Bcl-2抗体、RTA抗体、GAPDH抗体及偶联IR Dye 800的羊抗鼠IgG二抗进行免疫印迹。用Odyssey红外线成像系统(LI-COR公司)观察结果。

1.5 荧光素酶报告基因试验

107个HEK 293细胞共转染10μg荧光素酶报告质粒和10μg RTA表达质粒。转染后24 h收获细胞,制备细胞裂解液。向40μL细胞裂解液中加入25μL荧光素酶试验底物,使用LMaxII384荧光光度计(Molecular Devices)检测荧光水平。结果以3次试验值的均数与标准差表示。Western blot用来验证转染的蛋白质的表达。

1.6 染色质免疫共沉淀(ChIP)

BCBL1细胞于佛波酯诱导48 h后向培养液中加入甲醛,终浓度为1%,37℃固定细胞10 min,使蛋白质和DNA发生交联。加入甘氨酸使其终浓度为0.125 mol/L,在室温下晃动孵育5 min以终止交联反应。使用预冷的PBS清洗细胞2次,加入含1%SDS的裂解液裂解细胞,超声裂解细胞悬液将DNA均一地打断成500～1 000 bp的片段。用ChIP稀释缓冲液将超声剪切后的DNA稀释10倍,取20μL稀释液保存,这时的样品标记为INPUT,作为PCR的空白对照。其余稀释液加入蛋白A琼脂糖磁珠,4℃孵2 h,分为两组,一组加入RTA抗体,4℃振荡过夜,另一组加入鼠IgG抗体作为阴性对照。将免疫复合物用磁珠沉淀,将沉淀物分别经低盐、高盐和氯化锂溶液3次系列冲洗,然后用TE缓冲液洗2次,每次冲洗时间5 min。用新配制的洗脱缓冲液将蛋白/DNA复合物从磁珠上洗脱,加氯化钠(Na+浓度为200 mmol/L)与2μL RNaseA(0.5 mg/mL),65℃过夜,松解蛋白/DNA交联;加入5μL蛋白酶K(20 mg/mL),于55℃水浴2 h。用酚/氯仿抽提DNA。以回收DNA片段为模板,进行PCR反应,DNA的数量水平可通过定量PCR来检测,引物见表1。扩增产物越过RRE1与EERE2区域,片段长度为200 bp。同时做RT-PCR,用比较ΔΔCt值的方法对DNA丰度进行相对定量。

1.7 RNA干扰慢病毒载体的构建及细胞转导

Bcl-2基因小片段发卡结构RNA(small hairpin RNA,shRNA)用shBcl-2表示;对照shRNA以shC表示。它们均由Sigma公司合成[9]。pGIPZ是一种shRNA慢病毒载体,用来表达Bcl-2小片段发卡结构RNA,购自Open Biosystems。RNA干扰慢病毒载体构建及细胞转导实验方法参见文献[10]。本研究中,笔者构建了BC3-shBcl-2、BJAB-shBcl-2细胞及其对照BC3-shC、BJAB-shC细胞。

1.8 病毒子DNA的PCR扩增

BC3-shBcl-2、BC3-shC细胞经佛波酯诱导后培养48 h,离心弃细胞,用0.45μm孔径的过滤器收集培养液上清,23 500 r/min离心20 min以沉淀病毒颗粒。加50μL 0.2×PBS重悬病毒颗粒,放置95℃下15 min,加入1μL蛋白酶K(10 mg/mL)于56℃孵育1 h,95℃30 min灭活蛋白酶K。取5μL病毒裂解液作模板,PCR扩增KSHV编码的K9。K9引物见表1。以BC3细胞中分离的KSHV基因组DNA为对照。PCR产物条带的灰度用Kodak1D3.6软件(Eastman)定量。

1.9 细胞凋亡检测

PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡的原理是:凋亡细胞染色体降解、DNA碎片形成与可染性降低。收集细胞(106/mL)以1 000 r/min离心5 min,弃去培养液。3 mL PBS洗涤1次。离心去PBS,加入冰预冷的70%乙醇固定,4℃过夜。离心弃去固定液,PBS重悬细胞。加入终浓度50μg/mL PI(Sigma公司)、1μg/mL RNA酶于4℃下避光染色1 h。用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson公司)检测细胞凋亡,每个样本重复测定6次。

