马疱疹病毒

马疱疹病毒（共8篇）

马疱疹病毒 篇1

马疱疹病毒 ( EHV) 主要有5 个型, 即EHV - 1、EHV - 2、EHV - 3、EHV - 4、EHV - 5, 其中对养马业危害最严重的是EHV - 1 和EHV - 4[1,2]。EHV - 1 /4 属于疱疹病毒甲亚科水痘病毒属, 在全世界广泛分布, 并对所有年龄种类的马构成威胁。EHV - 1 /4 紧密相关又有所不同: 一方面, EHV - 1 /4 在遗传、抗原、致病性上的关系非常密切; 另一方面, EHV - 1 /4在抗原性、致病性、限制性内切图谱、宿主范围等方面有重要的生物学差异[3]。

EHV - 1 /4 与带状疱疹病毒[Varicella - zoster virus ( VZV) ]和单纯疱疹病毒 ( HSV - 1 和HSV - 2) 同属, 病毒颗粒为球形或不规则球形, 成熟的病毒颗粒的结构组成为病毒核芯、衣壳、内层囊膜 ( 内膜) 、外层囊膜 ( 外膜) , 直径为120 ~ 200 nm, 具有线性双链DNA和蛋白质缠绕的核心, 核衣壳是由162 个壳粒构成的20 面体[4,5]。EHV - 1 /4 基因组大小分别为150 kb和145 kb, G + C含量均为57%[6], 基因组含有76 个基因, 编码77 个不同蛋白[7,8]。其中宿主关闭蛋白 ( virus host shutoff [VHS]) 基因由UL41 编码。研究发现, HSV - 1 VHS具有降解宿主细胞和病毒mRNA及对抗干扰素通路的作用, 这对于病毒的复制和致病性有重要意义[9,10,11,12]。EHV - 1 /4 同样编码VHS蛋白, 但是国内对于VHS蛋白功能的研究鲜有报道。本研究将EHV - 1 /4 的VHS基因片段与真核表达载体p3 × Flag连接, 构建p3 × Flag - VHS - 1 和p3 × Flag - VHS - 4 重组质粒, 将其转染He La细胞, 确定VHS蛋白在细胞中的表达情况及亚细胞定位, 为EHV - 1 /4 的VHS蛋白功能研究提供基础资料。

1 材料与方法

1. 1 主要试剂

T4 DNA连接酶, 购自NEB公司; 4, 6 - 二氨基-2 - 苯基吲哚 ( DAPI) 、Flag羊抗鼠单克隆抗体、p3 ×Flag 10、FITC标记的羊抗鼠Ig G抗体, 购自Sigma公司; DMEM培养基, 购自Hyclone公司; Dy Light 800 标记的羊抗鼠Ig G抗体, 购自KPL公司; 脂质体Lipofectamine 2000, 购自Invitrogen公司; EHV - 1 /4, 购自美国模式培养物研究所; 病毒DNA提取试剂盒, 购自Omega公司; He La细胞, 由东北农业大学微生物学教研室保存。

1. 2 VHS基因扩增引物的设计与合成

根据EHV - 1 和EHV - 4 基因序列 ( 登录号分别为AP012321 和AF030027) , 利用Oligo软件设计2对引物, 引物序列为VHS - 1 - forward 5' - TTTAAGCTTATGGGACTGTTTGGACTCCTAAA - 3', VHS -1 - reverse 5' - TTTGAATTCTCACGACCACTGTCTACGGTGTC - 3 '; VHS - 4 - forward 5 ' - TTTAAGCTTATGGGACTGTTTGGACTCTTAAAA - 3', VHS - 4 - reverse 5 ' - TTTGAATTCTTAAGACCATTGTCTTCGGTGTCC - 3 ' ( 加粗部分为保护性碱基, 下画线部分为限制性酶切位点) , 预计扩增片段大小分别为1 494 bp和1 491 bp, 引物由长春库美生物有限公司合成。

1. 3 VHS基因的PCR扩增

提取EHV - 1 /4 全病毒DNA, 以全长DNA作为PCR模板扩增VHS基因。PCR反应条件: 94 ℃ 预变性5 min; 94 ℃ 变性30 s, 55 ℃ 退火30 s, 72 ℃ 延伸2 min, 共30 个循环; 72 ℃ 再延伸10 min。PCR产物用10 g /L琼脂糖凝胶电泳, 切胶并回收目的片段。

1. 4 p3 × Flag - VHS重组质粒的构建

将VHS基因与p3 × Flag分别用Hind Ⅲ和EcoRⅠ双酶切, 胶回收后用T4 DNA连接酶将双酶切的VHS片段与载体片段连接, 成功构建p3 × Flag -VHS - 1 和p3 × Flag - VHS - 4 重组质粒, 并将其转化至大肠杆菌DH5α 感受态中, 挑取菌落进行PCR鉴定, 对阳性克隆提取质粒并测序。

1. 5 He La细胞的培养与转染

将He La细胞接种至6 孔细胞培养板中, 细胞培养液为不含抗生素的DMEM, 细胞个数控制在1 ×105个/孔, 待细胞贴壁生长; 当细胞密度为80% ~90% 时进行转染, 转染步骤参照参考文献[13]。

1. 6 重组质粒p3 × Flag - VHS表达产物的Western -blot检测

转染后72 小时时弃去6 孔细胞培养板中的培养液, 用PBS清洗细胞3 次; 每孔加入300 μL细胞裂解液, 将6 孔细胞培养板置振荡摇床上振荡10 ~15 min; 收集细胞裂解液及细胞碎片至1. 5 m L EP管中, 12 000 r/min离心5 min; 收集上清液, 加入5 ×Loading Buffer, 于金属浴 ( 95 ℃ ) 中煮10 min, 蛋白样品收集完成; 将收集的样品经SDS - PAGE电泳后转移至硝酸纤维素 ( NC) 膜上, 50 g /L脱脂乳封闭, 抗体孵育, 其中一抗为Flag羊抗鼠单克隆抗体 ( 1∶10 000) , 二抗为Dy Light800 标记的羊抗鼠Ig G抗体 ( 1∶10 000) , 观察试验结果。

1. 7 VHS蛋白的亚细胞定位

在培养皿中接种细胞, 当细胞密度为80% ~90% 时进行转染, 转染步骤同1. 5。培养72 h后用40 g / L多聚甲醛固定, 1 g / L的Triton - X 100 透膜, 50 g / L脱脂乳封闭, 抗体孵育, DAPI染核处理细胞, 其中一抗为Flag羊抗鼠单克隆抗体 ( 1∶200) , 二抗为FITC标记的羊抗鼠Ig G抗体 ( 1 ∶200) , 在激光共聚焦显微镜下进行VHS蛋白的亚细胞定位。

2 结果与分析

2. 1 VHS基因的PCR扩增与重组质粒的酶切鉴定

结果见图1。

M.DNA分子质量标准;1.VHS-1片段PCR产物;2.VHS-4片段PCR产物;3.阴性对照;4.p3×Flag-VHS-1酶切产物;5.p3×Flag-VHS-4酶切产物。

由图1 可知, 扩增的VHS - 1 片段大小为1 494 bp, VHS - 4 片段大小为1 491 bp, 与预期片段大小一致。

2. 2 重组质粒p3 × Flag - VHS表达产物的Western -blot检测

结果见图2。

M.蛋白分子质量标准;1.重组质粒p3×Flag-VHS-1转染HeL a细胞;2.重组质粒p3×Flag-VHS-4转染HeL a细胞;3.空质粒p3×Flag转染HeL a细胞。

由图2 可知, 经检测重组质粒泳道得到单一条带, 而空质粒泳道未出现特异性条带。说明VHS - 1和VHS - 4 蛋白在He La细胞中能够有效表达。

2. 3 VHS蛋白的亚细胞定位

在激光共聚焦显微镜下观察VHS - 1 和VHS - 4蛋白在细胞中的定位, 重组质粒p3 × Flag - VHS - 1和p3 × Flag - VHS - 4 转染组能观察到特异性荧光, 且荧光主要分布于细胞浆中, 空质粒p3 × Flag转染组未观察到特异性荧光, 见261 页彩图3, 说明VHS -1 和VHS - 4 蛋白主要分布于He La细胞的细胞浆中。

3 讨论

本研究通过PCR方法获得EHV - 1 /4 型VHS基因片段, 构建重组质粒p3 × Flag - VHS - 1 和p3 ×Flag - VHS - 4, 在外源真核细胞He La中对其进行成功表达, 经激光共聚焦显微镜扫描证实, 该蛋白主要位于He La的细胞浆中。VHS基因片段长度分别为1 494 bp和1 491 bp, 预测其编码的蛋白大小应为55 ku左右, 经过Western - blot检测发现与预期大小相符。在研究中, 最初将扩增的VHS基因分别连接到Flag标签和HA标签的载体上, 但是转染细胞后并不能检测到目的蛋白, 而将其连接至p3 × Flag载体中才能够检测到较低的表达量, 这可能与VHS蛋白的某些性质有关。

研究发现, 在最初阶段VHS蛋白的主要功能是关闭宿主的mRNA转录[14], 但是随着近十年固有免疫的发展, VHS蛋白具有颉颃干扰素的作用, 本试验构建了重组质粒p3 × Flag - VHS - 1 和p3 × Flag -VHS - 4, 对EHV - 1 /4 的VHS蛋白进行了真核表达, 还确定该蛋白主要集中在He La细胞的细胞浆中, 这为VHS蛋白的功能研究奠定了基础。

A、B、C.空质粒p3×Flag转染组;D、E、F.重组质粒p3×FlagVHS-1转染组;H、I、J.重组质粒p3×Flag-VHS-4转染组。

摘要：为了研究1型和4型马疱疹病毒 (EHV) VHS蛋白在真核细胞中的表达与亚细胞定位, 试验将1型和4型马疱疹病毒VHS基因片段与p3×Flag载体连接, 构建p3×Flag-VHS-1和p3×Flag-VHS-4重组表达质粒, 经脂质体转染HeLa细胞后, 用Western-blot验证该蛋白在HeLa细胞中的表达情况, 并以激光共聚焦显微成像技术确定VHS蛋白在真核细胞中的分布及亚细胞定位。结果表明:重组质粒p3×Flag-VHS-1和p3×Flag-VHS-4在HeLa细胞中获得了表达, 且主要聚集于细胞浆。说明VHS蛋白能够在外源真核细胞HeLa中表达, 蛋白主要位于HeLa的细胞浆中。

关键词：马疱疹病毒,HeLa细胞,VHS蛋白,表达,定位,免疫印迹

锦鲤疱疹病毒病的研究进展 篇2

锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒 （KHV）引起的锦鲤、鲤鱼及其普通变种发生鳃坏死和间质性肾炎的一种高致病性和高死亡率的疾病。该病多发生在水温为18℃～28℃的春秋季节，但目前有低温下发病的趋势。该病具有高度传染性，发病率和死亡率均高达80%～100%。在锦鲤和鲤鱼的国际贸易中，由于缺乏相关的检疫制度，促使了该病在世界范围内暴发性流行，给锦鲤和鲤鱼养殖业带来了破坏性影响。

1.国内外流行现状

自从锦鲤疱疹病毒病暴发以来，各个国家和地区几乎每年都发生。2003年以来，我国东北地区的框镜鲤和普通鲤鱼发生暴发性疾病，死亡率高达80~90%，经PCR检测为KHV阳性；近两年来，KHV检测也均为阳性。另外，有报道，近年来在菲律宾非法进入的锦鲤中检测到KHV。2008年，中国台湾地区检测KHV阳性率为7%；据2010年鱼病统计结果显示，泰国也有KHV的发生。锦鲤疱疹病毒病的全球性暴发，给锦鲤观赏业、鲤鱼养殖业以及国际贸易等造成了极大的经济损失，并引起了各国的高度重视，因此，各国家和地区应加强合作，严格控制KHV的发生与流行。

2.病毒研究进展

2.1 KHV形态结构和理化特征

锦鲤疱疹病毒(KHV)属于疱疹病毒科，是直径为100～110nm的二十面体，有囊膜包裹，与其同科的鲤鱼1型疱疹病毒和叉尾鮰病毒之间有免疫交叉反应。病毒核表面具有螺纹样结构；核内有一个不对称的电子密集区，被认为是病毒DNA基因组构成的核蛋白。KHV在22℃左右的池塘水中至少存活4小时，并且在鱼的分泌物或池塘底泥中存活的时间可能更长。病毒对温度和酸碱度比较敏感，在35℃2天或60℃30分钟以及pH低于3或高于11的条件下，能够失去感染力。用氯仿、在25%的乙醚或0.1%的TritonX-100可迅速杀灭病毒。

2.2 KHV的分类和命名

研究表明，KHV与疱疹病毒在进化和形态学上具有明显的相似性，但KHV的基因组比其他疱疹病毒都大。通过序列分析发现，KHV与鲤鱼1型疱疹病毒和金鱼出血性坏死疱疹病毒有较高相似性，进一步表明KHV属于疱疹病毒科。

目前，国际上还没有对KHV的统一命名，锦鲤疱疹病毒（KHV）又称为鲤鱼间质性肾炎及鳃坏死病毒。通过比较疱疹病毒的主要囊膜蛋白基因、衣壳蛋白基因、DNA聚合酶基因、螺旋酶基因，认为KHV与鲶鱼疱疹病毒也有相近之处，建议将KHV命名为CyHV-3。因此，对病毒的系统发育及生物学方面的研究有利于对该病毒更加准确的分类及命名。

2.3 KHV基因组特征

KHV是线形双股DNA病毒，病毒基因组大小为295Kbp，两股基因组的末端含有22个正向重复序列；有156个开放性阅读框（ORF），8个末端重复序列；KHV平均每0.57Kbp有一个ORF，比IcHV-1稍低（0.68Kbp）；全部核苷酸的GC含量为59.2%。目前，已报道有4个分离株，即欧洲株、美国株（KHV-U）、亚洲株（KHV-J）和以色列株（KHV-I）。但在Genbank中未登录欧洲株的全基因组序列，KHV-I、KHV-J和KHV-U在基因组序列上有高度相似性，但是KHV-U与KHV-I比KHV-J更为相近。通过对三株病毒的基因组核苷酸分析认为KHV原始株最初分化为J系和U/I系，随后U/I系又分化成U和I两个分支。另外，用PCR方法可以区别亚洲株和其他三株。

2.4 编码蛋白

KHV的156个ORF只有少数已经确定其功能。ORF81和ORF83编码主要囊膜蛋白，且主要在细胞质中表达。其中ORF81编码蛋白的分子量为28.2 KD，等电点（PI）为8.65，含有4个跨膜区，可构成主要抗原决定簇；另外，ORF81在大量表达时出现细胞核缩小及细胞从瓶壁脱落的现象。研究表明，ORF81重组蛋白的表达可作为免疫荧光和ELISA检测KHV特异性血清抗体的诊断性抗原，还可以用于抗KHV的亚单位或DNA疫苗的研究。ORF25和ORF99编码膜糖蛋白；ORF72和ORF92编码衣壳蛋白，二者可分别表达47.6KD和145KD的蛋白，且表达量较大，可用于KHV的快速检测。

KHV含有15个与IcHV-1同源的保守基因，其中除了ORF72、ORF92和ORF99以及5个未知功能蛋白外都编码非结构蛋白。其余7个基因编码的蛋白与衣壳形成（ORF78）、核苷酸代谢（ORF19和ORF123）、DNA复制（ORF79，ORF71，ORF46）以及DNA包装（ORF33）有关。

另外，KHV编码胸苷酸单磷酸激酶、核糖核苷酸还原酶(RNR)以及胸苷激酶(TK,ORF140编码)的蛋白基因与痘病毒相似。任何其他疱疹病毒中均没有TmpK和B22R-like基因 ；另外，TK基因的部分序列与其它疱疹病毒的TK基因无相似性。