1.1 0 统计学方法

数据分析采用FlowJo软件(Tree Star),采用方差分析进行统计学检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 突变第1个与第2个CCN9GG RRE导致启动子活性显著降低

为进一步验证CCN9GG RRE的功能,笔者将pGL3-△P1报告质粒中的第1个和第2个CCN9GG RRE进行了突变,得到了pGL3-△RRE1、2这一新的报告质粒(图1A)。荧光素酶试验结果表明突变第1个与第2个CCN9GG RRE导致启动子活性显著降低(图1B)。在没有转染RTA的293细胞,报告质粒pGL3-△RRE1、2的荧光素酶活性与对照质粒pGL3-Basic都比较低;在转染了RTA的293细胞,报告质粒pGL3-△RRE1、2的荧光素酶活性约增加10倍,约为带有9个完整CCN9GG RRE的pGL3-△P1报告质粒荧光素酶活性的1/3。预留部分细胞裂解液做Western blot检测,以GAPDH作为对照,转染细胞RTA表达良好,表明转染效率佳。

2.2 RTA蛋白与CCN9GG序列存在直接相互作用

用佛波酯诱导和未经诱导的BCBL1细胞进行ChIP试验,表明RTA蛋白与CCN9GG序列存在直接的相互作用。PCR扩增证实免疫复合物中存在跨越第1个和第2个CCN9GG序列的DNA片段。在RTA抗体沉淀下来的经诱导的核DNA组目的条带清晰可见,在RTA抗体沉淀下来的未经诱导的核DNA组无阳性信号,两个IgG抗体阴性对照组亦均无阳性条带(图2A)。实时PCR用来相对定量沉淀下来的DNA的丰度,RTA抗体沉淀下来的经诱导BCBL1细胞的核DNA量比对照组高8～32倍(图2B)。

2.3 RTA介导的Bcl-2上调延缓溶解性感染的宿主细胞的凋亡,促进病毒子产生

RTA上调Bcl-2表达,Bcl-2是调节细胞凋亡的重要分子,因此笔者推测RTA介导的Bcl-2上调具有抑制宿主细胞的凋亡、促进病毒子产生的生物学功能。为验证此假设,笔者应用慢病毒介导的RNA干扰技术构建了Bcl-2抑制的稳定细胞株(BC3-shBcl-2、BJAB-shBcl-2)及对照细胞株(BC3-shC、B JAB-shC)。Western blot分析证实BC3-shBcl-2、BJAB-shBcl-2细胞的Bcl-2蛋白的表达水平很低(图3A)。BC3-shBcl-2、BC3-shC细胞经佛波酯诱导后培养48 h,分离宿主细胞裂解产生的病毒子,以PBS重悬的病毒颗粒作模板,扩增KSHV编码的K9基因。结果显示Bcl-2抑制细胞病毒子的产量约为对照组细胞的1/2(图3B)。这表明RTA介导的Bcl-2表达上调能够促进宿主细胞病毒子的产生。流式细胞仪分析显示KSHV阴性细胞BJAB-shC与BJAB-shBcl-2细胞经佛波酯诱导后细胞凋亡率分别为62.4%、64.4%,二者比较,差异无统计学意义(P>0.05);KSHV阳性细胞BC3-shC与BC3-shBcl-2细胞经佛波酯诱导后细胞凋亡率分别为58.2%、71.5%(图3C),二者比较,差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

Bcl-2家族成员调控着内源性线粒体途径的细胞凋亡[11]。其中根据其结构和功能可将Bcl-2家族成员分为两类,一类是具有抗凋亡功能,如:Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xL等,它们含有4个高度保守的Bcl-2同源结构域(BH 1-4)[12];另一类具有促进凋亡的功能,如:Bax、Bak、Bad、Bid、Bim等,其中Bax、Bak含有BH 1-3,而Bid、Bad、Bim等仅含BH3结构[13]。BH3是与促进凋亡有关的结构域,BH4是抗凋亡蛋白所特有的结构域。Bcl-2蛋白为Bcl-2原癌基因所编码,不论在生理或病理条件下均具有抑制细胞凋亡的功能[7,8]。Bcl-2基因在许多肿瘤细胞都高表达,不仅阻止肿瘤细胞凋亡,而且是肿瘤化疗、放疗不敏感的重要原因[14,15]。