3.流行病学

3.1 感染宿主

KHV具有高度传染性和致病性，毒性极强，但KHV的宿主范围十分狭窄，仅感染锦鲤、鲤鱼及其普通变种，与鲤鱼种系相近金鱼、鲢鱼、鲫鱼、草鱼、罗非鱼和鲈鱼等，即使是在KHV的适宜温度，长期与病鱼共养也不发病。不同龄的鱼均可感染，成鱼比幼鱼更易感病，且死亡率较高。据调查，死亡率与养殖密度有关，一般网箱养殖死亡率为50%~80%，最高可达100%；而池塘养殖死亡率达10%～30%。

3.2发病季节及水温

该病主要受水溫影响，多发在春秋季节。易发水温为18℃～28℃，23℃～28℃水温易暴发流行。鱼可在较低水温下感染但不表现临床症状，然而使其恢复到适宜的水温时能够产生典型的疾病和死亡。目前，该病具有低温下发病的趋势。

3.3传播途径

可从感染鱼的分泌物和粪便中检测到KHV病原和病毒DNA，因此，大多学者认为该病是通过水传播，并推测KHV在其他季节特别是寒冷季节可能潜伏在粪便中。另外，徐达等研究发现金鱼、虎皮蛙、朱文锦和大肚鱼感染KHV后不发病但可以作为传播媒介。

由于该病的主要症状之一是鳃坏死，并且在早期发病的鳃组织中就可检测到病毒DNA，但是利用生物发光成像技术，研究证明皮肤是KHV的入侵门户。病毒侵入鱼体内后，病毒蛋白在病鱼肾脏中大量表达，但在脑和肝脏中的表达较少，说明肾脏是病毒增殖效率最高的器官。

4.临床症状及病理特征

4.1临床症状

感染鱼典型临床症状是反应迟钝，呼吸困难，食欲不振，共济失调；皮肤有灰白色斑点，粘液分泌增多，鳃出血坏死，眼睛凹陷；感染后7～10天开始出现死亡，2~3周后死亡率可达100%。

4.2病理特征

病鱼最明显的损伤是在鳃、肾脏、肝脏和脾脏。感染后2天，鳃薄片减少，并伴随炎性细胞浸润；6天后鳃结构消失，鳃耙变细，鳃弓内血管充血。鳃的损伤早于其他组织，Hedrick等认为是由继发感染引起的。但试验证明由CNGV导致了鳃的初始症状，进而造成了继发感染。

除了鳃以外，最主要的病变在肾脏。感染后2天肾小管周围出现炎性浸润；第6天出现严重的间质性炎症，并伴随着血管充血。随后炎症加重，伴随一些肾单位管状上皮细胞的轻微变性。另外，其他器官也出现不同程度的病变。肝脏实质出现轻微炎性浸润，脑组织切片显示局灶性脑膜和脑膜旁炎症。

5. 疫苗的研究进展

防制病毒性传染病的有效方法是疫苗免疫。研究发现应用组织灭活苗进行免疫，效果并不理想。目前，该病较为有效的疫苗是通过变温的方法或在细胞上连续传代获得不致病的突变株，作为减毒疫苗免疫锦鲤和鲤鱼，保护率可达80%以上。 虽然弱毒苗可以有效刺激机体细胞免疫和体液免疫，并且免疫应答持续时间较长，具有更广泛的特异性，但是弱毒苗存在散播病毒和病毒变异的可能。因此，避免病毒散播和变异的可能性，对有效的基因工程疫苗的研究更是迫在眉睫，以控制KHV在锦鲤和鲤鱼的全球性暴发流行，从而减少经济损失，保证锦鲤和鲤鱼养殖业的健康发展。

锦鲤疱疹病毒的鉴定及预防思考 篇3

锦鲤疱疹病毒主要由病毒感染引起, 是一种普通的框镜鲤由病毒感染之后, 具有高度传染性, 一旦感染就会致死。该病主要出现在春秋季节, 水温为18~28℃之间, 这水温是病毒流行最佳水温。随着时间的推移, 病毒在低温环境下蔓延的趋势加强。KHV感染范围比较狭小, 只会感染鲤鱼、锦鲤以及一些普通的鱼种。同锦鲤鱼种类似, 都喜欢在合适的水温下生长, 也不会感染上疾病。一些成鱼和幼鱼就会容易感染。成鱼相对幼鱼而言, 死亡率较高。从2003年以来, 我国东北地区的普通锦鲤感染病毒的概率越来越高, 死亡率高达90%。进行PCR检测发现KHV呈阳性。KHVD病毒在我国锦鲤和匡锐鲫蔓延较为严重, 导致我国经济损失。

1 病毒效价测定及动物感染试验

1.1 毒价测定

把病毒液进行稀释, 稀释量为10倍之上, 将其分别接种入96孔板下进行培养, 获得锦鲤单层细胞, 每个稀释度再进行8孔重复。放置在22℃下进行培养, 安置上阳性对照孔, 对没有稀释的细胞毒以及阴性对照孔分析, 记录下CPE, 再使用Karber法计算出TCID50效价。

1.2 动物感染试

使用的是体积较轻的健康锦鲤作为实验对象, 数量为30条, 在实验室里观察了28d, 没有发现任何病症。将病毒培养液注射到实验鱼体内, 数量为20条, 每一条注射量为1m L, 水温维持在20~24℃之间。另外, 一组数量为10条的;锦鲤作为对照鱼, 考试观察实验现象。临床表现出, 在有症状的鱼组中提取出了DNA病毒, 进行PCR鉴定。同时, 病毒锦鲤的组织进行切片检查。

1.3 PGR鉴定分析

1.3.1 对病毒基因开展鉴定工作

把ORF25基因进行PCR拓增实验, 得出的产物胶电泳检测结果, 发现特异片大量的衍生而出。将其连接到p MD]8-T载体中, 进行科学的鉴定。

1.3.2 序列测定和分析

将测序结果同KHV序列结果对比, 结果显示出, 在OQF25基因中, 有病毒的侵蚀, 病毒类型为KHV-1, 同源病毒符合度高达99.9%, 锦鲤类型定位为KHVcj。氨基酸序列分析显示:当KHVcj氨基酸位置发生变动后, 则有一个稳定的突变位点存在。实验显示, 当期在第239位时, 突变从E变化为K。氨基酸抗原性分析得出, 该距离的抗原性水平高。

1.4 病毒毒价测定

开启病毒毒价测定, 经过检测发现, KHVcj第2代细胞培养物TCID效价为10。当锦鲤感染上病毒之后, 鱼活动减少, 表现为反应迟钝, 食欲不振, 鱼表面皮肤泛白, 有斑点。体表黏液分泌量增多, 有些病鱼腹部底部有出现迹象。随着时间推移, 白色斑点增多。随着感染时间增加到8d开始死亡。实验发现, 当感染病毒在30d内, 发病率达100%。而, 对照鱼组没有任何变化。进行PCR鉴定发现, 取出了临床症状实验鱼之后, 锦鲤肾脏组织被病毒破坏, PCR扩展增大, 而849bp特异性目的片段增多。在病毒感染到3d之后, 实验鱼的鳃薄片急速减少, 炎症扩散, 扩散到整个鱼体周边, 整条鱼的血管充满血。

2 锦鲤疱疹病毒思考

研究建立适宜于锦鲤养殖场新进厂区苗种、亲鱼、苗种和养殖场养殖环境中疱疹病毒的分子检测技术体系, 提高了养殖场苗种病毒检疫能力。为了有效预防病毒发生, 需做好预防工作。

2.1 在生态防控技术层面

加深对生态防控理念的认识, 在养殖进程中, 借助微生态剂, 全面开展养殖水体体制监控。养殖区采用生态防控措施。这里的生态指的是, 池塘水体表面同大气接触的横截面, 这个横截面是池塘鱼类交换气体重要场所, 是进行呼吸通道。同时, 这个界面也是水产动物的肠道, 这是个形象的比喻, 池塘内的锦鲤的呼吸和吸收, 都是经过该界面实现, 是能量转接平台。另外, 也是气-水界面关注藻相。从鱼类病毒感染情况上看, 这些病毒可以分类为应激性病毒、营养性病毒等等。在生态防控体系中, 每一道体系落实到位之后, 才能有效地防止鱼类受到病毒侵害。一般而言, 生态防控中的“控”, 是针对水生动物健康而言的, 是控制水生病毒有效防道。