笔者前期研究[16]发现KSHV RTA能够上调宿主细胞Bcl-2表达。RTA可直接激活Bcl-2基因启动子,这种激活作用呈剂量依赖性,无细胞选择性。CCN9GG RREs和P2启动子对RTA调控Bcl-2表达具有重要作用。为进一步验证CCN9GG样RTA反应元件的功能,阐明RTA调控Bcl-2的分子机制及其生物学意义,笔者突变Bcl-2启动子第1个和第2个CCN9GG RRE,在pGL3-△P1基础上构建了pGL3-△RRE1、2这一新的报告质粒。荧光素酶试验结果显示,突变第1个与第2个CCN9GG RRE导致RTA介导的Bcl-2启动子活性显著降低。染色质免疫共沉淀实验表明RTA蛋白与Bcl-2启动子中的RREs存在直接的相互作用。上述证据再次证明CCN9GG RRE对RTA反式激活Bcl-2具有重要的作用。用RNA干扰技术抑制Bcl-2基因后,佛波酯诱导的BC3-shB-cl2细胞与对照组细胞相比凋亡率显著增加,病毒子产生减少。

综上所述,KSHV RTA介导的Bcl-2表达上调促进病毒的溶解性感染,可以延缓宿主细胞的凋亡,并增加病毒子的产生。

[志谢:衷心感谢Véronique Bourgarel-Rey(Aix-Marseille Université,Marseille Cedex 05,France)提供Bcl-2基因全长启动子荧光素酶报告质粒pGL3-Bcl-2。]

摘要：目的 研究卡泼肉瘤病毒(Kaposis′s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)编码的复制转录激活因子(replication and transcription activator,RTA)调控宿主细胞Bcl-2表达的分子机制及其生物学意义。方法 突变Bcl-2启动子第1个与第2个CCN9GG样序列,构建了新的报告质粒(命名为pGL3-△RRE1,2),用荧光素酶试验和染色质免疫共沉淀进一步验证CCN9GG样RTA反应元件的功能。构建RNA干扰慢病毒载体,筛选稳定感染的BC3细胞,佛波酯诱导48 h后,分别用PCR、PI(碘化吡啶)染色流式细胞术检测病毒子DNA和细胞凋亡率。结果 突变第1个与第2个CCN9GG序列导致启动子活性显著降低;染色质免疫共沉淀试验证实RTA蛋白与CCN9GG序列存在直接相互作用。用RNA干扰技术抑制Bcl-2基因后,佛波酯诱导的KSHV阳性细胞与对照组细胞相比凋亡率增加,病毒子产生减少。结论 KSHV RTA能够调控内源性细胞凋亡信号通路,延缓溶解性感染宿主细胞的凋亡,并促进病毒子产生。

病毒和亚病毒因子 篇7

为了证明h RI是否是肿瘤抑制因子, 本研究将已构建的针对h RI基因的si RNA表达载体p KD-ds RI[6的H1 Promotor和MCS区段亚克隆至逆转录病毒载体p LNCX的MCS中, 获得有新霉素抗性的干扰载体p LNCX-p KD-ds RI, 为下一步探讨h RI抗肿瘤作用及抗肿瘤基因治疗的应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

质粒p LNCX、E.coli DH5α 由大连大学医学院 (以下简称“我院”) 生物化学与分子生物学教研室保存;针对人核糖核酸酶抑制因子si RNA表达载体p KDds RI (图1) 由我院生物化学与分子生物学教研室构建。

限制性内切酶、DNA Marker、T4DNA连接酶购自Ta Ka Ra;DNA快速凝胶产物回收试剂盒购自博大泰克公司;琼脂糖、氨苄青霉素和链霉素购自华美生物公司;LB培养基购自Invitrogen/GIBCO;G418 和RTPCR kit购自BBI;CellfectinR购自Invitrogen;Trizol、DEPC H2O购自上海生物工程有限公司;核酸序列分析软件primer 5.0、质粒绘制软件plasmid 2.0。