2.2 引入中草药消毒

众所周知, 中草药具有天然、高效以及无毒副作用功效, 不仅能够起到抵抗病毒功效, 还能调节动作机体免疫能力。提高动作免疫功能, 激发鱼类的抗应激作用。项目组基于分析发现, 引入大黄蒽醌及其大黄素中药材提取物, 能对水体中的污染物进行清理, 提升感染效应。另外也可以建立起防御消毒管理制度, 健全养殖管理体系。从对锦鲤材料的引入, 换水以及疾病预防等等层面着手分析。定期开展鱼塘换水工作, 提升防御效应。同时, 我国水产科技研究院需加快研究力度, 针对性建立起锦鲤疱疹病毒病防控关键技术研究与示范”区, 对病毒出现、传播、控制进行研究。

2.3 建立起一套科学养殖体系, 制定出养殖规范

在规范下开展养殖, 能获得良好养殖效益。病毒的发生是可控的, 在平时养殖活动进行中, 加强观察, 对应锦鲤疱疹病毒病出现特征分析, 确定出锦鲤疱疹病毒病后, 需加快选择应对措施, 将损失控制住。一般而言, 病毒的发生非常危险的, 平日的养殖预防工作要落实到位, 做好换水, 预防工作。这在一定程度上, 有效杜绝病毒的发生, 为更好的养殖锦鲤开辟健康环境, 为获得良好的养殖经济收入奠定基础。当下, 养殖业将锦鲤养殖作为首要养殖对象, 那么对锦鲤疱疹病毒病诊断和预防显得至关重要, 需加强控制, 提升养殖经济效益。

3 结束语

锦鲤养殖是养殖业发展趋向, 但是锦鲤疱疹病毒对锦鲤带来的危害较大。开展养殖业时, 需做好锦鲤锦鲤疱疹病毒诊断工作, 及时采取有效应对措施, 将病毒控制住, 提升养殖业生产效应。

参考文献

[1]周井祥, 李新伟.锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF81基因的克隆及生物信息学分析[J].水产学报, 2011, 35 (12) :1780-1786.

[2]王好, 王秋举锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF126基因的原核表达及免疫试验研究[J].中国兽医杂志, 2014 (12) :70-73.

[3]孟庆峰.锦鲤疱疹病毒Taq Man荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用[J].吉林农业大学学报, 2012, 34 (3) :339-342.

[4]尹伟力.液相芯片技术同时检测真鲷虹彩病毒和锦鲤疱疹病毒方法的建立[J].水产科学, 2014, 33 (3) :157-162.

治疗疱疹病毒的天然中药提取物 篇4

技术特点

利用不同的提取方法 (水提取和醇提取) 对该中药进行提取、浓缩和除菌;采用组织培养技术, 对中药提取物进行体外抗单纯疱疹病毒实验;采用抑菌环实验和营养肉汤稀释法对其进行最小抑菌浓度 (MIC) 和最小杀菌浓度 (MBC) 测定实验。

应用范围

通过体外抑菌和抗单纯疱疹病毒实验, 临床上用于治疗由抗单纯疱疹病毒引起的病毒性疾病 (病毒性脑炎、病毒性角膜炎以及生殖器疱疹病毒感染等疾病) ;用于治疗临床上常见的细菌感染, 特别对临床上耐药菌株有较强的抑制和杀灭作用。随着研究的深入, 逐步应用到体内外抗其他病原微生物的实验研究和临床应用。大大提高中药药用价值和经济效益, 极具开发价值。

市场预测

天然药物中的许多活性成分具有抗病毒的作用, 尤其是我国的中草药 (包括中药、民族药和草药) 是祖国医药的宝库, 这类天然药物的研究开发大有可为。有关该中药提取物抗病毒、抗细菌方面的实验研究, 国内外尚未见详细的报道。该中药可综合利用, 既可利用中药的营养价值, 又可以大力开发中药的药用价值, 还可以开发研制不同剂型的系列保健品和抗病原微生物的医药用品, 这必将带动医药和精细化工业的同步发展, 其前景非常广阔。

合作形式

技术转让或者合作开发。

单位:山东大学科技开发部

地址:山东济南山大南路27号

邮编:250100

检测锦鲤疱疹病毒方法的研究进展 篇5

关键词：锦鲤疱疹病毒,检测方法,分子生物学

锦鲤疱疹病毒 (KHV) 的诊断主要有细胞分离、电镜观察等传统的检测方法, 但是这些方法特异性不强, 用于早期诊断价值有限, 很难达到快速检测病原并根据病原进行相关控制的要求。随着分子生物学及相关科学领域的快速发展, 有些研究人员将聚合酶链式反应技术 (PCR) 应用于检测锦鲤疱疹病毒, 其检测方便、快捷, 但具有一定的局限性, 如气溶胶污染、操作需有相关的配套技术等, 锦鲤感染疱疹病毒后, 临床表现与一些细菌和寄生虫感染相似, 所以不能仅从临床症状就判定为锦鲤疱疹病毒感染, 必须通过实验室诊断加以佐证。目前, 锦鲤疱疹病毒已严重影响了淡水养殖业的发展;因此, 找到快速、准确的诊断检测方法对有效控制该病具有重要意义。

1 病原电镜检测

该方法通过电镜观察病毒结构、形态便可进行初步确诊, 在病原检测方面, 电子显微技术一直被广泛关注。在不知道病原体的情况下, 电镜诊断仍然是比较快捷而可靠的检测手段。通过电镜可以观察病毒的膜蛋白参与病毒的吸附和传入过程, 以及病毒从核膜出芽并释放的过程[1]。S.G.Grimmett等[2]利用电子显微镜观察死亡锦鲤被感染的细胞, 可以确定锦鲤的死亡与锦鲤疱疹病毒有关。通过电镜技术还可以确定锦鲤疱疹病毒的分类地位及其分子生物学的研究方向。电子显微镜检测锦鲤疱疹病毒虽然可直接观察到病原, 但方法繁琐、仪器操作较为专业, 不能满足快速检测的目的, 只能用于病原体的鉴定。

2 病原分离鉴定

锦鲤疱疹病毒的分离主要采用细胞培养分离技术, 此技术是最准确的诊断方法, 国际兽疫局 (OIE) 将其推荐为首选方法。研究表明, 锦鲤疱疹病毒具有种属特异性, 只能在原始宿主细胞上生长, 即只能在锦鲤鳍细胞 (KF) 上生长, 并产生特征性病变, 锦鲤疱疹病毒的这种特性, 可作为一种诊断方法。锦鲤鳍细胞系是美国的研究人员在1997年建立起来的[3], 锦鲤疱疹病毒在锦鲤鳍细胞上的适宜培养温度为15～25 ℃, 最适培养温度为20 ℃。P.R.Calle等[4]研究表明, 常用的鱼细胞都很难分离到病毒, 锦鲤疱疹病毒只能在锦鲤鳍细胞、宿主细胞及鱼脑中增殖[5], 再通过细胞培养的方法对临床受感染鱼体进行病毒分离。刘荭等人的研究也证实, 该病毒不可能在草鱼性腺细胞系 (CO) 、鲤鱼上皮细胞 (EPC) 和鲤鱼肾 (CK) 细胞上生长。朱霞等[6]将鲤鱼肾细胞和单层框镜鲤鱼鳍条细胞共同培养, 培养5～6 d后出现典型的细胞病变, 这是国内首次分离到的锦鲤疱疹病毒。然而, 能够分离病毒的细胞系有其自身的局限性;因此, 细胞培养分离法在检测锦鲤疱疹病毒DNA时并不像PCR方法那样敏感, 不能作为一种可靠的检测方法来进行考虑[7]。还有研究表明, 从死亡稍长或冰冻的感染锦鲤组织中很难分离到病毒, 若想分离病毒需用新鲜的肾脏做病毒培养, 因为肾脏是锦鲤疱疹病毒增毒最高的组织[8,9]。

3 抗原检测

3.1 免疫荧光检测

锦鲤疱疹病毒可以通过肝脏、肾脏及感染鱼类脑部的接触印痕及涂片, 利用免疫荧光法进行鉴定。应用免疫荧光法在肾脏中可以收获到较高水平的病毒阳性荧光。研究表明, 在感染早期应用免疫荧光法可以在肾脏印痕中检测到病毒[10]。

3.2 酶联免疫吸附试验

应用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 在感染器官中直接检测锦鲤疱疹病毒抗原的方法在很多实验室中都尚未发展成熟, 一些相关试验还有待于进一步研究。目前, 以色列的研究人员建立了在鱼类排泄物 (粪便) 中检测锦鲤疱疹病毒的ELISA方法[11]。

4 抗体检测

研究人员抽取鱼的血液进行抗体检测, 发现产生抗体的细胞需要一段时间才能激活, 而且一旦激活多种鱼类将会产生永久性免疫[12,13,14,15]。鱼体在感染锦鲤疱疹病毒时, 其自身免疫状态 (特异性免疫与非特异性免疫) 在抵御疱疹病毒入侵时起着至关重要的作用;当水温在18 ℃以上时鱼类的免疫应答处于最佳状态, 此时鲤鱼感染病毒后机体所产生的抗体可以抵抗病毒。研究表明, 机体在感染病毒3周后, 其血清中可以通过ELISA方法检测到抗体的存在, 而自然感染病愈1年后的鲤鱼也能检测到这些抗体。虽然, 含有锦鲤疱疹病毒抗体的锦鲤血清能与鲤鱼疱疹病毒1型出现交叉反应, 但研究人员发现, 通过ELISA方法仍能检测到具有较低含量的锦鲤疱疹病毒抗体;因此, 免疫学方法可以检测外观十分健康的初期感染者, 由于PCR方法在病毒含量较低时容易出现阴性反应, 所以免疫学方法检测抗体也许是唯一有效的监测手段。但是, 对鱼类病毒感染的免疫学方法研究较少, 相信随着血清学诊断技术的日臻完善, 应用免疫学方法在假定健康的鱼群中筛选病毒初期感染者将会成为可能。

5 分子生物学诊断技术

5.1 PCR方法

PCR是比较准确的诊断锦鲤疱疹病毒的方法;因此, 国际兽疫局将其列为推荐方法之一。截止到2006年, 运用PCR技术确诊的锦鲤疱疹病毒感染的阳性病料在德国有45例、英国16例以上、荷兰1例、美国2例, 以色列确诊的病例也是应用此技术完成的。有人用锦鲤疱疹病毒的1个保守片段建立PCR方法, 可用来区分锦鲤疱疹病毒、鲤鱼疱疹病毒 (CHV) 和海峡鲶鱼病毒 (CCV) 。2004年, T.Ishioka等[16]运用PCR技术对发生在日本的43份锦鲤疱疹病毒可疑病例进行了分子流行病学检测, 之后又利用锦鲤疱疹病毒的主要囊膜蛋白基因和聚合酶基因的核苷酸序列设计了相应引物, 并进行PCR扩增。结果表明, 有37份样品检出阳性, 检出率为86%。有研究人员认为, ORF25编码的蛋白在病毒的突变位点不易发生变化, 属于较为保守的基因序列[17];因此, 利用该基因进行PCR检测特异性较高。H.Bercovier等[18]用锦鲤疱疹病毒的胸苷激酶基因建立的PCR方法可区分锦鲤疱疹病毒、海峡鲶鱼病毒和鲤鱼疱疹病毒。2002年在广东省爆发的疑似锦鲤疱疹病毒病原感染中, 刘荭等人建立的检测方法发挥了积极的作用, 同时也预示着我国同样存在受贸易往来所导致的锦鲤疱疹病毒爆发的风险, 并提前为我国预防和控制该病提供了技术支持。乌日琴等[19]分别利用2种方法抽提组织中锦鲤疱疹病毒的DNA, 证实蛋白酶K-酚/氯仿抽提法不能达到从组织中抽提锦鲤疱疹病毒DNA的目的, 同时也评价了2套引物检测的特异性, 初步建立了反应快速、操作简便、灵敏度高的检测锦鲤疱疹病毒的PCR方法。孟庆峰等[20]通过使用靶基因序列合成的相关引物检测锦鲤疱疹病毒。结果表明, 所用靶基因均可用于锦鲤疱疹病毒的检测及其确证试验。但是, PCR检测方法也有自身的局限性, 它只能从出现临床症状的病鱼体内检测到锦鲤疱疹病毒, 还不能预知潜在的病毒感染, 同时假阳性、假阴性及气溶胶污染等也给PCR方法带来一些弊端。

5.2 探针检测

对于公布的单循环PCR方法, 最近被认为是从临床患病的鲤鱼体内采取新鲜器官样品中检测锦鲤疱疹病毒DNA最为敏感的, 该规程同样可以应用于检测具有亚临床症状的病毒, 首先应用TK探针发展该规程的是以色列希伯来大学-Hadassah医学院的研究人员。其后日本学者也对此进行了相关研究, 并对其进行了改进。研究表明, 若使用的器官样品有腐烂迹象, 则需要用探针位点靶向基因组的稍短区域。

5.3 环介导等温扩增技术 (LAMP)

环介导等温扩增技术是一种新型的恒温核酸扩增方法, 它能特异性识别靶核苷酸上6个位点的4对引物及具有链置换活性的DNA聚合酶, 在60～65 ℃条件下进行核酸的指数式扩增, 其扩增效率在1×10-9～1×10-10数量级上, 其反应的原理是在扩增的过程中产生茎环结构, 以保证引物和模板杂交后启动新一轮的扩增反应, 反应的副产物焦磷酸镁沉淀是肉眼可见的, 若反应中添加显色剂, 通过扩增过程颜色的变化, 还可以目测整个反应过程。该方法的优点是快速、简便、廉价、肉眼可观测到反应的发生, 并且不需要特殊的PCR反应仪器, 非常适合现场诊断;因此, 该方法有很好的应用前景。H.Soliman等[21]通过设计的3对引物建立了锦鲤疱疹病毒的环介导等温扩增技术, 该方法在90 min内即可完成, 省时、省力并且直观。I.Gunimaladevi等[22]利用锦鲤疱疹病毒胸苷激酶基因设计引物建立的环介导等温扩增技术, 其灵敏度与普通PCR方法相当。

6 结语

马疱疹病毒 篇6

该病的主要临床症状是精神沉郁,食欲废绝;行为上无方向感的游泳,甚至停止游泳;皮肤上出现苍白的块斑和水泡;鳍、鳞片、口腔、腹部出血或充血;患病鱼出现症状后1~2 d内死亡。

该病毒适合培养温度为21℃,只对锦鲤鳍细胞系敏感,产生细胞病变。目前国内有效的监测和诊断方法不多,主要用聚合酶链式反应(PCR)方法。PCR方法和细胞培养技术是OIE推荐的KHV诊断方法。目前,很多流行病的诊断都采用一种新技术——荧光定量PCR方法,该方法以其敏感性、特异性高,污染少,可定量等优点逐渐成为实验室和临床诊断中的主要方法。本研究利用锦鲤疱疹病毒VR52标准株建立荧光定量PCR(Flurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR)方法,利用一对特异性引物和探针建立一种特异的实时定量PCR方法,以期为KHV感染提供快速、特异的诊断方法。

1 材料和方法

1.1 毒株

KHV标准毒株VR52购自ATCC R公司。鲤春病毒血症病毒(SVCV),传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和病毒性出血性败血症病毒(IHNV)阳性质粒由深圳出入境检验检疫局馈赠。