1.2 方法

1.2.1重组载体pLNCX-pKD-dsRI的构建及鉴定

质粒pLNCX用HindⅢ单酶切质粒pLNCX、Klenow Fragment和dNTP补平、CIAP去除5'-磷酸末端后, 用乙醇沉淀法回收得到约6.2 kb的平末端的线性化、去磷酸化的载体大片断。质粒pKD-dsRI用PvuⅡ酶切后, 经1%琼脂糖电泳切胶回收, 获得目的片断 (H1Promotor-dsRI) ;同样处理pKD, 获得目的片断 (H1Promotor-MCS) 。载体与片段用T4DNA连接酶连接、转化后, 获得重组载体pLNCX-pKD-dsRI。用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pLNCX-pKD-dsRI, 筛选得到正向连接的阳性克隆。挑取单克隆, 提取质粒, 用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pLNCX-pKD-dsRI, 筛选得到正向连接的阳性克隆。将酶切筛选阳性克隆送TaKaRa测序鉴定。

1.2.2 HepG2细胞培养和转染

细胞用DMEM培养基进行培养, 补加0.03%谷氨酰胺, 0.2%NaHCO3, 0.59%Hepes (pH 7.2) , 10%热灭活 (56℃, 30 min) 的胎牛血清及双抗 (青霉素和链霉素各100 U/mL) , 培养条件为5%的CO2, 培养温度37 ℃。 细胞按4×104个/孔铺板于24 孔板, 至90%~95%汇片时, 按CellfectinR说明书转染并分组:①空白组 (正常细胞) ;②空载体组 (p LNCX-p KD载体转染组) ;③干扰组 (p LNCX-p KDds RI载体转染组) , 每组2 复孔。每组质粒共用0.8 μg、脂质体2 μL, 转染后24 h, 换成含600 μg/m L G418的培养基培养选择2 周, 挑取G418 的抗性单克隆, 繁殖、扩增。

1.2.3 mRNA转录水平的检测

采用Trizol试剂分别提取各孔中细胞的总RNA。使用RT-PCR试剂盒按照两步法进行RT-PCR反应。以总RNA逆转录合成的cDNA为模板进行PCR反应。用于检测内源表达的RT-PCR引物:5'-gacatccagtgtgaggagctgagcg-3', 5'-ccagcctcattgatgtcgttgttgc-3', 上游引物位于hri基因的No.27 bp, 下游引物位于hri基因的No.559 bp, 产物长度约为527bp。β-actin引物5'-gctgtccctgtacgcctctg-3', 5'-tgccgatggtgatgacctgg-3', 产物长度约为300 bp。由Bio-Rad凝胶成像仪摄取图像, Image LabTM软件对各个条带测定其面积及灰度值。用目的基因条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值表示目的基因的相对表达强度。干扰率= (相对表达强度空载体组-相对表达强度干扰组) /相对表达强度空载体组。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 11.5 统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差 (±s) 表示, 多组间比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验, 以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组载体p LNCX-p KD-ds RI的构建及鉴定

2.1.1重组载体pLNCX-pKD-dsRI的构建

质粒pKD-dsRI用PvuⅡ酶切后获得约618 bp的目的片断pkd-dsRI;同样处理pKD, 获得约534 bp的目的片断pkd (图2) 。质粒pLNCX用HindⅢ单酶切质粒pLNCX、Klenow Fragment和dNTP补平和CIAP去除5'-磷酸末端后, 回收得到约6.2 kb的平末端的线性化、去磷酸化载体大片断 (图3) 。

M1：DL2000 Marker；1：pKD-dsRI/PVUⅡ；2：pKD/PVUⅡ

M1:λ-EcoT14Ⅰdigested DNA Marker;1:pLNCX/HindⅢ

2.1.2酶切鉴定阳性重组质粒pLNCX-pKD-dsRI-Neor和pLNCX-pKD-Neor

用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pLNCX-pKD-dsRI, 得到5523 bp和1305 bp两条片段 (图4) ;同样处理pLNCX-pKD-dsRI, 得到5523 bp和1221 bp两条片段 (图5) 。