1.2 试剂和仪器

组织基因组DNA提取试剂盒(DV811A),Taq DNA聚合酶,PCR反应试剂盒,质粒提取试剂盒,PMD-18T Vector,Takara Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0,Takara Mini BEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0,DNA分子量Marker,DNAgreen,焦磷酸二乙酯(DEPC)均购自宝生物工程(大连)有限公司,其他试剂均为国产或进口分装。核酸蛋白分析仪Gene.specv为Hitachi Naka Instruments Co.Ltd公司产品。荧光PCR仪ABI7000 Sequence Detection Systems为ABI公司、普通PCR仪PTC-200 Peltien Thermal Cycler为MJ Research公司产品。凝胶成像仪Gel Doc TMXR为BIO-RED公司产品,高速冷冻离心机3K30为德国SIGMA公司。

1.3 FQ-PCR标准品的制备

1.3.1 引物的设计与合成

根据Gen Bank上公布的AB375391 KHV胸苷激酶(TK)基因的保守序列,利用Premier5.0引物设计软件设计两条引物,送上海生工合成。引物序列如下:

上游引物TK1为:5′-GGGTTACCTGTACGAG-3′下游引物TK2为:5′-CACCCAGTAGATTATGC-3′

1.3.2 TK基因的扩增

将KHV标准毒VR52接种KF细胞,待出现细胞病变收获细胞毒。用组织基因组DNA提取试剂盒提取细胞毒的核酸,做为扩增的模板。提取过程按照说明书进行操作。PCR扩增体系如下:25 L的体系,DNA模板3 L,10×Ex Taq buffer 2.5 L,d NTP(2.5 m M)2.5 L,引物TK11 L(10 p M),引物TK21 L(10 p M),Taq酶(5U/L)0.2 L,DEPC处理水补到25 L。反应条件为94℃5 min;95℃1 min,52℃1 min,72℃1 min,40个循环;72℃10 min;4℃保温。扩增片段大小为409 bp,以1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增效果。

1.3.3 TK基因的克隆与鉴定

利用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒将TK基因PCR扩增产物回收(具体操作见试剂盒说明书),将回收的产物与PMD-18T Vector连接16 h。连接体系:PMD-18T Vector 1 L,PCR产物1 L,DEPC处理水3 L,连接液5 L。将连接产物转化到DH5感受态细胞,加入IPTG和X-Gal,涂在Amp+琼脂平板上,次日挑取4个白色单个菌落,分别进行PCR鉴定。将阳性克隆菌落接种到Amp+LB液体培养基中,37℃摇床过夜,利用质粒小量提取试剂盒提取质粒,以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.3.4 质粒标准品浓度的计算

将上述质粒用核酸蛋白分析仪测定260 nm与280 nm波长下的OD值,判断其纯度(OD260nm/OD280nm>1.8者为纯品),然后按照下面的公式转换成质粒的拷贝数:每微升质粒拷贝数=(质量/分子量)×(6.02×1023)=[质粒浓度(ng/L)×1 L]×10-9/[(载体分子量+插入片段分子量)×660]×(6.02×1023个/mol),其中:6.02×1023是阿佛加德罗常数;660是每个碱基的平均分子量;重组质粒的总长度为3101bp。标准品作10倍梯度稀释,–20℃保存备用。

1.4 实时荧光定量PCR检测方法的建立

1.4.1 引物和Taq Man探针的设计与合成

以1.3中PCR扩增的片段为模板,利用Beacon Designer 5.0软件设计了1对特异引物和Taq Man探针,引物和探针均由大连宝生物有限公司合成,探针的5′端用荧光基团FAM标记,3′端用淬灭基团TAMRA标记。引物及其Taq Man探针序列见表1。扩增长度为116bp。

1.4.2 荧光定量PCR反应体系及条件

反应体系:25 L的总体系,DNA模板5 L,10×Ex Taq buffer 2.5 L,d NTP(2.5 m M)2.5 L,上游引物1 L(10 p M),下游引物1 L(10 p M),探针0.8 L(10 p M),Taq酶(5 U/L)1 L,DEPC处理水补到25 L。置荧光定量PCR仪中,反应条件为94℃3 min;94℃15 s,60℃30 s,72℃1 min,5个循环;94℃10 s,60℃40 s,40个循环,收集荧光信号。用矩阵法筛选引物和探针的最佳使用量。

1.4.3 标准曲线的制备

将KHV标准品质粒做10倍系列稀释,采用优化好的条件进行实时荧光定量PCR。根据质粒拷贝数和对应的Ct值,利用SDS1.2分析软件得到标准曲线。

1.4.4 FQ-PCR特异性试验

用建立的荧光定量PCR反应体系同时检测鲤春病毒血症病毒(SVCV),传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和病毒性出血性败血症病毒(IHNV)阳性质粒,检测KHV引物和探针的特异性。

1.4.5 FQ-PCR重复性试验

对FQ-PCR模板进行10倍系列稀释,并做2组平行样,检测其重复性。

2 结果

2.1 KHV TK基因特异性片段的扩增

目的片段大小为409 bp,经1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。

2.2 KHV标准阳性质粒的构建与鉴定

将目的片段与PMD-18T Vector连接,转化到大肠杆菌DH5,经过Amp+的琼脂平板的培养,挑取阳性克隆菌,提取质粒,并测序。经0.8%琼脂糖凝胶电泳,质粒大小为3 101 bp,结果如图2所示。测序结果显示,质粒中含有目的片段。以质粒为模板,进行常规PCR鉴定,扩增出409 bp的目的片段,如图3所示,说明质粒构建成功,取2号管对应的质粒做标准品,用于荧光定量PCR方法的建立。

2.3 重组质粒浓度的测定

提取的质粒经核酸蛋白分析仪测定,其质量浓度为32.85 g/m L,OD260nm/OD280nm比值为1.825,符合纯度要求。根据每个阳性质粒含3101bp,所提质粒DNA溶液浓度可换算为1.6×1010个拷贝/L。

2.4 引物和探针最佳使用浓度的确定

以相同浓度的阳性核酸为模板,选用不同浓度范围的引物和探针,采用矩阵法筛选引物和探针的最佳使用浓度。在模板量相同的情况下,以循环阈值(Ct值)最小,荧光强度增加值(Rn)最大,若两者不一致,优先以Ct值为准,矩阵法优选后,引物和探针的最佳浓度分别为0.4 p M和0.32 p M。

2.5 FQ-PCR标准曲线的建立和回归方程的确定

对标准阳性质粒10倍系列稀释,以优化的条件进行Taq Man FQ-PCR扩增。利用SDS1.2分析软件,以Ct值为纵坐标,质粒DNA拷贝数的对数为横坐标,获得一条标准曲线,如图4所示。可见,在1.6×10~1.6×105拷贝之间,测得的数值基本在一条直线上,与Ct值有良好的相关性,相关系数R2=0.992,说明各个浓度组相关性非常好,可以对病毒进行可靠的定量检测,此阳性质粒可作为FQ-PCR的标准品。质粒在稀释到10-9仍能检测到荧光信号,对应16个拷贝数,该方法检测的灵敏度为16个病毒拷贝数,灵敏度较高。图中,标准曲线的斜率为-3.09,截距为20.96,可以得出拷贝数N与Ct值之间的线性关系表达式即回归方程:Ct=-3.09Ig N+20.96。待测样品的Ct值可直接从仪器中读取,通过回归方程,可确定样品中核酸的含量。

2.6 FQ-PCR重复性试验

将KHV核酸做梯度稀释,做两组重复样,结果如图5所示,重复样Ct值之间相差0.1左右,重复性较好。

2.7 FQ-PCR特异性实验

分别对IHNV、SVCV、IHNV、KHV阳性质粒,用建立好的KHV FQ-PCR的反应体系,进行扩增。如图6所示,只有KHV有扩增曲线,呈现出良好的特异性。

3 讨论

目前对锦鲤疱疹病毒病的诊断方法主要有Soliman等[3]、Gunimaladevi等[4]报道采用LAMP法能高度灵敏、快速、省力的检测出KHV病毒;乌日琴等[5]、刘荭等[6]也初步建立了快速、灵敏和操作简便的KHV病毒的PCR检测方法。这些方法只能作为定性分析的手段。而本文建立的FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性,而且由于荧光探针的使用,可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果,所以还具有DNA杂交的高特异性、光谱技术的高精确性和实时监测的特点;FQ-PCR克服了常规PCR的许多缺点,如普通PCR需要琼脂糖凝胶电泳来观察结果,费时费力,并且紫外线和溴化乙锭对人体又有害,这些复杂的过程增加了假阳性的机会,FQ-PCR具有扩增与自动分析一体化,缩短了检测时间。本文建立的FQ-PCR检测方法,具有高灵敏性、高特异性、操作时间短,可做为KHV检测首选的方法。

本文FQ-PCR标准品的构建是荧光定量PCR方法建立的基础,本文选用6个稀释度的标准阳性质粒模板,建立的标准曲线,相关系数为0.992,表明拷贝数与Ct值相关性良好,本试验最低可检出16个病毒拷贝,说明灵敏度较高。因此本研究构建的检测KHV的标准品可用于FQ-PCR检测。

由于FQ-PCR可定量检测病毒数量的特点,可做为判断病毒在体内定植规律、复制水平和用药后病毒是否被清除、新药的药效学等方面研究提供有力的参考,有很好的应用前景和研究价值。

参考文献

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[2]张立峰,刘晶,苏世敏.一种新发现的鱼类病毒KHV在国外的流行和研究现状[J].中国动物检疫,2003,20(2):41~43.

[3]Soliman H,El-Matbouli M.An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus(KHV)infection by loop-mediated isothermal amplifi cation[J].J Virol,2005,17(2):83.

[4]Gunimaladevi I,Kono T,Venugopal M N,et al.Detection of koi herpesvirus in common carp,Cyprinus carpio L.,by loop-mediated isothermal amplification[J].J Fish Dis,2004,27(10):583~589.

[5]乌日琴,刘中勇,黄宝春.PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因[J].检验检疫科学,2005,15(2):6~8.

马疱疹病毒 篇7

关键词：单纯疱疹病毒,角膜炎,临床分析

单纯疱疹病毒性角膜炎 (herpes stromal keratiais, HSK) 是由于单纯疱疹Ⅰ型病毒感染角膜组织所引起的常见性眼病, 其病症表现顽固、复发周期快, 对视力影响严重[1]。近年来, HSK治疗以西医治疗较为广泛, 但治疗效果显著不大, 表现为患者耐药性增高, 疾病复发周期快, 复发症状严重。为此, 本文对此病例施行中西医结合的治疗方式治疗HSK, 效果显著, 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2008年2月至2011年2月佛山市南海区大沥医院收治的56例单纯疱疹病毒性角膜炎患者, 随机分为以中西医结合的治疗组35例 (62眼) , 其中男23例 (41眼) , 女12例 (21眼) ;以西医治疗为主的对照组21例 (30眼) , 其中男10例 (18眼) , 女11例 (12眼) ;两组年龄13-58岁, 平均年龄37.4岁;病程2d～16个月, 两组在性别、年龄、患眼情况具有可比性。

1.2 诊断标准

56例子HSK患者均符合《眼科学》中《单纯疱疹病毒性角膜炎诊断标准》[2]。其该病病例诱因主要为: (1) 感冒、发热等; (2) 病症表现为畏光、眼痛、流泪; (3) 膜发炎导致的视力减弱; (4) 患者眼睛角膜症状呈树枝状、图状、盘状; (5) 荧光抗体染色、素角膜染色。

1.3 治疗方法

1.3.1 对照组

单纯西药治疗。主要采用无环鸟苷及抗生素眼水, 口服无环鸟苷以抗病毒为主;抗生素眼水主要以抑制眼角膜发炎为主, 如使用0.1%阿昔洛韦滴眼液、0.1%羟苄唑眼液, 此2种抗生素眼水实行点滴, 6次/d, 1滴/次;还可以0.25 g阿昔洛韦配制5%的葡萄糖 (205mL) 行静脉滴注, 周期7～14d, 1d/3次;在患有深层型盘状角膜炎患者诊治中, 采用地塞米松滴眼液 (0.025%) 行点滴滴眼, 1d/3次, 1个疗程/14d。

1.3.2 治疗组

采用中西医结合治疗, 西医治疗结束后加入中药治疗。针对中医辨证论治理论, HSK患者被分为4类型[3]: (1) 肝经风热型。治宜疏风清热, 选材为银翘散、金银花; (2) 肝胆炽旺型, 治宜清肝泻火, 选材为龙胆泻肝汤; (3) 湿热蕴结型。治宜清热化湿, 选材为三仁汤加减; (4) 阴虚火旺型。治宜滋阴祛邪, 选材为知柏地黄汤加减。以上4类所选汤剂, 1天/1剂, 另外还可以患者具体病患情况而定, 对药物进行调整。

1.4 统计学处理

所得数据采用SPSS 13.0统计分析软件行统计学处理, P<0.05为差异有统计学意义。计数资料采用卡方检验, 计量资料采用t检验。

2 治疗结果

2.1 疗效判定

根据《眼科学》中《单纯疱疹病毒性角膜炎疗效标准》, HSK疗效症状判定为, 治愈:患者眼刺症状消失, 角膜遗留薄翳或近透明, 荧光素染色呈阴性, 视力逐渐恢复病前;有效:患者眼刺有轻微疼痛、畏光, 角膜水肿减轻, 荧光素染色呈阳性, 视力部分恢复, 症状有了明显改善;无效:症状体征均无明显改善, 荧光素染色阳性;复发:诊治治愈后稳定期短, 随后在半年以上HSK症状再发者。

2.2 临床疗效

5 6例H S K患者采用中西医治疗为主的治疗组治疗有效率为 (85.48%) , 总有效率为 (96.77%) , 且患者视力均达到有效改善;采用以西医治疗为主的对照组治疗有效率为 (60.00%) , 总有效率为 (76.66%) , 两组治愈率和总治愈率有显著性差异 (P<0.05) , 且治疗组疗效明显高于对照组。治疗组疗后0.5～1年无一病患HSK病症复发, 对照组复发4例, 复发率为 (13.33%) 。见表1。

2.3 安全评价

治疗前后安全指标未发生异变。中西医结合治疗HSK效果优于单纯西医治疗, 表现为见效快, 少复发、疗程短。

3 讨论

HSK在当今临床治疗仍是比较棘手的问题。临床西药单治首选药物是阿昔洛韦和无环鸟苷, 但如患者长期服用, 身体易产生产生耐药性和毒副作用, 导致回复周期长, 恢复见效差, 难以痊愈, 且还易产生复发。为此, 作者为弥补西药产生的不良疗效后果, 以中西药联合治疗的方式对HSK进行治疗, 疗后显著性大。

从中药治疗HSK临床病理上看, 该病归于“聚星障”、“混睛障”、“花翳向陷”等范畴[4];感冒、发热、肝火炽旺、湿热内蕴多为引起HSK发病的诱因。结合中医辩证诊治理论, 主要将HSK分为以下四类: (1) 肝经风热类; (2) 肝胆炽旺类; (3) 湿热蕴结类; (4) 阴虚火旺类。

从本组临床数据上看, 采用中西医结合治疗HSK的治疗组, 治疗效果明显优于单纯采用西药治疗的对照组, 两组在治愈率、有效率、无效率、复发例数上均具有差异统计学意义 (P<0.05) 。从表1可知, 中西医结合治疗HSK在治愈率上达到85.48%, 总有效率达到96.77%, 这是单纯采用西医食疗HSK所不及的, 且数据还显示出, 采用中西医结合治疗HSK, 术后复发率低乃至无, 视力情况得到很大恢复, 这都充分说明了中西医联系治疗单纯疱疹病毒性角膜炎临床效果确切。

综上所述, 中西医联合治疗HSK具有见效快, 回复周期短、愈后复发少等优点, 这是由于中西医联合治疗过程中, 具有抑制病毒再发, 提高患者免疫力, 减轻患者炎症反应的功效, 值得临床大力推广。

参考文献

[1]葛坚.眼科学[M].北京:人民卫生出版社, 2005:1569.