M1:DL2000 Marker;M2:λ-EcoT14Ⅰdigested DNA Marker;1:pLNCX-pKD-neor/BamHⅠ+XhoⅠ

M1:DL2000 Marker;M2:λ-EcoT14Ⅰdigested DNA Marker;1:pLNCX-pKD-dsRI-neor/BamHⅠ+XhoⅠ (5523 bp和1221bp) ;2:plasmid of pLNCX-pKD-neor

2.2 m RNA转录水平的检测

RT-PCR结果显示, 空白组hri基因的相对表达强度为0.790±0.014, 空载体组的相对表达强度为0.904±0.027, 干扰组的相对表达强度为0.361±0.048。与空白组和空载体组对比, 干扰组中hri基因均显著下调 (P < 0.05) , 抑制率大于80%。 可见, hri基因在转录后水平上分别被沉默 (图6) 。

M:DL2000 Marker;1:空白组中β-actin的表达;2:空白组中hri基因的表达;3:空载体组中β-actin的表达;4:空载体组中hri基因的表达;5:干扰组中hri基因的表达被干扰;6:干扰组中β-actin的表达

3 讨论

RNA干扰 (RNA interference, RNAi) 是双链RNA (double-strand RNA, ds RNA) 介导的序列特异的转录后基因沉默 (posttranscriptional gene silencing, PTGS) 现象。 2001 年Elbashir等[7]证明合成的双链si RNA在哺乳动物细胞中可实现靶基因特异沉默作用, 由此RNAi被广泛用于特异基因的生物学功能的研究。 目前常用的si RNA的制备方法有化学合成法、体外转录法、RNase Ⅲ消化法、si RNA质粒表达载体法、si RNA表达盒细胞内表达法等[8], 其中, 质粒载体表达si RNA法, 最常利用哺乳动物细胞启动子RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子如鼠和人U6-sn RNA启动子、人RNase P (H1) 启动子、人Val-t RNA启动子等调控表达si RNA或sh RNA, 但存在转染效率低等问题。 由于逆转录病毒载体能将外源基因有效地整合到宿主细胞基因组中, 并随细胞分裂而传给后代, 所以使用逆转录病毒载体转染可以获得长期稳定的RNA干扰效果[9]。 如Clontech的RNAi-Ready p SIREN-Retro Q-Ds Red-Ex press[10]、Oligoengine的p SUPER retro[11]、Ta Ka Ra的p SINsi系列载体、Ambion公司的p SilencerTM5.1 Retro[12等。 基于2002 年Xia[13]等报道, 细胞内RNA聚合酶Ⅱ依赖的启动子也能高效表达si RNA, Ambion公司的RNAi载体p SilencerTM4.1 -CMV neo利用改良Cytomegalomavirus (CMV) 启动子表达sh RNA, 也实现了稳定RNA干扰作用。

本研究在瞬时载体p KD-ds RI基础上, 将p KD的H1 promoter及其下游的MCS序列亚克隆至逆转录病毒p LNCX的MCS中, 得到耐受新霉素的稳定表达沉默h RI的载体p LNCX-p KD-ds RI-neor。双酶切鉴定及在Hep G2 细胞内RT-PCR结果表明了干扰h RI基因的稳定表达载体构建成功。这为以后研究hRI基因的抗肿瘤作用及在基因治疗中的应用奠定了基础。

摘要：目的 构建针对人核糖核酸酶抑制因子 (hRI) 的shRNA逆转录病毒载体, 为探讨hRI抗肿瘤作用机制打下基础。方法 用亚克隆法将目的片段pkd-dsRI和pkd从表达载体pKD-dsRI克隆到pLNCX上, 用双酶切筛选得到阳性克隆后, 用脂质体法将其转染到人肝癌细胞HepG2细胞中, 用800 mg/L G418筛选2周, 产生稳定的细胞克隆后, 用RT-PCR检测细胞中核糖核酸酶抑制因子mRNA表达的变化。结果 双酶切鉴定为阳性克隆。RTPCR表明, 对比空白组 (0.790±0.014) 和空载体组 (0.904±0.027) , 干扰组hri基因表达 (0.361±0.048) 明显下调, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论 成功构建了针对hRI的shRNA逆转录病毒载体。