[2]南京中医药大学.中药大辞典[M].上海:上海科学技术出版社, 2006:2167.

[3]高颜茹, 程春旭.中西医结合治疗复发性单纯疱疹病毒性角膜炎的临床观察[J].吉林医学, 2009, 3 (23) :3057.

马疱疹病毒 篇8

1 资 料

1.1 临床资料

收集2008年6月—2011年6月单纯疱疹毒性脑炎25例, 男16例, 女9例, 年龄15岁～77岁, 平均45.23岁。发病时间无季节性, 起病前2周有上呼吸道感染症状者9例, 4例有口唇疱疹, 12例有癫痫发作, 5例有意识障碍, 7例有精神症状, 2例有偏瘫, 12例有脑膜刺激征, 复发者2例。

1.2 实验室检查

脑脊液检查:25例患者入院后均行腰椎穿刺检查, 其中脑脊液压力增高者15例, 正常者10例, 细胞数增高者16例, 蛋白增高者13例, 10例行单纯疱疹病毒学检查, 有2例I型单纯疱疹病毒IgM抗体阳性。 脑电图检查:15例患者入院后1周行24 h动态脑电图检查, 5例正常, 轻度异常5例, 中、重度异常5例。主要表现为一侧或双侧颞叶、额区周期性弥漫性高波幅慢波。影像学检查:25例患者均行头颅MRI检查, 正常者4例, 异常者21例, 主要表现为T1低信号, T2高信号改变, 其中14例为单侧颞叶、岛叶和扣带回, 3例为双侧颞叶, 一侧为重, 病灶多累及皮层及皮层下白质, 其中5例有不同程度的占位效应。

1.3 治疗

所有患者均给予脱水、抗病毒、改善脑代谢及其他对症治疗, 有癫痫发作者给予抗癫痫治疗, 抗病毒治疗主要给予无环鸟苷或者更昔洛韦, 疗程3周。

1.4 随访及预后

出院时15例临床症状恢复满意, 生活能够自理, 脑电图复查回复至正常;7例有记忆力减退;3例影像学检查均为双侧颞叶病变的患者恢复差, 记忆力明显减退, 高级认知功能减退, 生活需人照顾;其中有部分患者3个月随访, 5例有摄食异常;4例留有癫痫发作;5例有精神症状, 表现为兴奋、自言自语、幻想等。

2 讨 论

单纯疱疹病毒是双排扭曲的DNA病毒, 具有嗜神经性。75%的病毒性脑炎是由单纯疱疹病毒I型引起的[1]。单纯疱疹病毒性脑炎多为急性起病, 早期症状常为头痛及发热、口周疱疹, 体温可高达40 ℃以上, 在无充分进行病原治疗时病死率可高达70%, 且预后严重[2], 临床上很快可出现头痛、呕吐等一般颅内感染症状, 多不被引起注意, 至出现癫痫、记忆力减退时才引起注意;也有亚急性甚至慢性起病者, 容易被误诊为其他疾病治疗, 影响预后。在本研究病例中, 有17例急性起病, 表现为发热、头痛、精神症状、记忆力减退;2例亚急性起病, 主要为逐渐出现的记忆力减退、言语内容混乱被家人发现而就诊;1例为慢性起病, 患者为老年女性, 出现反应迟钝、认知功能减退以脑血管病对症治疗, 效果不佳, 经脑脊液病毒学检查而确诊。在中枢神经系统感染中, 单纯疱疹病毒性脑炎并不少见, 约占全部脑炎的10%～20%[3], 与所有的感染性疾病类似, 单纯疱疹病毒脑炎的起病形式缓急、临床症状轻重, 取决于病毒感染的数量、感染病毒的毒力和宿主的免疫功能状态。

I型单纯疱疹病毒通过口、鼻黏膜潜伏于三叉神经节, 激活后沿颅中窝脑膜上三叉神经分支向额叶、颞叶、边缘结构播散, 故单纯疱疹病毒脑炎以侵及颞叶、岛叶皮质、额下区和扣带回为特征。本组有7例表现为记忆力减退、遗忘, 经头颅MRI检查病变在颞叶及海马, 3例双侧颞叶、岛叶受累后出现视觉失认, 不能区别家人及陌生人, 食欲明显增加、善饥、情绪易于改变, 表现为激动、烦躁;12例起病后表现为癫痫发作或持续状态, 1例表现为严重的锥体外系症状及精神症状。

15例行脑电图检查, 有2例表现为在高波幅的慢波背景上出现颞区周期性棘波, 其余为轻、中度异常, 脑电图异常在单纯疱疹病毒脑炎中出现较早, 一般见于中枢系统受累后2 d～12 d。99%的患者在疾病早期有脑电图异常, 单纯疱疹病毒脑炎患者脑电图常表现为弥漫性高波幅慢波, 以单侧或双侧颞、额区异常明显, 甚至可以出现颞区的尖波及棘波。临床研究证实, 脑电图异常程度与病情进展平行, 随着病情好转, 脑电图表现好转, 甚至完全恢复正常, 但是, 如果脑电图恢复慢, 4周复查仍存在慢波, 恢复不满意, 表明脑电图好转情况可作为衡量疗效及病情预后恢复的指标之一[4], 若慢波或病理波持续存在, 则预后不良[5]。

影像学表现的病变部位及范围也可提示病情的严重程度及预后。本观察中发现, 有3例患者为双侧颞叶受累, 表现为记忆力及高级认知功能明显减退, 经正规治疗4周, 3个月后随访, 患者记忆力改善不明显, 存在食欲异常, 表现为食欲旺盛、善饥, 情绪不稳;一侧颞叶受累同时累及海马, 经过3个月随访, 患者记忆力存在明显异常;单纯疱疹病毒性脑炎影像学具有特征性[6]:①病变多先累及单侧或双侧颞叶, 部分病例可向额叶或枕叶发展, 单独发生于额叶、枕叶及顶叶者少见。②病变均与豆状核之间界限清楚, 凸面向外。③MRI多发性T1WI呈等、低信号, T2WI高信号改变, 信号不均质, 边缘欠规则, 临近脑回肿胀, 脑沟变平, 病变与豆状核之间常可见清晰边界, 似“刀削”征, 当岛叶受累时尤为明显。④不增强或线样脑回状增强, 主要位于病变的边缘部分。单纯疱疹病毒性脑炎临床缺乏特征性, 但临床上脑脊液疱疹病毒抗体阳性, 脑电图的改变、影像学综合分析后可作出诊断, 如果脑脊液中能分离出病毒则可明确诊断, 但临床检测方法的限制, 使诊断及治疗方案制定受到一定的影响, 从而影响疾病的转归及预后。

单纯疱疹病毒性脑炎的治疗主要以抗病毒为主, 临床上主要应用无环鸟苷及阿糖胞苷, 疗程要足充。也有报道, 在有效抗病毒药物治疗基础上, 根据脑组织的病理环境给予糖皮质激素治疗, 激素应用一般限于伴发明显脑水肿的患者, 可调控小胶质细胞激活的免疫炎性反应, 从而改善脑炎预后[7]。

参考文献

[1]吴军, 张海鸥, 张玉丙, 等.表达降钙素基因相关肽的单纯疱疹病毒I型扩增子载体免疫效果观察[J].中国实验诊断学, 2006, 10 (10) :1126-1128.

[2]Buursma AR, de Vries EF, Garssen J, et al.[18F]FHPG positronemission tomography for detection of herpes simplex virus (HSV) in experimental HSV encephalitis[J].J Virol 2005, 79 (12) :7721-7727.

[3]王新德.神经病毒学-基础与临床[M].北京:人民卫生出版社, 2000:377.

[4]汪芳, 丁莉, 邵良, 等.单纯疱疹病毒性脑炎治疗前后血清NSE含量及脑电图分析[J].中国实用神经疾病杂志, 2009, 12 (12) :29-30.

[5]Herrman M, Curio N, Joct S, et al.Release of biochemical markersof damage to neuronal and glial brain tissueis associated with shortand long term neuropsycholigical out after traumatie brain injury[J].J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2000, 70 (1) :95.